TOXICIDAD AGUDA (DL50) DEL ACEITE ESENCIAL de Thymus vulgaris L. “tomillo” FRENTE A Artemia sp. y EFECTO SOBRE

POLIMORFONUCLEARES

Universidad Nacional San Agustín de

Arequipa

CONSUELO E. ORIHUELA ABARCARENEE M. CONDORI APAZASAUL PEREZ MONTAÑO

Wright SAC – Div. WrightLab

ANTECEDENTES GENERALESJUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓN

El incremento del uso de los aceites esenciales en; la industria farmacológica, cosmética, aromaterapia, bebidas y productos alimenticios, han creado una gran necesidad de análisis para determinar su toxicidad y así poder realizar un uso adecuado de estas sustancias.

El modo de acción de la mayoría de aceites esenciales con propiedad antibacteriana, reside en su capacidad de dañar la integridad de la membrana celular bacteriana, además de afectar el pH del medio intracelular y el equilibrio de los iones inorgánicos. Este efecto se aprecia sobre todo en aquellos aceites que tienen en su composición timol y carvacrol, como es el caso del aceite esencial de tomillo.

La mayoría de estos trabajos coinciden en que uno de los aceites con mayor potencial bacteriostático y bactericida es el aceite esencial de tomillo, el que además por su alto contenido en compuestos fenólicos, es uno de los aceites con mayor actividad antioxidante.

El carácter lipofílico de los compuestos fenólicos explica la capacidad antimicrobiana del aceite de tomillo, debido a su capacidad de incorporarse a la membrana lipídica de la célula microbiana, provocando la desestabilización de la membrana, incrementando su fluidez y permeabilidad, deja salir el contenido celular por lo cual la célula finalmente muere.

OBJETIVOSObjetivo General Determinar la toxicidad aguda del aceite esencial de Thymus vulgaris

L. “tomillo” sobre Artemia sp. y su efecto en polimorfonucleares.

Objetivos Específicos. Extraer aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo”. Determinar la DL50 del aceite esencial de Thymus vulgaris L.

“tomillo” mediante el bioensayo con Artemia sp. Determinar el efecto del aceite esencial de Thymus vulgaris L.

“tomillo” sobre la viabilidad de polimorfonucleares con la DL50 obtenida.

Determinar el efecto del aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo” sobre la funcionalidad de polimorfonucleares con la DL50 obtenida.

TOMILLO Thymus vulgaris L.

Clasificación taxonómica Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Lamiales Familia: Lamiaceae Subfamilia: Nepetoideae Tribu: Mentheae Género: Thymus Especie: T. vulgaris

Descripción botánica:Es un arbusto de 0.10 a 0.40 m. Tallo tortuoso, leñoso, muy ramificado, cuadrangular. Hojas opuestas, oblongo-lineares, pequeñas (hasta 8 x 1,5 mm), de margen revoluto y no ciliado. Cáliz bilabiado, el labio superior formado por tres dientes triangulares, anchos y el inferior por dos dientes largos y estrechos de márgenes ciliados. Las flores son rosadas, pequeñas, en corimbo, se encuentran dispuestas en verticilios. Los 4 estambres sobresalen de la corola y el fruto es un tetraquenio, lampiño, de color marrón.

Composición Química

Esta planta contiene no menos de 1% de aceite volátil y por lo menos de 0.5% de fenoles. Los principales componentes de Thymus vulgaris son el timol y el carvacrol (más del 64% del aceite) junto con el linalol, cimol, p-cimeno, timeno, pineno, apigenina, luteolina, y 6-hidroxiluteolina glicosidos, así como flavonoides di-, tri- y tetrametoxilados. El fármaco también contiene flavonoides, como luteolina, apigenina, naringenina, eriodictol, cirsilineol, salvigenina, cirsimaritina, timonina y timusina, entre otros.

También contiene heterósidos monoterpénicos, ya que una pequeña parte de timol y carvacrol se halla en forma de glucósidos o de galactósidos6. Presenta otros componentes como los ácidos fenoles: cafeico, rosmarínico; taninos y triterpernos (ácidos ursólico y oleanólico).

Sus componentes alcanzan la mayor concentración durante la época de floración. Se ha visto que el aceite esencial extraído del tomillo en flor llena, presenta un mayor poder bactericida.

Usos y propiedadesActividad espasmolítico y antitusiva: Es atribuido a los constituyentes fenólicos timol y carvacrol, las cuales constituyen un gran porcentaje de el aceite volátil, también se debe por otra parte a las flavonas metoxiladas. Estas últimas serían las responsables de la actividad de los extractos fluidos de tomillo, cuyo contenido en timol y carvacrol suele ser muy bajo. Por otro lado, se ha comprobado que la acción de los flavonoides derivados del luteolol potencia la acción espasmolítico de los fenoles, actuando sobre todo en la tráquea, gracias a una inhibición de la fosfodiesterasa, seguida de un incremento del nivel intracelular del AMPc.

