TOXICITÉ DE L'OCHRATOXINE A. I. – EFFET EMBRYOTOXIQUE ET TÉRATOGÈNE CHEZ LE RATSubmitted on 1 Jan 1974
HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.
TOXICITÉ DE L’OCHRATOXINE A. I. – EFFET EMBRYOTOXIQUE ET TÉRATOGÈNE CHEZ LE
RAT J. Moré, P. Galtier, M. Alvinerie, Marie-José Escribe
To cite this version: J. Moré, P. Galtier, M. Alvinerie, Marie-José Escribe. TOXICITÉ DE L’OCHRATOXINE A. I. – EF- FET EMBRYOTOXIQUE ET TÉRATOGÈNE CHEZ LE RAT. Annales de Recherches Vétérinaires, INRA Editions, 1974, 5 (2), pp.167-178. hal-00900797
I. — EFFET EMBRYOTOXIQUE ET TÉRATOGÈNE CHEZ LE RAT
J. MORÉ P. GALTIER
M. ALVINERIE Marie-José ESCRIBE
Station de Pharmacologie-Toxicologie, I. N. R. A., 180, Chemin de T’OMfM!/eMtNe,
31300 Toulouse
RÉSUMÉ
Un premier groupe de Rattes gestantes (A) a reçu une dose totale d’ochratoxine A de 4 mg/kg, par voie intrapéritonéale étalée sur deux (A,), quatre (A8) et huit (A.) jours. Un deuxième groupe d’animaux (B) a reçu en totalité et par voie orale 5 mg/kg de toxine répartis sur deux (Bl), quatre (B.), six (B.) et huit (B4j jours. Enfin, un troisième groupe C a reçu la même dose totale suivant la même voie d’administration. Le traitement a porté sur deux (C,) et trois (Cs) jours. Dans les trois groupes le traitement a débuté au 8e jour après la saillie.
On a calculé le poids moyen des foetus + placenta, des foetus et des placentas seuls ainsi que le nombre moyen d’implantations, de fcetus et de résorptions par femelle de chaque lot.
L’étude statistique montre des différences significatives entre les lots traités et les lots té- moins (implantations exceptées). De plus, on observe une proportion anormale de foetus hémor- ragiques (hémorragies superficielles et profondes). Enfin, dans les lots ayant reçu un traitement court (A,, B,, Cl et C2) la célosomie atteint de r,8 à 26 p. 100 des foetus ; ce qui prouve le carac- tère tératogène de la mycotoxine.
Les relations entre la perte pondérale et les perturbations du métabolisme glucidique sont envisagées. En outre, on a rapproché les hémorragies et la célosomie des microthromboses ren- contrées chez les animaux adultes en toxicité aiguë.
INTRODUCTION
La toxicité de l’ochratoxine A a été testée principalement chez des animaux adultes. PuRCHASE et NEL (1967) et PURCHAS:B: et THERON (1968) ont signalé, chez le Rat, des lésions du foie (vacuolisation et nécrose des hépatocytes) et du rein (né- crose des cellules tubulaires).
Par contre, les effets de la mycotoxine sur les embryons des rattes gestantes
sont encore mal connus. STILL et al. (1971) ont cependant montré qu’elle entraînait, chez la ratte gravide, un taux élevé de résorptions foetales.
Jusqu’ici aucun effet tératogène n’a été signalé. Nous nous sommes donc proposé de vérifier l’existence éventuelle d’un tel effet chez cette espèce.
MATÉRIEL ET TECHNIQUES
i. - Les animaux
Nous avons utilisé 180 rattes vierges Wistay d’un poids moyen de 320 g. Placées en cages individuelles, elles ont été nourries ad libitum. Les animaux randomisés ont été répartis en trois groupes, eux-mêmes subdivisés en lots (tabl. t), de la façon suivante :
Groupe A, de 60 animaux : 4 lots de 15 femelles (Al, A8, A3, At) ; Groupe B, de 60 animaux : 5 lots de 12 femelles (Bl, B2, Bs, B4, Bt) ; Groupe C, de 60 animaux : 3 lots de 20 femelles (Ci, C8, et).
