Transferencia de Métodos de HPLC a UHPLC: … · 1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity...

1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Transferencia de

Métodos de HPLC

a UHPLC:

Estrategias y

Criterios de

Selección de

Columnas.

Isidre Masana

Agilent Technologies

Especialista Productos UHPLC/MS

UHPLC MasterClass Junio 2013

Agenda

1. Introducción

2. ¿Cómo convertir métodos de HPLC

a UHPLC?:

• Estrategias de Traspaso de Métodos

– Isocrático y Gradientes Concentración

• Criterios de Selección de Columna

– Longitud y Tamaño Partícula

– Fase estacionaria y tipo de columnas

– Diámetro

3. Conclusiones.

4. Anexo con información adicional.

Página: 2

Agenda

1. Introducción


a UHPLC?:






– Diámetro

3. Conclusiones.


Página: 3

Introducción Métodos HPLC UHPLC

Página: 4

HPLC UHPLC:

• Columnas HPLC 5 y 3.5µm UHPLC: 1.8µm (TP) o 2.7µm (SP).

OBJETIVOS / Estrategias:

• Reducir Tiempos de Análisis SIN perder Resolución.

• Aumentar la Resolución SIN incrementar tiempo de Análisis.

Fundamentos:

• Poder trabajar a flujos elevados sin perder eficacia con rellenos TP<2µm ó SP 2.7µm.

• Aumento de la capacidad de separación en gradientes con flujos elevados.

* Trabajando con gradientes de concentración

Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC/RRLC

www.agilent.com/chem Instruments

Liquid Chromatography

Buscar: Method translator

Página: 5

http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe para descargárselo (6Mb – requiere Flash Player).

http://www.agilent.com/chem

http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe

Agenda

1. Introducción


a UHPLC?:






– Diámetro

3. Conclusiones.


Página: 6

Estrategias de Traspaso de Métodos HPLC a

UHPLC

• ¿Método ya validado? ¿Se quieren mantener condiciones

dentro del rango de cambios admitidos por USP?

• Admite 5µm 2.7µm (SP). Pero NO a < 2.5µm.

• 3.5µm 2.7µm (SP), 1.8µm (TP). Pero NO < 1.75 µm.

• Mantener validación USP Adicionalmente estar limitado a:

– Reducción Diámetro columna: : ≥ 0.50 x D p.e. 4.6mm3mm (NO a 2.1mm)

– Subida Flujo: ≤1.50 x F

– Subida Temperatura: T+≤10ºC

• OBJETIVO:

• ¿Reducir tiempos de Análisis?

• ¿Aumentar Resolución?

• ¿Combinación de ambas?

Poroshell 120: 2.7µm

Superficialmente

porosas

Página: 7

¿Cuanto Puede Cambiarse en HPLC/UHPLC

un Método USP “Standard”?

• pH de la Fase Móvil: +/- 0.2 unidades

• Concentración de sales en tampón: +/- 10%

• Ratio de componentes in fase móvil para componentes minoritarios: < +/- 30% relativo. / <10% absoluto.

• Longitud Columna: +/- 70% p.e. 250mm75mm 150mm50mm

• Diámetro Interno Columna: +/- 50%. Adaptando el flujo para mantener la velocidad lineal constante. F2 = F1 x D2

2 / D12 p.e. 4.6mm3mm (NO a 2.1mm)

• Tamaño Partícula: puede reducirse en un 50% p.e. 5µm 2.7µm (NO a 1.8µm)

• Flujo: +/-50%. Si se reduce d.i. columna se aplicará el +/-50% al resultante de F2 = F1 x (L2 D2

2) / (L1 D12).

• Long. Onda (UV-VIS): ninguno (error detector < +/- 3 nm)

• Temperatura Columna: +/- 10ºC.

• Volumen Inyección: cualquier volumen menor que cumpla requisitos.

Fuente: Pg. 6 USP 34 Physical Tests / <621> Chromatography 1

Poroshell 120: 2.7µm

Superficialmente

porosas

Página: 8

Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:

Estrategias en el Traspaso de Métodos Reducción de Tiempo:

• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).

• Aumentar el flujo.

• Aumentar la temperatura.

• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo).

Mejora de Resolución :

• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).

• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.

• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)

• Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5μm.

1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.

5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)

Página: 9










• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)

• Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5μm.



Página: 10

min5 10 15 20 25 30 35 40

mAU

0

5

10

15

20

25

30

Gradiente = 67min

Capacidad picos = 694 (10/min)

“Resolución GC”

Mapa péptidico de BSA digerida con tripsina con

Agilent 1200-RRLC (SL)

Zorbax SB-C18, 2.1x150mm, 1.8µm

min2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Gradiente = 30min

Capacidad picos = 540 (18/min)

Cromatografía de Alta Resolución con el Agilent

1200 RRLC (SL) + Columnas 1.8µm y 150mm

Capacidad de Separación de Picos: 700

Eficacia : 36.000 platos/columna 15cm x 1.8µm

(típica de columna GC de 10metros x 0.32mm)

8 Columnas x 5µm 200.000 platos/ 2 metros

Página 11

Cromatografía de Alta Resolución por Acoplamiento

en Serie de Columnas de 5μm

0.4ml/min H2O/CH3CN 60/40 80ºC

4 Columnas en serie 5 x 25cm x 4.6mm - 5μm


1 Columna 25cm x 4.6mm - 5μm

70bars

177bars

360bars

20.000 platos

100.000 platos

200.000 platos

105min

14min

Cromatografía de Alta Resolución con 5μm y 80ºC

100.000 platos en 30min

380bars


1 y 2 ml/min H2O/CH3CN 60/40 30 y 80ºC 29min










• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo

• Acoplar varias columnas en serie de 5μm.



Página: 14

Traspaso de Métodos Isocráticos a UFLC.

Columna referente: 5µm x 150mm (12.500 platos)

Reducción del Tiempo de Análisis*

Flujo Constante Flujo x 2 Flujo x 3

1.8µm x 50mm

(12.000 platos)

1/3

30min10min

1/6

30min5min

1/9

30min3.3 min

3.5µm x 75mm

(10.500 platos)

1/2

30min15min

1/4

30min7.5min

1/6

30min5 min

3.5µm x 100mm

(14.000 platos)

2/3

30min20min

1/3

30min10min

2/9

30min6.7 min

La resolución será semejante a la original. La misma proporción aplica a D.I. 2.1 y 3mm *Nota: Reducción del tiempo de análisis calculada con respecto a columna de 150x4.6mm 5µm

**Incremento presión: +2% para 7.5cm x 3.5µm +35% para 10cm x 3.5µm +150% para 5cm y 1.8µm (∆P = f (η.u.L/ dp2))

• Mantener: composición y nº puntos muestreo pico (↑ Hz).

• Subir Flujo (hasta p.e. 80% presión máxima columna/ instrumento).

• Reducir volumen inyección (proporcionalmente a. reducción volumen columna).

Página: 15

Ajuste de la Frecuencia de Adquisición de Datos: Compromiso entre Resolución Cromatográfica y Sensibilidad.

• Aumentar la frecuencia de adquisición de datos proporcionalmente a la reducción del tiempo de análisis.

