TITULACION DE AMINOACIDOS

Titulación de Aminoácidos – Página 1

Bioquímica Harry Alices-Villanueva, Ph.D.

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS & MATEMÁTICAS

Bioquímica

LABORATORIO: TITULACION DE AMINOACIDOS

Prof. Harry Alices-Villanueva, Ph.D.

Los aminoácidos alfa son los bloques constituyentes de las proteínas. Casi todas las proteínas consisten de varias combinaciones de los mismos 20 aminoácidos. Los aminoácidos son compuestos que contienen un grupo amino, ―NH2, y un grupo carboxilo, ―COOH. En adición hay

un grupo “R” que es diferente para cada aminoácido. El símbolo “R” se utiliza aquí para representar una abreviatura generalizada para indicar un grupo orgánico.

NH2 |

R ― C ― H |

COOH

En sistemas fisiológicos donde el pH es casi neutral, el grupo amino de un aminoácido estará protonado y el grupo carboxilo estará ionizado.

NH3+

| R ― C ― H

| COO-

Esto se conoce como la forma zwitterion del aminoácido.



En soluciones fuertemente ácidas, el grupo carboxilo estará también protonado, mientras en soluciones muy básicas ambos grupos, el carboxílico y el amino, estarán en forma no-protonada. NH3

+ NH2 | | R ― C ― H R ― C ― H | | COOH COO- Ácido Básico

EL comportamiento ácido-base de los aminoácidos se describe mejor con la teoría de Bronsted de ácidos y bases. Un aminoácido simple (que no tenga un grupo ionizable ácido o básico en el grupo “R”) es un ácido bibásico en su forma totalmente protonada; puede donar dos protones durante su titulación completa con una base. La titulación con NaOH es una titulación en dos pasos representada como:

+NH3CHRCOOH + OH- � +NH3CHRCOO- + H2O

+NH3CHRCOOH + OH- � NH2CHRCOO- + H2O La sal hidrocloruro de un aminoácido simple contiene un mol de HCl por cada mol de aminoácido tal que el mismo está totalmente protonado.

+NH3CHRCOOH + Cl-

La curva de titulación será bifásica (vea diagrama abajo). Habrá dos porciones separada o inflexiones en la curva de titulación. El punto medio de la primera inflexión (B) es donde el aminoácido está mitad en forma ácida y mitad en forma zwitterion. EL punto de inflexión C ocurre cuando todo el aminoácido original ya está en forma de zwitterion. El pH

al cual esto ocurre se denomina el pH isoeléctrico (punto isoleléctrico) y se le da el símbolo pI (asumiendo que el grupo “R” no tiene carga). En la titulación de pH de un aminoácido con un grupo no ionizable “R”, el punto de equivalencia ocurre en el pI del aminoácido. En el punto medio de la segunda inflexión (D), la mitad del aminoácido está en forma de zwitterion y la otra mitad está en forma básica.



A: 100% +NH3CHRCOOH B: 50% +NH3CHRCOOH y 50% +NH3CHRCOO-

C: 100% +NH3CHRCOO- D: 50% +NH3CHRCOO- y 50% NH2CHRCOOH E: 100% NH2CHRCOO-

Los valores aparentes de pK par alas dos etapas de disociación pueden

ser extrapolados de los puntos medio de cada inflexión. Esto se puede demostrar con la ecuación de Henderson-Hasselbach:

][

][log

ácido

aniónpKpH a +=

El pKácido (el pK del grupo carboxílico) es el punto (B) donde la mitad del grupo ácido ha sido titulado. En este punto la ecuación se vuelve:

pH = pKa

Del mismo modo, el punto (D) nos da el valor del pKamino. En este experimento, usted titulará una muestra de un aminoácido desconocido y determinará su pI, pKácido, y el pKamino y comparará estos

valores con los valores reales (teóricos).



MATERIALES

Buretas de 50 mL Tres beakers de 150 mL Barras magnéticas Tres beakers de 100 mL

Agitador magnético Pipeta de 25 mL Medidor de pH con su electrodo Pipeta de 10 mL Bulbo de pipeta Kimwipes™ SOLUCIONES

Solución de NaOH, 0.3 M

Solución de la sal de cloruro de un aminoácido A, 0.1 M Solución de la sal de cloruro de un aminoácido B, 0.1 M Soluciones amortiguadoras (buffers) para calibrar los medidores de pH. PROCEDIMIENTO

Usted habrá de titular una sola de las soluciones de aminoácidos, A o B, tres veces. Titulación de la solución del aminoácido 1. Mantenga el electrodo de pH en agua destilada mientras prepara la solución de aminoácido y monta la bureta.

2. Enjuague bien la bureta con dH2O. Repita. 3. Obtenga aproximadamente 100 mL de la solución de NaOH. Anote la concentración. Enjuague y entonces llene la bureta (hasta la marca graduada en el nivel superior) con la solución de NaOH. Remueve cualquier burbuja de aire que pueda estar presente,

especialmente en la punta de la bureta. Anote el volumen con qué va a comenzar.

4. Obtenga aproximadamente 35 mL de una de las soluciones de aminoácido; anote la letra que la identifica. Enjuague la pipeta de 10 mL con dH2O y luego con dos pequeñas porciones de su solución de aminoácido. Pipetee 10 mL de su solución de

aminoácido a un beaker limpio de 100 mL. Añada 25 mL de dH2O (para un volumen total en su beaker de 35 mL.

5. Calibre su medidor de pH. EL medidor permanecerá calibrado mientras no se apage.



6. Coloque una barra magnética en el beaker con el electrodo. Ajuste el electrodo para que no tropiece con la barra magnética. Si el electrodo no está debidamente sumergido, las lecturas de pH serán

erráticas. 7. Titule la solución de aminoácido con el NaOH en la bureta. Esta corrida se hace añadiendo NaOH a intervalos de ~1.0 mL hasta que pase el primer punto de equivalencia; es decir, se mantendrá añadiendo incrementos de 1.0 mL hasta que el pH suba abruptamente (el punto C en la gráfica). Anote toda esta data en la

tabla al final de este trabajo, Note que usted puede fácilmente calcular el volumen de NaOH requerido para llegar al segundo punto teórico de equivalencia con solo duplicar el volumen que tomó llegar al primer punto.

8. Llene nuevamente la bureta con NaOH. Tome otro beaker limpio y seco de 150 mL y “pipetee” 10 mL de su solución de aminoácido al beaker. Añada 25 mL de dH2O. Titule la solución de aminoácido nuevamente (Tabla de datos Titulación 1 ); esta vez use intervalos de 0.5 mL justo hasta antes de llegar a cada punto de equivalencia y luego gota a gota hasta llegar a cada punto. Esta será la data real

para construir su gráfica. Continúe hasta que se hayan añadido 2.5 equivalentes de NaOH o el pH lea 12.5.

9. Vuelva a llenar la bureta y repita el proceso de titulación (Tabla de data Titulación 2) con una nueva solución de su aminoácido.

DISPOSICION DE DESPERDICIOS

Las soluciones deben estar a un pH entre 5 y 12 antes de ser descartadas. Se puede bajar el pH añadiendo HCl o subirlo con peuqeñas porciones de bicarbonato de sodio. TABLAS DE DATOS

Concentración de la solución de NaOH _________

Aminoácido (letra) _____ Primera Titulación (alicuotas de 1 mL)

mL de NaOH añadidos

pH



Por supuesto que la tabla tendrá más filas, al menos 12. Primer punto de equivalencia _____ mL

Segundo punto de equivalencia ______ mL (esto tal vez sea mejor calcularlo que medirlo)

Titulación 1

mL NaOH añadidos pH

Titulación 2

mL NaOH añadidos pH

(De nuevo, va a necesitar más filas). INFORME DE LABORATORIO

1. Escriba un objetivo de dos oraciones para este experimento. 2. Los aminoácidos A y B utilizados en este laboratorio están incluidos en la lista siguiente: glicina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina). Vea la estructura en su texto. Identifique el grupo “R” y dibuje la formula estructural (ácida, básica y zwitteriónica) mientras la titulación procede. Note que algunos aminoácidos tendrán tres formas y otros cuatro.

3. Explique si pueden coexistir el grupo amino y el grupo carboxilo sin carga al mismo pH.

4. Prepare una gráfica con sus resultados, graficando mL de NaOH versus pH. Construya cada gráfica en papeles separados; recomiendo usar Excel™ para esto. Recuerde rotular los ejes y déle

un título apropiado a su gráfica. 5. A partir de la curva de titulación, determine los puntos de inflexión, pI. Este es el punto en donde 1.0 equivalentes de base han sido añadidos. En este experimento usted usará 10 mL de NaOH 0.1 M



0 1.0 milimoles del aminoácido (totalmente protonado). Como se dijo en la introducción, la forma totalmente protonada del aminoácido puede donar dos protones durante la titulación. Tomará entonces un equivalente (1.0 milimoles) de base para

titular el primer protón en el grupo ácido y otro equivalente para titular el protón del grupo amino. Localice el pI y márquelo en la gráfica.

6. Como el pKácido es el punto medio de la primera inflexión, puede hallar el pKácido a 0.5 equivalentes de base. Así mismo, el pKamino se

puede hallar a 1.5 equivalentes de base. Rotule estos puntos en su gráfica.

7. Calcule un promedio de los valores de pKácdio de las últimas dos gráficas.

8. Calcule un promedio de los valores de pKamino de las últimas dos gráficas (si posible).

9. Promedio los valores de pI de las últimas dos gráficas. 10. Si posible, calcule el pI hallando el promedio entre el pKácido

promedio y el pKamino promedio. Este es un mejor método para hallar el pI del aminoácido. Compare los números obtenidos en el paso 9 con el de este paso 10.

11. Identifique su aminoácido de los mencionados en la lista: glicina, aspártico, glutámico o lisina. Compare con los valores

reales del pI y calcule un porcentaje de error. 12. Comente sobre la efectividad de este método para identificare aminoácidos; específicamente, si no hubiera tenido una lista de donde escoger, ¿sería capaz de diferenciar entre los veinte aminoácidos? Si no pudo determinar el valor de pKamino,

mencione alguna razón.



Los 20 Aminoácidos Standard

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