TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA ...ntu.edu.vn/Portals/66/Tap chi...

Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2012

TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG � 163

KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC

TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) CỦA CHỦNG VI KHUẨN

EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ĐỘT BIẾN GEN purA

ASSESSMENT ON THE PATHOGENICITY OF AN EDWARDSIELLA ICTALURI purA MUTANT ON CATFISH (PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS)

Trần Thị Bích Thủy1, Võ Thị Ngọc Trâm2, Nguyễn Thị Chi3,Võ Hoàng Ánh4,Võ Văn Nha5

Ngày nhận bài: 29/9/2011; Ngày phản biện thông qua: 13/4/2012; Ngày duyệt đăng: 12/9/2012

TÓM TẮT

Thí nghiệm gây cảm nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri hoang dại gây bệnh gan thận mủ cá

tra (WT) và chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA từ chủng WT (PAM) được tiến hành trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) có khối lượng 10 - 12g/con để xác định khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của chủng PAM. Kết quả

cho thấy, 100% cá tra được tiêm chủng WT đều bị chết với biểu hiện của bệnh gan thận mủ tương tự như những mô tả ngoài

ao nuôi ở nồng độ tiêm 105CFU/cá, còn tất cả cá tra được tiêm chủng PAM ở nồng độ tiêm 105CFU/cá đều bình thường

sau 15 ngày thí nghiệm, không có cá thể nào biểu hiện bệnh gan thận mủ. Liều gây chết 50% (LD50) của chủng PAM cao

(>109CFU/con). Kết quả nghiên cứu chứng tỏ khả năng gây bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng E. ictaluri bị đột biến

gen purA (PAM) yếu hơn nhiều so với chủng E. ictaluri hoang dại (WT) khi chưa bị đột biến gen purA. Chủng vi khuẩn này

tiếp tục được nuôi cấy lưu giữ, sử dụng xác định khả năng sinh miễn dịch để làm nguyên liệu sản xuất vắc xin nhược độc

phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra sau này.

Từ khóa: cá tra, Edwardsiella ictaluri, đột biến gen purA

ABSTRACT

Striped catfi sh (Pangasianodon hypophthalmus) weighing about 10-12 grams were experimentally infected with

the wild-type Edwardsiella ictaluri and purA mutant strain of E. ictaluri to determine their virulence. The result showed

that all fi sh challenged with wild-type E. ictaluri were killed and displayed a symptom of white spots in the internal

organ as those in naturally infected fi sh at an injected concentration of 105 CFU per fi sh, but all fi sh challenged with PAM

were healthy without any clinical signs of disease at the same concentration after 15 days of exposure. By the injection, a

50% lethal dose (LD50) for PAM was higher than 109 CFU per fi sh. The results demonstrated that PAM strain was highly

attenuated very much compared to wild-type E. ictaluri. Further, this strain continues to determine the immunization as

primary material for production of live attenuated vaccine to prevent the disease symptom of white spots in the internal

organ of striped catfi sh.

Keywords: Pangasianodon hypophthalmus, Edwardsiella ictaluri, purA mutant

1 Trần Thị Bích Thủy: Lớp Cao học Nuôi trồng Thủy sản 2009 - Trường Đại học Nha Trang2 CN. Võ Thị Ngọc Trâm, 3KS. Nguyễn Thị Chi, 4CN. Võ Hoàng Ánh, 5TS. Võ Văn Nha: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III


164 � TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG

I. ĐẶT VẤN ĐỀCá tra Pangasianodon hypophthalmus là loài cá

da trơn nước ngọt được nuôi rộng rãi, đặc biệt ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích nuôi và sản lượng ngày càng gia tăng. Để đạt được sản lượng cao, ngoài việc mở rộng diện tích, người nuôi cá tra đã không ngừng phát triển nhiều loài hình nuôi như nuôi ao, hầm, lồng bè với mật độ thâm canh rất cao. Chính vì vậy, môi trường bị ô nhiễm, làm xuất hiện nhiều loại bệnh, trong đó bệnh gan thận mủ đã gây thiệt hại lớn cho người nuôi, tỷ lệ cá mắc bệnh chết từ 10 - 90%, thậm chí lên đến 100% tùy thuộc vào mức độ nhiễm bệnh và kích thước cá nuôi. Vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra đã kháng với một số loại thuốc kháng sinh như Oxytetracylin, Oxolinic acid,Sulphonamid (Từ Thanh Dung và cộng sự, 2004); Bactrime, Colistin, Florphenicol, Amoxicilin, Tetracyclin,Doxycyclin (Trương Ngọc Loan, 2007). Hơn nữa, các sản phẩm thủy sản sau đó thường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt cá. Do vậy, việc phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vắc xin là vấn đề được đặt ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay. Nghiên cứu này nhằm xác định độc lực của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA làm cơ sở cho việc sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cá tra.

II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu- Chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại gây

bệnh gan thận mủ cá tra (WT) và chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA từ chủng WT (PAM) được cung cấp từ đề tài cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III (Viện III) chủ trì.

- Cá tra Pangasianodon hypophthalmus có khối lượng trung bình 10 g/con được nuôi tại khu thực nghiệm Viện III từ nguồn cá của Trung tâm Quốc gia giống Thủy sản nước ngọt Nam Bộ.

2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn

Hình dạng, kích thước vi khuẩn E. ictaluri được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram, soi trên kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) ở độ phóng đại 1000 lần; kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa bằng kít API 20E (Pháp) kết hợp một số phản ứng sinh hóa truyền thống (KIA, Mannitol di động,oxidase, catalase, khả năng chịu mặn ở 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30‰). Định danh vi khuẩn dựa vào hệ thống phân loại của Bergey’s (1994).

3. Phương pháp gây cảm nhiễm để xác định khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra của vi khuẩn E. ictaluri

Thí nghiệm tiến hành trên hệ thống bể 100L, sục khí 24/24 giờ. Hệ thống thí nghiệm được tẩy trùng bằng chlorin 30ppm trước khi tiến hành và khi kết thúc; nước trong bể sau thí nghiệm có vi khuẩn gây bệnh được xử lý với thuốc tím 50ppm 1 ngày trước khi thải ra nguồn nước thải chung. Cá tra giống có khối lượng từ 10 - 12g/con khỏe mạnh được nuôi lớn và ổn định tại Viện III trước khi đưa vào thí nghiệm. Cá được bố trí ngẫu nhiên 30 cá/bể. Trước khi gây cảm nhiễm, chọn ngẫu nhiên 3 cá để kiểm tra ký sinh trùng và sự hiện diện của vi khuẩn.

Chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm được phục hồi trên môi trường thạch BHIA (Brain HeartInfution Agar) và giữ trong tủ ấm 48 giờ ở 280C, sau đó chọn một khuẩn lạc đơn tăng sinh trong môi trường BHI lỏng (Brain Heart Infusion Broth) 24 giờ, xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch BHIA của Koch. Dùng phương pháp tiêm vi khuẩn vào khoang bụng của cá thí nghiệm với liều tiêm 0,1 mL/cá ở các nồng độ 105(PAM.5), 106(PAM.6), 107(PAM.7), 108(PAM.8), 109(PAM.9) CFU/cá (chủng PAM) và 103(WT.3), 104(WT.4), 105(WT.5), 106(WT.6), 107(WT.7), 108(WT.8) CFU/cá (chủng WT). Lô đối chứng (ĐC) tiêm 0,1ml/cá nước muối sinh lí (0,85% NaCl). Thí nghiệm lặp lại 3 lần theo không gian, được theo dõi trong 2 tuần.

Theo dõi và ghi nhận biểu hiện của cá trong suốt quá trình thí nghiệm: xác định thời gian cá bắt đầu xuất hiện dấu hiệu bệnh do vi khuẩn gây ra; thời gian cá chết; mổ khám nghiệm để đánh giá mức độ bệnh lý của cá; thu mẫu cắt lát mô gan, thận và lách cá theo Coolidge và Howard (1979) để đánh giá mức độ của bệnh trên tế bào mô, từ đó so sánh với lô đối chứng để đánh giá độc lực của chủng vi khuẩn đột biến (PAM), đồng thời tái phân lập và định danh lại vi khuẩn từ gan, thận và lách cá yếu để khẳng định sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri.

4. Phương pháp xác định liều gây chết 50% (LD50): Theo phương pháp Reed-Muench (1938)

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

1. Một vài đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA1.1. Đặc điểm hình thái

Trên môi trường nuôi cấy BHIA, vi khuẩn E.ictaluri bị đột biến gen purA (PAM) cũng như E. ictaluri



hoang dại (WT) đều phát triển chậm. Cụ thể, ở nhiệt độ 280C, sau 48 giờ nuôi cấy khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên mặt đĩa thạch có kích thước đường kính khoảng 1mm, màu trắng hơi đục, dạng tròn trơn, hơi lồi, rìa có dạng không đồng nhất (hình 1A, B). Khi nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA có dạng hình que ngắn, không có nhân, đơn hoặc chuỗi ngắn, bắt màu hồng với thuốc nhuộm Gram

(gram âm), kích thước 1 x 2-4µm (hình 1C) tương tự hình dạng chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại (WT) (hình 1D). Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự như những mô tả về hình thái chủng E. ictaluri thu được từ cá tra bị bệnh gan thận mủ (chủng hoang dại) của Từ Thanh Dung và cộng sự (2004). Điều này chứng tỏ vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA có kiểu hình ổn định, không thay đổi sau khi bị đột biến và có khả năng nuôi cấy và lưu giữ.

Hình 1. Khuẩn lạc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (A, B) trên môi trường BHIA C-vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA. D-vi khuẩn E. ictaluri hoang dại (chưa đột biến)

A B 1mm

1.2. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi

khuẩn E. ictaluri (PAM, WT) được kiểm tra bằng phương pháp truyền thống và dùng kít API 20E. Kết quả thu được được thể hiện ở Bảng 1

Kết quả từ bảng 1 cho thấy các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (PAM) như: Gram âm, kỵ khí tùy tiện, di

A B 1mm C D

động yếu, cho phản ứng oxydase âm tính, catalase dương, lysin dương, âm tính với các loại đường ngoại trừ Glucose,… đều tương đồng với chủng vi khuẩn E. ictaluri hoang dại (WT) và của khóa phân loại Bergey’s (1994). Điều này khẳng định chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (PAM) cũng cho các đặc điểm sinh lý, sinh hóa không khác gì so với chủng E. ictaluri hoang dại (WT).

Bảng 1. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn E. ictaluri (PAM, WT)

Đặc điểm Chất nền E. ictaluri (PAM) E. ictaluri (WT) E. ictaluri theo Bergey’s

Hình dạng Que Que QueGram - - -Di động Yếu YếuOxidase Oxidase - - -Catalase Catalase + + +O/F +/+ +/+ +/+ONPG Orthonitrophenyl - - -ADH Arginin - - -LDC Lysin + + +ODC Ornithin - - VCIT Sodium citrat - - -H2S Sodium thisulfat - - -URE Urê - - -TDA Tryptophan - - -IND Indol - - -VP Sodium piruvac - - -



2. Khả năng gây bệnh gan thận mủ cá tra và LD50 của vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA

Kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng PAM và WT bằng cách tiêm vào xoang bụng của cá tra khỏe (khối lượng 10 - 12g/con) được thể hiện ở hình 2.

Hình 2. Tỉ lệ chết tích lũy của cá theo thời gian thí nghiệm

Kết quả từ hình 2 cho thấy, cá tra được gây

nhiễm vi khuẩn bắt đầu xuất hiện dấu hiệu bệnh

lý sau 60 giờ cảm nhiễm. Cá thí nghiệm chết sau

72 giờ tiêm (ngày thứ 3) và tỷ lệ chết tích lũy đạt

100% ở ngày thí nghiệm thứ 7 tại các lô tiêm chủng

WT có nồng độ tiêm 1,7x105CFU/con (tương ứng

với 1,7x106CFU/ml) trở lên. Ngược lại, tất cả cá tra

được tiêm chủng PAM đều bình thường sau 14 ngày

thí nghiệm ở cùng nồng độ. Ở lô tiêm chủng PAM

với nồng độ cao: 1,4 x 109CFU/cá (tương đương

1,4 x 1010CFU/ml), tỉ lệ chết tích lũy của cá tra cao

nhất chỉ đạt 18,9% vào ngày thứ 5 sau khi tiêm.

Liều gây chết 50% (LD50) của chủng vi khuẩn PAM

cao (>109CFU/con) trong khi đó LD50 của chủng vi

khuẩn WT là 103,14CFU/con. Kết quả của Nguyễn

Mạnh Thắng (2007), Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng

sự (2009) khi nghiên cứu về liều gây chết của cá tra

sau khi tiêm chủng E. ictaluri cho thấy, liều gây chết

50% cá thí nghiệm (LD50) là 2,5x104 tế bào/0,2ml/

cá (Nguyễn Mạnh Thắng, 2007); <102 CFU/ml

(chủng CAF-08-01 độc lực cao nhất) và 106,81 CFU/

ml (chủng CAF-07-02 độc lực thấp nhất) (Đặng Thị

Hoàng Oanh và cộng sự, 2009). Như vậy, kết quả

nghiên cứu của chúng tôi đã chứng tỏ khả năng gây

bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng E. ictaluri

bị đột biến gen purA (PAM) yếu hơn nhiều so với

chủng E. ictaluri hoang dại (WT) gây bệnh gan thận

mủ cá tra khi chưa bị đột biến gen purA.

Quan sát dấu hiệu bệnh lý của cá tra bị bệnh

do cảm nhiễm nhân tạo ở cả hai nghiệm thức tiêm

chủng PAM và chủng WT cho thấy giống như dấu

hiệu bệnh lý của cá nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ngoài

GEL Gelatin - - -GLU Glucose + + +Gas Hơi - - VKhử Nitrate Nitrate + + +MAN Manitol - - -INO Inositol - - -SOR Sorbitol - - -RHA Rhamnose - - -SAC Sacrose - - -MEL Melibiose - - -AMY Amygdalin - - -ARA Arabinose - - -Lactose Lactose - - -Độ muối (‰)0;5;10;15;20;25 NaCl + +30 NaCl - -

+: dương tính; -: âm tính; V: biến đổi (có chủng âm tính, chủng dương tính)



tự nhiên. Cụ thể, cá bệnh có thể có hoặc không

xuất hiện các dấu hiệu bất thường bên ngoài. Đa

số cá bệnh đều có dấu hiệu xuất huyết nhẹ ở gốc

vây, xung quanh miệng và vùng bụng, một số xuất

huyết quanh mắt, hậu môn sưng. Trước khi chết, cá

bơi lờ đờ, mất phương hướng, màu sắc cá sậm lại.

Giải phẫu nội tạng cho thấy tất cả cá bệnh đều có

những dấu hiệu bệnh lý đặc trưng là sự xuất hiện

các đốm trắng có đường kính 1 - 2mm ở gan, thận

và lách (hình 3). Gan, thận, lách sưng to, một số cá

có thận bị nhũn, ổ bụng chứa dịch màu trắng. Các

đốm trắng thường xuất hiện trước tiên ở thận, sau

đó là ở lách và gan. Ở gan, các đốm trắng thường

thưa hơn so với thận và thường không thấy đốm

trắng ở cá chết giai đoạn sớm. Riêng cá ở các lô đối

chứng và cá khỏe còn lại ở các lô thí nghiệm chủng

PAM vẫn ở trạng thái bình thường trong suốt thời

gian thí nghiệm.

Mô bệnh học các tổ chức gan, thận và lách của

cá tra bệnh sau cảm nhiễm (hình 4) cho thấy nhiều

vùng mô bị hoại tử nghiêm trọng, mất đi cấu trúc

bình thường. Tại vị trí hoại tử, tế bào thường bị biến

dạng, cấu trúc rời rạc với nhân kết đặc và phì đại

hơn bình thường bắt màu tím của hematocyline.

Đồng thời quan sát được sự có mặt của các đám

trực khuẩn bắt màu tím của hematocyline thường

tập chung thành từng bó (hình 4C-mũi tên). Trong

khi đó cá khỏe còn lại ở các lô thí nghiệm chủng

PAM cho kết quả mô học gan, thận và lách tương

tự như cá tra khỏe ở lô đối chứng.

A B

Hình 3. Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A). Đốm trắng trên nội quan cá trađược gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri (B)

Hình 4. Mô bệnh học cá tra bị bệnh gan thận mủLát cắt mô bệnh học của gan (A), thận (B) và lá lách (C) của cá tra bị bệnh gan thận mủ cho thấy nhiều vùng hoại tử nghiêm trọng làm tế bào bị biến dạng, cấu trúc lỏng lẻo, nhân tế bào phì to và ưa kiềm (B-đầu mũi tên), tại những ổ hoại tử này có thể quan sát thấy từng đám vi khuẩn hình que bắt màu tím của hematocylin (C-mũi tên).

C

A B C



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Từ Thanh Dung, Crumlish M., Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh, Đặng Thị Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, trang 137-142.

2. Đồng Thanh Hà và Đỗ Thị Hòa, 2008. Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh mủ ở gan thận trên cá tra nuôi tại Bến Tre. Truy cập ngày 20 tháng 06 năm 2009 từ http://www.ntu.edu.vn/khoa/nuoitrong/privateres/khoa/nuoitrong/fi le/sv/2008-dong.

3. Trương Ngọc Loan, 2007. Khảo sát hiện trạng nuôi cá tra thâm canh ở tỉnh Đồng Tháp và mô tả một số đặc điểm của vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ. Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

4. Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, 2009. Độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá tra(Pangasius hypophthalmus) bệnh mủ gan. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số 12/2009, trang 64-70.

Tiếng Anh

5. Nguyen Manh Thang, 2007. Report on Fish Vaccine production. RIA2 and NAVETCO: workshop on development vaccine used in Aquaculture. in Ha Noi 6/20007.

6. Coolidge and Howard R. M., 1979. Animal Hispathology Procedures (2nd edn. ed.,), National Institutes of Health, Bethesda.

Sau khi gây cảm nhiễm, vi khuẩn được tái phân lập và định danh từ gan, thận và tỳ tạng của cá tra thí nghiệm có dấu hiệu bệnh sắp chết. Kết quả đều cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập này là vi khuẩn E. ictaluri với các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa giống như các chủng vi khuẩn E. ictaluri gây cảm nhiễm ban đầu.

IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊKết quả nghiên cứu chứng tỏ khả năng gây

bệnh gan thận mủ trên cá tra của chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA yếu hơn nhiều so với chủng

E. ictaluri hoang dại gây bệnh gan thận mủ cá tra khi

chưa bị đột biến gen purA. Liều gây chết 50% (LD50)

của chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA đối với cá

tra rất cao, trên 109 CFU/cá (1010 CFU/ml). Vi khuẩn

E. ictaluri bị đột biến gen purA cần phải được tiếp

tục xác định khả năng đáp ứng miễn dịch khi tiêm/

ngâm chủng vi khuẩn này với cá tra khỏe để từ đó

có thể sử dụng làm nguyên liệu cho việc sản xuất

vắc xin nhược độc phòng bệnh gan thận mủ trên cá

tra nuôi.

TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA ...ntu.edu.vn/Portals/66/Tap chi...

Documents

Transcript of TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA ...ntu.edu.vn/Portals/66/Tap chi...