– Ajustar “Peak width” adquisición al “width” de integración de los resultados del pico más fino de interés.

– Proporcionará unos 35-40 puntos de medición por pico para máxima resolución cromatográfica.

• El ruido se reduce con el aumento del nº de puntos promediados:

Ruido α ~ 1 / √ nº promedios

• Para máxima sensibilidad ajustar a 8-10 puntos (RSD% ≈ 10-15%).

• Para óptima repetibilidad cuantitativa adquirir >15 puntos (RSD< 1%).

Página: 16

Parámetros Optimización Resolución Cromatográfica

Rs= 2 (T1-T2) /( Wb1+Wb2) N= 5.54 ( Tr / w50%)1/2

α = (T2 – T0)/(T1 – T0) K’ = (Tr – T0) / T0

* Para picos de tamaños muy distintos se recomienda Rs > 2

Parámetro

Modificado

% Mejora

Resolución Incremento

Tiempo Análisis

Long. x 2 40% x 2

K’: 0.5 2 100% x 2

K’: 5 10 10% x 2 El incrementar la retención por encima de K’=5

apenas mejorará la resolución.

OBJETIVO Rs > 1.5 (2)*

1 < K'< 10 Rs= 0.25 N1/2 ((α- 1)/ α ) (K'/(K'+1))

RETENCIÓN Poder Eluotrópico Eluyente

% modificador Orgánico SELECTIVIDAD Fase Estacionaria y Soporte

pH Fase Móvil (si pH próximo a pK)

Modificador Orgánico y su %

Aditivos Fase Móvil

Temperatura

EFICACIA√

Tamaño Partícula del Relleno Longitud de la Columna Excesivos Volúmenes Muertos (-) Flujo:

ISOCRÁTICO:

k' k'/k'+1 T. análisis

0,2 0,17 1.2 x T 0

0,5 0,33 1.5 x T 0

1 0,50 2 x T 0

2 0,67 3 x T 0

3 0,75 4 x T 0

4 0,80 5 x T 0

5 0,83 6 x T 0

10 0,91 11 x T 0

20 0,95 21 x T 0

La mejora de Resolución

es muy importante al

incrementar la retención

hasta K’= 5

Rs = f ( K’/[K’+1] )

0,2

0,5

1

2

3 4

5 10

20

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

K'

k'/k

'+1

k'/k'+1

La mejora de Resolución

es muy importante al

incrementar la retención

hasta K’= 5

N= f(L/ 2dp)

Para mejorar resolución de picos con K’ > 5 mejor

aumentar long. columna. Para K’<2 reducir “poder

eluotropico” del eluyente

DISMINUCION 10% ORGANICO ===> K’2 = (2 ó 3) x K’1

Log K’ =aprox flineal(%orgánico)

Traspaso de Métodos con Gradientes

•S: definirá la “sensibilidad” del analito a variaciones en la proporción de modificador orgánico.

•Valores típicos S: aumentan con el tamaño de la molécula

2-5 moléculas pequeñas / 10 moléculas grandes (péptidos) / 40 moléculas muy grandes (proteínas)

•Al aumentar el tamaño de la molécula aumenta su “sensibilidad” a cambios de composición del eluyente.

K‘ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Parámetro dependiente de:

• Analito

• Modificador Orgánico

Volumen muerto de la columna

% de incremento de Modificador Orgánico Tiempo del gradiente (min)

Flujo (ml/min)

“Factor de Capacidad ó Retención” en Gradientes

Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8

4.6x50, 3.5µm Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min

Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3

B: Metanol

Flujo: 2 y 3 mL/min

Temperatura: 35°C Muestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam

2. Dipyradamole 3. Nifedipina

4. Lidoflazina 5. Flunarizina

EJEMPLO 1 - REDUCCIÓN TIEMPO ANÁLISIS: Reducir Tg Aumentando F

Al mantener TG x F = constante el perfil de la separación NO varía

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)

F = 2.0 mL/min

Tg = 3 min

3 min

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)

F = 3.0 mL/min

Tg = 2 min

2 min

Si K’ se mantiene constante el poder de separación no variará

Página: 18

Comparación Estrategias Mejora de la Resolución

k = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Columna: ZORBAX SB-C8

Gradiente: 20 – 60% B en 10 min o 60 min

Fase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2

B: Acetonitrilo

Flujo: 1.0 mL/min Temperatura: 35°C

Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine

5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor

Tg = 10 min

4.6 x 150 mm, 5 µm

N = 12,000

V0=1.5ml

15 min

1,2

3 4 5

6

7

8

0 5 10 15 Time (min)

• Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican ) 1

Tg = 60 min a 1mL/min 4

2

0 25 50 Time (min)

3

5

8

6

7 40 min

4.6 x 150 mm, 5 µm

N = 12,000

V0=1.5ml

Tradicional

• Reducir V0 y Subir Flujo 4.6 x 75 mm, 3.5 µm V0=0.75ml

N = 10,000

Tg = 15 min a 2mL/min

“Moderna”:

Si k se aumenta (↑Tg, ↑F, ↓V0) el poder de separación mejorará.

Página: 19

Time (min) 0 5 10

2

3

4 5

6 7

8

1

7 min

1x10/1.5= 6,7

2x15/0.75= 40

1x60/1.5= 40

¡¡¡Se reduce Tiempo análisis

a 1/6 pero se mantiene la

Separación !!!

¿Cómo mejorar?

Ejemplo de Reducciónde Tiempo SIN Cambiar de

Columna 5µm 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg

1mL/min 10 min Gradiente FxTg=10

1290 Infinity Cuaternario

Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8

Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en X min

Flujo: 1, 2, 3 y 4mL/min (pruebas respetando

Pmáx. columna: 400bars) 40ºC

Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y

dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm

o-terfenilo en metanol)

12min.


6min.

3mL/min 3.33min Gradiente FxTg=10

4min.

4mL/min 2.5 min Gradiente FxTg=10

3min.

Página: 20



Representación Normalizada en el Eje de Tiempo










12min.


6min.

3mL/min 3.33min Gradiente FxTg=10

4min.

4mL/min 2.5 min Gradiente FxTg=10

3min.

Página: 21



Representación Normalizada en el Eje de Tiempo









1mL/min 10 min Gradiente AZUL FxTg=10

2mL/min 5 min Gradiente ROJO

3mL/min 3.33 min Gradiente VERDE

4mL/min 10 min Gradiente FUCSIA

50% altura pico 0.006min 0.08% 0.012min 0.16%

10% altura pico 0.015min 0.19% 0.024min 0.29%

8min. F=1ml/min

8min. F=1ml/min

14mL/min

Δancho pico

0.018min

26% pk wd

0.24% Tr

14mL/min

Δancho pico

0.0398min

30% pk wd

0.48% Tr

Página: 22

Agenda

1. Fundamentos de la UHPLC:

• Ecuación de Van Deemter


a UHPLC?:



– Longitud y Tamaño Partícula.

– Nuevos tipos de columnas para

poder hacer UHPLC en HPLC's

convencionales (Poroshell).