Actividad expectorante y secretomotora: Evidencias experimentales sugieren que esta actividad ha sido asociado con una saponina extraída de T. vulgaris. Se ha observado además un incremento en la secreción mucosa de los bronquios, después del tratamiento con aceite esencial de “tomillo”. El aceite esencial de tomillo provoca una fluidificación de las secreciones bronquiales y favorece a su eliminación, ejerce un efecto relajante del músculo liso bronquial que justifica su uso como antitusivo.

Actividad antifungal y antibacteriana: El aceite esencial de tomillo debido a sus componentes fenólicos, timol y carvacrol, tiene actividad antibacteriana frente a bacterias Gram negativas y Gram positivas. Este efecto es debido a su acción sobre la membrana. Estudios in vitro han demostrado que el aceite esencial de Thymus vulgaris y el timol tienen actividad antifúngica frente a un número de hongos incluyendo Cryptococcus neoformans, Aspergillus, Saprolegnia, y especies de Zygorhynchus. Ambos, el aceite esencial y el timol tienen actividad antibacterial frente a Salmonella typhimurium,4 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, especies de Candida y un número de otras especies de bacterias.

Por otra parte el extracto acuoso de tomillo inhibe de forma significativa, in Vitro, el crecimiento de Helicobacter pylori y su potente actividad ureasa.

Otras acciones:

Actividad antioxidante, en la que se encuentran implicados el timol y el carvacrol de la esencia, así como los flavonoides y otros polifenoles.

Produce una considerable estimulación de la leucopoyesis y una elevación de los niveles de trombocitos en sangre, por ello se considera que puede ser interesante su uso como potenciador de la acción de otros inmunoestimulantes.

Regulador hormonal: es débilmente estrogénico, compitiendo con el estradiol a nivel del los receptores intracelulares. Por esta acción es posible la prevención de enfermedades producidas por un exceso de xenoestrógenos, como es el caso del cáncer de mama.

Modo de usoLa hierba desecada se utiliza para infusión, aceite esencial y tintura.

Vía oral:

Infusión al 5%:

Fármaco pulverizado encapsulado: 400 mg del polvo del Tomillo.

Extracto fluido, 1:1 (g/ml).

Extracto seco (5:1)

Aceite esencial: el aceite esencial se puede administrar por vía oral (1-5 gotas por dosis, sobre un terrón de azúcar o en solución acuosa), en forma de inhalaciones secas, inhalaciones húmedas o vahos, cápsulas entéricas (25-50 mg por cápsula), entre otras.

Vía tópica:

Decocción al 5%

Gel antiséptico al aceite esencial de tomillo: 5% de extracto glucólico.

Alcohol de tomillo (antiséptico).

Aceite al tomillo (antiséptico).

Extracto fluido (1:1): puro o diluido al 50% (colutorios o gargarismos).

ACEITES ESENCIALESSon mezclas complejas de diferentes sustancias químicas, (generalmente en número mayor de un millar); sin embargo, sus componentes principales pueden ser menores, la proporción de estas sustancias varía de un aceite esencial a otro, e incluso dentro de una misma especie, dándoles unas propiedades medicinales y una toxicidad característica para cada planta, estas proporciones varían en función del momento de recolección de la planta.

Son líquidos (en algunas casos semisólidos y muy raras veces sólidos) poco solubles en agua pero si volatilizables con vapor, se evaporan a diferentes velocidades bajo presión atmosférica.

Los aceites esenciales son variables en sus constituyentes, observándose dos series, caracterizadas por orígenes biosintéticos distintos, la serie terpénica y la serie aromática; los compuestos arénicos son derivados del fenilpropano y existen en diversas partes de las plantas. Los terpenos son los constituyentes de los aceites esenciales con mayor predominancia siendo principalmente cadenas de hidrocarbonos, monoterpénicos y sesquiterpeno con la formula general (C5H8)n que derivan de componentes oxigenados de estos hidrocarbonos donde están los alcoholes, aldehídos, esteres, éteres, cetonas, fenoles y óxidos

Composición de los aceites esencialesLos aceites esenciales generalmente son mezclas complejas de hasta más de 100 componentes que pueden tener la siguiente naturaleza química:

Serie terpénica. Monoterpenos; Están constituidos principalmente por hidrocarburos

acíclicos, monocíclicos, bicíclicos policíclicos, los que van acompañados de sus alcoholes, aldehídos, cetonas, esteres, éteres. Aunque están formados por dos isoprenos curiosamente son llamados monoterpenos.

Sesquiterpenos.- La cadena al aumentar el número de ciclaciones y de modificaciones posteriores posibles crece de manera espectacular.

Serie aromática.

Los compuestos de esta serie son mucho menos frecuentes que los monos y sesquiterpenos, derivando en su mayoría del fenilpropano, que son producto del metabolismo del ácido shikimico.

Algunos aceites esenciales contienen pequeñas cantidades de compuestos acíclicos no terpénicos como alcoholes, aldehídos, cetonas de peso molecular bajo.

Tipos de Extracción de los Aceites Esenciales

ARTEMIA Sp.Descripción Reino: Animalia Filo: Arthropoda Subfilo: Crustacea Clase: Branchiopoda Orden: Anostraca Familia: Artemiidae Género: Artemia Especie: Artemia sp.

Del griego artemía que significa óptima conservación. Género de crustáceos branquiopodos del orden anostráceos, de pequeño tamaño llegando a alcanzar 10-15 mm en etapa adulta, y desprovistos de caparazón. Viven en las aguas salobres del litoral o del interior. Presentan razas anfigónicas y partenogenéticas, adaptadas a cada medio en particular. En las razas partenogenéticas son frecuentes las formas polipoides. La Artemia es un filtrador no selectivo y se alimenta tanto de materia orgánica particulada.

Ciclo de Vida y DesarrolloEl camarón de salmuera posee la propiedad de reproducirse de dos maneras diferentes.

Dependiendo de las condiciones ambientales ya sea larvas de libre natación (ovoviviparidad) o quistes o huevos latentes (oviparidad) son liberados. La reproducción ovovivípara (nauplios como descendencia) ocurre mayormente en niveles de baja salinidad, considerando que los quistes (reproducción ovípara) son producidos en salinidades más allá de 150 ppt.

Cultivo de Artemias SalinasParámetros Ambientales Temperatura: Deberá mantenerse en el intervalo de 25–30°C. A

temperatura por debajo de 25°C la eclosión es más lente y por encima de 30°C el metabolismo de los quistes se detiene irreversiblemente.

Salinidad y pH: La composición química del medio debe de tener iones de Na, K, Mg en proporciones adecuadas. La relación Na:P es muy importante. Cabe mencionar que se han transferido especies de medios con sales de Carbonatos a medios con sales de Sulfatos, y se ha reportado que pueden adaptarse a ellos, observándose cambios de interés en la cepa adaptada diferente a la cepa original.

pH: En relación al pH, se considera adecuado el rango de 8.0 a 10.0. Oxígeno: El rango de O2 es amplio desde 1.0 mg/l hasta saturación de

O2 .

Alimentación

Se han encontrado en análisis del contenido del tubo digestivo desde algas y detritus hasta granos de arena, lo que demuestra que es un organismo filtrador no selectivo, por lo que puede ingerir materiales contaminados. Ingiere partículas de 1.2 a 50 μ. Sólo se alimenta de partículas, no de alimentos solubles. La Artemia no regula su nutrición (se alimenta las 24 h).

Proceso de Eclosión

Es un fenómeno químico puro (intercambio iónico), relacionado con la concentración de glicerol que posee el embrión, a mayor producción de glicerol hay mayor absorción de agua; en etapas críticas de presión osmótica la membrana se rompe, y después la concentración de glicerol súbitamente baja a cero, el glicerol es liberado. Si bien se ha observado que en altas densidades de quistes la presencia de glicerol es importante, pues interviene en la sincronía de la eclosión (ya que no actúa tóxicamente sobre las larvas).

Bioensayo con Artemia sp

Los bioensayos permiten evaluar la bioactividad presentada por algunos metabolitos secundarios y las respuestas que generan al establecerse la interacción del producto natural con los organismos.

Actualmente, la Artemia se utiliza como especie de bioensayo para una variedad de objetivos tales como:

Investigación de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias químicas y muestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguda de sustancias químicas, extractos vegetales, detección de toxinas naturales en comestibles y farmacéuticos, estudios de modelos de acción toxica de sustancias, y estudios de la transferencia trófica de contaminantes.

EVALUACION DE LA ACTIVIDAD TOXICOLÓGICA

Uno de los aspectos importantes para la evaluación de la actividad toxicológica es la relación entre la concentración de un compuesto químico a la cual se expone un organismo y el consecuente efecto nocivo que le produce. Esta relación, conocida como relación dosis-respuesta.

Dosis Letal DL50

La dosis letal 50 % (DL50) es un término muy utilizado para expresar la magnitud de la virulencia de microorganismos (virus, bacterias) y la toxicidad de sustancias sintetizadas por éstos.

Análisis Probit

El análisis estadístico Probit es un tipo de regresión utilizado para analizar las variables de respuesta binomial. La cual transforma la respuesta de la curva de dosis-respuesta de forma sigmoide en una línea recta que luego pueden ser analizados por la regresión o bien a través de los mínimos cuadrados o máxima verosimilitud.

RELACION DOSIS - RESPUESTA

INTRODUCCIÓN AL SISTEMA INMUNITARIO

Las células fagocíticas son muy importantes en la defensa de los seres vivos frente a lo que les es extraño. Esta acción protectora se ve reforzada por el resto de los sistemas de defensa que junto a las primeras, constituyen el sistema inmunológico:

a) La inmunidad inespecífica o innata, se compone de las barreras naturales, los factores celulares y los humorales.

b) La inmunidad específica o adaptativa, surge tras la interacción entre el agente reconocido como extraño y el sistema inmune. Existen dos tipos de inmunidad específica.

LEUCOCITOSHace aproximadamente un siglo, Paul Ehrlich sentó las bases de la inmunidad inespecífica al describir la existencia de tres tipos de células fagocíticas en la sangre: los neutrófilos, los eosinófilos y los monocitos, pero fue Elie Metchnikoff quien delimitó poco más tarde sus funciones al observar que durante la respuesta inflamatoria los leucocitos ingerían microorganismos mediante el proceso que denominó fagocitosis. Existen dos tipos de fagocitos: los leucocitos polimorfonucleares (PMN), que son células circulantes que emigran a los sitios de inflamación y los fagocitos mononucleares, que circulan por la sangre o bien se encuentran fijos en los tejidos y que también se acumulan en los lugares de inflamación.

En la sangre se encuentras seis tipos de glóbulos blancos: polimorfonucleares neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, linfocitos, y células plasmáticas. Además hay un gran número de plaquetas.

POLIMORFONUCLEARES NEUTRÓFILOS (PMN)

Se llaman polimorfonucleares por su núcleo multilobulado, neutrófilos por carecer de coloración citoplasmática específica. Son los leucocitos más numerosos en la circulación. Los PMN neutrófilos son células sanguíneas de vida efímera y sumamente móviles que penetran rápidamente en las zonas de infección para ingerir y destruir a los microorganismos.

Producción

La médula ósea es el sitio de producción de los polimorfos y su desarrollo se puede dividir en dos etapas una primera fase proliferativa o mitótica seguida de una segunda fase de maduración.

Función

La función de la célula fagocítica en la defensa del hospedador contra los microbios depende de los siguientes pasos 58: migración de los fagocitos sanguíneos al interior de los tejidos y establecimiento de contacto con los microbios invasores, fagocitosis, y acontecimientos post fagocíticas que conducen a la muerte intracelular y digestión de los microbios.

Migración de los neutrófilos al interior de los tejidos.

La secuencia de sucesos en la migración de los neutrófilos comienza con la adherencia de la célula al endotelio vascular, especialmente a las vénulas postcapilares.

El receptor MAC-1, también llamado MO-1 y OKM-1, se encuentra en PMN y también en monocitos, células NK y en algunos linfocitos; esta molécula funciona como el receptor de C3b~ (CR3).

Quimiotaxis.

Los leucocitos son capaces de responder frente a determinadas sustancias con un movimiento dirigido, desde una concentración menor a una mayor. Este es el fenómeno de la quimiotaxis y depende del complemento e indirectamente de las inmunoglobulinas lgM e lgG que al unirse a los anticuerpos superficiales del organismo activan secuencialmente los componentes del complemento.

Funciones de los PMN

Fagocitosis.

Es el proceso por el cual las células ingieren sustancias particuladas. En ella hay un reconocimiento previo a la ingestión. Para que una partícula sea ingerida es necesario que se una a determinadas áreas de la célula fagocítica. Los microorganismos encapsulados evitan esa unión y por lo tanto resisten la ingestión, contribuyendo este hecho a su patogenicidad. Esta propiedad antifagocitaria puede quedar limitada por el proceso de opsonización.

Acontecimientos postfagocíticos.

a) Desgranulación. Es el proceso por el cual gránulos citoplásmicos se fusionan con la membrana del fagosoma y vierten su contenido enzimático al interior de aquél. Este fenómeno se ve acompañado de una caída del pH en el interior del fagosoma hasta valores de 3,5 o 4, acidez necesaria para activar las hidrolasas ácidas vertidas por los gránulos.

b) Estimulación del metabolismo celular oxidativo. También llamado estallido respiratorio; implica un marcado aumento en el consumo de oxígeno y a un sistema enzimático, NADPH oxidasa, que cataliza la transferencia de un electrón del NADPH al oxigeno molecular. El producto de esta reacción es el anión superóxido (O;) con la consiguiente formación de agua oxigenada gracias al pH ácido del fagosoma.

CANDIDA ALBICANSEs un levadura polimórfica asociada obligatoriamente a animales de sangre caliente. Normalmente está presente en el hombre como comensal, pero puede presentarse como patógeno produciendo infecciones. Este Hongo dimorfo que forma largas seudohifas, hifas y blastoconidios (células gemantes subesféricas de 3-8 x 2-7 μm). Asimilan y fermentan azúcares. Numerosas clamidosporas unicelulares, redondas u ovaladas, con gruesa pared refringente (8-16 μm de diámetro), situadas al final de las hifas, seudohifas o laterales sobre blastoconidios ovalados. Se caracteriza de la siguiente forma: Reino: Fungi Phylum: Ascomycota Orden: Sacharomycetales Familia: Sacharomicetaceae Género: Candida Especie: C. albicans

Interacciones entre Quimioterápicos, Microorganismos y Células Fagocíticas:

La evolución favorable de las enfermedades infecciosas depende esencialmente de la eficacia de las células fagocíticas para destruir microorganismos y de una quimioterapia adecuada. Esto hace que sea necesario conocer las interacciones que se establezcan entre microorganismos, células fagocíticas y quimioterápicos.

Interacción de Quimioterápicos con Agente Patógeno y Hospedador (Triángulo de Davis)

Interacción de los Quimioterápicos con la Actividad Funcional de las Células Fagocíticas:

Los quimioterápicos pueden actuar directamente sobre las células fagocíticas modificando su capacidad funcional. Las funciones que pueden quedar alteradas son la quimiotaxís, la fagocitosis y la capacidad microbicida.

Efecto de los quimioterápicos en las interacciones leucocito-microbio: efectos PAE, PAFE Y PALE. (efecto post antibiótico, post antifúngico y efecto post antibiótico leucocitario):

Los efectos de los quimioterápicos sobre las células fagocíticas descritos anteriormente se pueden suplementar con los efectos independientes de los quimioterápicos sobre los propios agentes patógenos.

INTERACCIONES PMN-QUIMIOTERAPICO

Métodos para medir la fagocitosis:

Se puede medir desde la incubación con partículas inertes con bacterias.

Microscopía: Consiste en contar el número de partículas ingeridas en función del tiempo, su ventaja es que provee una vía visual directa y como tal es de gran valor para validar los resultados obtenidos con otros métodos o para contar el número de partículas ingeridas por un determinado número de fagocitos.

Algunos autores utilizan antibióticos para combatir bacterias extracelulares, pero puede producirse interacciones no deseables.

Durante el ensayo se puede contabilizar la ingesta de partículas intracelulares o bien se puede contabilizar las partículas ingeridas restando del total adicionado las que se observan en el sobrenadante después de un pase de centrifugación. Con éste método se intenta distinguir entre la ingesta completa de la partícula y los elementos adheridos a la célula.

METODOLOGIADeterminación de la toxicidad aguda (DL50) del aceite esencial de

“tomillo” (Thymus vulgaris L.) en Artemia sp. y Efecto sobre PMNs

Obtención del aceite esencial de Thymus vulgaris L.Se adquirió material vegetal seco consistente en hojas y flores de Thymus vulgaris (tomillo) .

El método que se empleó para la obtención de aceite esencial, fue el método de destilación por arrastre con vapor de agua, siendo este el método más usado actualmente, porque permite aislar el aceite esencial con buen rendimiento y tratar una cantidad grande de material. Entonces se colocó aproximadamente 1Kg de material seco dentro de un alambique de acero inoxidable, el material se encontraba separado mediante una plataforma perforada del agua en ebullición, de tal manera que no hacía contacto directo con el agua, pero si tenia un contacto directo con el vapor de agua, este vapor mas el aceite esencial pasa a través de un condensador de serpentín, que desemboca en una probeta graduada, donde el aceite se separa del agua y se ubica en la parte exterior, el aceite fue separado del agua poco a poco haciendo uso de una jeringa. Se extrajo 12ml de aceite esencial, que fue conservado en un frasco de vidrio ámbar, en un lugar fresco y protegido de la luz, hasta su posterior utilización.

Procedimiento para el Bioensayo en Artemia sp.

Huevos de Artemia sp

Desactivación de la diapausa

Eclosión de huevos y separación de nauplios de

Artemia sp

Aceite esencial de Thymus vulgaris

Preparación de diluciones con DMSO

Bioensayo

Control x 5 tubos (10 indiv. x tubo)

Incubación con solución salina

Blanco x 5 tubo (10

indiv. x tubo)

Experimental 5 tubos x cada dilucion (10 indiv.

x tubo)

Incubación con solución salina y

DMSO

Incubación con dilución de aceite

esencial+DMSO en solución salina

24 horas de incubación

Conteo de individuos muertos

Determinación de la DL50

mediante el método de Finney

Evaluación del efecto tóxico en Polimorfonucleares - PMNs

Obtención de PMNs:

Se tomaron muestras de sangre venosa periférica de un donante sano. Se colocaron dos gotas separadas de sangre en una lámina portaobjetos limpia, se prepararon cinco láminas para control, y cinco láminas para la muestra experimental, todas las láminas fueron llevadas a incubar en cámara húmeda a una temperatura de 37ºC durante 30 minutos.

Transcurrido este tiempo, se extrajo de la estufa, la cámara húmeda y se procedió a cubrir las gotas de sangre con PBS (solución buffer fosfato salino), para luego comenzar a despegar cuidadosamente los bordes de los coágulos con una aguja desechable, seguidamente se procedió con la remoción del coágulo y lavado de la lámina mediante un chorro continuo de PBS con la ayuda de una pipeta Pasteur, concluido este proceso se obtuvieron dos áreas de PMNs adheridos en cada lámina portaobjetos.

Prueba de viabilidad

El punto de partida de los tratamientos será la Dosis letal media (DL50 hallada en el bioensayo con Artemia sp.), para comprobar el efecto sobre la viabilidad de los PMNs. La solución de aceite esencial fue preparada con PBS y utilizando DMSO como diluyente.

Se dispusieron 5 láminas para ser expuestas a la acción del aceite esencial y 5 láminas para servir en calidad de control.

Se cubrió las áreas de PMNs adheridos, con las soluciones que correspondían, según se trataba de controles o de muestras experimentales, se llevaron las láminas a incubar a 37ºC durante 30 ó 60 minutos, según era el caso. Al cabo de este tiempo se procedió a lavar las láminas con PBS, luego se cubrió el área de PMNs con una gota de Azul de Tripán al 0.4% (peso/volumen en solución isotónica salina), se colocó un cubreobjetos a fin de eliminar el exceso de colorante. Luego se procedió al conteo de PMNs en un microscopio óptico a 40X, diferenciando las células vivas (refringentes) de las muertas (azules).

Con los datos se obtuvo los porcentajes de viabilidad de las muestras y de los controles, valores con los cuales se halló el índice de viabilidad, haciendo uso de las siguientes fórmulas:

Se consideró una concentración como tóxica cuando su índice de viabilidad fue menor a 90%. Así mismo las láminas control que presentaron una viabilidad menor del 95% fueron descartadas.

Prueba de funcionalidad de polimorfosLa cepa de Candida albicans fue obtenida del laboratorio UPSIPROBI e identificada por el método del tallo germinativo, una vez identificada la cepa se procedió a su siembra en agar Saboraud y a su posterior incubación a 37º C por 24 horas. Concluido este tiempo se extrajo la placa de la estufa y se mantuvo en refrigeración hasta su posterior utilización, se realizó la renovación del cultivo cada cuatro días.

Para la preparación de la suspensión se tomó una muestra de las colonias de Candida albicans formadas en la placa con un asa de siembra, se disolvió en 5ml de PBS (buffer fosfato salino, pH 7.4). Seguidamente se colocó sobre una lámina portaobjetos, una gota de la suspensión preparada, se vertió una gota de azul de Tripán y se procedió a leer la viabilidad de la C. albicans en un microscopio óptico a 40x, se descartaron las muestras que presentaron una viabilidad menor a 95%.

Luego se realizó el conteo de levaduras de la suspensión en una cámara de Newbauer, luego se ajustó la suspensión a 2x106 C. albicans/ml en una solución de PBS con 20% de suero autólogo para la opsonización de las levaduras.

Prueba de funcionalidad

Para esta prueba se utilizó la Dosis letal media hallada en el bioensayo con Artemia sp.

Los PMNs aislados fueron expuestos durante 30 y 60 minutos a la acción del aceite esencial de T. vulgaris, luego de transcurrido el tiempo, se lavó las láminas con PBS y se cubrió los PMNs con aproximadamente 0.5ml de la suspensión de C. albicans preparada previamente, la cual contenía 2x106 candidas/ml y 20% de suero antólogo.

Se incubaron las láminas en cámara húmeda a 37ºC por 30 minutos, luego del cual se lavaron las láminas con PBS. Seguidamente se fijaron con metanol absoluto durante 30 a 60 segundos, se enjuagaron con agua y se procedió a teñir con Giemsa .3%, cubriendo el área con el colorante y dejándolo actuar durante 7 a 10 minutos, a continuación se lavó las láminas y se las dejó escurriendo hasta el momento de su lectura en microscopio óptico a 100X.

Se contabilizó el número de PMNs que lograron fagocitar y la cantidad de partículas ingeridas por cada PMN, se contarán un total de 100 PMNs en cada área de las láminas expuesta al aceite esencial, es decir 200 PMNs por lámina portaobjetos.

Luego se obtuvieron los índices fagocíticos de las muestras y de los controles, índices que fueron relacionados en una fórmula, para obtener de este modo las eficiencias fagocíticas para cada muestra.

Se consideró una concentración como tóxica siempre y cuando en las láminas expuestas a esta concentración presentaron una eficiencia fagocítica menor al 95%.

Metodología estadística

Para analizar los experimentos se compararon los 4 grupos (DL50 a los 30min, DL50 a los 60min y sus respectivos controles) por medio de un análisis de varianza, con un nivel de significancia de p< 0.05.

Adicionalmente se comparó a través de una prueba de T de student para datos emparejados (resultados de los tratamientos con sus respectivos controles), con un nivel de significancia de p< 0.05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓNRendimiento y densidad del aceite esencial de Thymus vulgarisLuego de la extracción del aceite de Tomillo se logro determinar un rendimiento de 1.5%, lo cual significa que para obtener un litro de aceite esencial de tomillo se requieren aprox. 67 kilos de tomillo desecado.

En otro estudio se encontró un rendimiento de 2.05% utilizando la misma metodología empleada en esta investigación, es también importante mencionar que el rendimiento de los aceites depende de factores climáticos y calidad de los suelos.

La densidad del aceite esencial de tomillo obtenido fue de 0.969g/ml, este valor no difiere mucho del encontrado en otro estudio (0.939g/ml). Esto es muy relativo ya que como puede variar el rendimiento y la composición por diversos factores, también otros parámetros físicos como la densidad también puede variar debido a la variación de quimiotipos, etapa del ciclo de vida de la planta, diferentes partes de la planta, factores ambientales y estacionales, condiciones estacionales de cultivo.

RESULTADOS DEL BIOENSAYO EN Artemia sp.

Dosis

(ppm) Log (Dosis)

Porcentaje de

Mortalidad (%) Probit

3.03 0.48 6.7 3.50

6.06 0.78 35.5 4.63

12.11 1.08 91.7 6.39

24.23 1.38 100.00 8.72

48.45 1.69 100.00 -

96.9 1.99 100.00 -

El grado de mortalidad parece guardar una correlación con la dosis empleada, ya que a dosis mayores se puede apreciar una porcentaje de mortalidad mayor, así se puede apreciar que el menor porcentaje de mortalidad se encuentra a la dosis de 3.03ppm y el mayor porcentaje de mortalidad a las dosis de 24.23ppm, también se puede notar que la DL50 podría hallarse entre la concentraciones de 6.06ppm a 12.11ppm.

PROBIT VS LOGARITMO DE DOSIS

Para fines de lograr una regresión lineal se han transformado los porcentajes de mortalidad a Probits (Tabla de Finney) y la concentración en logaritmo de dosis, según la gráfica, el coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.976, por lo tanto si conocemos el valor del Probit podremos predecir con un 97.6% de confiabilidad el valor del Log de la dosis y un valor preliminar de 6.18ppm para la DL50 del aceite de tomillo.

Resultados del Segundo Bioensayo en Artemia sp.

Dosis

(ppm) Log (Dosis)

Porcentaje de

Mortalidad (%) Probit

1.6 0,2 1,5 2.83

3.2 0,5 7,8 3.58

6.4 0,8 44,9 4.87

12.8 1,10 85,5 6.06

25.6 1,40 98,3 7.12

En el segundo bioensayo se han utilizado dosis intermedias a las empleadas en el primer bioensayo para hallar un valor de DL50 más exacto.En los resultados obtenidos se puede apreciar que la DL50 se encuentra más cercana a la dosis de 6.4ppm.

PROBIT VS LOGARITMO DE DOSIS

La gráfica corresponde a la regresión lineal obtenida entre los Probits y el Logaritmo de las dosis utilizadas, el coeficiente de correlación (R2) en este bioensayo, es de 0.9943, lo cual indica que existe una mejor correlación que en la regresión del primer bioensayo, por lo tanto en éste segundo bioensayo luego de aplicar el método de Finney y de realizar los cálculos respectivos se ha determinado el valor de 6.75ppm para la DL50 del aceite de tomillo siendo este valor más exacto.

La toxicidad hallada en este experimento es más elevada a la que se encontró en larvas del insecto Spodoptera frugiperda (0.277g/ml lo que equivale a 277000ppm), lo cual es lógico debido a que estas larvas presentan una estructura más compleja que las larvas de Artemia sp.

La toxicidad observada es un indicativo de la presencia de potentes componentes citotóxicos, de hecho, se ha comprobado en numerosos casos la actividad biológica del aceite esencial de tomillo, así, numerosos estudios consideran que el aceite esencial de tomillo está entre los más potentes aceites esenciales con respecto a las propiedades antimicrobianas, sumado a esto, de manera aislada los componentes mayoritarios del aceite esencial de tomillo (timol y carvacrol) tienen comprobada actividad citotóxica, así es que están considerados entre los más activos compuestos agonistas de múltiples patógenos transmitidos por alimentos, el timol, compuesto fenólico monocíclico con actividad bactericida, también se le ha encontrado propiedades moluscicidas e insecticidas.

Es conocido que la Na-K-ATPasa es una enzima fundamental para mantener el equilibrio iónico dentro del fluido corporal interno de la Artemia, en este contexto algún factor externo que perturbe el adecuado funcionamiento de esta enzima denotaría graves alteraciones fisiológicas, que podrían concluir con la muerte del organismo.

Resultados de la Prueba de Viabilidad de PMNs

Fuente de variación

GL SC MS Fc

Tratamiento 3 348.9 116.3

9.9487 Error 36 421 11.69

Total 39 769.9

Fc > Ft; p<0.05

Luego de aplicar la prueba de Análisis de Varianza con un 99.5% de confianza se ha determinado que existe diferencia significativa entre los grupos de investigación evaluados .

T de Student para la Prueba de Viabilidad de PMNs Dosis Tiempo dsx t p

7ppm 30min

93.4 ± 5.19 3.683 <0.05

control 99.5 ± 0.71

7ppm 60min

93.8 ± 4.26 4.169 <0.05

control 99.5 ± 0.71

7ppm 30min 93.4 ± 5.19 0.188 >0.05

7ppm 60min 93.8 ± 4.26

12ppm 30min

75.3 ± 4.97 15.248 <0.05

control 99.5 ± 0.71

El T de Student con un 99.5% de confianza ha demostrando que existe un efecto del aceite esencial sobre los PMNs, no obstante como se puede observar, los valores promedio de viabilidad en los tratamientos no son menores a 90% en ninguno de los casos, siendo este el valor que se toma como parámetro de normalidad. Dado que la viabilidad es normal, no se considera que exista un efecto tóxico del aceite esencial sobre PMNs a la concentración empleada. Sin embargo cuando la concentración del aceite esencial es de 12ppm, el porcentaje de viabilidad se reduce a 75.3% lo cual indica la existencia de un efecto tóxico al compararlo con los parámetros normales de referencia, además, la diferencia estadística con el control es mayor que en los casos anteriores.

Resultados de prueba de funcionalidad en PMNs

Fuente de variación

GL SC MS Fc

Tratamiento 3 81.23 27.08

1.025 Error 20 528.17 26.41

Total 23 609.40

Fc < Ft; p>0.05

Luego de la prueba estadística aplicada se ha determinado con un 99.5% de grado de confianza que no existe diferencia significativa entre los grupos evaluados.

T de Student para el porcentaje de fagocitosis

Dosis Tiempo dsx t p

7ppm 30min

83.0 ± 7.68 1.604 >0.05

control 88.5 ± 3.39

7ppm 60min 80.83 ± 4.75 0.827 >0.05

control 82.83 ± 3.54

Aplicando la prueba T de Student, con un 99.5% de confianza se ha determinado que no existe diferencia significativa entre los tratamientos y los respectivos controles. Debido a estos resultados se puede inferir que no existe efecto tóxico del aceite esencial a la concentración probada.

Eficiencia fagocítica de PMNs sometidos al aceite esencial

Dosis Tiempo de

exposición

Eficiencia

Fagocítica (%)

7ppm 30 min 94.88

60 min 90.48

Los resultados de la tabla indican los porcentajes de eficiencia fagocítica de los PMNs luego de ser sometidos a dos tiempos de exposición.Los porcentajes se encuentran dentro de los parámetros normales que se ha tomado como referencia en el presente estudio (mínimo 85%), lo cual indica que no ha existido efecto tóxico del aceite esencial sobre la funcionalidad de los PMNs, a la dosis evaluada.

Análisis del promedio de levaduras fagocitadas por PMNsFuente de variación

GL SC MS Fc

Tratamiento 3 1.98 0.66

3.725 Error 20 3.53 0.1767

Total 23 5.51

Fc > Ft; p<0.05

Dosis Tiempo dsx t p

7ppm 30min 2.41 ± 0.3 0.610 >0.05

control 2.54 ± 0.42

7ppm 60min 2.85 ± 0.31 1.515 >0.05

control 3.15 ± 0.38

7ppm 30min 2.41 ± 0.3 2.5 <0.05

7ppm 60min 2.85 ± 0.31

Se ha determinado con un 99.5% de confianza que existe diferencia significativa entre los grupos evaluados y al aplicar la prueba de T de Student con un 99.5% de confianza se ha determinado que no existe diferencia significativa entre los tratamientos con aceite esencial y los respectivos controles.Sin embargo se ha encontrado una diferencia significativa entre los tiempos de tratamiento, lo cual demuestra que el tiempo ha influenciado en el número de levaduras fagocitadas por PMNs. Siendo mayor el promedio a los 60min.Por lo tanto al incrementar el tiempo de exposición con la suspensión de Candida albicans, los PMNs han logrado fagocitar un mayor número de levaduras.

CONCLUSIONES Se extrajo el aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo”,

obteniéndose con un rendimiento de extracción de 1.5% y una densidad de 0.969g/ml.

Mediante la DL50 se determino el grado de toxicidad del aceite esencial Thymus vulgaris L. “tomillo” mediante el bioensayo con Artemia sp obteniéndose un grado de toxicidad a 6.75ppm.

Se ha determinado que no existe efecto tóxico del aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo” sobre la viabilidad de polimorfonucleares al emplearse la dosis hallada por la DL50 obtenida en el bioensayo. Sin embargo el efecto tóxico se manifiesta a la dosis de 12ppm.

Se ha determinado que no existe efecto tóxico del aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo” sobre la funcionalidad de polimorfonucleares con la dosis de la DL50 obtenida en el bioensayo.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Cosentino S, Tuberoso CIG, Pisano B, Satta M, Arzedi E, Plamas F: In

vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinians Thymus essential oils. Lett Appl Microbiol 1999; 29:130-135.

Crespo ME, Jimenez J, Gomis E, Navarro C: Antibacterial activities of the essential oil of Thymus serpylloides subspecies gadorensis. Microbios 1990; 61:181-184.

Culici M, Capretti V, Dal Sasso M, Guffanti EE, Mucci M, Braga PC: Evaluation of thymol inhibition of Candida albicans adhesiveness to human vaginal cells. GIMMOC (submitted), 2005.

Dal Sasso M, Culici M, Guffanti EE, Mucci M, Braga PC: Thymol inhibitory activity on Escherichia coli and Staphylococcus aureus adhesion to human vaginal cells. J Essent Oil Res (submitted), 2005.

Dorman HJ, Deans SG: Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J Appl Microbiol 2000; 88:308-316.

Vardar-Ünlü G, Candan F, Sökmen A, Daferera D, Polissiou M, Sökmen M, Dönmez E, Tepe B: Antimcirobial and antioxidant activity of the essential oil and methanol extracts of Thymus pectinatus Fisch, et Mey. Var. pectinaus (Lamiaceae). J Agric Food Chem 2003; 51:63-67.

Bajo un sueño se avanza, la Ciencia!!!