オリゴヌクレオチドコンジュゲートTotalSeq™ 抗体ハイスループットシングルセルプロテオゲノミクス研究用試薬

PBMC（5000Cells）でのシングルセルトランスクリプトーム解析によるクラスター結果とCITE-seqによる発現プロファイルを比較することで、発現プロファイルが異なる細胞集団が存在することを判別できます。上のパネルは、全細胞中の全体的な遺伝子発現パターンによって細胞をクラスタリングし、遺伝子発現に基づいて分類された主要な細胞型を示しています。下のパネルは、mRNA （青色）および対応する抗体由来タグ（ADT、緑色）のシグナルを示しています。

マルチオミックスデータの同時生成:プロテオームおよびトランスクリプトーム双方のデータを同時に得ることにより、シングルセル実験によって得られる情報が増加します。ドロップアウトの低減:mRNAとは対照的に、TotalSeq™由来のタグは、一般的に偽陰性の原因とされるドロップアウトが起こりにくい傾向があります。細胞種判別性の向上:

ドロップアウト率の低減によりサンプルクラスタリングの向上が期待できます。関連研究分野

• 個別医療• がん研究• 幹細胞研究• 免疫学分野• バイオマーカー探索• 新規希少細胞の同定• 神経学分野• ワクチン学分野

CD3e CD4 CD8a

mRNA

ADT

mRNA

ADT

mRNA

ADT

CD19 CD11b IL7R

mRNA

ADT

mRNA

ADT

mRNA

ADT

B

tSNE1

tSNE2

CD14mono

CD16mono

NK

NKT

CD8 T

CD4 T

CD8 T

DC

pDC

次世代シークエンシング（NGS）および液滴ベースのマイクロ流体技術を用いることで、何千ものシングルセルからなるトランスクリプトームレベルのデータを得るハイスループットシングルセルRNAシークエンシング（scRNA-seq）が可能となりました。近年、10x Genomics ChromiumTMシステムとSingle Cell 3ʼ Solutionが生物医学研究におけるscRNA-seqの普及を促進しており、scRNA-seqを利用してプレシジョン・メディシンへの道のりを早めることが期待されています。生物においてタンパク質は非常に重要であるにも関わらず、従来はプロテオミクスをこれらのハイスループットscRNA-seqアッセイに組み込むことは出来ませんでした。BioLegendの新製品TotalSeq™はハイスループットでシングルセルのトランスクリプトームとプロテオーム双方のデ ータ生成を同時に可能にし、生物医学研究における新たな発見をもたらすことが期待されます。

トミーデジタルバイオロジー株式会社〒112-0002 東京都文京区小石川1-1-17日本生命春日駅前ビル 3階email: info_ap@digital-biology.co.jp phone: 03-6240-0843

Learn more at: biolegend.com/totalseq

High

Low

HighLow

High

Low

HighLow

TotalSeq™ Antibody Oligonucleotide ConjugatesBioLegend社の品質保証 BioLegendは、品質なしに継続的なイノベーションは起こり得ないと確信しています。それゆえに、全ての製品が最高品質の基準を満たすことを確認しています。

TotalSeq™製品ラインにおける品質保証:正確なオリゴ標識とシークエンシングTotalSeq™製品の全ロットは抗体あたり1または2個のオリゴが標識されています。また、製品に未標識抗体が含まれないことを検証しています。さらに、正しいオリゴバーコードが（かつ、正しいバーコードのみが）抗体に結合していることをシークエンシングで確認しています。

厳密なフローサイトメトリー試験すべてのロットにおいて、フローサイトメトリー試験を実施し、その抗体が本来標的とする細胞集団が染色されることと、オリゴが抗体に結合していることを確認しています。このプロセスは、従来の2ステップフローサイトメトリー染色との比較によって検証されています。

A B

A. Unconjugated antibody.

B. Pooled fractions of conjugated antibodies with one (lower band), or two (upper band) oligonucleotides.

Clone UCHT1 Clone RPA-T4A

Clone UCHT1 Clone RPA-T4B

Clone UCHT1 Clone RPA-T4C

Isoelectric focusing gel

（A）蛍光標識二次抗体で検出された未標識精製抗体。（B）同じ蛍光標識二次抗体で検出されたTotalSeq™抗体。（C）蛍光標識オリゴdTがハイブリダイズしたTotalSeq™抗体。これら3つの方法はすべて、適切な細胞集団について同様の染色プロファイルを示します。上記の例では、T細胞はCD3とCD4について一貫した染色性を示すことが確認されます。

トミーデジタルバイオロジー株式会社〒112-0002 東京都文京区小石川1-1-17日本生命春日駅前ビル 3階email: info_ap@digital-biology.co.jp phone: 03-6240-0843

購入者がBioLegendのTotalSeq™ 製品をご自身の使用目的に使用するために必要な知的所有権を有しているかを判断する責任は購入者のみが負うものとします。例として、購入者がTotalSeqTMを使用するプラットフォームに関して、当該プラットフォーム自体の使用およびTotalSeq™をそのプラットフォームで使用するために必要な第三者の知的財産権をすべて所有しているかは、購入者自身の責任で判断してください。AlexaFluor®は、Life Technologies Corporationの登録商標です。Chromium™は10x Genomicsの商標です。

4.pdf 2019/04/26 14:35:27

C

M

Y

CM

MY

CY

CMY

K

1_F.pdf 2019/04/26 16:00:40

TotalSeq™試薬のシームレスワークフロー1. TotalSeq™ 試薬で細胞を標識する。2. 抗体由来タグ（ADT, Antibody-Oligo-

Conjugates）で標識された細胞をpoly-Aテール互換のscRNA-seqプラットフォームにかける。

3. mRNA由来のcDNAとADT由来のcDNAを分離する。

4. 両方の cDNA ライブラリーをそれぞれ増幅する。5. 適切な比率でライブラリーを混合し、同一レーン上で配列を同定する。

Table 1. Summary of TotalSeq™ formats. Other conjugates may be available in the futureTotalSeq™-A TotalSeq™-B TotalSeq™-C

10x Genomics compatibility

Single Cell Gene Expression Solution (3’, v3) and any system employing a poly-A capture method

Single Cell Gene Expression Solution (3’, v3) with Feature Barcoding Technology and 10x Genomics Data Analysis Software

with Feature Barcoding technology and 10x Genomics Data Analysis Software

PCR handle CCTTGGCACCCGAGAATTCCA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNN CGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNNN

Capture sequence Poly-A [(A)30*A*A] NNNNNNNNNGCTTTAAGGCCGGTCCTAGC*A*A NNNNNNNNNCCCATATAAGA*A*A

Next-Generation Sequencing compatibility

Compatible with Illumina® instruments Compatible with Illumina® instruments Compatible with Illumina® instruments

様々な細胞の包括的な解析にTotalSeqTM試薬をお使いください

platform from 10x Genomics.

BioLegendは、初めてのプロテオゲノミクス用試薬として TotalSeq™-Aの販売を開始しました 。TotalSeq™-A は、オリゴ(dT)を利用してmRNAを単離するscRNA-seqに適合するようデザインされています。抗体に標識されたオリゴヌクレオチド配列内にpoly-Aテールが存在しているため、本試薬は通常のmRNA と同様にscRNA-seq ワークフローにより解析されます。オリゴヌクレオチドには、クローン特異的にラベルされたバーコードとPCRハンドルが含まれており、 Illumina® シーケンシング試薬や機器に適合します。また、BioLegendは、パートナー企業との協働により、10x Genomics社によるFeature Barcode技術などの新しいゲノミクス試薬に対応できるようになりました。新製品であるTotalSeq™-B は Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution (v3)に適合した試薬です。さらに、ワクチンやがん研究に重要な適応免疫反応の解析、特に健康と病気のバランスを左右するキープレーヤーであるB細胞やT細胞のシングルセル解析が増加しています。 このような研究分野をサポートするために、Chromium™ Single Cell Immune Profiling Solutionに適合するTotalSeq™-Cの新規販売・拡充を行っています。

N represents either randomly selected A, C, G, or T. The symbol * indicates a phosphorothioated bond, to prevent nuclease degradation.

2.pdf 2019/04/26 14:24:38

ハッシュタグscRNA-seqプラットフォームでのイムノフェノタイピングとトランスクリプトーム解析を組み合わせたTotalSeq™製品群に加えて、BioLegendではサンプルのマルチプレックス解析を可能とし、マルチプレット検出、およびscRNA-seq機器へ複数サンプルを一度にローディングすることも可能にする、ハッシュタグ抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲートも提供しています。セルハッシュタグ試薬は細胞表面に広汎に発現するマーカーを認識する抗体を活用しています。ヒト用のハッシュタグ試薬はCD298およびβ2ミクログロブリンを認識し、それらは同一のユニークなDNAバーコードでタグ付けされています。また、マウス用試薬は、CD45およびH-2 MHCクラスIを認識し、これらもユニークなバーコードでタグ付けされています。この試薬はプレミックスされており、ready to useで使用できます。

tSNE1

tSN

E2

tSNE1

tSN

E2

Hashtag mRNA

A

B

C

D

CD4 T

CD8 T

NK

B

CD14mono

CD16mono

DC

pDC

左のパネルは、マルチプレックスされた4人の異なるPBMCドナー由来の細胞をハッシュタグを用いて一度にシングルセルプラットフォームにかけたマルチプレックスデータセットを示しています。マルチプレット（灰色）は、解析対象から除去すべき細胞集団を示しています。右のパネルは、マルチプレットを除去した後のトランスクリプトームに基づくクラスタリングを示し、4つのサンプルすべてに点在する異なる免疫細胞集団を判別して示しています。B︓B細胞、T︓T細胞、NK︓ナチュラルキラー細胞、 mono︓単球、DC︓樹状細胞、pDC︓形質細胞様樹状細胞。細胞はハッシュタグ分類に基づいて色分けされています。

Sample A B C D

1. TotalSeq™ 抗体と同じクローンのPE標識抗体を使用したフローサイトメトリー実験を行うことで、使用する抗体量の最適化を行うことができます。フローサイトメトリー実験時の抗体量は、TotalSeq™ 抗体の最適使用量に相当します。

2. Alexa Fluor® 647等で蛍光標識されたpoly-dTオリゴヌクレオチドなどの二次試薬もしくはPE標識された二次抗体を使用することができます。

3. シーケンシングによる抗体のタイトレーションにはコストがかかりますが、ハッシュタグ製品を使用することで、下記図のようにタイトレーションを簡便に行うことができるようになります。

Peripheral blood leukocytes from human and mouse were stained with a panel of TotalSeq™ antibodies with serial dilution (six points each). Additionally, each titration point was labeled with a distinct hashtag antibody (for human or mouse). After staining, all samples were pooled together for single-cell partitioning, library construction, and next-generation sequencing. Panel A shows cell clusters based on hashtag detection. Panel B shows signal levels of each human hashtag superimposed on the clusters. Panels C and D show examples of titration results (counts) after sequencing and after normalization (C, clone 3G8 for human CD16 and D, clone HI30 for human

which optimal staining concentrations can be selected.

3.pdf 2019/04/26 14:26:19

C

M

Y

CM

MY

CY

CMY

K

3.pdf 2019/04/26 16:04:52

Library Constructionprimer

10xGenomicsより別途購入が必要お客様による準備が必要（プライマー情報はBioLegend社プロトコルに記載あります）

10xGenomicsより別途購入が必要

＊プロトコルは下記をご参照ください。https://www.biolegend.com/protocols/totalseq-a-antibodies-with-10x-single-cell-3-reagent-kit-v3-protocol/5010/

ハッシュタグ製品は実験ワークフローや複雑な実験条件の最適化に役立ちます。また、TotalSeq™ 抗体の使用量の最適化にもご使用いただけます。TotalSeq™ 抗体のタイトレーションは、下記のように直接もしくは間接的な手法で行っていただけます。

TotalSeq™試薬のシームレスワークフロー1. TotalSeq™ 試薬で細胞を標識する。2. 抗体由来タグ（ADT, Antibody-Oligo-

Conjugates）で標識された細胞をpoly-Aテール互換のscRNA-seqプラットフォームにかける。

3. mRNA由来のcDNAとADT由来のcDNAを分離する。

4. 両方の cDNA ライブラリーをそれぞれ増幅する。5. 適切な比率でライブラリーを混合し、同一レーン上で配列を同定する。

Table 1. Summary of TotalSeq™ formats. Other conjugates may be available in the futureTotalSeq™-A TotalSeq™-B TotalSeq™-C

10x Genomics compatibility

Single Cell Gene Expression Solution (3’, v3) and any system employing a poly-A capture method

Single Cell Gene Expression Solution (3’, v3) with Feature Barcoding Technology and 10x Genomics Data Analysis Software

with Feature Barcoding technology and 10x Genomics Data Analysis Software

PCR handle CCTTGGCACCCGAGAATTCCA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNN CGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNNN

Capture sequence Poly-A [(A)30*A*A] NNNNNNNNNGCTTTAAGGCCGGTCCTAGC*A*A NNNNNNNNNCCCATATAAGA*A*A

Next-Generation Sequencing compatibility

Compatible with Illumina® instruments Compatible with Illumina® instruments Compatible with Illumina® instruments

様々な細胞の包括的な解析にTotalSeqTM試薬をお使いください

platform from 10x Genomics.

BioLegendは、初めてのプロテオゲノミクス用試薬として TotalSeq™-Aの販売を開始しました 。TotalSeq™-A は、オリゴ(dT)を利用してmRNAを単離するscRNA-seqに適合するようデザインされています。抗体に標識されたオリゴヌクレオチド配列内にpoly-Aテールが存在しているため、本試薬は通常のmRNA と同様にscRNA-seq ワークフローにより解析されます。オリゴヌクレオチドには、クローン特異的にラベルされたバーコードとPCRハンドルが含まれており、 Illumina® シーケンシング試薬や機器に適合します。また、BioLegendは、パートナー企業との協働により、10x Genomics社によるFeature Barcode技術などの新しいゲノミクス試薬に対応できるようになりました。新製品であるTotalSeq™-B は Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution (v3)に適合した試薬です。さらに、ワクチンやがん研究に重要な適応免疫反応の解析、特に健康と病気のバランスを左右するキープレーヤーであるB細胞やT細胞のシングルセル解析が増加しています。 このような研究分野をサポートするために、Chromium™ Single Cell Immune Profiling Solutionに適合するTotalSeq™-Cの新規販売・拡充を行っています。

N represents either randomly selected A, C, G, or T. The symbol * indicates a phosphorothioated bond, to prevent nuclease degradation.

2.pdf 2019/04/26 14:24:38

ハッシュタグscRNA-seqプラットフォームでのイムノフェノタイピングとトランスクリプトーム解析を組み合わせたTotalSeq™製品群に加えて、BioLegendではサンプルのマルチプレックス解析を可能とし、マルチプレット検出、およびscRNA-seq機器へ複数サンプルを一度にローディングすることも可能にする、ハッシュタグ抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲートも提供しています。セルハッシュタグ試薬は細胞表面に広汎に発現するマーカーを認識する抗体を活用しています。ヒト用のハッシュタグ試薬はCD298およびβ2ミクログロブリンを認識し、それらは同一のユニークなDNAバーコードでタグ付けされています。また、マウス用試薬は、CD45およびH-2 MHCクラスIを認識し、これらもユニークなバーコードでタグ付けされています。この試薬はプレミックスされており、ready to useで使用できます。

tSNE1

tSN

E2

tSNE1

tSN

E2

Hashtag mRNA

A

B

C

D

CD4 T

CD8 T

NK

B

CD14mono

CD16mono

DC

pDC

左のパネルは、マルチプレックスされた4人の異なるPBMCドナー由来の細胞をハッシュタグを用いて一度にシングルセルプラットフォームにかけたマルチプレックスデータセットを示しています。マルチプレット（灰色）は、解析対象から除去すべき細胞集団を示しています。右のパネルは、マルチプレットを除去した後のトランスクリプトームに基づくクラスタリングを示し、4つのサンプルすべてに点在する異なる免疫細胞集団を判別して示しています。B︓B細胞、T︓T細胞、NK︓ナチュラルキラー細胞、 mono︓単球、DC︓樹状細胞、pDC︓形質細胞様樹状細胞。細胞はハッシュタグ分類に基づいて色分けされています。

Sample A B C D

1. TotalSeq™ 抗体と同じクローンのPE標識抗体を使用したフローサイトメトリー実験を行うことで、使用する抗体量の最適化を行うことができます。フローサイトメトリー実験時の抗体量は、TotalSeq™ 抗体の最適使用量に相当します。

2. Alexa Fluor® 647等で蛍光標識されたpoly-dTオリゴヌクレオチドなどの二次試薬もしくはPE標識された二次抗体を使用することができます。

3. シーケンシングによる抗体のタイトレーションにはコストがかかりますが、ハッシュタグ製品を使用することで、下記図のようにタイトレーションを簡便に行うことができるようになります。

Peripheral blood leukocytes from human and mouse were stained with a panel of TotalSeq™ antibodies with serial dilution (six points each). Additionally, each titration point was labeled with a distinct hashtag antibody (for human or mouse). After staining, all samples were pooled together for single-cell partitioning, library construction, and next-generation sequencing. Panel A shows cell clusters based on hashtag detection. Panel B shows signal levels of each human hashtag superimposed on the clusters. Panels C and D show examples of titration results (counts) after sequencing and after normalization (C, clone 3G8 for human CD16 and D, clone HI30 for human

which optimal staining concentrations can be selected.

3.pdf 2019/04/26 14:26:19

C

M

Y

CM

MY

CY

CMY

K

3.pdf 2019/04/26 16:04:52

Library Constructionprimer

10xGenomicsより別途購入が必要お客様による準備が必要（プライマー情報はBioLegend社プロトコルに記載あります）

10xGenomicsより別途購入が必要

＊プロトコルは下記をご参照ください。https://www.biolegend.com/protocols/totalseq-a-antibodies-with-10x-single-cell-3-reagent-kit-v3-protocol/5010/

ハッシュタグ製品は実験ワークフローや複雑な実験条件の最適化に役立ちます。また、TotalSeq™ 抗体の使用量の最適化にもご使用いただけます。TotalSeq™ 抗体のタイトレーションは、下記のように直接もしくは間接的な手法で行っていただけます。

オリゴヌクレオチドコンジュゲートTotalSeq™ 抗体ハイスループットシングルセルプロテオゲノミクス研究用試薬

PBMC（5000Cells）でのシングルセルトランスクリプトーム解析によるクラスター結果とCITE-seqによる発現プロファイルを比較することで、発現プロファイルが異なる細胞集団が存在することを判別できます。上のパネルは、全細胞中の全体的な遺伝子発現パターンによって細胞をクラスタリングし、遺伝子発現に基づいて分類された主要な細胞型を示しています。下のパネルは、mRNA （青色）および対応する抗体由来タグ（ADT、緑色）のシグナルを示しています。

マルチオミックスデータの同時生成:プロテオームおよびトランスクリプトーム双方のデータを同時に得ることにより、シングルセル実験によって得られる情報が増加します。ドロップアウトの低減:mRNAとは対照的に、TotalSeq™由来のタグは、一般的に偽陰性の原因とされるドロップアウトが起こりにくい傾向があります。細胞種判別性の向上:

ドロップアウト率の低減によりサンプルクラスタリングの向上が期待できます。関連研究分野

• 個別医療• がん研究• 幹細胞研究• 免疫学分野• バイオマーカー探索• 新規希少細胞の同定• 神経学分野• ワクチン学分野

CD3e CD4 CD8a

mRNA

ADT

mRNA

ADT

mRNA

ADT

CD19 CD11b IL7R

mRNA

ADT

mRNA

ADT

mRNA

ADT

B

tSNE1

tSNE2

CD14mono

CD16mono

NK

NKT

CD8 T

CD4 T

CD8 T

DC

pDC

次世代シークエンシング（NGS）および液滴ベースのマイクロ流体技術を用いることで、何千ものシングルセルからなるトランスクリプトームレベルのデータを得るハイスループットシングルセルRNAシークエンシング（scRNA-seq）が可能となりました。近年、10x Genomics ChromiumTMシステムとSingle Cell 3ʼ Solutionが生物医学研究におけるscRNA-seqの普及を促進しており、scRNA-seqを利用してプレシジョン・メディシンへの道のりを早めることが期待されています。生物においてタンパク質は非常に重要であるにも関わらず、従来はプロテオミクスをこれらのハイスループットscRNA-seqアッセイに組み込むことは出来ませんでした。BioLegendの新製品TotalSeq™はハイスループットでシングルセルのトランスクリプトームとプロテオーム双方のデ ータ生成を同時に可能にし、生物医学研究における新たな発見をもたらすことが期待されます。

トミーデジタルバイオロジー株式会社〒112-0002 東京都文京区小石川1-1-17日本生命春日駅前ビル 3階email: info_ap@digital-biology.co.jp phone: 03-6240-0843

Learn more at: biolegend.com/totalseq

High

Low

HighLow

High

Low

HighLow

TotalSeq™ Antibody Oligonucleotide ConjugatesBioLegend社の品質保証 BioLegendは、品質なしに継続的なイノベーションは起こり得ないと確信しています。それゆえに、全ての製品が最高品質の基準を満たすことを確認しています。

TotalSeq™製品ラインにおける品質保証:正確なオリゴ標識とシークエンシングTotalSeq™製品の全ロットは抗体あたり1または2個のオリゴが標識されています。また、製品に未標識抗体が含まれないことを検証しています。さらに、正しいオリゴバーコードが（かつ、正しいバーコードのみが）抗体に結合していることをシークエンシングで確認しています。

厳密なフローサイトメトリー試験すべてのロットにおいて、フローサイトメトリー試験を実施し、その抗体が本来標的とする細胞集団が染色されることと、オリゴが抗体に結合していることを確認しています。このプロセスは、従来の2ステップフローサイトメトリー染色との比較によって検証されています。

A B

A. Unconjugated antibody.

B. Pooled fractions of conjugated antibodies with one (lower band), or two (upper band) oligonucleotides.

Clone UCHT1 Clone RPA-T4A

Clone UCHT1 Clone RPA-T4B

Clone UCHT1 Clone RPA-T4C

Isoelectric focusing gel

（A）蛍光標識二次抗体で検出された未標識精製抗体。（B）同じ蛍光標識二次抗体で検出されたTotalSeq™抗体。（C）蛍光標識オリゴdTがハイブリダイズしたTotalSeq™抗体。これら3つの方法はすべて、適切な細胞集団について同様の染色プロファイルを示します。上記の例では、T細胞はCD3とCD4について一貫した染色性を示すことが確認されます。

トミーデジタルバイオロジー株式会社〒112-0002 東京都文京区小石川1-1-17日本生命春日駅前ビル 3階email: info_ap@digital-biology.co.jp phone: 03-6240-0843

購入者がBioLegendのTotalSeq™ 製品をご自身の使用目的に使用するために必要な知的所有権を有しているかを判断する責任は購入者のみが負うものとします。例として、購入者がTotalSeqTMを使用するプラットフォームに関して、当該プラットフォーム自体の使用およびTotalSeq™をそのプラットフォームで使用するために必要な第三者の知的財産権をすべて所有しているかは、購入者自身の責任で判断してください。AlexaFluor®は、Life Technologies Corporationの登録商標です。Chromium™は10x Genomicsの商標です。

4.pdf 2019/04/26 14:35:27

C

M

Y

CM

MY

CY

CMY

K

1_F.pdf 2019/04/26 16:00:40