– Diámetro

3. Conclusiones.

Página: 23

Selección de la Longitud Columna y Tamaño de Partícula del Relleno “versus” Eficacia

Longitud

(mm)

Eficacia

N(5 µm)

Eficacia

N(3.5 µm)

Eficacia

N(1.8 µm)

150 12,500 21,000 36.000

100 8,500 14,000 24,000

75 6000 10,500 18.000

50 4,200 7,000 12,000

30 2.500 4,200 6,500

15 1.250 2,100 2,500

Tiempo

Análisis*

-

- 33%

- 50%

- 67%

- 80%

- 90%

• La Eficacia aumenta con la reducción del tamaño de partícula ( N= f(L / 2dp) )

• El tiempo de análisis se reduce acortando la longitud de la columna. ( Tr = f(L / F) )

• Reduciendo Longitud y Tamaño de partícula, pero manteniendo flujo y nº platos proporcionados por la

columna, se conseguirá reducir el tiempo de análisis y consumo de disolvente sin perder Resolución.

* Reducción con respecto a una columna de 150 mm

+ Eficacia

(N)

+

Presión

- Tiempo

Análisis

- Volumen Pico

- Consumo Solvente

Página: 24

Recomendación: Columnas 5cm para gradientes ≤ 5min, 10cm para 5-30min, 15cm para > 30min

Viscosidad “versus” Composición Orgánico/Agua. En UHPLC se suele utilizar Acetonitrilo

Gradiente 10100%

Metanol

Tener en cuenta:

La alta viscosidad de las mezclas metanol/agua (máximo a 40/60)

3 3

η

0 20 40 60 80

1

2

1

2

Vis

cosid

ad

[cP]

a 20º C

100%

n-Propanol

Etanol

Metanol

Acetonitrilo

Perfiles de Presión con Gradientes Concentraciónº

Perfil de Concentración

Presión CH3-CN / H2O

Presión CH3OH / H2O

Este gráfico es útil para poder calcular relaciones

aproximadas de viscosidad entre distintas

composiciones de eluyentes y poder calcular

presiones equivalentes: p.e. 100 bars con CH3-CN/H20 70/30 equivalen a 100 x

(1.3/0.6) = 217 bars con CH3OH/H20 70/30

η ~ 0.6

η ~ 1.3

70/30 org. /agua

CH3OH

CH3CN

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

Bar 25 o C (355b)

80ºC (140bars)

% Orgánico[w/w]

50ºC (220bars)

ºC Posible Δ flujo con

respecto a 25ºC

50ºC x 1.6

80ºC x 2.5

Página: 25 + info en Anexo final

Traspaso de Métodos de H20/CH30H a H20/CH3CN. Composiciones Fase Móvil con Fuerza Eluotrópica

Equivalente

Acetonitrilo / Agua (da menor presión)

Metanol / Agua

Tetrahidrofurano / Agua

%MeOH %ACN %THF

20 15 10

40 30 25

60 50 38

80 72 53

100 98 72

%ACN %MeOH %THF

20 30 18

40 50 30

60 72 45

80 85 58

100 >100 72

%THF %MeOH %ACN

20 35 28

40 65 55

60 88 82

80 >100 >100

100 >100 >100

72%

53%

80%

En RRLC se recomienda trabajar con fases poco viscosas

Página: 26

Reducción del Tiempo de Análisis mediante Incremento de la Temperatura Ejemplo a Flujo Constante

Trabajar a temperaturas elevadas permitirá reducir considerablemente los tiempos de análisis y

en ocasiones cambiar la selectividad de la separación. la alta estabilidad térmica de las columnas

StableBond a pH’s ácidos: hasta 80ºC (90 para las SB-C18) amplían esta posibilidad.

Optimización

Método

Alta

Temperatura

Baja

Temperatura Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 75 mm, 5 μm Eluyente: 74% 7.4 mM hexano sulfonato y

0.07% ácido fosfórico

26% MeOH

Flujo: 1 mL/min (constante)

Detección: UV 280 nm

Muestras: Vitaminas B

min.

Acorta a 1/3 el

tiempo análisis

Cuando se trabaja a altas temperaturas se

recomienda enfriar el eluyente a la salida de la

columna antes de entrar en el detector (no hace

falta con MS). En los Agilent Series 1100 / 1200

utilizar el 2º intercambiador (el de 3µl) de los

T.C.C, o el específico del 1200-SL (1.5µl).

Cte Dieléctrica Agua: 20ºC=80 / 60ºC=67 / 90ºC=58

Metanol a 25ºC=33 Hexano a 20ºC=2

+ info en Anexo final

Agenda




a UHPLC?:




– Fase estacionaria y tipo de

columnas.

– Diámetro

3. Conclusiones.

Página: 28

Selección Fase Estacionaria (Relleno)

• Si es posible, mantener el mismo relleno que en

HPLC simplemente cambiando tamaño partícula

(p.e. Zorbax XX).

• Si NO se quiere revalidar de nuevo los métodos al

transferir HPLCUHPLC, la limitación en la reducción

de tamaño de partícula en métodos validados obliga a

pasar de rellenos 5µm (TP) a 2.7µm (SP) cambio

fase.

• Con HPLC convencionales (400 bars) utilizar rellenos

SP de 2.7µm

Página: 29

• Para 1.8μm utilice las Zorbax de 600-1200bars. Además reducen la

presión de trabajo en >20%, gracias a la distribución del tamaño de

partícula ingeniada por Agilent.

• Utilice el mismo tipo de Zorbax: muy fácil

escalabilidad debido a la idéntica selectividad

de Zorbax - independiente del tamaño de

partícula (5, 3.5,1.8µm) y dimensiones de la columna.

• Zorbax Eclipse Plus / XDB para separaciones a pH’s intermedios y

traspaso de columnas de otros fabricantes (excepto a pH’s extremos).

• Zorbax Stablebond (SB) para separaciones a pH muy ácidos (hasta pH

0.8) y/o a Alta Temperatura hasta 90° C (100ºC).

• Zorbax Extended para separaciones a pH básicos (hasta pH 11.5)

• Excelente tiempo de vida y resistentes a las más altas presiones

gracias a la alta resistencia mecánica de las partículas ZORBAX (+1300 b) .

Selección del Tipo de Fase Estacionaria con

Columnas ZORBAX 1.8µm


Tabla de Similitud* de Fases Recomendadas para el

Traspaso de métodos a RRLC con Zorbax 1.8µm ó 2.7µm.

Ace C18, Develosil-ODS-HG,Develosil-ODS-MG, Develosil-

ODS-UG, Hichrom C18, Hichrom RPB, Hypersil HyPURITY

C18, Inertsil ODS, Inertsil ODS2, Luna 5 C18(2), Nucleosil

C18 HD, Prodigy ODS2, Symmetry C18, Xterra MS C18,

YMC ODS A, YMC ODS AM, YMC Pro C18

ECLIPSE PLUS o XDB

(C18 o C8 según el caso)

Poroshell 120 EC (C18 o C8)

Cosmosil C18-AR, Exsil ODS, Hypersil BDS C18,

LiChrosorb RP-18, Novapak C18, Nucleosil C18AB, Partisil

ODS3, Resolve C18, Synchropak CR101, TSK ODS-120T,

TSK ODS-80TM, u-Bondapak C18, Ultrasphere ODS,

Vydac 218MS, Vydac 218TP,Vydac Selectapore 300M,

Vydac Selectapore 300P, Vydac Selectapore 90M, Waters

Spherisorb ODS1, Waters Spherisorb ODS2, Waters

Spherisorb ODSB, YMC J'Sphere ODS M80

STABLEBOND (SB)

(SB-C18 o C8 según el caso)

Poroshell 120 SB C18

Genesis C18, Inertsil ODS3, Kromasil C18, Prodigy ODS3,

Purospher RP18-e

EXTENDED o XDB

(C18 o C8 según el caso)

*Sugerencia de columna a probar en primer lugar, por su mayor similitud. Obviamente pueden

haber diferencias de selectividad. La mejor dependerá de los analitos a separar.


Ejemplo Comparativo

min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

mAU

-2

0

2

4

6

8

10

DAD1 B, Sig=275,8 Ref=400,80 (ACECLO070918\004-0301.D)

0.0

07

0.9

10 0

.964

1.0

33

1.4

29

1.5

16

1.6

73

1.67 min

20.2 min

Symmetry C18 5 μm 250 x 4.6 mm;

Gradiente 1ml/min

Zorbax Eclipse Plus C18 1.8 μm 50 x 4.6 mm;

Gradiente 3.4 ml/min

500bars- 50ºC

Agilent 1200 RRLC

1.67 2.4min a 25ºC y

2.4ml/min -500 bars

¿Tipo de Columna: Superficial o Totalmente Porosas?

Superficial Totalmente Porosa

Poroshell-120 reduce 40-50% de presión con similar resolución

2.7µm (capa porosa: 0,5µm)

1.8µm

Ventajas Poroshell 120:

• Reducir la presión para aumentar el flujo.

Importante con HPLC de 400 bars

• Mejorar la resolución en Métodos USP

con 5µm (2.7µm <50% en disminución

del tamaño de partícula).

• Robustez: fritas 2µm (en lugar de 0.5µm de las de 1.8µm)

Ventajas 1.8µm Totalmente Porosas:

• Mayor surtido de fases.

• Zorbax 1.8-3.5-5µm con idéntica

selectividad.

• 10-20% más eficacia/cm.

Página: 33

Poroshell -120

+ info en Anexo final

Comparación Eficacia Partículas Superficial

“versus” Totalmente Porosas (SP vs TP)

Poroshell 120 proporciona:

• Eficacia muy similar* (>80-90%.) a partículas 1.8µm totalmente porosas.

• Curva de Van Deemter plana en un amplio rango de flujos.

• Su mayor permeabilidad le permite trabajar a flujos más elevados.

* También su capacidad de carga

Poroshell -120

Mínimo flujo recomendado (columna 4.6mm d.i.) ↓P↑F


Muestra de tranquilizantes

Columna: Porosa superficial

Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um

Flujo 3.5ml/min, ~ 700 bar Gradiente 2-92% ACN en 0.4min

T= 80 °C

0.095sec PW

0.140secPW

Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de

separación con todo tipo y marcas de columnas

Columnas Superficialmente Porosas:

permiten muy elevadas velocidades lineales

con elevada resolución y menor presión

0.5 s

Núcleo

Sólido

1.7um

} 0.5µm

2.7µm


1.8µm Eclipse Plus C18 vs. Poroshell 120 EC-C18

Análisis de 17 Aminoácidos con 1290 Infinity

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

Poroshell 120 EC-C18

3.0 x 100mm, 2.7um

Pmax=331 bar

F=0.86 mL/min

RRHT Eclipse Plus C18

3.0 x 100mm, 1.8um

Pmax=474 bar (Porosh.+43%)

F=0.86 mL/min

RRHD Eclipse Plus C18

3.0 x 100mm, 1.8um

Pmax=528 bar (HT+11%)

F=0.86 mL/min

Rs6,5=1.98

Rs6,5=2.28

Rs6,5=2.90

Rs14,13=1.81

Rs14,13=2.34

Rs14,13=1.81

W½ 9 =0.043 min.

W½ 9 =0.036 min.

W½ 9 =0.045 min.

Selectividad Poroshell 120 EC-C18 ~ Eclipse Plus C18 (o Eclipse XDB)

Pmáx.=1200bars

Pmáx.=600bars

Pmáx.=600bars


Tipos Instrumentos y Columnas UHPLC

Tipos Instrumentos UHPLC

• Presión máx.≈ 1000-1200 bars y Flujo máx. 5 – 10 mL/min. (Fluj. elev.todo tipo columnas)

• Presión máx.≈ 1000-1200 bars y Flujo máx. 1 -2 mL/min (Fluj. elev. columnas 2-3mm d.i.)

• Presión máx.≈ 600 bars y Flujo máx. 5 – 10 mL/min (Fluj. elev. Columnas SP)

Tipos Columnas UHPLC

• Totalmente porosas <2µm (1.7, 1.8, 1.9µm). USP 50% 5µm = 1.75µm

- Zorbax ofrece distribución asimétrica del tamaño de partícula reduce la presión en un 20-30%

- Zorbax ofrece la misma selectividad independientemente del tamaño de partícula: 1,8, 3.5 y 5µm.

• Superficialmente porosas 2.7µm (efectivo 0.5µm). reduce presión en un 40-50%

• Diámetros: 2.1 a 4.6 mm. 0,6mL/min en d.i. 2.1 3mL/min en d.i. 4.6mm

UHPLC’s que permitan llegar a 5 mL/min permitirán obtener todo el rendimiento

de las columnas Superficialmente Porosas y de columnas con 4.6mm d.i.

Con Columnas UHPLC el trabajar a flujos elevados permitirá mejorar

la capacidad de separación en gradientes

El flujo máximo es un parámetro clave en un UHPLC

Superficialmente

porosas

Página: 37

NO es imprescindible un cromatógrafo de Alta

Presión (600-1200bars) para trabajar en UHPLC

Tipo

Cromatógrafo

(Presión Máxima)

“Máxima” Longitud Columna*

1.8µm (TP)** Poroshell-120 2.7µm (SP)**

400 (“HPLC”) 5 (10) cm 10 (15) cm

600 (“UHPLC”) 10 (15) cm 15 (20) cm

1200 (“UHPLC”) 25 (30) cm 35 (40) cm

* En UHPLC suele utilizarse acetonitrilo; el utilizar metanol reducirá los flujos máximos de trabajo (especialmente con

contenidos de agua alrededor del 60% ).

** TP: Totalmente Porosa *** SP: Superficialmente Porosa; las columnas SP permiten utilizar columnas entre un 40 y

60% más largas que las TP (o trabajar a flujos mayores).

Equivalencia Eficacia columnas UHPLC

(1.8µm TP/ 2.7µm SP)

Columnas HPLC

5µm

5 cm 15 cm

10 cm 30 cm

25 cm 75 cm

+ info en Anexo final Página: 38

Agenda




a UHPLC?:




– Nuevos tipos de columnas para

poder hacer UHPLC en HPLC's

convencionales (Poroshell).

– Diámetro

3. Conclusiones.

Página: 39

¿Qué Diámetro de Columna Utilizar?: ¿d.i. (mm): 2.1, 3, 4.6?: Mantener la del método validado.

• Recomendación LC/MS: 2.1mm con Electrospray (óptimo 0.5-0.8mL/min) //

3-4.6mm con APCI (/APPI con dopante): óptimo ~ 1.5mL/min (actúa como detector que

responde a la cantidad absoluta de analito mejor inyectar cantidades lo mayores posible).

• Recomendación LC/DAD/UV/FLD/…. : 2.1- 3 - 4.6mm.

• El flujo debe ser proporcional a la sección de la columna utilizada.

• Al reducirse el diámetro se reducirá el flujo de trabajo (para mantener la misma

velocidad lineal dentro de la columna).

• 3mL/min en 4.6mm d.i. ~ 1.26mL/min en 3.0mm ~ 0.6mL/min en 2.1mm

• Reducir el diámetro permite reducir consumo de disolvente y si se inyecta la misma cantidad

absoluta de muestra, ganar sensibilidad pero:

• Se debe de inyectar menor volumen/cantidad de muestra para:

• NO sobrecargar la columna de analito (pérdida de resolución por saturación

columna).

• NO deformar el perfil del pico por un exceso de poder de elución del volumne (p.e.

en fase reversa disolver la muestra en solvente orgánico)

• Se debe reducir los volúmenes del sistema: bombas, capilares, celdas de detección,…. (a 1/5 al pasar de d.i. 4.6mm a 2.1 mm)

Página: 40

Influencia Volumen de Dispersión en la Eficacia

Flujos ajustados al d.i. de la columna:

4.6 mm columna 1 mL/min

3 mm columna 0.43 mL/min

2.1 mm columna 0.21 mL/min

Ejemplo para compuesto con K’=4

Columna:

50 mm long.

1.8 µm tam. part.

Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 x V0 columna <0.1x V pico

d.i. mm capilar V0 µL/cm.

0.17 mm 0.227 µL/cm

0.12 mm ** 0.113 µL/cm

0.05 (sílice fundida) 0.020 µL/cm

0.025 (sílice fundida) 0.00467 µL/cm

*

* Volumen dispersivo: el que recorre la muestra fuera de la columna ** 0.12mm recomendado para columnas de 2-3mm d.i.

Página: 41

Típico 60 cm capilar 0.12mm = 7µL + X µL celda + Y µL vol. Inyectado total > 10µL

Requerirá

HP

LC

’s

adecuados

Selección D.I. de Columna según Sistema de Bombeo Mejora de la Sensibilidad y Consumo Disolvente con la Reducción del D.I.

MS con Nano-Electrospray o

HPLC-Chip Cube

Nano LC 100 µm

75 µm

50 µm

500 nl/min

250 nl/min

100 nl/min

Micro LC 1 mm

800 µm

40 µl/min

20 µl/min

LC Capilar 300 µm

180 µm

4 µl/min

2 µl/min

LC Estándar 4.6 mm

2.1 mm

1000 µl/min

200 µl/min

Flujo típico

D.I. Columna Ganancia Teórica

en Sensibilidad UV

~ 1

~ 5

~ 20

~ 30

~ 200

~ 600

~ 2000

~ 3500

~ 8500

• Celdas DAD / MWD:

x10

x200

Muy utilizadas en ESI

LC Estándar 4.6 mm

2.1 mm

1000 µl/min

200 µl/min

CUATERNARIA*

Mezcla a baja presión

Na

no-1

200

1

20

0 C

ap

ilar

UV

/ VIS

• Standard: 13µl y 10mm, 120bar típica para columnas D.I.: 3 - 4.6 mm

• Semi-Micro: 5µl y 6mm, 120bar para columnas D.I.: 2.1 - 3 mm

• Micro - Alta Presión: 1.7µl y 6mm columnas D.I ≥ 1 mm

• Semi-Nano: 500nl y 1cm para columnas DI > 1mm

• Nano: 80nl y 6mm para columnas DI >= 180-300µm.

Con columnas cortas de 1.8µm y flujos elevados

se deberá reducir el volumen de la celda

BINARIA

Mezcla alta presión

LC

/MS

D.I. Diámetro de referencia (D.I.): 4.6mm

Sensibilidad Consumo Disolvente Vo columna

2.1 mm x 5 1/5 (-80%) 1/5 (-80%)

3 mm x 2.35 1/2.35.(-57%) 1/2.35.(-57%)

↓ d.i. columna ↓ Vmuertos que recorre la muestra (d.i. capilares,

volumen de la celda de detección,…)

Página: 42

*1290 cuaternario permite

también 2.1mm d.i.

???

Aumento Tiempo de Retardo del Gradiente

0 min 0 min

Reducir flujo (/d.i. columna) gradiente tardará más en llegar a la columna:

• se deberá reducir volumen barrido por el gradiente

en inyector y bomba.

Página: 43

d.i.: 4.6mm d.i.: 2.1mm

Configuración del Volumen de Retardo del Gradiente de Concentración

• El volumen de retardo se recomienda no sea superior al Vo de la columna

utilizada (como valor orientativo).

• Con columnas de D.I. 2.1mm (usuales en LC/MS con ESI) o columnas cortas de

1.8µm se recomienda utilizar un sistema con mezclado en alta presión (bombas

binarias) o 1290 cuaternarias.

• Con columnas largas de 1.8µm o flujos muy elevados se requerirá sistemas de

bombeo de alta presión como el Agilent 1200-RRLC (SL), 1220, 1260 y 1290 infinity.

Gradientes con Mezclado a Alta

Presión

Menor volumen de retardo – Configurable

120-800µL (1100,1200,1260) // 10-45µL (1290)

Bombas binarias 1100, 1200, 1260 y 1290

Gradientes con Mezclado a Baja Presión

(en válvula proporcional)

Válvula proporcional

Mayor volumen de retardo – NO configurable 600-900µL / (<350 1290 cuaternario)

Bombas cuaternarias 1100,1200, 1220, 1260 y 1290

Página: 44

sólo 1220/1260

*Ambos 1290 NO llevan “Damper” Amortiguador /Damper (sólo 1260)

Bomba Binaria Serie 1200-RRLC: Muy Fácil Cambio

de Configuración

Configuración 1:

Volumen de retardo

estándar (mixer 400µL)

Retardo: 600-800µl

Retardo con “Mixer”

200µL*: 400-600µl

B A

600bar Amortiguador

200 o 400µl

Mezclador

600 bars Sensor

Presión

Válvula Purga

Configs. 1 2: ¡Desconectar sólo estos punto!

Configuración 2: Bajo volumen de retardo

Retardo: 120µl

¡Conectar sólo este punto!

B A

Sensor

Presión

Válvula Purga

600bar Damper

400µl Mixer

Sensor Presión

Válvula Purga

Inicio Mezcla: T

Recorrido del Flujo

T

T

Incorpora “amortiguador electrónico” de pulsaciones

Sensor Presión

Válvula Purga

Inicio Mezcla: T

Amortiguador

Mezclador 400 o 200µl

*Solvent mixer, 200 µl (600bars) ref.: 5067-1565

Página: 45

Reducción Volumen de Retardo del Gradiente con

Bombas Binarias*: 1100/1200/ 1220/1260 “versus” 1290

Infinity

1220/60 Series

Channel A

Passive Damper

0 - 300 µl

Passive Mixer

400 µl (opcional 200)

1220/60 Series

Channel B

1290 Inifinity

Chanel A

1290 Inifinity

Chanel B

Very Low Noise

~ 600-800 µl

+ = Active Damping

10µl

Jet Weaver Mixer

35µl

Delay Volume

• 10µl / 45µl

• 80x / 20x lower

1290 Infinity

Página: 46

* En bombas con mezclado en baja presión sin mezclador (cuaternarias) el volumen de retardo NO se puede reducir.

Agilent 1200 Series HP Autosampler SL

Delay Volume Reduction and Overlapped Injections

Main Pass Bypass

Simultaneous Speed and Carry Over optimization by

• Simple “one-valve“ flow-through design

• Automatic delay volume reduction (6ul)

• Overlapped injection

• Programmable sample flush-out time

• External needle wash

• Minimized Carry Over by additional valve

switches

Permitirá reducir el volumen de retardo del gradiente, al

colocar la válvula en posición de “Bypass” cuando la

muestra ha salido del inyector (“Sample Flush-Out Factor”)

Página: 47

Problema: Reproducción de Analisis en Gradiente con

diferentes HPLC´s: - Impacto del volumen muerto y de la calidad de

la mezcla. Columna: 3 x 50 mm, 2.7 µm Poroshell

min 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Rs= 1.90 1100 Series Binary LC

1290 Infinity LC - El gradiente llega antes

Rs= 1.15

Me

tam

itro

n

Chlo

rid

azo

ne

Sim

azin

e

Chlo

rtolu

ron

Diu

ron

Pro

pa

zin

e

Te

rbu

tyla

zin

e

Pro

me

tryn

Cya

niz

ine

1290 Infinity LC

with iSET

Rs= 1.87

Página: 48

June 26, 2013

Confidentiality Label 49

Emulación de “cualquier” HPLC/UHPLC con el

1290 y la nueva tecnología ISET.

ISET: Tecnología de Emulación Inteligente - Como trabaja (1290 con un 1200)

Programa de gradiente

1290 gradiente

1200 gradiente

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

0

50

100

150

200

250

300

350

400

min

mAU

Inyecctión

Mismas condiciones de gradiente

pero desplazando el gradiente y

emulando el perfil del gradiente a

clonar

+ info en Anexo final Página: 50

Agenda

1. Introducción


a UHPLC?:






– Diámetro

3. Conclusiones.


Página: 51

Resumen Traspaso de Métodos a UHPLC/RRLC

• Reducir Tiempo Análisis sin perder Resolución:

– Reducir tamaño de partícula y longitud de la columna pero manteniendo constante nº platos columna (15cm x 5µm = 10cm x 3.5µm = 5cm x 1.8µm).

– Las columnas TP de 1.8µm o SP de 2.7µm permiten trabajar a flujos elevados para reducir tiempo de análisis y mejorar resolución en gradientes.

• Maximizar la Resolución:

– Sin aumentar tiempo de análisis: Reducir tamaño de partícula y mantener la longitud de la columna (p.e. 150mm x 1.8µm).

– Aumentado tiempo de análisis: acoplar varias columnas en serie de 5µm requieren un equipo de alta presión como el Agilent 1200-RRLC (SL).

• Columnas Poroshell 120 (superficialmente porosas):

– Le permiten trabajar en UHPLC con HPLC’s convencionales.

– Poder trabajar a mayores flujos para:

• reducir sus tiempos de análisis.

• incrementar la capacidad de separación y resolución en gradiente.

Página: 52

Capacidad de separación en gradientes proporcional a F x Tg / V0 Trabajar a flujos elevados permite mejorar la capacidad de separación en gradientes de concentración

1200 Infinity Method Translator http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe

para descargárselo (6Mb – requiere Flash Player).

Página: 53

http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe

Agilent 1290 Infinity LC

Muchas

Gracias

por su

Atención

Estamos a su disposición en

tel.: 901.11.6890 [email protected]

[email protected] www.agilent.com/chem




¿Preguntas?

Agenda

1. Introducción


a UHPLC?:






– Diámetro

3. Conclusiones.


Página: 56

Columnas Poroshell-120 (600bars) 9 Fases: EC-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), Phenyl (USP L11), SB-

CN (USP L10), SB-Aq, SB-bonus RP, HILIC. 3 Diámetros y 6 Longitudes

Info 2013

Página 57

Especificaciones Columnas Poroshell-120 9 Fases: EC-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), Phenyl (USP L11),

SB-CN (USP L10), SB-Aq, SB-bonus RP, HILIC.

Info 2013

Página 58

13 Fases: Eclipse Plus C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Eclipse XDB-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Extend-

C18 (USP L1), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), SB-Phenyl (USP L11), SB-CN (USP L10), SB-Aq, Rx-SIL

(USP L3), Bonus-RP (USP L60), Eclipse PAH (USP L1)

Página 59

La Mayor Flexibilidad: Especificaciones 17 Fases Diferentes RRHD de 1.8 μm y 1200bars para Cualquier Aplicación

La Mayor Flexibilidad: + 120 Columnas Diferentes RRHT de 1.8 μ y 600bars para Cualquier Aplicación

1.0

2.1

3.0

4.6

ID’s

Longitudes: 20,30, 50, 100 y 150mm nº Fases: 10

Con igual selectividad que los rellenos de 3.5 y 5µm

La Mayor Flexibilidad: + 120 Columnas Diferentes RRHT de 1.8 μ y 600bars para Cualquier Aplicación

13 Fases: Eclipse Plus C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Eclipse XDB-C18 (USP L1) y C8

(USP L7), Extend-C18 (USP L1), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), SB-Phenyl (USP L11),

SB-CN (USP L10), SB-Aq, Rx-SIL (USP L3), Bonus-RP (USP L60), Eclipse PAH (USP L1)

Designaciones USP

Página 62

Designaciones USP

Página 63

Designaciones USP

Página 64

Designaciones USP

Página 65

“Workshop” 1200-RRLC: Conversión de

Métodos de HPLC Convencional a

Cromatografía de Resolución Rápida

Página 66

Flujo (mL/min)

Reducción de la Presión de Trabajo mediante la Optimización de la Distribución del Tamaño de Partícula con Nuevos Rellenos Zorbax de 1.8m

0

50

100

150

200

250

300

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

Pre

sión (B

ars

)

+25% MÁS de

Presión a (2.0

mL/min)

Rellenos 1.8m standard

Nuevos Rellenos 1.8m

Distribución Optimizada

Columnas: ZORBAX SB-C18

Dimensiones: 4.6 x 30mm, 1.8 m

Eluyenty: 85:15 ACN:Agua

Flujos: 0.05 – 5.0 mL/min

Temp: 20°C

Muestra: 1.0L Octanofenona en Eluyente

Detección: UV 245nm

Presión Sistema (1100 sin Columna)

Manteniendo la eficacia, las nuevas columnas Zorbax de 1.8µm

reducen la presión en + 20% y permiten trabajar hasta 600bares

“Workshop” 1200-RRLC: Conversión de

Métodos de HPLC Convencional a

Cromatografía de Resolución Rápida

Página 67

600 bar

5μm 3.5μm

2.3 2.1

1.8μm

0

100

200

300

400

500

600

700

800

400 bar

Presión “versus”: Diámetro Partícula y Longitud de Columna

Presión 1/(dp)2

700-800

600-700

500-600

400-500

300-400

200-300

100-200

0-100

Presión (bars)

Longitud Columna (mm) Diámetro Partícula (µm)

1 mL/min H2O/CH3CN 50/50* Temp.: 25°C

Calculado en base Agilent 1100 y columnas

Zorbax 4.6mmx1.8μm con tecnología de

400bars

15cm 3.5μm

10cm

5cm

1.8μm

400bars

600bars

200bars

25cm

5μm

* Viscosidad 10-15% inferior a la del agua J

-35%

-55%

-65%

Reducción viscosidad

Página 68

Efecto del Incremento de la Temperatura en la

Viscosidad del Eluyente y Presión de Trabajo

• La viscosidad se reduce con

respecto a 25ºC:

• a 80ºC: entre un 35 y

65%.

• a 60ºC: entre un 25-

50%.

• Flujo ↑ x 1.5-3)

• ∆P = f (η . u . L / dp2)

Subir temperatura permite trabajar a mayores flujos

Página: 69

1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Modelo

UHPLC

Pres. Máx

bars

“Máxima” Longitud

Columna UHPLC cm Rango d.i.

Columna mm

“Delay

Volume”

Bomba

µL

Flujo

máx. mL/min

1.8µm (TP)** Poroshell-120 2.7µm (SP)**

1220 binario

1260 cuaternario 600 10 (15) cm 15 (20) 3-4.6 (16) 600-900 10

1260 binario 600 10 (15) cm 15 (20) 2.1-4.6 (8) 120 /600-800 5

1290 cuaternario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (16) <350 10

1290 binario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (8) 10 / 45 5

¿Qué UHPLC Agilent se Adapta Mejor a Sus

Necesidades/ Presupuesto?

+

-

Coste

• La selección del cromatógrafo depende del

diámetro y longitud de las columnas de UHPLC

que se quieran utilizar. • Algunos UHPLC’s del mercado están limitados a un flujo

máximo de 1-2mL/min NO permitirá trabajar con

columnas de d.i. 4.6mm a velocidades lineales/flujos

elevados.

Bomba Binaria Series 1200/1100*- Configuraciones *excepto modelo 1200-SL

Configuración 1: Volumen de retardo estándar

Retardo: 600-900µl

Sensor Presión

Válvula Purga

Inicio Mezcla: T

Amortiguador

400µl Mezclador

Configs. 1 2: Desconectar sólo estos puntos!

Recorrido del Flujo

B A

400bar Amortiguador

+Sensor Presión

400µl

Mezclador

Sensor

Presión

Válvula Purga

T

Sensor Presión

Válvula Purga

Inicio Mezcla: T

Amortiguador

80µl filtro

Configs. 2 3: Desconectar sólo estos puntos!

Recorrido del Flujo

B A

Configuración 2: Volumen de retardo medio**

Retardo: 300-600µl**

400bar Amortiguador

+Sensor Presión

80µl

Filtro en

Línea (400 bars) Sensor

Presión

Válvula Purga

T

** Al eliminarse el mezclador el ruido

de mezcla puede aumentar

Página: 70

Bomba Binaria Series 1200/1100- Configuraciones *excepto modelo 1200-SL

Configuración 3: Volumen de retardo medio*

Retardo: 200-500µl

** Al eliminarse el mezclador el ruido

de mezcla puede aumentar

Inicio Mezcla: T

Válvula Purga

Amortiguador +

Sensor Presión

Configuración 4: Volumen de retardo muy bajo**

Retardo: < 200µl

B A

400bar Amortiguador

+Sensor Presión Sensor

Presión

Válvula Purga

400µl

Mezclador

T

Amortiguador +

Sensor Presión

Válvula Purga

Inicio Mezcla: T

B A

400bar Amortiguador

+Sensor Presión Sensor

Presión

Válvula Purga

400µl

Mezclador

T

Recorrido del Flujo

Página: 71

Soluciones 1290 Infinity LC - 2000 muestras/día usando ACR (Reg. Aut. de Columna)

• Análisis y Regeneración de columna

simultáneos con válvula de 2

posiciones / 10 puertos

• Tiempos de ciclo más cortos y mayor

capacidad de análisis de muestras para

laboratorios de HT y desarrollo de

métodos

• Respuestas más rápidas en los

controles de calidad durante la fase de

producción o de liberación de producto

acabado

Adaptación HPLC: Mínimizar los Volúmenes Extra-

Columna en Función su Tamaño: Capilares de Conexión

Columna Vol. Col. Flujo tip. Vol. pico

d.i. mm L, mm V0 µl µl/min µl @k'=3

4.6

2.1

1

0.5

0.3

0.075

150 1329 1400 667

150 417 292 139

150 94 66 31

150 23.6 17 7.9

150 8.5 6.0 2.8

150 0.53 0.37 0.18

Capilar de 0,17 mm de d.i. x 150 mm = 3,4 µl de vol. interno

Capilar de 0,12 mm de d.i. x 150 mm = 1,7 µl de vol. interno

Capilar de 0,05 mm de d.i. x sílice fundida 150 mm = 0,3 µl vol

Capilar de 0,025 mm de d.i. x sílice fundida 150 mm = 0,07 µl vol

Re

qu

iere

n in

str

um

en

tos

es

pe

cíf

icam

en

te d

ise

ña

do

s

máx. D.I. cap. 0.17

0.12

0.075 0.05

0.025

(0.025)

Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 X V0 columna <0.1 x V pico

Reducción Volúmenes Extra-Columna: Celdas Detección

y Volumen de Retardo con Gradientes de Concentración

Celdas de Detección DAD & MWD: (opciones parecidas con VWD)

Standard: 13µl, 10mm, 120bar típica para columnas D.I.: 3 - 4.6 mm

Semi-Micro: 5µl, 6mm, 120bar típica para columnas D.I.: 2.1 - 3 mm

Micro: 2µl, 3mm, 120bar típica para columnas D.I.: 1 – 2.1 mm

Alta Presión 1.7µl, 6mm, 400bar típica para MS y columnas D.I ≥ 1 mm

Semi-Nano: 500nl, 10mm, 50bar típica para columnas D.I.: 0.5 –1 mm

Nano: 80nl, 6mm, 50bar típica para columnas D.I.: 0.18 –0.5mm

Preparativas: 3mm, 120bar / 0.3mm, 20bar / 0.06mm, 20bar

Con columnas cortas de 1.8µm y flujos elevados

se deberá reducir el volumen de la celda

Adaptación HPLC: Cromatogramas < 1min pueden

Requerir Frecuencias de Adquisición Superiores a 20Hz: Detectores DAD-SL y MWD-SL pueden adquirir hasta a 80Hz para picos de

tan sólo 0.15 segundos de ancho

Para picos con PW (peakwidth al 50% de su altura)

> 0.01min (0.6seg) el DAD standard a 20Hz es suficiente

min 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0

80Hz

PW=0.30sec

40Hz

PW=0.33sec

20Hz

PW=0.42sec

10Hz

PW=0.67sec

5Hz PW=1.24sec

DAD standard

20Hz

Agilent SL Fast DAD

RSD%<1% 15 ptos./pico

1<RSD%<3% 12 ptos./pico

RSD% 10-12% 8 ptos./pico

Muestra: Mezcla de Fenonas

Columna: Zorbax SB-C18, 4.6x30, 1.8um Gradiente: 50-100% ACN en 0.3min

Celda det.: 5ul

24pts.

80 pts.

12pts.

40 pts.

6pts.

20 pts.

Frec.

Adq..

Ancho pico Resolución Capacidad

sep. picos

80 Hz 0.300 2.25 60

40 Hz 0.329 2.05 55

20 Hz 0.416 1.71 45

10 Hz 0.666 1.17 29

5 Hz 1.236 0.67 16

Configuración para Inyección “Grandes

Volúmenes”

Bomba Gradientes Detector

Columna Inyector

Configuración con Inyección Directa*: según las condiciones

utilizadas el volumen de inyección está limitado por las dimensiones de la columna*

Válvulas controladas por Agilent LC-1200/1100

Configuración con Columna Concentradora

Bomba de

Carga Isocrática

Pre-Columna

Concen-

tradora en válvula 2

posiciones

Desecho

Bomba

Gradientes

Inyector

Columna Separadora Detector

Carga (p.e. 2 min)

Análisis

Requiere 2 bombas

Concentración

Permitirá la inyección de grandes

volúmenes. La elución de la columna

concentradora se realiza en sentido contrario

a su sentido de carga

* Volumen típico de inyección 1-2 (5) % del V0 de la columna utilizada. V0(col. 100 x 4.6mm) =1.0ml

Posibilidades 1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario Prestaciones UHPLC para TODOS LOS LABORATORIOS:

Resolución optimizada

3x100mm, 1.8µm

Resolución pico 5 = 7.16

Tiempo análisis: 7 min

Velocidad y Resolución optimizadas

3x50mm, 1.8µm


Tiempo análisis: 1.1min

Convencional

4.6x150, 5µm


Tiempo análisis: 11 min

min 0 2 4 6 8 10

min 0 2 4 6 8 10

min 0 2 4 6 8 10

10 x PRODUCTIVIDAD mayor nº de datos y de mejor calidad!

Página: 77

600 bars

Posibilidades 1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario 100% Compatibilidad con Métodos HPLC

Reemplazo Sin Riesgo

1260/1220 Infinity LC

Sistema Cuaternario

1100/1200 Series

Sistema Cuaternario

Columna: 4.6 x 150mm, 5µm

Gradiente: 0 min 20 % B

10min 95 %

Flujo: 1 mL/min

min 0 2 4 6 8 10

Ejecute sus actuales métodos de HPLC y obtenga los mismos resultados

Página: 78

1100/1200 Binarios serían remplazados por 1260 Binario o 1290+ISET

600 bars

Problema: Reproducción de Analisis en

Gradiente con diferentes HPLC´s: - Impacto del

volumen muerto y de la calidad de la mezcla

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

DAD1 B, Sig=275,4 Ref=400,40 (B:\RIC\AGI...RIC DATA\1 PHARMA METOCLOPRAMIDE\WAD PHARMA\XBRIDGE-2000004.D) 2

.747

3.0

49

8.1

21

8.3

23

8.7

47 8

.930

9.5

45

9.9

75

12.

005

12.

215

12.

393

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000001.D)

2.7

44 2

.884

6.0

88

6.3

28

6.6

73

6.8

72

7.4

80

7.9

23 9.9

37

10.

249

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000003.D)

2.8

87

3.3

20

8.5

38

8.7

44

9.1

59 9

.325

9.9

51

10.

379

12.

395

12.

630

12.

763

1200 Series LC Bomba Cuaternaria

1290 Infinity bomba Binaria

Sample: 0.5% impurities in formulation

(metoclopramide)

Xbridge C18, 150x3 mm, 3.5 µm dp,

0.45 ml/min, Eluent: A =0 .25 % AmAc, B = ACN,

Gradient: 0-15 min; 5-57 % B

El resultado:

• Diferencias en los RT y resolución

• ¡Se juntan 2 picos!

Página: 79

June 26, 2013

Confidentiality Label 80

Emulación de “cualquier” HPLC/UHPLC con el

1290 y la nueva tecnología ISET.

Pesticidas: Ejemplo Emulación 1100 con ISET Columna: 3 x 50 mm, 2.7 µm Poroshell

min 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Rs= 1.90 1100 Series Binary LC

1290 Infinity LC - El gradiente llega antes

Rs= 1.15

Me

tam

itro

n

Chlo

rid

azo

ne

Sim

azin

e

Chlo

rtolu

ron

Diu

ron

Pro

pa

zin

e

Te

rbu

tyla

zin

e

Pro

me

tryn

Cya

niz

ine

1290 Infinity LC

with iSET

Rs= 1.87

Intelligent System Emulation Technology

ISET: - Cómo programarlo?

Select pump

Select autosampler

• Agilent 1100

• Agilent 1200

• Agilent 1220

• Agilent 1260

• Agilent 1290

• Waters Alliance

• …

Tecnología de Emulación Inteligente - Como trabaja (1290 con un 1200)

Programa de gradiente

1290 gradiente

1200 gradiente

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

0

50

100

150

200

250

300

350

400

min

mAU

Inyecctión

Mismas condiciones de gradiente

pero desplazando el gradiente y

emulando el perfil del gradiente a

clonar

Resumen Conclusiones Adicionales • Posibilidades Adicionales para Reducir Tiempo Análisis :

– Trabajar a temperaturas elevadas permitirá reducir el tiempo de análisis, trabajar a flujos más elevados y reducir la resistencia a la transferencia de masa (útil con rellenos de 5μm).

– Aumentar el flujo con gradientes de concentración permitirá reducir proporcionalmente el tiempo del gradiente manteniendo la separación.

– Reducir el Vo de la columna permitirá reducir proporcionalmente el tiempo del gradiente manteniendo el poder de separación (si FxTg/ V0 = cte).

• Requisitos de la Cromatografía Ultra-rápida:

– Requerirá reducir el volumen de los capilares de conexión y de las celdas de detección, y aumentar la frecuencia de adquisición de datos.

– Requerirá adecuar el volumen de retardo al flujo y dimensiones de la columna utilizada.

– Columnas de 2.1mm de D.I. requerirán un equipo con mezcla a alta presión y mínimo volumen de retardo (como las bombas 1290, 1260, 1200, 1100 binarias o 1290 cuaternaria)

• Requisitos de la Cromatografía de Alta-Resolución:

– Requerirá un equipo de alta presión como el Agilent 1220, 1260 o 1290 y columnas 150mm x 1.8µm, o acoplar varias columnas en serie de 250mm x 5µm.

La flexibilidad de la Serie Agilent 12X0-Infinity le permite trabajar en

óptimas condiciones con todo tipo de cromatografía

Agilent 1290 Infinity LC

Muchas

Gracias

por su

Atención




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