T.P Nº 8: Diseño de oligonucleótidos

Objetivo: Diseño de oligonucleótidos adecuados

para la amplificación mediante PCR de un

fragmento interno del gen rpoS en Ps. alcaligenes

Estrés: ayuno en nutrientes, pH ácido, alta osmolaridad

RpoS o S

Genes que confieren resistencia al estrés, genes involucrados en re-arreglos morfológicos y genes que provocan cambios en el metabolismo celular

RpoS

Procedimiento

1) En base de datos de secuencias proteicas buscar secuencias correspondientes a RpoS de Pseudomonas.

2) Elegir 4 de estas secuencias y armar con ellas un archivo en formato FASTA

3) Buscar las regiones de homología utilizando el ClustalW

ClustalW

Procedimiento

4) Elegir regiones de homología situadas a una distancia adecuada (50 aa = 150 nucleótidos)

5) Reconstruir la secuencia nucleotídica de los nucleótidos elegidos, teniendo en cuenta los diferentes codones para un mismo aminoácido y el uso de codones para P. alcaligenes

Ejemplo

1) Secuencia aminoacídica elegida

PDA(A o E)WDG

2) Reconstrucción de secuencia nucleotídica

  

 

A (Ala) R (Arg) N (Asn) D (Asp) C (Cys) Q (Gln) E (Glt)

GCAGCCGCGGCT

CGACGCCGGCGTAGAAGG

AACAAT

GACGAT

TGCTGT

CAACAG

GAAGAG

             

G (Gly) H (His) I (Ile) L (Leu) K (Lys) M (Met) F (Fen)

GGAGGCGGGGGT

CACCAT

ATAATCATT

CTACTCCTGCTTTTATTG

AAAAAG

ATG TTCTTT

             

P (Pro) S (Ser) T (Thr) W (Trp) Y (Tyr) V (Val)

CCACCCCCGCCT

TCATCCTCGTCTAGCAGT

ACAACCACGACT

TGG TACTAT

GTAGTCGTGGTT

           

Código genético

Codon usage para P oleovorans

AspGluGlyPheLeuSerTyrCysTrpLeuProHisGlnGATGAAGGTTTTCTTTCTTATTGTTGGCTTCCTCATCAA  C  G  C  CT CAGC  C  C   T C  C  C  G

         A     A  A           A  A          G     G  G           G  G 

Elegir la region de 18 a 21 nucleotidos menos “degenerada”

Un total de 32 oligonucleotidos se generan para dar lugar al peptido . TATTGTTGGCTTCC TACTGTTGGCTTCC TATTGCTGGCTTCC TACTGCTGGCTTCC

etc.  

Nucleótidos complementarios

C – GA - TB – VD - HK – MN - NR – YS – SW –W

Nucleótidos degenerados:

B = C ó G ó TD = A ó G ó TH = A ó C ó TK = G ó TM = A ó CN = A ó C ó G ó TR = A ó GS = G ó CV = A ó C ó G W = A ó TY = C ó T

Nomenclatura para nucleótidos degenerados

• Tamaño del oligonucleótido y del producto

• Temperatura de fusión (Tm)

• Especificidad

• Secuencias complementarias

• Contenido en G/C y cadenas de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A,

G)

• Secuencia 3’ terminal.

• Secuencia 5’ terminal y regiones centrales

Para diseñar primers

• Tamaño del oligonucleótido

18 a 24 bases

Temperatura de fusión (Tm)

Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

Tamaño del

Oligonucleótido

Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)

Tamaño del

Oligonucleótido

Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)

4 12°C 22 66°C

6 18°C 24 72°C 8 24°C 26 78°C

10 30°C 28 84°C 12 36°C 30 90°C

14 42°C 32 96°C 16 48°C 34 102°C

18 54°C 36 108°C 20 60°C 38 114°C

Tann: 5- 8 °C más baja que la de fusión

• Contenido en G/C

45% al 55% Ideal mezcla al azar un contenido en GC del 50% y ~ 20 bases (la Tm

estaría en el rango de 56°C – 62°C).

• Complementariedad

NO estructuras secundarias o

dímeros o doble cadena

• Secuencia 3’-terminal

CG Clamp • Secuencia 5’-terminal y

regiones centralesCG Clamp

Resumén de Criterios “positivos” para el diseño de primers

 

 Temperatura de fusión

(Tm)

TmForward = TmReverse Tm = 55-62ºCT hibridación ~ 5-8ºC menos que la

Tm

Tamaño del primer 12-30 b, óptimo 18 a 24 b

Distancia entre primers 10 b-10 kb

Contenido en G+C >= secuencia diana; ideal del 45% al 55%

“cepo GC” en 3’ termina en T; G o C en dos (máx.) de cinco últimas bases

“cepo GC” en 5’ incluir varias G o C en las últimas bases

Lugares de apareamiento de de primers

únicos  

Diseño de oligonucleótidos para Reacción en cadena de

la polimerasa (PCR)

Online

http://molbiol-tools.ca/PCR.htm

Diseño de oligonucleótidos para Reacción en cadena

de la polimerasa (PCR)

Uso del programa DNAMAN