TITAN III Haemoglobin Electrophoresis - Pera...

TITAN III Haemoglobin ElectrophoresisUsing Cellulose Acetate Plate in Alkaline Buffer

Instructions For UseREF. 3022

TITAN III Électrophorèse d’hémoglobines utilisant une plaque d’acétate de cellulose dans un tampon alcalinFiche technique

TITAN-III Hämoglobin-Elektrophorese auf Zellulose-Acetat in alkalischem PuffermilieuAnleitung

TITAN III Elettroforesi dell’emoglobinacon piastra di acetato di cellulosa in tampone alcalinoIstruzioni per l'uso

Electroforesis de hemoglobina TITAN III con placas de acetato de celulosa en tampón alcalinoInstrucciones de uso

Contents

English 1Français 9Deutsch 17Italiano 25Español 33

INTENDED PURPOSEThe Helena Haemoglobin Electrophoresis Procedure using cellulose acetate in alkaline buffer isintended for the qualitative and quantitative determination of abnormal haemoglobins.

Haemoglobins (Hb) are a group of proteins whose chief functions are to transport oxygen from thelungs to the tissues and carbon dioxide in the reverse direction. They are composed of polypeptidechains called globin, and iron protoporphyrin heme groups. A specific sequence of amino acidsconstitutes each at four polypeptide chains, which are designated α, β, γ, and δ. Two other chains, ξand Z are formed in the embryo. Each normal haemoglobin molecule contains one pair of alpha andone pair of non-alpha chains. In normal adult haemoglobin (HbA) the non-alpla chains are called betaand the structure is expressed as a α2β2. The non-alpha chains of fetal haemoglobin are called gammaand its structure is α2γ2. A minor (3%) haemoglobin fraction called HbAg contains alpha and deltachains and its structure is α2δ2. In a hereditary inhibition of globin chain synthesis called thalassemia,the non-alpha chains may aggregate to form HbH (β4) or Hb Bart's (α4). In addition to globin, eachhaemoglobin molecule contains four heme groups (one for each chain) located within pockets formedby the folding of the chains. The major haemoglobin in the erythrocytes of the normal adult is HbAand there are small amounts of HbAg and HbF. In addition, over 400 mutant haemoglobins are nowknown, some of which may cause serious clinical effects, especially in the homozygous state or incombination with another abnormal hemoglobin. Wintrobe

1divides the abnormalities of haemoglobin

synthesis into three groups:I. Production of an abnormal protein molecule (e.g. sickle cell anemia).2. Reduction in the amount of normal protein synthesis (e.g. thalassemia).3. Developmental anomalies (e.g. hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH)).

The two most commonly seen mutant haemoglobins in the United States are HbS and HbC. Others apt to be encountered are Hb Lepore, E.G-Philadelphia, D-Los Angeles, and O-Arab

2.

Electrophoresis is generally considered the best method for separating and identifying thehaemoglobins present in a blood sample and, optimally, the protocol for haemoglobin electrophoresisinvolves step-wise use of two systems

3-8. Initial electrophoresis is performed in alkaline buffers.

Cellulose acetate is the major support medium used because it yields rapid separation of HbA, F, S andC and many other mutants with minimal separation time. However, because of the electrophoreticsimilarity of many structurally different haemoglobins, the evaluation must be supplemented by aprocedure that measures some property other than electrical charge. A simple procedure whichconfirms the identification if both HbS and HbC, as well as HbA. HbF and many other mutants, iscitrate agar electrophoresis. This method is based on the complex interactions of the haemoglobinwith the electrophoretic buffer (acid pH) and the agar support. Electrophoresis is a simple procedurerequiring only minute quantities of hemolysate to provide highly specific (but not absolute)confirmation of the presence of HbS, HbC and HbF as well as several other abnormal haemoglobins.

Very small samples of hemolysates prepared from whole blood are applied to the Titan III CelluloseAcetate Plate. The haemoglobins in the sample are separated by electrophoresis using an alkalinebuffer (pH 8.2-8.6) and are stained with Ponceau S Stain. The patterns are scanned in a scanningdensitometer and the relative percent of each band determined.

1

TITAN III HAEMOGLOBIN ELECTROPHORESIS

English

WARNINGS AND PRECAUTIONSAll reagents are for in-vitro diagnostic use only. Do not ingest or pipette by mouth any kit component.Wear gloves when handling all kit components. Refer to the product safety data sheet for risk andsafety phrases and disposal information.

COMPOSITION1. Supre-Heme® Buffer (Cat No. 5802)

The buffer contains Tris-EDTA and boric acid. pH 6.2 - 8.6. Dissolve one pack of buffer in 980mlpurified water. The buffer is ready for use when all material is dissolved and completely mixed.

2. Hemolysate Reagent (Cat. No. 5125)The reagent contains 0.005 M EDTA in purified water with 0.01% potassium cyanide added aspreservative. The reagent is ready to use as packaged.

3. Ponceau S Stain (Cat. No. 5526)The stain is supplied as a powder and is a mix of Ponceau S and Sulphosalicylic Acid. Dissolve thecontents of the bottle in 1 litre of deionised water and mix for 30 minutes or until completelydissolved.

4. Clear Aid (Cat. No. 5005)The reagent contains polyethylene glycol. Clear Aid is used to prepare the clearing solution usedin the STEP-BY-STEP PROCEDURE. Mix 30 parts glacial acetic acid, 70 parts absolute methanoland 4 parts Clear Aid.

5. Other kit componentsEach kit contains Instructions for Use

STORAGE AND SHELF-LIFE1. Supre-Heme® Buffer (Cat No. 5802)

The packaged buffer should be stored at 15...30°C and is stable until the expiry date indicated onthe label. The buffer solution is stable for two months at 15...30°C. Deterioration may beindicated by dampness or discoloration or if it shows signs of bacterial contamination.

2. Hemolysate Reagent (Cat. No. 5125)The reagent should be stored at 15...30°C and is stable until the expiry date indicated on the label.

3. Ponceau S Stain (Cat. No. 5526)The stain should be stored at 15...30°C and is stable until the expiry date indicated on the label.Store in a tightly closed bottle or staining dish. The stain may be reused multiple times if properlystored. Deterioration may be indicated by excessive evaporation or the appearance of largeamounts of precipitate.

4. Clear Aid (Cat. No. 5005)Clear aid should be stored at 15...30°C and is stable until the expiry date indicated on the label.Store the prepared clearing solution in a tightly closed container to prevent evaporation of themethanol. When evaporation occurs the plates may delaminate. Water contamination from over-use of the clearing solution will cause the plates to be cloudy.

SAMPLE COLLECTION AND PREPARATIONWhole blood collected in tubes containing EDTA or heparin. Preparation of the specimen is outlinedin the STEP-BY-STEP PROCEDURE. Whole blood samples may be stored for up to one week at2...6°C.

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Alternate Sample Preparation Procedure:If removal of denatured haemoglobins from the samples is deemed necessary perform the followingsteps:a. Centrifuge the blood sample at 3500 RPM for 5 minutes.b. Remove the plasma from the sample and wash the red blood cells in 0.85% saline (v/v) three

times. After each wash, centrifuge the cells for 10 minutes at 3500 RPM.c. Add I volume purified water and 1/4 volume toluene (or carbon tetrachloride) to the washed red

cells.d. Vortex at high speed for one minute.e. Centrifuge the samples at 3500 RPM for 10 minutes.f. If toluene is used the top layer in the tube will contain cell stroma and should be removed with a

capillary pipette before proceeding to the next step. The clear middle layer contains the desiredsample. If carbon tetrachchloride is used, all red cell waste material will be contained in thebottom of the tube after centrifugation.

g. Filter the clear red solution through two layers of Whatman #1 filter paper.

ITEMS REQUIRED BUT NOT PROVIDED;Cat. No. 5116 I.O.DCat. No. 1520 EWS Digital Power SupplyCat. No. 3021 Titan Ill-H Cellulose Acetate (25 plates 94 x 76 mm)Cat. No. 3022 Titan® lll-H Cellulose Acetate (25 Plates 76 x 60 mm)Cat. No. 5802 Supre Heme Buffer (10 x 14.6g)Cat. No. 5125 Hemolysate Reagent (1 x 250ml)Cat. No. 5526 Ponceau S5% acetic acidAbsolute methanolCat. No. 5005 Clear Aid (1 x 250ml)Cat. No. 5090 Zip Zone® PrepCat. No. 5081 Zip Zone® Chamber Wicks (500/box)Cat. No. 5053 Titan Plastic Envelopes (12 sample 100/pkg)Cat. No. 5052 Titan Plastic Envelopes (200 pkg)Cat. No. 5037 Titan Blotter pads (100/box 89 x 108mm)Cat. No. 5034 Titan Blotter Pads (100/box 76 x 102 mm)Cat. No. 5000 Helena markerCat. No. 5015 Identification LabelsCat. No. 5212 Haemoglobin Report Form (100/pad)Cat. No. 5002 Glue Stick

STEP-BY-STEP PROCEDURE1. Dissolve one package Supre-Heme Buffer in 980ml of purified water.2. Properly code the required number of Titan III-H Plates by marking on the glossy hard side with

a Helena Marker.3. Soak the required number of plates In Supre-Heme Buffer for 5 minutes. The plates should be

soaked in the bufferizer according to the instructions provided. Alternately, the plates may bewetted by slowly and uniformly lowering a rack of plates into the buffer. NOTE: The samesoaking buffer may be used for soaking up to 12 plates or for approximately one week if storedtightly closed. If used for a prolonged period, residual solvents from the plates may build up in the

3


English

buffer and cause poor separation of the proteins or evaporation may cause greater bufferconcentration.

4. Pour approximately 100ml of Supre-Heme Buffer into each of the outer sections of the chamber.5. Wet two disposable wicks in the buffer and drape one over each support bridge being sure it

makes contact with the buffer and that there are no air bubbles under the wicks.6. Cover the chamber to prevent the buffer evaporating.7. Prepare a hemolysate of the patient samples as follows:a. Using whole blood: Add 1 part whole blood to 3 parts Haemolysate Reagent. Mix well and allow

to stand 5 minutes.b. Using packed cells: Mix 1 part packed red blood cells to 6 parts Haemolysate Reagent. Mix well

and allow to stand 5 minutes.NOTE: If removal of denatured haemoglobins from the sample is deemed necessary, see theAlternate Sample Preparation Procedure.

8. Place 5µl of the prepared patient hemolysates or 5µl of at least one of the Helena Hemo Controlsinto the wells of the Sample Well Plates using the Microdispenser. NOTE: The Helena HemoControls are used directly from the vial. DO NOT prepare a hemolysate.

9. If the samples are not used within 2 minutes cover the Sample Well Plate with a glass slide toprevent evaporation.

10. Prime the applicator by depressing the tips into the sample wells 3 or 4 times. Apply this loadingto a piece of blotter paper. DO NOT load applicator again and go to the next step.

11. Remove the wetted Titan III Plate from the buffer and blot once firmly between two blotters.Place the plate in the aligning base, cellulose acetate side up, aligning the bottom edge of the platewith the black scribe line marked "CATHODE APPLICATION". The identification mark should bealigned with sample No. 1. Before placing the plate in the aligning base place a drop of water orbuffer on the center of the aligning base. This prevents the plate from shifting during the sampleapplication.

12. Apply the sample to the plate by depressing the applicator tips into the sample well 3 or 4 timesand transfer the applicator to the aligning base. Press the button down and hold it for 5 seconds.

13. Place the plate in the chamber, cellulose acetate side down. Place a weight on the plate to ensurecontact with the wicks.

14. Electrophorese: 25 minutes,350 volts.15. Remove the plates from the chamber and stain in Ponceau S for 5 minutes.16. Destain in 3 successive washes of 5% acetic acid. Allow the plates to stay in each wash for 2

minutes.17. The plates may be dried and stored for a permanent record at this point. If a transparent

background is desired (i.e. for densitometry) proceed to the next step.18. Dehydrate the plates in 2 successive washes of absolute methanol. Allow the plates to stay in each

wash for 2 minutes.19. Place the plate in clearing solution for 5-10 minutes.20. Remove the plate from the clearing solution and drain off excess solution.21. Place the plate, cellulose acetate side up, on a blotter pad under the Micro-Hood, or in a drying

oven, at 56°C for 10 minutes or until dry.

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Evaluation of the Haemoglobin Bands1. Qualitative evaluation: The haemoglobin plates may be inspected visually for the presence of

abnormal haemoglobin bands. The Helena Hemo Controls provide a marker for bandidentification.

2. Quantitative evaluation: Determine the relative percent of each haemoglobin band by scanningthe cleared and dried plates in the densitometer using a 525nm filter.

Stability of End Product: The dried plates are stable for an indefinite period of time and may bestored in Titan Plastic Envelopes.

INTERPRETATION OF RESULTSFigures1 and 2 illustrate how the combination of cellulose acetate and citrate agar electrophoresis canbe used in tandem for the identification of haemoglobins.

Figure 1. Electrophoretic Mobilities of Haemoglobins on Titan III Cellulose Acetate.

Figure 2. Electrophoretic Mobilities of Haemoglobins on Titan Gel Acid Hb showingelimination of possible Hb mutants.

Most haemoglobin variants cause no discernible clinical symptoms, so are of interest primarily toresearch scientists. Variants are clinically important when their presence leads to sickling disorders,thalassemia syndromes, life long cyanosis, hemolytic anemias or erythrocytosis or if the heterozygoteis of sufficient prevalence to warrant genetic counseling. The combinations of Hb S-S, Hb S-D-LosAngeles, and Hb S-0 Arab lead to serious sicking disorders

2. Several variants including Hb H.E-Fort

Worth and Lepore cause a thalassemic blood picture2.

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English

AA2DE

GJH

F O S C

+

A2

CEO

SDG

F A

ALKALINE Hb

The two variant haemoglobins of greatest importance in the U.S. in terms of frequency and pathologyare HbS and HbC

2. Sickle cell anemia (HbSS) is a cruel and lethal disease. It first manifests itself at

about 5-6 months of age. The clinical course presents agonizing episodes of pain and temperatureelevations with anemia, listlessness, lethargy, and infarct in virtually all organs of the body. The individual with homozygous HbCC suffers mild haemolytic anemia which is attributed to theprecipitation or crystallization of HbC within the erythrocytes. Cases of HbSC disease arecharacterised by haemolytic anemia that is milder than sickle-cell anemia. The thalassemias are a groupof haemoglobin disorders characterised by hypochromia and microcytosis due to the diminishedsynthesis of one globin chain (the α or β) while synthesis of the other chain proceeds normally

9,10.

This unbalanced synthesis results in unstable globin chains. These precipitate within the red cell,forming inclusion bodies that shorten the life span of the cell. In α-thalassemias the α chains are diminished or absent and in β-thalassemia the β chains are affected.Another quantitative disorder of haemoglobin synthesis, hereditary persistent fetal haemoglobin(HPFH), represents a genetic failure of the mechanisms that turn off gamma chain synthesis at aboutfour months after birth which results in a continued high percentage of HbF. It is a more benigncondition than the true thalassemias and persons homozygous for HPFH have normal development,are asymptomatic and have no anemia

10.

The most common haemoglobin abnormalities:Sickle Cell TraitThis is a heterozygous state slowing HbA and HbS and a normal amount of HbA2 on cellulose acetate.Results on citrate agar show haemoglobins in the HbA and HbS migratory positions (zones).Sickle Cell Anemia.This is a homozygous state showing almost enclusively HbS, although a small amount of HbF may alsobe present.Sickle-C DiseaseThis is a heterozygous state demonstrating HbS and HbC.Sickle Cell-Thalassemia DiseaseThis condition shows HbA, HbF, HbS. and HbA2. In Sickle Cell β-Thalassemia HbA is absent.Thalassemia-C DiseaseThis condition shows HbA, HbF and HbC.C DiseaseThis is a homozygous state showing almost exclusively HbC.Thalassemia MajorThis condition shows HbF, HbA and HbA2.

Calculation of Unknown: The Helena EDC. CliniScan and other Helena densitometers withcomputer accessories will automatically print the relative percent of the bands.

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Further testing required:1. Citrate agar electrophoresis may be a necessary follow up test for confirmation of abnormal

haemoglobins detected on cellulose acetate.2. Globin chain analysis (both acid and alkaline) and structural studies may be necessary in order to

positively identify some of the more rare haemoglobins.3. Anion exchange column chromatography is the most accurate method for quantitating HbA2.

Helena BioSciences Europe Sickle-Thal Quik Column Method for quantitation of HbA2 in thepresence of HbS, or the Helena Beta-Thal HbA2 Quik Column Procedure are recommended.HbA2 quantitation is one of the most important diagnostic tests in the diagnosis of β-thalassemiatrait.

4. Low levels of HbF (1-10%) may be accurately quantitated by radial immunodiffusion using theHelena HbF-QUIPIate Procedure.

QUALITY CONTROLThe following controls are available from Helena BioSciences Europe for haemoglobin electrophoresis:Cat. No. 5328 AA2 Hemo ControlCat. No. 5329 ASA2 Hemo ControlCat. No. 5330 AFSA2 Hemo ControlCat. No. 5331 AFSC Hemo Control

The controls should be used as markers for the identilication of the haemoglobin bands and they maybe quantitated for verification of the accuracy of the procedure. Refer to the package insert providedwith the controls for assay values and migration patterns. Use at least one of these controls on eachplate run.

LIMITATIONSSome abnormal haemoglobins have similar electrophoretic mobilities and must be differentiated byother methodologies.

REFERENCE VALUESAt birth, the majority of haemoglobin in the erythrocytes of the normal individual is fetal haemoglobin,HbF. Some of the major adult haemoglobin, HbA, and a small amount of HbA2, are also present. At the end of the first year of life and through adulthood, the major haemoglobin present is HbA withup to 3.5% HbA2 and less than 2% HbF.

BIBLIOGRAPHY1. Wintrobe, Maxwell M Cynical Hemaotogy 6th Edition. LaFebiger. Philadelphia. 1967.2. Fairbanks, VF, Diagnostic Medicine. Nov/Dec, 53-58. 1980.3. Schneider, RG, et al. Laboratory Identification of the Hemoglobins, Lab Management, August. 29-

43. 1981.4. Center for Disease Control. Laboratory Methods for Detecting Hemoglobinopathies, U.S.,

Department of Health and Human Services/Public Health Service, 1984.5. Schneider. RG. Method for Detection of Hemoglobin Variants and Hemoglobinopathies in the

Routine Clinical Laboratory. CRC Clinical Reviews in Clinical laboratory Sciences, 1978.6. Schneider, RG et al., Abnormal Hemoglobins in a Quarter Million People, Blood, 48(5);629-637.

1976.

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English

7. Huisman.THJ and Schroeder. WA. New Aspects of the Structure, function, and Synthesis ofHemoglobins. CRC Press. Cleveland. 1971.

8. Schmidt, RM, et al. The Detection of Hemoglobinopathies, CRC Press, Cleveland. 1974.9. Weatherall. DJ and Clegg JB. The Thalassaemia Syndromes. Blackwell Scientific Publications.

Oxford, 1972.10. Lehman, H and Huntsman RG. Man's Haemoglobins. JB. Lippincott Co., Philadelphia, I974.

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UTILISATIONLe protocole d’électrophorèse d’hémoglobines Helena utilisant de l’acétate de cellulose dans untampon alcalin sert à la détermination qualitative et quantitative des hémoglobines anormales.

L’hémoglobine (Hb) est un groupe de protéines dont la fonction principale est le transport de l’oxygènedes poumons vers les tissus et du dioxyde de carbone en sens inverse. Les hémoglobines sontcomposées de chaînes polypeptidiques appelées globines et de groupements protoporphyriquesferreux, les hèmes. Une séquence spécifique d’acides aminés constitue chacune des quatre chaînespolypeptidiques, appelées α, β, γ, et δ. Deux autres chaînes, ξ et Z, sont formées chez l’embryon.Chaque molécule normale d’hémoglobine est constituée de deux chaînes alpha et de deux chaînes non-alpha. Les chaînes non-alpha de l’hémoglobine normale adulte (HbA) sont appelées bêta et la structurecorrespondante est notée α2β2. Les chaînes non-alpha de l’hémoglobine fœtale (HbF) sont appeléesgamma (structure : α2γ2). L’HbA2 (3%) est composée des chaînes alpha et delta (structure : α2δ2).En cas d’inhibition héréditaire de la synthèse des chaînes de globine appelée thalassémie, les chaînesnon-alpha peuvent s’agréger pour former les hémoglobines HbH (β4) et Hb Bart (α4). La moléculed’hémoglobine contient aussi quatre groupements hème (un pour chaque chaîne) qui sont encapsulésdans les chaînes de globine. L’HbA constitue la majeure partie de l’hémoglobine présente dans lesérythrocytes d’un adulte normal ; l’HbA2 et l’HbF sont également présentes, mais en moindrequantité. Actuellement, plus de 400 mutants sont connus, certains sont à l’origine de signes cliniquesgraves et plus particulièrement dans la forme homozygote ou en combinaison avec d’autreshémoglobines anormales. Wintrobe

1divise la synthèse des hémoglobines anormales en trois groupes :

1. Production d’une molécule protéique anormale (par exemple, la drépanocytose).2. Réduction de la synthèse de protéines normales (par exemple, la thalassémie).3. Développement d’anomalies (par exemple, la persistance héréditaire de l’hémoglobine F [PHHF]).

Les deux mutants d’hémoglobine les plus couramment rencontrés aux États-Unis sont l’HbS et l’HbC.Il est aussi facile de trouver l’Hb Lepore, l’HbE, l’Hb G-Philadelphie, l’Hb D-Los Angeles et l’Hb O-arabe

2. L’électrophorèse est généralement considérée comme la meilleure méthode de séparation

et d’identification des hémoglobines présentes dans un échantillon de sang et le protocole impliquel’utilisation de deux systèmes

3-8. Une électrophorèse initiale est réalisée en pH alcalin. L’acétate de

cellulose est le principal support utilisé car il donne lieu à une séparation rapide de l’HbA, de l’HbF, del’HbS et de l’HbC ainsi que d’autres mutants avec un temps de séparation minimal. Cependant, du faitde la similarité électrophorétique de beaucoup d’hémoglobines structurellement différentes, l’analysedoit être complétée par une technique qui met en œuvre d’autres propriétés que la charge électrique.L’électrophorèse sur gel d’agar en tampon citrate est une technique simple qui confirme l’identificationde l’HbS et de l’HbS ainsi que l’HbA, l’HbF et plusieurs autres mutants. Elle se base sur une interactioncomplexe de l’hémoglobine avec le tampon de migration (pH acide) et le support d’agar. Il s’agit d’uneméthode simple ne demandant que de petites quantités d’hémolysat pour donner une confirmationtrès spécifique (mais pas absolue) de la présence d’HbS, d’HbC, d’HbF et de plusieurs autreshémoglobines anormales.

De très petits échantillons d’hémolysats préparés à partir du sang total sont déposés sur la plaqued’acétate de cellulose Titan III. Les hémoglobines de l’échantillon sont séparées par électrophorèse enutilisant un tampon alcalin (pH 8,2 – 8,6) et sont ensuite mises en évidence avec du colorant PonceauS. Les protéinogrammes sont lus avec un densitomètre, ce qui permet de déterminer le pourcentagerelatif de chaque bande.

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TITAN III ÉLECTROPHORÈSE D’HÉMOGLOBINES

Français

PRÉCAUTIONSTous les réactifs sont à usage diagnostic in vitro uniquement. Ne pas ingérer ou pipeter à la boucheaucun composant. Porter des gants pour la manipulation de tous les composants. Se reporter aux fichesde sécurité des composants du kit pour la manipulation et l’élimination.

COMPOSITION1. Tampon Supre-Heme® (réf. 5802)

Le tampon contient du Tris-EDTA et de l’acide borique, pH 6,2 – 8,6. Dissoudre un sachet detampon dans 980 ml d’eau distillée. Le tampon est prêt à l’emploi lorsque la dissolution estcomplète et qu’il est bien mélangé.

2. Réactif hémolysant (réf. 5125)Le réactif contient de l’EDTA à 0,005 M dans une solution aqueuse additionnée de cyanure depotassium à 0,01% comme conservateur. Le réactif est prêt à l’emploi.

3. Colorant Ponceau S (réf. 5526)Le colorant, fourni sous forme de poudre, est une mélange de Ponceau S et d’acidesulfosalicylique. Dissoudre le contenu de flacon dans 1 litre d’eau désionisée et mélanger pendant30 minutes ou jusqu’à la dissolution complète.

4. Réactif d’éclaircissement (réf. 5005)Le réactif d’éclaircissement contient du polyéthylène glycol. Il sert à préparer la solutiond’éclaircissement utilisée dans la section MÉTHODOLOGIE. Mélanger 30 volumes d’acideacétique glacial, 70 volumes de méthanol absolu et 4 volumes de réactif d’éclaircissement.

5. Autres composants du kitChaque kit contient une fiche technique.

STOCKAGE ET CONSERVATION1. Tampon Supre-Heme® (réf. 5802)

Le tampon non reconstitué doit être conservé entre 15...30°C ; il est stable jusqu’à la date depéremption indiquée sur l’étiquette. Le tampon reconstitué est stable deux mois entre 15...30°C.S’il présente des signes d’humidité ou de décoloration ou s’il existe une contamination bactérienne,cela indique une détérioration du produit.

2. Réactif hémolysant (réf. 5125)Le réactif doit être conservé entre 15...30°C ; il est stable jusqu’à la date de péremption indiquéesur l’étiquette.

3. Colorant Ponceau S (réf. 5526)Le colorant doit être conservé entre 15 et 30 °C ; il est stable jusqu’à la date de péremptionindiquée sur l’étiquette. Conserver dans une bouteille hermétiquement fermée ou dans un bac decoloration. Il est possible de le réutiliser plusieurs fois s’il est stocké correctement. Une évaporation excessive ou l’apparition de grandes quantités de précipités indique unedétérioration du produit.

4. Réactif d’éclaircissement (réf. 5005)Le réactif d’éclaircissement doit être conservé entre 15...30°C ; il est stable jusqu’à la date depéremption indiquée sur l’étiquette. Conserver la solution d’éclaircissement dans un récipienthermétiquement fermé pour éviter l’évaporation du méthanol. S’il se produit une évaporation, les plaques risquent de se décoller. Une contamination de l’eau due à une utilisation excessive dela solution d’éclaircissement risque de ternir les plaques.

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PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONSLe sang total doit être prélevé dans des tubes contenant de l’EDTA ou de l’héparine. La préparationde l’échantillon est indiquée dans la section MÉTHODOLOGIE. Il est possible de conserver les échantillons de sang total une semaine entre 2...6°C.

Procédure alternative de préparation de l’échantillon :Si vous estimez qu’il est nécessaire d’enlever les hémoglobines dénaturées de l’échantillon, suivre lesinstructions suivantes :a. Centrifuger l’échantillon de sang à 3500 rpm pendant 5 minutes.b. Retirer le plasma de l’échantillon et laver trois fois les hématies dans de la solution physiologique

à 0,85% (v/v). Après chaque lavage, centrifuger les hématies pendant 10 minutes à 3500 rpm.c. Ajouter 1 volume d’eau distillée et 1/4 de volume de toluène (ou du tétrachlorure de carbone) aux

hématies lavées.d. Vortexer à haute vitesse pendant une minute.e. Centrifuger les échantillons à 3500 rpm pendant 10 minutes.f. Si vous utilisez du toluène, la couche supérieure du tube contient le stroma des hématies et doit

être enlevée avec une pipette capillaire avant de passer à l’étape suivante. La couche claire dumilieu contient l’échantillon désiré. Si vous utilisez du tétrachlorure de carbone, tous les déchetsdes hématies se situent en bas du tube après centrifugation.

g. Filtrer la solution transparente rouge au travers de deux couches de papier filtre Whatman nº 1.

MATÉRIELS NÉCESSAIRES NON FOURNISRéf. 5116 Appareil IOD (incubateur, étuve, sécheur)Réf. 1520 Générateur électrique numérique EWSRéf. 3021 Acétate de cellulose Titan Ill-H (25 plaques 94 x 76 mm)Réf. 3022 Acétate de cellulose Titan® lll-H (25 plaques 76 x 60 mm)Réf. 5802 Tampon SupreHeme (10 x 14,6 g)Réf. 5125 Réactif hémolysant (1 x 250 ml)Réf. 5526 Colorant Ponceau SAcide acétique à 5%Méthanol absoluRéf. 5005 Réactif d’éclaircissement (1 x 250 ml)Réf. 5090 Zip Zone® PrepRéf. 5081 Ponts papier pour chambre Zip Zone® (500 par boîte)Réf. 5053 Enveloppes plastiques Titan (12 échantillons, 100 par paquet)Réf. 5052 Enveloppes plastiques Titan (200 paquets)Réf. 5037 Blocs buvards Titan (100 par boîte, 89 x 108 mm)Réf. 5034 Blocs buvards Titan (100 par boîte, 76 x 102 mm)Réf. 5000 Marqueur HelenaRéf. 5015 Étiquettes d’identificationRéf. 5212 Fiches de résultats d’hémoglobines (100 par bloc)Réf. 5002 Bâton de colle

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Français

MÉTHODOLOGIE1. Dissoudre un sachet de tampon Supre-Heme dans 980ml d’eau distillée.2. Identifier correctement le nombre nécessaire de plaques Titan III-H en écrivant sur le côté dur et

brillant avec un marqueur Helena.3. Tremper le nombre nécessaire de plaques dans le tampon Supre-Heme pendant 5 minutes.

Les plaques doivent être trempées dans le bac tampon Bufferizer conformément aux instructionsfournies. Sinon, il est possible d’imbiber les plaques en plongeant lentement et uniformément unsupport de plaques dans le tampon. REMARQUE : Le même tampon de trempage peut êtreutilisé pour imbiber 12 plaques et il se conserve environ une semaine dans un récipienthermétiquement fermé. S’il est utilisé pendant une période plus longue, il risque de se produireune accumulation de solvants résiduels provenant des plaques ou une évaporation modifiant laconcentration du tampon, ce qui entraînerait une mauvaise séparation des protéines.

4. Verser environ 100ml de tampon Supre-Heme dans chacun des compartiments extérieurs de lachambre.

5. Humidifier deux ponts papier jetables dans le tampon et en déposer un sur chaque pont dusupport, en veillant à ce qu’ils soient bien en contact avec le tampon et qu’aucune bulle d’air nereste dessous.

6. Couvrir la chambre pour éviter que le tampon ne s’évapore.7. Préparer un hémolysat avec les échantillons patients de la façon suivante :a. Avec du sang total : Ajouter 1 volume de sang total à 3 volumes de réactif hémolysant.

Bien mélanger et laisser reposer 5 minutes.b. Avec du culot globulaire : Mélanger 1 volume de culot globulaire et 5 volumes de réactif

hémolysant. Bien mélanger et laisser reposer 5 minutes.REMARQUE : Si vous estimez qu’il est nécessaire d’enlever les hémoglobines dénaturées, suivrela procédure alternative de préparation de l’échantillon.

8. Déposer 5 µl d’hémolysat patient préparé ou 5 µl d’au moins un hémo contrôle Helena dans lespuits du masque échantillon à l’aide d’une micropipette. REMARQUE : Ne pas préparerd’hémolysat avec les hémo-contrôles Helena ; ils doivent être utilisés directement à partir du flacon.

9. Si les échantillons ne sont pas utilisés dans les 2 minutes, couvrir le masque échantillon avec unelame de verre pour éviter l’évaporation.

10. Amorcer l’applicateur en abaissant les embouts dans les puits échantillons 3 ou 4 fois. Déposer cette charge sur un morceau de papier buvard. Ne pas charger à nouveau l’applicateuret passer à l’étape suivante.

11. Enlever la plaque Titan III du tampon et la sécher entre deux buvards. Placer la plaque sur l’embased’alignement, acétate de cellulose vers le haut, en faisant correspondre le bas de la plaque avec laligne de séparation noire signalée par DÉPÔT CATHODE. Le repère d’identification doit êtrealigné avec l’échantillon nº 1. Avant de placer la plaque sur l’embase d’alignement, déposer unegoutte d’eau ou de tampon au centre de celle-ci pour éviter que la plaque de se déplacer lors dudépôt de l’échantillon.

12. Déposer l’échantillon sur la plaque en abaissant les embouts de l’applicateur dans le puitséchantillon 3 ou 4 fois puis transférer l’applicateur sur l’embase d’alignement. Appuyer sur lebouton et le maintenir appuyé pendant 5 secondes.

13. Placer la plaque dans la chambre, acétate de cellulose vers le bas. Placer un poids sur la plaque defaçon à assurer un bon contact avec les ponts papier.

14. Faire migrer 25 minutes à 350 volts.15. Enlever la plaque de la chambre et colorer avec du Ponceau S pendant 5 minutes.16. Décolorer dans 3 bains successifs d’acide acétique à 5% de 2 minutes chacun.

12

17. Les plaques doivent être séchées et conservées à ce moment si vous désirez un résultatpermanent. Si vous désirez un fond de bande transparent (pour la densitométrie), passer à l’étapesuivante.

18. Déshydrater les plaques dans 2 bains successifs de méthanol absolu de 2 minutes chacun.19. Placer la plaque dans la solution d’éclaircissement pendant 5 à 10 minutes.20. Enlever la plaque de la solution d’éclaircissement et éliminer la solution en excès.21. Placer la plaque, acétate de cellulose vers le haut, sur un bloc buvard sous la micro-hotte ou bien

dans une étuve de séchage à 56°C pendant 10 minutes ou jusqu’à ce qu’elle soit sèche.

Évaluation des bandes d’hémoglobines1. Évaluation qualitative :

Une lecture visuelle des plaques permet de déterminer si des bandes d’hémoglobine anormalesont présentes ou non. Les hémo-contrôles Helena utilisés servent de marqueurs de position pourl’identification des bandes.

2. Évaluation quantitative : Déterminer le pourcentage relatif de chaque bande d’hémoglobine en réalisant une lecture desplaques éclaircies et séchées dans un densitomètre avec un filtre à 525nm.

Stabilité du produit final : Les plaques sèches sont stables indéfiniment et peuvent être conservéesdans les enveloppes plastiques Titan.

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATSLes figures 1 et 2 illustrent la manière dont l’utilisation en tandem de l’électrophorèse sur acétate decellulose et de l’électrophorèse sur gel d’agar en tampon citrate peut servir à identifier leshémoglobines.

Figure 1. Mobilité électrophorétique des hémoglobines sur acétate de cellulose Titan III.

Figure 2. Mobilité électrophorétique des hémoglobines sur une plaque Titan Hb acide avecélimination des mutants potentiels d’Hb.

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F O S C

+

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CEO

SDG

F A

ALKALINE Hb

La majeure partie des variants d’hémoglobine ne donnent pas de symptômes cliniques, mais présententun intérêt pour la recherche scientifique. Les variants sont importants d’un point de vue médicallorsque leur présence implique des désordres cliniques (syndromes thalassémiques, cyanoses, anémieshémolytiques ou érythrocytaires) ou lorsque le signe hétérozygote prévaut pour garantir un conseil engénétique. Les combinaisons d’Hb S-S, d’Hb S-D-Los-Angeles et d’Hb S-O-arabe conduisent à unefalciformation grave

2. Plusieurs variants comme l’Hb H, l’Hb E-Fort Worth et l’Hb Lepore produisent

un trait thalassémique2.

Les deux variants d’hémoglobine les plus importants en terme de fréquence aux États-Unis et depathologie sont l’HbS et l’HbC

2. L’anémie drépanocytaire (HbSS) est une maladie douloureuse et létale.

Elle se manifeste dans les 5-6 premiers mois de la vie. Le tableau clinique se présente avec des épisodesde fortes fièvres et de douleurs avec anémie, d’apathie, de léthargie et des lésions dans presque tousles organes du corps. Les patients avec une hémoglobine HbCC homozygote souffrent d’anémiehémolytique qui est attribuée à la précipitation ou cristallisation de l’HbC dans les érythrocytes. Dans le cas d’HbSC, elle se caractérise par une anémie hémolytique moins sévère qu’avec l’anémiefalciforme. Les thalassémies sont un groupe caractérisé par des désordres comme l’hypochromie et lamicrocytose dues à une diminution de la synthèse d’une chaîne de globine (α ou β) alors que lasynthèse des autres chaînes se produit normalement

9,10. Cette synthèse non homogène provoque une

instabilité des chaînes de globine. Celles-ci précipitent dans les globules rouges, formant des inclusionset réduisant la vie des hématies. Dans l’α-thalassémie, ce sont les chaînes alpha qui sont diminuées ou absentes alors que, dans la β-thalassémie, il s’agit des chaînes bêta. Un autre désordre quantitatif de la synthèse d’hémoglobine, lapersistance héréditaire de l’hémoglobine F (PHHF), est un défaut génétique dans le mécanisme d’arrêtde la synthèse de la chaîne gamma qui intervient environ quatre mois après la naissance et qui se traduitpar un fort pourcentage en HbF. Il s’agit d’une situation bénigne par rapport aux vraies thalassémies ouaux patients homozygotes. Pour la PHHF, le développement est normal, c’est-à-dire asymptomatiqueet sans anémie

10.

Voici les hémoglobinopathies les plus communes :Trait drépanocytaireIl s’agit d’un état hétérozygote montrant HbA, HbS et un taux normal d’HbA2 en acétate de cellulose.Les résultats en pH acide montrent la présence d’hémoglobines migrant en position A et S.DrépanocytoseIl s’agit d’un état homozygote montrant presque uniquement de l’HbS, avec parfois un faible tauxd’HbF.Hémoglobinose S-CIl s’agit d’un état hétérozygote avec présence d’HbS et d’HbC.Thalasso-drépanocytosePrésence d’HbA, d’HbF, d’HbS et d’HbA2. Dans la β-thalasso-drépanocytose, l’HbA est absente.Hémoglobinose C-thalassémiePrésence d’HbA, d’HbF et d’HbC.Hémoglobinose CIl s’agit d’un état homozygote montrant exclusivement de l’HbC.Thalassémie majeurePrésence d’HbF, d’HbA et d’HbA2.

14

Calcul de l’inconnue : Les densitomètres EDC et CliniScan Helena ainsi que d’autres densitomètresHelena équipés de périphériques informatiques impriment automatiquement le pourcentage relatif desbandes.

Analyses supplémentaires nécessaires :1. L’électrophorèse sur gel d’agar en tampon citrate est un test supplémentaire nécessaire pour

confirmer la présence d’hémoglobines anormales détectées sur acétate de cellulose.2. Il est possible qu’il soit nécessaire de réaliser une analyse des chaînes de globine (en milieu alcalin

et acide) et des études structurelles pour arriver à identifier de façon formelle certaineshémoglobines rares.

3. La colonne échangeuse d’anions est la méthode la plus appropriée pour le dosage de l’HbA2. La technique Helena BioScience Sickle-Thal Quik colonne pour la quantification de l’HbA2 enprésence d’HbS ou la technique Helena BioScience Beta-Thal HbA2 Quik colonne sontrecommandées. Le dosage de l’HbA2 est l’un des tests les plus importants pour le diagnostic d’untrait thalassémique.

4. De faibles taux d’HbF (1% – 10%) peuvent être quantifiés par immunodiffusion radiale enutilisant la méthode Helena HbF-QUIPlate.

CONTRÔLE QUALITÉHelena BioSciences Europe distribue les contrôles suivants pour l’électrophorèse des hémoglobines:Réf. 5328 Hémo contrôle AA2Réf. 5329 Hémo contrôle ASA2Réf. 5330 Hémo contrôle AFSA2Réf. 5331 Hémo contrôle AFSC

Les contrôles doivent être utilisés comme marqueurs servant à identifier les bandes d'hémoglobines. Il est possible de les doser pour vérifier l'exactitude de la méthode. La notice accompagnant le contrôlecontient les valeurs de dosage et le diagramme de migration. Utilisez au moins l'un des ces contrôlessur chaque plaque.

LIMITESCertaines hémoglobines ont une migration électrophorétique similaire et doivent être identifiées pard'autres méthodes.

VALEURS DE RÉFÉRENCEÀ la naissance, la majeure partie de l'hémoglobine d'un sujet normal est de l'hémoglobine fœtale, HbF.Des traces des hémoglobines adultes HbA et en moindre quantité HbA2 sont aussi présentes. Dès la fin de la première année et durant toute la vie adulte, l'hémoglobine principale est l'HbA avecun maximum de 3,5% d'HbA2 et moins de 2% d'HbF.

BIBLIOGRAPHIE1. Wintrobe, Maxwell M Cynical Hemaotogy 6th Edition. LaFebiger. Philadelphia. 1967.2. Fairbanks, VF, Diagnostic Medicine. Nov/Dec, 53-58. 1980.3. Schneider, RG, et al. Laboratory Identification of the Hemoglobins, Lab Management, August. 29-


Department of Health and Human Services/Public Health Service, 1984.

15


Français

5. Schneider. RG. Method for Detection of Hemoglobin Variants and Hemoglobinopathies in theRoutine Clinical Laboratory. CRC Clinical Reviews in Clinical laboratory Sciences, 1978.

6. Schneider, RG et al., Abnormal Hemoglobins in a Quarter Million People, Blood, 48(5);629-637.1976.



Oxford, 1972.10. Lehman, H and Huntsman RG. Man's Haemoglobins. JB. Lippincott Co., Philadelphia, I974.

16

ANWENDUNGSBEREICHDas Verfahren der Helena Hämoglobin-Elektrophorese unter Verwendung von Zellulose-Acetat inalkalischem Puffermilieu ist zur qualitativen und quantitativen Bestimmung abnormaler Hämoglobinebestimmt.

Hämoglobine (Hb) bezeichnen Proteingruppen, deren Hauptfunktion im Transport von Sauerstoff ausder Lunge zu den Geweben und dem Transport von Kohlendioxid in umgekehrter Richtung besteht.Sie setzen sich aus Polypeptidketten (Globine) und Eisenprotoporphyrinen als Häm-Gruppenzusammen. Jede der vier Polypeptidketten ist durch eine spezifische Sequenz von Aminosäuren –Alpha (α), Beta (β), Gamma (γ) und Delta (δ) genannt - bestimmt. Zwei weitere Ketten, ξ und Z,werden im Embryo gebildet. Jedes normale Hämoglobinmolekül besteht aus einem Alpha-Ketten- undeinem Nicht-Alpha-Ketten-Paar. Im normalen Erwachsenenhämoglobin (HbA) werden die Nicht-Alpha-Ketten als Beta-Ketten bezeichnet, wobei die Struktur als α2α2 angegeben wird. Die Nicht-Alpha-Ketten fetalen Hämoglobins werden als Gamma-Ketten bezeichnet mit einer α2γ2-Struktur.HbA2 ist eine kleine Hämoglobinfraktion von 3%, die sowohl Alpha- als auch Delta-Ketten enthält undaus einer α2δ2-Struktur besteht. Bei einer angeborenen Hemmung der Globinketten-Synthese, derThalassämie, können die Nicht-Alpha-Ketten sich zu einem Aggregat vereinigen, um HbH (β4) oderHb Bart (α4) zu bilden. Zusätzlich zum Globin enthält jedes Hämoglobin-Molekül vier Häm-Gruppen(eine pro Kette), die innerhalb der durch die Faltung der Ketten entstandenen Taschen lokalisiert sind.Der Hauptanteil des Hämoglobins in den Erythrozyten eines gesunden Erwachsenen besteht aus HbAneben kleinen Mengen von HbA2 und HbF. Darüber hinaus sind über 400 Hämoglobinmutantenbekannt. Davon können einige, vor allem im homozygoten Zustand oder in Kombination mit einemanderen pathologischen Hämoglobin, schwere klinische Krankheitsbilder verursachen. Wintrobe

1

unterscheidet in der Hämoglobinsynthese drei Gruppen von Anomalien:1. Synthese eines abnormalen Eiweißmoleküls (z. B. bei der Sichelzellenanämie).2. Verminderung in der Proteinsynthesemenge (z. B. bei der Thalassämie).3. Entwicklungsanomalien (z. B. hereditäre Persistenz von fetalem Hämoglobin (HPFH)).

Die beiden häufigsten Hämoglobinmutationen in den Vereinigten Staaten sind HbS und HbC.Weiterhin können Hb-Lepore, E.G-Philadelphia, D-Los Angeles und O-Arab angetroffen werden

2.

Die Elektrophorese gilt allgemein als die beste Methode zur Trennung und Identifizierung vonHämoglobinen in einer Blutprobe. Dabei besteht die Versuchsanordnung der Hämoglobin-Elektrophorese optimalerweise in der schrittweisen Anwendung zweier Systeme

3-8. Die erste

Elektrophorese wird im alkalischen Puffermilieu durchgeführt. Zelluloseacetat ist dasHauptträgermedium, das wegen seiner raschen Auftrennung von HbA, HbF, HbS und HbC und vielenweiteren Mutanten mit einer minimalen Trennzeit benutzt wird. Da sich jedoch die strukturellverschiedenen Hämoglobine elektrophoretisch ähneln, muss die Auswertung durch ein Verfahrenergänzt werden, das neben der elektrischen Ladung weitere Eigenschaften misst. Ein einfachesVerfahren, das die Identifikation sowohl des HbS und HbC als auch des HbA, HbF und viele andereMutanten bestätigt, ist die Citrat-Agar-Elektrophorese. Diese Methode beruht auf den komplexenWechselwirkungen des Hämoglobins mit einem Elektrophorese-Puffer (saurer pH) unter Mithilfe vonAgar. Elektrophorese ist ein einfaches Verfahren, das nur kleinste Mengen an Hämolysat erfordert, umeine hoch spezifische (aber nicht absolute) Bestätigung der Anwesenheit von HbS, HbC und HbF,sowie mehreren anderen abnormalen Hämoglobinen zu liefern.

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TITAN-III HÄMOGLOBIN-ELEKTROPHORESE

Deutsch

Sehr kleine, aus Vollblut hergestellte Hämolysat-Proben werden auf die Titan-III Zellulose-Acetat-Platte aufgetragen. Die Hämoglobine der Probe werden durch Elektrophorese in alkalischemPuffermilieu (pH 8,2-8,6) aufgetrennt und mit Ponceau S-Farbstoff angefärbt. Die Muster werden ineinem Densitometer gescannt und der relative Prozentsatz der einzelnen Banden bestimmt.

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMENAlle Reagenzien sind nur zur in-vitro Diagnostik bestimmt. Nicht einnehmen oder mit dem Mundpipettieren. Beim Umgang mit den Kit-Komponenten ist das Tragen von Handschuhen erforderlich.Siehe Sicherheitsdatenblatt mit den Gefahrenhinweisen und Sicherheitsvorschlägen sowieInformationen zur Entsorgung.

INHALT1. Supre-Heme® Puffer (Kat. Nr. 5802)

Der Puffer enthält Tris-EDTA und Borsäure, pH 6,2 - 8,6. Eine Packung Puffer in 980mldestilliertem Wasser auflösen. Der Puffer ist gebrauchsfertig, wenn die Substanz aufgelöst undvollständig gemischt ist.

2. Hämolysat-Reagenz (Kat. Nr. 5125)Das Reagenz enthält 0,005 mol EDTA in destilliertem Wasser mit 0,01% Kaliumcyanid alsKonservierungsmittel. Das Reagenz ist gebrauchsfertig verpackt.

3. Ponceau S-Farbstoff (Kat. Nr. 5526)Der Farbstoff wird als Pulver geliefert und besteht aus Ponceau S und Sulfosalizylsäure. Den Inhaltder Flasche in 1 liter deionisiertem Wasser auflösen und 30 min., bzw. bis der Farbstoff vollständiggelöst ist, mischen.

4. Clear Aid (Kat. Nr. 5005)Das Reagenz enthält Polyethylenglycol. Clear Aid wird zur Herstellung der Clearing-Lösung in derSCHRITT-FÜR-SCHRITT METHODE verwendet. 30 Teile Eisessig, 70 Teile reines Methanol und4 Teile Clear Aid mischen.

5. Weitere Kit-KomponentenJedes Kit enthält eine Gebrauchsanweisung.

LAGERUNG UND STABILITÄT1. Supre-Heme® Puffer (Kat. Nr. 5802)

Der verpackte Puffer sollte bei 15...30°C gelagert werden und ist bis zum aufgedrucktenVerfallsdatum stabil. Die Pufferlösung ist bei 15...30°C zwei Monate stabil. Feuchtigkeit,Verfärbung oder Anzeichen bakterieller Kontamination können auf Verfall hinweisen.

2. Hämolysat-Reagenz (Kat. Nr. 5125)Das Reagenz sollte bei 15...30°C gelagert werden und ist bis zum aufgedruckten Verfallsdatumstabil.

3. Ponceau S-Farbstoff (Kat. Nr. 5526)Der Farbstoff sollte bei 15...30°C gelagert werden und ist bis zum aufgedruckten Verfallsdatumstabil. In einer fest verschlossenen Flasche oder Färbeschale lagern. Bei richtiger Lagerung kannder Farbstoff mehrfach wieder verwendet werden. Übermäßige Verdunstung oder das Auftreteneiner großen Anzahl Präzipitate können auf Verfall hinweisen.

4. Clear Aid (Kat. Nr. 5005)Clear Aid sollte bei 15...30°C gelagert werden und ist bis zum aufgedruckten Verfallsdatum stabil.Die vorbereitete Clearing-Lösung in einer zur Vermeidung von Methanolverdunstung festverschlossenen Flasche lagern. Bei Verdunstung können die Platten delaminieren. Kontaminationmit Wasser durch eine Überbenutzung der Clearing-Lösung lässt die Platten trübe erscheinen.

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PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNGVollblut mit EDTA- oder Heparin-Zusatz. Probenvorbereitung ist in der SCHRITT-FÜR-SCHRITTMETHODE angegeben. Vollblutproben können bei 2...6°C bis zu einer Woche gelagert werden.

Alternative Probenvorbereitung:Folgende Schritte durchführen, sollte sich ein Entfernen denaturierter Hämoglobine aus der Probe alserforderlich erweisen: a. Die Blutprobe bei 3500 rpm 5 Minuten zentrifugieren.b. Plasma von der Probe entfernen und die Erythrozyten dreimal mit 0,85% Kochsalz (V/V) waschen.

Die Zellen nach jeder Wäsche 10 Minuten bei 3500 rpm zentrifugieren.c. 1 Volumenteil destilliertes Wasser und 1/4 Volumenteil Toluen (oder Tetrachlorkohlenstoff) zu

den gewaschenen Erythrozyten geben.d. Eine Minute bei hoher Geschwindigkeit mit dem Vortex-Mischer mischen.e. Die Proben 10 Minute bei 3500 rpm zentrifugieren.f. Bei Verwenden von Toluen enthält die obere Schicht im Röhrchen Stroma, das vor dem nächsten

Schritt mit einer Pasteurpipette abpipettiert werden muss. Die klare Schicht in der Mitte enthältdie gewünschte Probe. Bei Verwenden von Tetrachlorkohlenstoff befindet sich nach derZentrifugation alles zu verwerfende Zellmaterial im unteren Teil des Röhrchens.

g. Die klare, rote Lösung durch zwei Schichten Filterpapier #1 der Fa. Whatman filtrieren.

NICHT MITGELIEFERTES, ABER BENÖTIGTES MATERIAL:Kat. Nr. 5116 I.O.DKat. Nr. 1520 EWS Digitales NetzteilKat. Nr. 3021 Titan Ill-H Zellulose-Acetat (25 Platten 94 x 76mm)Kat. Nr. 3022 Titan® Ill-H Zellulose-Acetat (25 Platten 76 x 60mm)Kat. Nr. 5802 Supre-Heme Puffer (10 x 14,6g)Kat. Nr. 5125 Hämolysat-Reagenz (1 x 250ml)Kat. Nr. 5526 Ponceau S5% EssigsäureReines MethanolKat. Nr. 5005 Clear Aid (1 x 250ml)Kat. Nr. 5090 Zip Zone® PrepKat. Nr. 5081 Zip Zone® Kammer-Elektrodenstreifen (500/Schachtel)Kat. Nr. 5053 Titan Plastik-Umschläge (12 Proben 100/Pack)Kat. Nr. 5052 Titan Plastik-Umschläge (200 Proben 100/Pack)Kat. Nr. 5037 Titan Blotter-Pads (100/Schachtel 89 x 108mm)Kat. Nr. 5034 Titan Blotter-Pads (100/Schachtel 76 x 102mm)Kat. Nr. 5000 Helena MarkerKat. Nr. 5015 Etiketten zur BeschriftungKat. Nr. 5212 Hämoglobin Befundblatt (100/Block)Kat. Nr. 5002 Klebestift

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Deutsch

SCHRITT-FÜR-SCHRITT METHODE1. Eine Packung Supre-Heme Puffer in 980 ml destilliertem Wasser auflösen.2. Die erforderliche Anzahl an Titan III-H-Platten durch Markierung auf der glänzenden, harten Seite

mit einem Helena-Marker richtig kodieren.3. Die erforderlich Anzahl Platten in Supre-Heme Puffer 5 Minuten einweichen. Die Platten sollten

laut beiliegender Anleitung im „Pufferbad“ eingeweicht werden. Alternativ können die Plattendurch langsames und gleichmäßiges Senken eines Platten-Racks in den Puffer angefeuchtetwerden. BITTE BEACHTEN: Der gleiche Soaking-Puffer kann zum Einweichen für bis zu 12Platten verwendet oder fest verschlossenen für maximal eine Woche aufbewahrt werden. Wirdder Puffer über einen langen Zeitraum verwendet, können sich dort Restlösungsmittel aus denPlatten aufbauen und so für eine schlechte Auftrennung der Proteine sorgen, oder Verdunstungkann die Pufferkonzentration erhöhen.

4. Jeweils ungefähr 100 ml Supre-Heme Puffer in die äußeren Bereiche der Kammer füllen.5. Zwei Einweg-Elektrodenstreifen in Puffer anfeuchten und über jede Trägerbrücke legen. Dabei

darauf achten, dass sie mit dem Puffer in Kontakt stehen und unter den Streifen keine Luftblasensind.

6. Die Kammer abdecken, um Verdunstung des Puffers zu verhindern.7. Hämolysate der Patientenproben wie folgt vorbereiten:a. Aus Vollblut: 1 Teil Vollblut zu 3 Teilen Hämolysat-Reagenz geben. Gut mischen und 5 Minuten

stehen lassen.b. Aus gewaschenem Erythrozytenkonzentrat: 1 Teil Erythrozytenkonzentrat mit 6 Teilen

Hämolysat-Reagenz mischen. Gut mischen und 5 Minuten stehen lassen.BITTE BEACHTEN: Sollte ein Entfernen denaturierter Hämoglobine aus der Probe erforderlichsein, siehe „Alternative Probenvorbereitung“.

8. 5 µl vorbereitete Patientenhämolysate oder 5 µl von mindestens einer der Helena Hämo-Kontrollen mit dem Mikrodispenser in die Vertiefungen der Probenplatten geben. BITTEBEACHTEN: Die Helena Hämo-Kontrollen direkt aus dem Fläschchen verwenden. KeinHämolysat herstellen.

9. Werden die Proben nicht innerhalb von 2 Minuten verwendet, die Probenplatten zur Vermeidungeiner Verdunstung mit einem Glasobjektträger abdecken.

10. Den Applikator durch 3 bis 4-maliges Herunterdrücken der Spitzen in die Probenvertiefungeneinspülen. Diese Füllung auf ein Stück Blotterpapier auftragen. Applikator nicht wieder füllen undsofort zum nächsten Schritt übergehen.

11. Die angefeuchteten Titan-III Platten aus dem Puffer nehmen und einmal kräftig zwischen zweiBlotter blotten. Die Platte mit der Acetatseite nach oben in die Ausrichtungsschiene geben unddie untere Kante der Platte an der schwarzen Strichmarkierung „KATHODEN-APPLIKATION“ausrichten. Das Identifizierungs-Kennzeichen sollte dabei an Probe Nr. 1 ausgerichtet werden.Vor dem Positionieren der Platte in die Ausrichtungsschiene einen Tropfen Wasser oder Puffer aufdie Mitte der Ausrichtungsschiene geben. Das verhindert, dass die Platte sich während derProbenapplikation verschiebt.

12. Probe durch 3 oder 4-maliges Herunterdrücken der Applikatorspitzen in die Probenvertiefung aufder Platte auftragen, den Applikator auf die Ausrichtungsschiene übertragen. Den Knopfherunterdrücken und 5 Sekunden halten.

13. Die Platte mit der Zelluloseacetat-Seite nach unten in die Kammer geben. Ein Gewicht auf diePlatte legen, um Kontakt mit den Streifen zu gewährleisten.

14. Elektrophorese: 25 Minuten, 350 Volt.15. Platten aus der Kammer nehmen und 5 Minuten in Ponceau S färben.

20

16. In drei aufeinander folgenden Waschschritten mit 5 % Essigsäure entfärben. Die Platten in jedemWaschvorgang 2 Minuten belassen.

17. Zu diesem Zeitpunkt können die Platten getrocknet und archiviert werden. Wird eindurchsichtiger Hintergrund gewünscht (d. h. für die Densitometrie) mit dem nächsten Schrittweitergehen.

18. Die Platten in zwei aufeinander folgenden Waschschritten mit reinem Alkohol dehydrieren. Die Platten in jedem Waschvorgang 2 Minuten belassen.

19. Die Platte 5-10 Minuten in Clearing-Lösung geben.20. Platte aus der Clearing-Lösung nehmen und überschlüssige Lösung abtropfen lassen.21. Die Platte mit der Zellulose-Acetatseite nach oben auf ein Blotter-Pad unter den „Micro-Hood“

oder in einen Trockenschrank bei 56°C 10 Minuten, oder bis sie trocken ist, trocknen.

Auswertung der Hämoglobin-Banden1. Qualitative Auswertung:

Die Hämoglobin-Platten können optisch auf Anwesenheit von abnormalen Hämoglobin-Bandenuntersucht werden. Die Helena Hämo-Kontrollen dienen als Marker für die Bandenerkennung.

2. Quantitative Auswertung: Den relativen Prozentsatz der einzelnen Hämoglobin-Banden durch Scannen der klaren undgetrockneten Platten im Densitometer bei Filter 525 nm bestimmen.

Stabilität des Endprodukts: Die getrockneten Platten können unbegrenzt in den Titan Plastik-Umschlägen aufbewahrt werden.

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSEAbbildungen 1 und 2 zeigen, wie die Kombination aus Zellulose-Acetat- und Citrat-Agar-Elektrophorese zur Identifikation von Hämoglobinen verwendet werden kann.

Abbildung 1. Elektrophoretische Mobilität der Hämoglobine auf Titan III-Zellulose-Acetat.

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ALKALINE Hb

Abbildung 2. Elektrophoretische Mobilität der Hämoglobine auf Titan-Gel Säure-Hb,welches den Ausschluss möglicher Hb-Mutanten zeigt.

Die meisten Hämoglobinvarianten verursachen keine erkennbaren klinischen Symptome und sindsomit in erster Linie von wissenschaftlichem Interesse. Varianten sind von klinischer Bedeutung, wennihre Anwesenheit zu Sichelzellenanämie, Thalassämiesyndromen, lebenslanger Zyanose, hämolytischenAnämien oder Erythrozytose führt, oder wenn der heterozygote Zustand von signifikanter Prävalenzist und eine genetische Beratung erforderlich macht. Die Kombination von HbS-S, HbS-D-Los Angelesund HbS-O Arab führt zu schweren Sichelzellenanämien

2. Mehrere Varianten, darunter HbH, E-Fort

Worth und Lepore, verursachen ein für die Thalassämie typisches Blutbild2.

Die beiden wichtigsten Hämoglobinvarianten hinsichtlich Häufigkeit und Pathologie sind in den USA dasHbS und HbC

2. Sichelzellenanämie (HbSS) ist eine schwere, tödlich verlaufende Erkrankung. Sie tritt

zuerst im fünften bis sechsten Lebensmonat auf. Der klinische Verlauf ist durch schwere Schmerz- undFieberschübe kombiniert mit Anämie, Lethargie und einem Infarktgeschehen in so gut wie allenOrganen charakterisiert. Der Patient mit homozygotem HbCC leidet unter einer leichtenhämolytischen Anämie, die auf Ausfällung oder Kristallisierung von HbC innerhalb des Erythrozytenzurückzuführen ist. Fälle von HbSC-Erkrankung sind durch eine hämolytische Anämie, leichter als beider Sichelzellenanämie, charakterisiert. Thalassämien gehören zu einer Gruppe von Störungen derHämoglobin-Synthese, die durch Hypochromasie und Mikrozytose charakterisiert sind. Die Störungwird durch die verminderte Synthese einer Globinkette (der Alpha- oder Beta-Kette) hervorgerufen,wohingegen die Synthese der anderen Kette normal verläuft

9,10. Durch diese ungleiche Synthese kommt

es zur Bildung instabiler Globinketten. Diese fallen innerhalb der Erythrozyten als Einschlusskörperaus, und verkürzen somit die Lebensdauer der Zelle. Bei der Alpha-Thalassämie sind die Alpha-Ketten entweder vermindert oder fehlen ganz, während beider Beta-Thalassämie die Beta-Ketten betroffen sind. Eine weitere quantitative Störung derHämoglobin-Synthese, die hereditäre Persistenz fetalen Hämoglobins (HPFH), ist ein genetischbedingtes Versagen des etwa im vierten Lebensmonat auftretenden Aussetzens der Gammaketten-Synthese, die zu einem ständig erhöhten HbF-Anteil führt. Es handelt sich dabei um eine mildere Formder echten Thalassämie, und HPFH homozygote Patienten entwickeln sich normal, ohne Symptomeund Anämie

10.

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F O S C

Die am häufigsten vorkommenden Hämoglobinanomalien:Sichelzellenanämie-MerkmalHierbei handelt es sich um die heterozygote Form mit HbA und HbS sowie einer normalen Menge vonHbA2 auf dem Celluloseacetat. Resultate auf dem Citratagar zeigen Hämoglobine in den HbA- undHbS-Wanderpositionen (-zonen).SichelzellanämieHierbei handelt es sich um die homozygote Form mit fast ausschließlicher Präsenz von HbS, obwohlauch eine geringe Menge von HbF vorhanden sein kann.Sichelzell-Hämoglobin-C KrankheitDies ist die heterozygote Form, die HbS und HbC aufweist.Sichelzell-ThalassämieDiese Erkrankung weist HbA, HbF, HbS und HbA2 auf. Bei der Sichelzell-Beta-Thalassämie fehlt HbA.Thalassämie-C ErkrankungDiese Erkrankung weist HbA, HbF und HbC auf.Die C-ErkrankungHierbei handelt es sich um die homozygote Form mit fast ausschließlich HbC.Thalassaemia majorDiese Erkrankung weist HbF, HbA und HbA2 auf.

Berechnung der Unbekannten: Das Helena-EDC. CliniScan und andere Densitometer der FirmaHelena mit Computerausrüstung druckt automatisch den relativen Prozentsatz der Banden.

Weitere notwendige Untersuchungen:1. Die Citrat-Agar-Elektrophorese gehört zu den notwendigen, weiteren Untersuchungen zur

Bestätigung der auf Zelluloseacetat nachgewiesenen, abnormalen Hämoglobine.2. Sowohl die saure als auch die alkalische Globinketten-Analyse können neben Strukturstudien zur

Identifikation einiger der selteneren Hämoglobine notwendig sein.3. Anionen-Wechselsäulen-Chromatographie ist die präziseste Methode zur quantitativen

Bestimmung von HbA2. Die Helena BioSciences Europe Sickle-Thal Quik Column Methode zurquantitativen Bestimmung von HbA2 in Anwesenheit von HbS oder die Helena Beta-Thal HbA2Quik Column Methode werden empfohlen. Die HbA2-Quantifizierung ist einer der wichtigstenTests zur Diagnose des Beta-Thalassämie-Merkmals.

4. Niedrige HbF-Werte (1-10%) können mit der radialen Immundiffusion der Helena HbF-QuiPlateMethode quantitativ genau bestimmt werden

QUALITÄTSKONTROLLEFür die Hämoglobin-Elektrophorese bietet Helena BioSciences Europe folgende Kontrollen an:Kat. Nr. 5328 AA2 Hämo-KontrolleKat. Nr. 5329 ASA2 Hämo-KontrolleKat. Nr. 5330 AFSA2 Hämo-KontrolleKat. Nr. 5331 AFSC Hämo-Kontrolle

Die Kontrollen sollten bei der Identifizierung der Hämoglobin-Banden als Marker verwendet werden.Zur Verifizierung für die Genauigkeit der Methode kann man sie quantifizieren. Siehe Packungsbeilageder Kontrollen für Testergebnisse und Migrationsmuster. Mindestens eine dieser Kontrollen bei jedemLauf mitführen.

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Deutsch

EINSCHRÄNKUNGENEinige der abnormalen Hämoglobine haben ähnliche elektrophoretische Bewegungsmuster undmüssen durch andere Untersuchungsmethoden differenziert werden.

REFERENZWERTEBei der Geburt besteht der Hauptanteil des Hämoglobins in den Erythrozyten normaler Neugeboreneraus fetalem Hämoglobin (HbF). Es ist außerdem ein gewisser Anteil HbA, dem Hauptanteil desErwachsenenhämoglobins, und ein geringer Anteil an HbA2 vorhanden. Der Hauptanteil desHämoglobins am Ende des ersten Lebensjahres und beim Erwachsenen ist das HbA, mit einem HbA2-Anteil von bis zu 3,5% und weniger als 2% HbF.

LITERATUR1. Wintrobe, Maxwell M Cynical Hemaotogy 6th Edition. LaFebiger. Philadelphia. 1967.2. Fairbanks, VF, Diagnostic Medicine. Nov/Dec, 53-58. 1980.3. Schneider, RG, et al. Laboratory Identification of the Hemoglobins, Lab Management, August. 29-


Department of Health and Human Services/Public Health Service, 1984.5. Schneider. RG. Method for Detection of Hemoglobin Variants and Hemoglobinopathies in the

Routine Clinical Laboratory. CRC Clinical Reviews in Clinical laboratory Sciences, 1978.6. Schneider, RG et al., Abnormal Hemoglobins in a Quarter Million People, Blood, 48(5);629-637.

1976.7. Huisman.THJ and Schroeder. WA. New Aspects of the Structure, function, and Synthesis of

Hemoglobins. CRC Press. Cleveland. 1971.8. Schmidt, RM, et al. The Detection of Hemoglobinopathies, CRC Press, Cleveland. 1974.9. Weatherall. DJ and Clegg JB. The Thalassaemia Syndromes. Blackwell Scientific Publications.

Oxford, 1972.10. Lehman, H and Huntsman RG. Man’s Haemoglobins. JB. Lippincott Co., Philadelphia, I974.

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PRINCIPIOLa procedura di elettroforesi dell’emoglobina Helena con acetato di cellulosa in tampone alcalino èstata formulata per la determinazione qualitativa e quantitativa di emoglobine anomale.

Le emoglobine (Hb) sono un gruppo di proteine la cui funzione principale è trasportare l’ossigeno daipolmoni ai tessuti e l’anidride carbonica in direzione opposta. Sono costituite da catene di polipeptidi,chiamate globine, e gruppi eme di protoporfirina di ferro. Una sequenza specifica di aminoacidicostituisce ciascuna delle 4 catene di polipeptidi, che vengono indicate come α, β, γ e δ. Nell’embrionevengono formate altre due catene, denominate ξ e Z. Ogni molecola di emoglobina fisiologicacontiene una coppia di catene alfa e una di catene non-alfa. Nell’emoglobina dell’adulto normale(HbA), le catene non-alfa vengono denominate beta e la struttura corrispondente è espressa comeα2β2. Le catene non-alfa dell’emoglobina fetale sono invece denominate gamma e la strutturacorrispondente è espressa come α2γ2. Una frazione di emoglobina di minore importanza (3%),denominata HbAg, contiene catene alfa e delta e la sua struttura è α2δ2. In un’inibizione ereditariadella sintesi delle catene globiniche, denominata talassemia, le catene non-alfa possono aggregarsi performare HbH (β4) o Hb di Bart (α4). Oltre alle globine, ciascuna molecola di emoglobina contiene 4gruppi eme (uno per ogni catena) situati all’interno di tasche formate dal ripiegamento delle catene.L’emoglobina principale negli eritrociti dell’adulto normale è l’HbA; vi sono anche modeste quantità diHbAg e di HbF. Inoltre, si conoscono attualmente più di 400 emoglobine mutanti, alcune delle qualipossono causare effetti clinici gravi, specialmente nello stato omozigote o in combinazione con un’altraemoglobina anomala. Wintrobe1 suddivide le anomalie della sintesi dell’emoglobina in tre gruppi:I. produzione di una molecola proteica anomala (ad es. anemia a cellule falciformi);2. riduzione dell’entità della normale sintesi proteica (ad es. talassemia);3. anomalie dello sviluppo (ad es. persistenza ereditaria di emoglobina fetale (HPFH)).

Le due emoglobine mutanti più comunemente riscontrate negli Stati Uniti sono l’HbS e l’HbC. Altreemoglobine facilmente riscontrabili sono: Hb Lepore, E.G-Philadelphia, D-Los Angeles e O-Arab

2.

L’elettroforesi viene generalmente ritenuta il metodo migliore per separare e identificare leemoglobine presenti in un campione di sangue; in condizioni ideali, il protocollo per l’elettroforesidell’emoglobina comprende l’utilizzo graduale di due sistemi

3-8. L’elettroforesi iniziale viene effettuata

in tamponi alcalini. L’acetato di cellulosa è il principale mezzo di supporto utilizzato, in quantoconsente una rapida separazione di HbA, HbF, HbS e HbC e di molte altre emoglobine mutanti con untempo di separazione minimo. Tuttavia, in ragione della similarità elettroforetica di molte emoglobinestrutturalmente diverse, la valutazione deve essere integrata con una procedura destinata adeterminare una proprietà diversa dalla carica elettrica. Una semplice procedura che confermal’identificazione in presenza di HbS e HbC, nonché di HbA, HbF e molte altre emoglobine mutanti èl’elettroforesi su agar citrato. Il metodo si basa sulle complesse interazioni dell’emoglobina con iltampone elettroforetico (pH acido) e il supporto di agar. L’elettroforesi è una semplice procedura cherichiede quantità ridotte di emolisato per fornire una conferma altamente specifica (ma non assoluta)della presenza di HbS, HbC e HbF e di molte altre emoglobine anomale.

Alla piastra di acetato di cellulosa Titan III vengono applicati piccolissimi campioni di emolisati preparaticon sangue intero. Le emoglobine contenute nel campione vengono separate per elettroforesiutilizzando un tampone alcalino (pH 8.2-8.6) e vengono colorate con colorante Ponceau S. I patternvengono analizzati in un densitometro a scansione e viene determinata la percentuale relativa diciascuna banda.

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TITAN III ELETTROFORESI DELL’EMOGLOBINA

Italiano

AVVERTENZE E PRECAUZIONITutti i reagenti sono destinati esclusivamente alla diagnostica in vitro. Non ingerire né pipettare con labocca i componenti del kit. Indossare i guanti durante la manipolazione di tutti i componenti del kit.Per le indicazioni relative ai rischi e alla sicurezza e per le informazioni sullo smaltimento, fare riferimento alle schede tecniche dei prodotti.

COMPOSIZIONE1. Tampone Supre-Heme® (Cod. N. 5802)

Il tampone contiene Tris-EDTA e acido borico. pH 6.2 - 8.6. Sciogliere una confezione di tamponein 980ml di acqua depurata. Il tampone è pronto per l’uso non appena tutto il materiale apparedisciolto e completamente miscelato.

2. Reagente per emolisato (Cod. N. 5125)Il reagente contiene 0,005 M EDTA in acqua depurata con cianuro di potassio allo 0,01% comeconservante. Il reagente è in confezione pronta all’uso.

3. Colorante Ponceau S (Cod. N. 5526)Il colorante si presenta sotto forma di polvere ed è costituito da una miscela di Ponceau S e acidosulfosalicilico. Sciogliere il contenuto del flacone in 1 litro di acqua deionizzata e miscelare per 30minuti o fino al completo scioglimento.

4. Clear Aid (Cod. N. 5005)Il reagente contiene polietilenglicole. Clear Aid viene utilizzato per preparare la soluzionechiarificante utilizzata nel paragrafo PROCEDURA. Miscelare 30 parti di acido acetico glaciale, 70parti di metanolo assoluto e 4 parti di Clear Aid.

5. Altri componenti del kitOgni kit contiene un foglio procedurale.

CONSERVAZIONE E STABILITÀ1. Tampone Supre-Heme® (Cod. N. 5802)

Il tampone confezionato deve essere conservato a 15...30°C ed è stabile fino alla data di scadenzariportata sull’etichetta. La soluzione tampone è stabile per 2 mesi a 15...30°C. Il deterioramentopuò essere indicato da umidità o scolorimento o dalla presenza di segni di contaminazionebatterica.

2. Reagente per emolisato (Cod. N. 5125)Il reagente deve essere conservato a 15...30°C ed è stabile fino alla data di scadenza indicatasull’etichetta.

3. Colorante Ponceau S (Cod. N. 5526)Il colorante deve essere conservato a 15...30°C ed è stabile fino alla data di scadenza indicatasull’etichetta. Conservare in una bottiglia chiusa ermeticamente o in un piatto di colorazione. Il colorante può essere riutilizzato più volte se conservato adeguatamente. Il deterioramento puòessere indicato dall’eccessiva evaporazione o dalla comparsa di grandi quantità di precipitato.

4. Clear Aid (Cod. N. 5005)Il Clear Aid deve essere conservato a 15...30°C ed è stabile fino alla data di scadenza riportatasull’etichetta. Conservare la soluzione chiarificante preparata in un contenitore chiusoermeticamente, per evitare l’evaporazione del metanolo. In caso di evaporazione, le piastrepossono presentare segni di delaminazione. La contaminazione dell’acqua dovuta ad un utilizzoeccessivo della soluzione chiarificante intorbidisce le piastre.

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RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONISangue intero raccolto in provette contenenti EDTA o eparina. La preparazione dei campioni èillustrata nel paragrafo PROCEDURA. I campioni di sangue intero possono essere conservati fino a 1 settimana a 2...6°C.

Procedura alternativa di preparazione dei campioniSe si ritiene necessaria la rimozione di emoglobine denaturate dai campioni, eseguire le fasi sottoillustrate:a. Centrifugare il campione di sangue a 3500 giri/min. per 5 minuti.b. Rimuovere il plasma dal campione e lavare gli eritrociti in soluzione fisiologica allo 0,85%

(volume/volume) per 3 volte. Dopo ogni lavaggio, centrifugare le cellule per 10 minuti a 3500giri/min.

c. Aggiungere 1 volume di acqua depurata e 1/4 volume di toluene (o tetracloruro di carbonio) aglieritrociti lavati.

d. Miscelare con il Vortex ad alta velocità per un minuto.e. Centrifugare i campioni a 3500 giri/min. per 10 minuti.f. Se viene utilizzato il toluene, lo strato superiore presente nella provetta conterrà stroma cellulare

e dovrà essere rimosso con una pipetta capillare prima di procedere alla fase successiva. Lo stratointermedio trasparente contiene il campione desiderato. Se si utilizza il tetracloruro di carbonio,tutto il materiale di scarto eritrocitario si troverà sul fondo della provetta in seguito acentrifugazione.

g. Filtrare la soluzione rossa trasparente con due strati di carta da filtro Whatman n. 1.

MATERIALI NECESSARI MA NON IN DOTAZIONECod. N. 5116 I.O.D.Cod. N. 1520 Alimentatore digitale EWSCod. N. 3021 Acetato di cellulosa Titan Ill-H (25 piastre 94 x 76 mm)Cod. N. 3022 Acetato di cellulosa Titan® lll-H (25 piastre 76 x 60 mm)Cod. N. 5802 Tampone Supre-Heme (10 x 14,6 g)Cod. N. 5125 Reagente per emolisato (1 x 250ml)Cod. N. 5526 Ponceau SAcido acetico al 5%Metanolo assolutoCod. N. 5005 Clear Aid (1 x 250ml)Cod. N. 5090 Prep Zip Zone®Cod. N. 5081 Stoppini per camera Zip Zone® (500/scatola)Cod. N. 5053 Buste in plastica Titan (12 camp. 100/conf.)Cod. N. 5052 Buste in plastica Titan (200 conf.)Cod. N. 5037 Blocchetti di blotter Titan (100/scatola 89 x 108 mm)Cod. N. 5034 Blocchetti di blotter Titan (100/scatola 76 x 102 mm)Cod. N. 5000 Marcatore HelenaCod. N. 5015 Etichette di identificazioneCod. N. 5212 Modulo di report sull’emoglobina (100/blocchetto)Cod. N. 5002 Colla in stick

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Italiano

PROCEDURA1. Sciogliere una confezione di tampone Supre-Heme in 980ml di acqua depurata.2. Codificare adeguatamente il numero richiesto di piastre Titan III-H contrassegnandole sul lato

rigido lucido con un marcatore Helena.3. Immergere il numero richiesto di piastre in tampone Supre-Heme per 5 minuti. Le piastre devono

essere immerse nel “bufferizer” (contenitore di immersione in tampone) conformemente alleistruzioni fornite. In alternativa, le piastre possono essere inumidite introducendo, in modo lentoed uniforme, un rack di piastre nel tampone. NOTA: Lo stesso tampone di immersione puòessere utilizzato per immergere fino a 12 piastre o conservato per circa una settimana in uncontenitore ermeticamente chiuso. In caso di impiego per periodi prolungati, i solventi residuiprovenienti dalle piastre possono accumularsi nel tampone e causare una scarsa separazione delleproteine oppure l’evaporazione può dare luogo ad una maggiore concentrazione del tampone.

4. Versare circa 100ml di tampone Supre-Heme in ogni sezione esterna della camera.5. Inumidire 2 stoppini monouso nel tampone e stenderne uno su ogni ponticello di supporto,

assicurandosi che entri a contatto con il tampone e che non vi siano bolle d’aria sotto gli stoppini.6. Coprire la camera per evitare l’evaporazione del tampone.7. Preparare un emolisato dei campioni del paziente come illustrato di seguito:a. Utilizzando sangue intero: Aggiungere 1 parte di sangue intero a 3 parti di reagente per emolisato.

Miscelare accuratamente e lasciare riposare per 5 minuti.b. Utilizzando cellule impaccate: Miscelare 1 parte di eritrociti impaccati con 6 parti di reagente per

emolisato. Miscelare accuratamente e lasciare riposare per 5 minuti.NOTA: Se si ritiene necessaria la rimozione di emoglobine denaturate dal campione, fare riferimento al paragrafo Procedura alternativa di preparazione dei campioni.

8. Introdurre 5µl di emolisati paziente preparati o 5µl di almeno uno degli emocontrolli Helena neipozzetti delle piastre a pozzetti servendosi del microdispenser. NOTA: Gli emocontrolli Helenadevono essere utilizzati direttamente dal flacone. Non preparare un emolisato.

9. Se i campioni non vengono utilizzati entro 2 minuti, coprire la piastra a pozzetti con un vetrino perevitare l’evaporazione.

10. Per innescare l’applicatore, premere le punte per 3-4 volte all’interno dei pozzetti per campioni.Applicare la carica ad un blotter. Non caricare nuovamente l’applicatore, ma passare alla fasesuccessiva.

11. Rimuovere dal tampone la piastra Titan III inumidita ed asciugare una volta con decisione tra 2blotter. Collocare la piastra nella base di allineamento, con il lato dell’acetato di cellulosa versol’alto, allineando il bordo inferiore della piastra stessa rispetto alla linea nera contrassegnata da“CATHODE APPLICATION”. Il contrassegno di identificazione dovrà essere allineato con ilcampione n. 1. Prima di collocare la piastra nella base di allineamento, applicare una goccia diacqua o di tampone sul centro della base stessa. Ciò consente di evitare che la piastra si spostidurante l’applicazione dei campioni.

12. Per applicare il campione alla piastra, premere le punte dell’applicatore per 3-4 volte all’interno deipozzetti per campioni e trasferire l’applicatore alla base di allineamento. Premere il pulsante etenerlo premuto per 5 secondi.

13. