Tossicologia Sperimentale Animale: Studi in Acuto, a Medio e a Lungo Termine Milano, 24 Ottobre...

Tossicologia Sperimentale Animale: Studi in Acuto, a Medio e a Lungo Termine

Milano, 24 Ottobre 2008

Definizione• La tossicologia è la branca della medicina, il

cui interesse si estende anche alla chimica, che studia sintomi, meccanismi e trattamenti degli avvelenamenti di persone e animali ad opera di droghe, veleni o farmaci. Il principale parametro per determinare la tossicità di una sostanza è la dose: infatti, quasi tutte le sostanze, in certe dosi o in determinate circostanze possono essere tossiche.

http://it.wikipedia.org/wiki/Medicina

http://it.wikipedia.org/wiki/Chimica

http://it.wikipedia.org/wiki/Droga

http://it.wikipedia.org/wiki/Veleno

http://it.wikipedia.org/wiki/Farmaco

http://it.wikipedia.org/wiki/Tossicit%C3%A0

EgyptiansThe Ebers Papyrus Dated to 1500 BCE, compiles material back to 3000 BCE Named for EgyptologistGeorg Moritz Ebers (1837-1898) 20 m scroll with 700 drugs in 900 formulas Indications, dosages andappropriate spells.

• Theophrastus Phillippus Aureolus Bombastus von Hohenheim, Paracelsus (1493-1541)

• The Father of Toxicology

“The dose makes the poison”

Storia della Tossicologia(alcune date fondamentali)

• 1535 - Paracelsus: dose• 1578 - Harvey: moderna scienza sperimentale• 1775 - Potts: primo caso di “occupational cancer”• 1900 - Ehrlich: recettore

• 1927 - Trevan: LD50

• 1961 - Truhaut: NOAEL

Tossicologia(discipline di competenza)

• Farmaci

• Alimenti

• Ambiente

• Occupazionale

Iter per lo sviluppo di un farmaco

Autorità regolatorie:– Nazionali

• FDA (USA)

• MHLW (Giappone)

– Regionali

• EMEA (Europa)

FDA's Mission Statement

The FDA is responsible for protecting the public health by assuring the safety, efficacy, and security of human and veterinary drugs, biological products, medical devices, our nation’s food supply, cosmetics, and products that emit radiation. The FDA is also responsible for advancing the public health by helping to speed innovations that make medicines and foods more effective, safer, and more affordable; and helping the public get the accurate, science-based information they need to use medicines and foods to improve their health.

European Medicines Agency

European Medicines Agency (EMEA) is a decentralised body of the European Union with headquarters in London.Its main responsibility is the protection and promotion of public and animal health, through the evaluation and supervision of medicines for human and veterinary use. The EMEA coordinates the evaluation and supervision of medicinal products throughout the European Union. The Agency brings together the scientific resources of the 25 EU Member States in a network of 42 national competent authorities. It cooperates closely with international partners, reinforcing the EU contribution to global harmonisation.

Organization of the Ministry of Health, Labour and Welfare

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ [ ] _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _

(MHLW)

Schema generale dello sviluppo di una NCE (New Chemical Entity)

100 000 NCEesaminate

2-3 farmaci fanno profitto

0.002%-0.003%

Inizio sperimentazione clinica di Fase I

First human dose (FHD)

Safety, pharmacokinetics

Sperimentazione esplorativa sul paziente

Fase II

Studi definitivi sul paziente

Fase III

Registrazione

Selezione

discovery

Screeningtossicologico

Tossicologia

acuta e subacuta per FHD

Mutagenesi in vitro

Safety pharmacology

Tossicologia sulla funzione riproduttiva

Mutagenesi in vivo

Tossicologia cronica

Cancerogenesi

sviluppo

Tossicologia(tipo di studi)

• IN VIVO: esposizione acuta e cronica, potenziale cancerogeno, effetto sulla riproduzione, teratologia

• IN VITRO: culture cellulari (animali e umane), microsomi

Sperimentazione animale in Tossicologia

Regolamentata in Italia dal decreto 116 del 27 gennaio 1992 (applicazione di normative CEE del 1986)

• provenienza degli animali da impiegare per le provenienza degli animali da impiegare per le sperimentazioni, condizioni di stabulazione, sperimentazioni, condizioni di stabulazione, modalità di sperimentazione, autorizzazioni per modalità di sperimentazione, autorizzazioni per personale e strutture personale e strutture


• Topi 60%Topi 60%

• Ratti 20% Ratti 20%

• Conigli 5% Conigli 5%

• Altre specie ( Cavie, Cani, Rettili, Scimmie) Altre specie ( Cavie, Cani, Rettili, Scimmie)

Specie maggiormente utilizzate

TopoTopo• durata vita durata vita 1-3 anni1-3 anni• peso adulto peso adulto 20-40 g20-40 g• maturità sessuale a maturità sessuale a 50 giorni 50 giorni• ciclo estrale ciclo estrale 4-5 giorni4-5 giorni• gestazione gestazione 20 giorni20 giorni• numerosità prolenumerosità prole 10-1210-12• età allo svezzamento età allo svezzamento 20 giorni 20 giorni• frequenza cardiaca frequenza cardiaca 600 batt/min 600 batt/min• pressione arteriosa pressione arteriosa 100-160 mmHg 100-160 mmHg• frequenza respiratoria frequenza respiratoria 160 atti/min160 atti/min

Specie maggiormente utilizzate

RattoRatto• durata vita durata vita 2,5-3 anni2,5-3 anni• peso adulto peso adulto 300-600 g300-600 g• maturità sessuale a maturità sessuale a 60 giorni 60 giorni• ciclo estrale ciclo estrale 4-5 giorni4-5 giorni• gestazione gestazione 20-23 giorni20-23 giorni• numerosità prolenumerosità prole 8-148-14• età allo svezzamento età allo svezzamento 20 giorni 20 giorni• frequenza cardiaca frequenza cardiaca 300-400 batt/min 300-400 batt/min• pressione arteriosa pressione arteriosa 60-180 mmHg 60-180 mmHg• frequenza respiratoria frequenza respiratoria 80 atti/min80 atti/min

Specie maggiormente utilizzateConiglioConiglio• durata vita durata vita 5-13 anni5-13 anni• peso adulto peso adulto 4-6 kg4-6 kg• maturità sessuale a maturità sessuale a 6-10 mesi6-10 mesi• gestazione gestazione 30-35 giorni30-35 giorni• numerosità prolenumerosità prole 4-104-10• età allo svezzamento età allo svezzamento 30-45 giorni30-45 giorni• frequenza cardiaca frequenza cardiaca 100-300 batt/min100-300 batt/min• pressione arteriosa pressione arteriosa 60-130 mmHg60-130 mmHg• frequenza respiratoria frequenza respiratoria 30-60 atti/min30-60 atti/min

Estrapolazione da animale a uomo

Variabilità individualeVariabilità individuale Variabilità tra specie Variabilità tra specie Variabilità Variabilità tra razzetra razze

Ulteriori informazioni dirette di effetti tossici sull’uomo:Ulteriori informazioni dirette di effetti tossici sull’uomo: controlli medici di lavoratori esposti a specifici controlli medici di lavoratori esposti a specifici

composticomposti studi epidemiologicistudi epidemiologici rilievi su pazienti dopo assunzione di dosi eccessive di rilievi su pazienti dopo assunzione di dosi eccessive di

farmaci o esposti a quantità elevate di sostanze farmaci o esposti a quantità elevate di sostanze chimichechimiche


Un maggior grado di attendibilità di Un maggior grado di attendibilità di possibili effetti tossici sull’uomo da studi possibili effetti tossici sull’uomo da studi su animali può derivare da:su animali può derivare da:

• impiego di diverse specie animaliimpiego di diverse specie animali

• accurate indagini sui meccanismi e velocità di accurate indagini sui meccanismi e velocità di biotrasformazione nelle varie speciebiotrasformazione nelle varie specie

• impiego di condizioni simili alle situazioni impiego di condizioni simili alle situazioni di di esposizione dell’uomoesposizione dell’uomo

Estrapolazione da animale a uomo Valutazione della Valutazione della “safety”“safety” o ragionevole o ragionevole

indicazione che non verifichino danni a indicazione che non verifichino danni a uomo o ambiente se il composto in oggetto uomo o ambiente se il composto in oggetto viene impiegato alle dosi e condizioni viene impiegato alle dosi e condizioni proposteproposte

ADIADI (acceptable daily intake) o dose (acceptable daily intake) o dose giornaliera accettabile giornaliera accettabile

stabilita in base al dato distabilita in base al dato di

NOAELNOAEL: no observable adverse effect level: no observable adverse effect level


ADIADI quantità giornaliera di un composto che, quantità giornaliera di un composto che, assunta per tutto il periodo della vita, assunta per tutto il periodo della vita, appare appare essereessere priva di apprezzabili rischi per la salute, priva di apprezzabili rischi per la salute, sulla base delle conoscenze al momento sulla base delle conoscenze al momento disponibilidisponibili

NOAEL NOAEL massima dose che non ha determinato,massima dose che non ha determinato, sulla base del più sensibile indicatore biologicosulla base del più sensibile indicatore biologico, , alcun segno di tossicità alcun segno di tossicità nella più reattiva specie nella più reattiva specie animale trattataanimale trattata

GLP – “Good Laboratory Practice”

Proposte dalla FDA nel 1978 raccolgono requisiti Proposte dalla FDA nel 1978 raccolgono requisiti richiesti per effettuare studi sperimentali, richiesti per effettuare studi sperimentali, stesura di protocolli, raccolta e archiviazione stesura di protocolli, raccolta e archiviazione della documentazione relativadella documentazione relativa

Anche l’EPA (Environmental Protective Agency) Anche l’EPA (Environmental Protective Agency) ha proposto GLP per lo studio di effetti ha proposto GLP per lo studio di effetti sull’ambientesull’ambiente

BPL – “Buone pratiche di laboratorio”

Regolamentate in Italia dal Decreto Legislativo Regolamentate in Italia dal Decreto Legislativo no. no. 50 del 2 Marzo 200750 del 2 Marzo 2007

Attuazione delle direttive CEE in materia di Attuazione delle direttive CEE in materia di Ispezione e verifica della buona prassi di Ispezione e verifica della buona prassi di laboratoriolaboratorio


Studi di tossicità:Studi di tossicità:

ACUTAACUTA A MEDIO TERMINE A MEDIO TERMINE (subacuta o subcronica)(subacuta o subcronica)

A LUNGO TERMINEA LUNGO TERMINE

Linee guida definite da OECDLinee guida definite da OECD


TOX. ACUTA Singola dose

TOX. A MEDIO

TERMINE

Tox. subacutaTox. 14- 28 giorni

Tox. subcronicaTox. 90-180 giorni

TOX. A LUNGO

TERMINE

Tox. > 180 giorni (fino a 2 anni)


Tossicità Acuta (I) singola doseTossicità Acuta (I) singola doseLinee guida OECD no. 420 – 423- 425Linee guida OECD no. 420 – 423- 425Permette di identificare la categoria di un Permette di identificare la categoria di un

composto tossico composto tossico


Tossicità Acuta (II) singola doseTossicità Acuta (II) singola doseSingola dose orale (via di somm. nell’uomo)Singola dose orale (via di somm. nell’uomo)Roditori (età 8-12 settimane)Roditori (età 8-12 settimane)Solitamente femmine (più sensibili) Solitamente femmine (più sensibili) Osservazioni fino a 14 giorniOsservazioni fino a 14 giorniRegistrazione del peso corporeo e necroscopia Registrazione del peso corporeo e necroscopia

Classificazione di Tossicità Acuta• In accordo con il GHS (Globally Harmonized In accordo con il GHS (Globally Harmonized

System for Chemical Substances and System for Chemical Substances and Mixtures)Mixtures)

• Categoria Categoria

• 1 1 < 5 mg/kg< 5 mg/kg

• 22 5-50 mg/kg5-50 mg/kg

• 3 3 50-300 mg/kg50-300 mg/kg

• 44 300-2000 mg/kg300-2000 mg/kg

• 55 2000-5000 mg/kg2000-5000 mg/kg


Tossicità Acuta (III) singola doseTossicità Acuta (III) singola doseLimit testLimit test: usato quando si ritiene che la sostanza : usato quando si ritiene che la sostanza

in esame non sia tossica. Dose testata 2000 in esame non sia tossica. Dose testata 2000 mg/kg (o in casi particolari 5000 mg/kg)mg/kg (o in casi particolari 5000 mg/kg)


Tossicità Acuta (IV) singola doseTossicità Acuta (IV) singola dose• Sighting studySighting study (studio bersaglio): (studio bersaglio):

• fase esplorativa partendo da una dose fase esplorativa partendo da una dose selezionata tra 5, 50, 300 e 2000 mg/kg. Se non selezionata tra 5, 50, 300 e 2000 mg/kg. Se non si hanno riferimenti sulla possibile tossicità, la si hanno riferimenti sulla possibile tossicità, la dose di partenza sarà di 300 mg/kg.dose di partenza sarà di 300 mg/kg.

Sighting study (studio bersaglio):


Tossicità Acuta (V) singola doseTossicità Acuta (V) singola dose• Main testMain test::• Si parte dalla dose indicata dal sighting study. Si Si parte dalla dose indicata dal sighting study. Si

utilizzano 5 animali per ogni dose, di un solo sesso. utilizzano 5 animali per ogni dose, di un solo sesso. • Se si rende necessario effettuare il main test su più Se si rende necessario effettuare il main test su più

dosi, si attendono 3-4 giorni tra una dose e l’altra dosi, si attendono 3-4 giorni tra una dose e l’altra • Valutati: mortalità, variazioni in peso, analisi Valutati: mortalità, variazioni in peso, analisi

istologicaistologica

Main testMain test

START

5 female300 mg/kg

A B C

5 female2000 mg/kg

A

5 female 5 mg/kg

B

5 female 50 mg/kg

C A B CA B C

Study concluded

GHS category 1 2 2 3 3 4 4 5 5


Tossicità a medio termine (I) – 14-28 giorniTossicità a medio termine (I) – 14-28 giorni Linee guida OECD no. 407Linee guida OECD no. 407 permette di identificare NOAEL, LOAEL (lowest permette di identificare NOAEL, LOAEL (lowest

observed adverse effect level)observed adverse effect level) 14-28 giorni di trattamento giornaliero14-28 giorni di trattamento giornaliero Roditore e non roditoreRoditore e non roditore Sia maschi che femmine (5+5)Sia maschi che femmine (5+5) Utilizzate almeno tre dosi (una che dia lievi effetti Utilizzate almeno tre dosi (una che dia lievi effetti

tossici, una non tossica, una o più intermedie)tossici, una non tossica, una o più intermedie)


Tossicità a medio termine (II) – 14-28 giorniTossicità a medio termine (II) – 14-28 giornivalutazione degli effetti: variazioni di peso, di valutazione degli effetti: variazioni di peso, di

consumo del mangime, esami ematologici, consumo del mangime, esami ematologici, ematochimici, esami delle urine, esami post-ematochimici, esami delle urine, esami post-mortem (peso degli organi, istologia)mortem (peso degli organi, istologia)


Tossicità a medio termine (III) - 90-180 giorniTossicità a medio termine (III) - 90-180 giorni Linee guida OECD no. 408 (roditori), 409Linee guida OECD no. 408 (roditori), 409 permette di identificare “maggiori effetti tossici, organi permette di identificare “maggiori effetti tossici, organi

bersaglio e possibilità di accumulo”bersaglio e possibilità di accumulo” 90 -180 giorni di trattamento giornaliero90 -180 giorni di trattamento giornaliero Roditore e non roditoreRoditore e non roditore Sia maschi che femmine (10+10)Sia maschi che femmine (10+10) Utilizzate almeno tre dosi (una che dia lievi effetti Utilizzate almeno tre dosi (una che dia lievi effetti



Tossicità a medio termine (IV) - 90-180 giorniTossicità a medio termine (IV) - 90-180 giorni

valutazione degli effetti: variazioni di peso, valutazione degli effetti: variazioni di peso, consumo di mangime, esami ematologici, consumo di mangime, esami ematologici, ematochimici, esami delle urine, esami post-ematochimici, esami delle urine, esami post-mortem (peso degli organi, istologia)mortem (peso degli organi, istologia)


Tossicità a lungo termine (I) - >180 giorniTossicità a lungo termine (I) - >180 giorni permette di identificare se il farmaco è potenzialmente permette di identificare se il farmaco è potenzialmente

cancerogeno cancerogeno 6-24 mesi di trattamento giornaliero6-24 mesi di trattamento giornaliero Roditore e non roditoreRoditore e non roditore Sia maschi che femmine (10+10)Sia maschi che femmine (10+10) Utilizzate almeno tre dosi (una che dia lievi effetti Utilizzate almeno tre dosi (una che dia lievi effetti


Test Report

Test Substance Test Substance

Vehicle Vehicle

Test animalsTest animals

Test conditionsTest conditions

Results (with Statistic)Results (with Statistic)

Discussion of ResultsDiscussion of Results

ConclusionsConclusions

Tossicologia Sperimentale Animale: Studi in Acuto, a Medio e a Lungo Termine Milano, 24 Ottobre...

Documents

Transcript of Tossicologia Sperimentale Animale: Studi in Acuto, a Medio e a Lungo Termine Milano, 24 Ottobre...