La date de la saillie a été confirmée par la pratique journalière des frottis vaginaux (colora- tion de Schorr). Dans tous les cas, les animaux ont été sacrifiés au vingtième jour post coitum, sauf certaines femelles du lot A, sacrifiées à zI jours pour des raisons techniques accidentelles.
2. - La toxine
L’ochratoxine A cristallisée a été obtenue à partir d’une souche d’Aspeygillus ochyaceus WILHELM isolée de fourrages contaminés et cultivée sur blé selon le protocole de GALTIER et LE BARS (I(]’J3).
La mycotoxine a été dissoute dans une solution aqueuse de CO,HNA à 14 g/1 dans laquelle l’ochratoxine A existe sous forme de sel de Na.
3. - Les traitements
Des essais préliminaires portant sur un petit nombre d’animaux ont montré un effet téra- togène pour une dose de 4 à 5 mg/kg suivant la voie d’administration (voie intrapéritonéale ou voie orale).
Chaque animal du groupe A, traité par voie intrapéritonéale, a reçu au total 4 mg/kg de toxine, la fréquence des administrations variant suivant les lots (tabl. 1). La dose totale par ratte du groupe B, traité par voie orale, a été de 5 mg/kg, les doses étant plus ou moins étalées dans le temps. Cependant, le taux élevé de résorptions foetales chez les femelles gavées pendant 2 jours nous a conduit à mettre en oeuvre le groupe C (5 mg/kg, voie orale) pour pouvoir disposer d’un nombre plus important d’animaux (tabl. i). Les femelles des lots témoins (At, Bt et Ct) ont reçu une dose de bicarbonate (14 g/1) identique à la quantité de solvant contenant la myco- toxine administrée aux animaux de poids équivalent traités.
4. - Étude des foetus, des placentas et des utérus
Les fœtus prélevés par laparo-hystérotomie ont été débarrassés de leurs annexes à l’exception du placenta et du cordon ombilical. Après pesée de l’ensemble foeto-placentaire, le cordon ombi- lical a été sectionné puis, on a déterminé séparément le poids du foetus et celui de son placenta.
L’observation microscopique des fœtus a permis de déceler les anomalies importantes. Une partie d’entre eux, tirée au sort, ont été colorés par la technique de DAWSON (I9z6) qui révèle les malformations squelettiques éventuelles. Les foetus restants ont été conservés dans le formol à 10 p. 100 pour servir ultérieurement à l’étude des organes internes (méthode des coupes trans- versales de WILSON et WARKANY, 1965) et à l’étude histologique (coloration à l’hémalun- éosine).
Les utérus frais ont été colorés par la méthode de SALEWSKI (1964) qui visualise les sites d’implantation.
Pour les différents lots de chaque groupe, nous avons calculé :
- le poids moyen des foetus -! placenta (Pf+p), des fœtus seuls (Pf) et des placentas seuls (Py) par femelle d’un lot.
- le poids moyen des foetus + placenta CPf+P)’ des foetus seuls (Tf) et des placentas seuls (py) par fcetus d’un lot.
- le nombre moyen de foetus (f), de résorption (!) et d’implantation (i) par femelle dans chaque lot.
5. - Détection de l’ochyatoxine A
Notre essai a porté sur trois types de substrats. D’une part, le sérum des femelles sacrifiées obtenu par centrifugation du sang après prélèvement dans l’aorte abdominale ; d’autre part les broyats de fœtus et de placentas. Dans chaque cas, une extraction à l’éther permet de récu- pérer l’ochratoxine A. On a effectué ensuite des chromatogrammes en couche mince de gel de silice (1). Ceux-ci ont été révélés par lecture à la lumière de Wood (366 nm).
(1) Toluène, acétate d’éthyle, acide formique (5 : q. : r, v/v/v).
6. - Analyse statistique des résultats
Les différentes moyennes calculées ont été comparées deux à deux par le test de Scheffe.
RÉSUI,TATS
1. - L’embryotoxicité
Les résultats sont consignés dans les tableaux 2, 3 et 4. Nous constatons en
général, pour chaque groupe, que les différentes moyennes pondérales augmentent progressivement avec la durée du traitement ; les moyennes les plus élevées sont obtenues avec les lots témoins. On note une progression identique pour le nombre
moyen de foetus, tandis que le taux moyen de résorption varie en raison inverse. Les comparaisons des moyennes entre elles dans les différents lots de chaque groupe sont consignées dans le tableau 5. On remarque que dans les trois groupes, et en ce
qui concerne les résorptions, les lots témoins diffèrent tous significativement des lots traités pendant deux jours. Ces derniers sont, de plus, significativement diffé- rents des autres lots sauf pour Ci et C,.
La figure i donne les pourcentages de résorptions dans les lots. Si l’on considère avec BERTRAND (ig6o) que le taux normal de résorption chez la Ratte est compris entre 2o et 30 p. 100, on voit que la majorité des animaux traités sortent de la limite biologique normale.
Notons enfin que l’étude statistique des implantations ne montre aucune diffé- rence significative entre les lots. Cela plaide en faveur de leur homogénéité.
2. - La tératogénicité : aspect qualit:atif et quantitatif
a) Observations macroscopiques. La coloration des squelettes au rouge d’alizarine acide n’a visualisé aucune
malformation osseuse des fcetus. De même, les sections transversales ne révèlent
pas de lésions organiques macroscopiquement décelables. Par contre, dans les lots A,, Bi, B, et Ba nous relevons respectivement 10,9 p. 100,
30,7 p. 100, i5,4 p. 100 et 8,5 p. 100 de foetus présentant des hémorragies cutanées souvent étendues à une moitié du corps, au crâne ou à la région pectorale (Pl. I, fig. A). La seule malformation importante est une célosomie (Pl. I, fig. A et B) qui affecte le plus souvent la région abdominale, mais qui intéresse parfois le thorax. Les embryons célosomiens ne se rencontrent que dans les lots Ai, B1 et Ci traités
pendant deux jours et dans le lot CI (traitement étalé sur trois jours). Dans le lot Ai, nous avons dénombré 26 p. 100 de foetus présentant cette anomalie, tandis que dans le lot B1 ce taux est de 7,6 p. 100. Pànfin, dans le groupe C, la célosomie atteint 17,6 p. 100 des foetus du lot Ci (avec un cas compliqué d’oedème) et 1,8 p. 100 de
ceux du lot CI (fig. i). Nous avons en outre obtenu un cas de hernie ombilicale (lot Cl).
b) Histologie. L’examen des coupes de foetus a porté sur un nombre limité d’exemplaires.
Sur tous les échantillons issus de femelles traitées, on note une dilatation des vaisseaux
pulmonaires (Pl. II, fig. C et D). Au niveau du foie, les phénomènes congestifs sont importants et on relève de nombreuses microhémorragies des sinusoïdes hépatiques (Pl. II, fig. A et B). Enfin chez certains foetus les épanchements sanguins intéressent la cavité abdominale (PI. III).
3. - La localisation de l’ochratoxine A
Nous n’avons pour l’instant que des résultats qualitatifs qui nous permettent de dire que l’on retrouve la toxine dans : - le sang des mères lors du sacrifice ; - les broyats de foetus de 20 jours ; - les broyats des placentas de ces mêmes foetus.
La présence de la mycotoxine reste indépendante de la durée du traitement.
DISCUSSION
L’ochratoxine A entraîne une perte pondérale chez les foetus issus de mères intoxiquées. En effet, excepté pour le groupe A, les autres expériences montrent des différences significatives aux risques consentis entre les lots traités et les lots témoins (il en est de même des ensembles foeto-placentaires et des placentas). De plus, la perte pondérale varie en raison inverse de la durée du traitement (tabl. 3 et 4) pour une même dose totale. Or, on sait que dans le foie l’action de l’ochratoxine A porterait essentiellement sur l’AMP cyclique et rendrait inopérante la phosphory- lase-B-kynase. Il s’ensuivrait donc un arrêt de la glycolyse, une accumulation du glycogène dans le foie et un abaissement du taux du glucose sanguin (PITOUT, z967). On peut donc penser que l’organisme maternel appauvri en glucose prive en partie le foetus d’un nutriment important. Cette pénurie serait sans doute responsable de la perte de poids des foetus issus des femelles intoxiquées. En effet, la teneur en glycogène tissulaire de l’embryon de Rat est très élevée et la formation du méta- bolite dépend de la quantité de glucose fourni par la mère (ASSA!,I, ig68). I,’embryon va donc être faiblement pourvu en glucose et subit un premier handicap. De plus, la drogue franchit le placenta. On la retrouve en effet dans les broyats de l’organe et chez le foetus. Donc, celui-ci sera gêné, d’une part pour élaborer le glycogène nécessaire en quantité suffisante, la mère fournissant moins de glucose que norma- lement, d’autre part, une fois ce glycogène synthétisé par le foie, le foetus sera désa- vantagé par la présence de l’ochratoxine qui freinera la glycolyse. Il subira donc un second handicap qui, ajouté au premier, perturbera son développement.
Ainsi, dans nos expériences, et plus particulièrement dans le cas d’un traitement de durée moyenne (4, 6 ou 8 jours), une dose journalière faible pourrait diminuer la production maternelle de glucose d’une manière moindre que la dose quotidienne élevée des traitements de courte durée (2 et 3 jours). On pourrait aussi admettre qu’un apport insuffisant en glucose à un embryon de 8, g ou 10 jours puisse entraîner, soit la mort in utero, soit un retard ontogénique. Par ailleurs, des essais en cours montrent que ce retard se répercute jusqu’à la dixième semaine Post partum. En ce qui concerne le poids plus élevé des foetus du lot Ai (tabl. 2), nous pensons l’expliquer par le retard apporté au sacrifice des mères.
L’analyse du taux de résorption et celle du nombre de foetus par portée plaident en faveur de la nocivité de la mycotoxine et confirment les observations de PURCHAS>! et NEL (1967) et de PURCHAS! et TIœRON (1968).
La tératogénicité nous a montré deux cas différents quant à leur importance : les hémorragies foetales d’une part et la célosomie d’autre part. Pour les hémorragies, on est tenté de les associer aux propriétés anticoagulantes des dérivés coumariniques (dicoumarol et cyclocoumarol), dans la mesure où la molécule d’ochratoxine A
comporte un noyau isocoumarique dont une telle action reste à démontrer. Mais on peut aussi envisager que les hémorragies soient consécutives à la rup-
ture de petits vaisseaux comme cela s’observe chez les animaux en intoxication aiguë. Ceux-ci présentent, en effet, des thromboses intra-vasculaires qui pourraient être à l’origine des épanchements sanguins et des phénomènes de congestion passive que l’on observe dans ce cas. Cependant, de tels thrombus n’ont pu être localisés chez les foetus.
Enfin, les cas de célosomie peuvent être dus à un oedème généralisé du foetus, à une lordose, à une malformation de l’amnios ou bien à une rupture vasculaire (ANCEL et LALLEMAND, i96q.). Sur l’ensemble des célosomiens rencontrés, un seul présentait un oedème généralisé (Pl. I, fig. A) ; par contre, nous n’avons relevé aucune malformation de la colonne vertébrale ou de l’amnios. On peut donc penser à une rupture vasculaire détruisant les ébauches pariétales du corps. Ce phénomène pourrait être rapproché des accidents vasculaires que nous avons signalés.
CONCLUSION
L’ochratoxine A induit chez les femelles traitées : - une perte pondérale significative des fœtus ; - un taux de résorption qui dépasse les limites biologiquement admises ; - une diminution sensible du nombre de petits par portée.
Ces observations sont, pour une même dose totale, liées à la durée du traitement. Nous pensons les associer aux propriétés antiglycogénolytiques de la mycotoxine.
La drogue provoque de plus : - des hémorragies foetales superficielles et profondes plus ou moins impor-
tantes, mais sans relation avec la fréquence du traitement, - l’apparition de foetus célosomiens chez les mères ayant reçu 2 et 2,5 mg/kg/
jour/ x 2 jours d’ochratoxine A.
La tératogénicité est peut-être en relation avec des thromboses ou des ruptures vasculaires.
Reçu pour publication en janvier 1974.
REMERCIEMENTS
Il nous est agréable de remercier MM. C. BARADAT, pour son assistance au cours des autopsies, J. LE BARS et L. ESCOULA, responsables de la culture des souches d’AS!leYgiIL24S ochraceus WILHELM, R. DANTZER, T. HACHET, M. ROCA chargés des calculs statistiques.
SUMMARY
I. - EMBRYOTOXIC AND TERATOGENIC EFFECTS IN THE RAT
A first group of pregnant rats (A) received a total dose of ochratoxin A of 4 mg/kg by the intraperitoneal route spread over two (A,), four (A2) and eight (A3) days. A second group of animals (B) received, by the oral route, a total of 5 mg/kg of the toxin distributed over two (B,), four (B2), six (B3) and eight (B4) days. Finally a third group (C) received the same total dose by the same route of administration. The treatment was carried out over two (C1) and three (C2) days. In the three groups the treatment began on the eighth day after mating.
The mean weight of the foetuses plus placentae was calculated, of the foetuses and placentae separately, as well as the mean number of implantations, of foetuses and of resorptions by the females of each group.
Statistical study shows significant differences between the treated groups and the control groups (implantations excepted). Furthermore one sees an abnormal proportion of haemorrhagic foetuses (haemorrhage superficial and extensive). Finally, in the groups that received a short treatment Al, Bl, C1 and C.) the coelosoma reaches 1.8 to 26 p. 100 of the foetuses which substan- tiates the teratogenic character of the mycotoxin.
The relations between weight loss and the disturbances in glucose metabolism are discussed. In addition the haemorrhages and coelosoma are compared with the microthromboses met in the adult animals in acute toxicity.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANCEL P., LALLEMAND S., Ig44. Sur la réalisation expérimentale de la célosomie par divers mécanismes. C. R. Soc. Biol., 138, 3-6. ASSALI N. S., 1968. Biology of gestation, vol. 2, 9, II, Académie Press, New York, London. BERTRAND M., 1960. Effets du méprobamate sur l’évolution de la gestation de la Ratte. C. R. Soc.
Biol., 154, 2309-2312. DAWSON A. B., 1926. A note of staining of the skeleton of cleared specimens with alizarin red. Stain
Technol., 1, I23-I24. GALTIER P., LE BARS J., 1973. Toxines d’Aspergillus ochraceus WILHELM. I. Production d’ochratoxines
par des souches isolées de fourrages secs et cultivées sur blé, Ann. Rech. vétér., 4 (3), 487-497. PITO’UT M. J., r97I. In PURCHASE I!..F. H. Symposium on mycotoxins in human health - Biochemical
studies on ochratoxin A, 53-6ç, Mac Millan, London. PURCHASE I. F. H., NEL W., 1967. Biochemistry of some foodborne microbial toxins, 153-168, Mateless and Wogan M. I. T. Press, Cambridge, U. S. A. PURCHASE I. F. H., TxEIxoN J. J., 1968. The acute toxicity of ochratoxin A to rats. Food Cosmet.
Toxicol., 6, 479-483. SALEWSKI E., 1964. Farbemethode zum makroskopischen Nachweis von Implantationstellen an Uterus
der Ratte. Arch. (Naunyn-Schmiedebergs) exper. Pathol. Pharmakol., 247, 367. STILL P. E., MACKLIN A. W., RIBELIN W. E., SMALLEY E. B., I9&dquo;/I. Relationship of ochratoxin A to foetal death in laboratory and domestic animals. Nature, 234, $63-$64. WILSON J. G., WARKANY J., 1965. Teratology, principles and technigues, 1 vol. 279 p. University
Chicago Press, U. S. A.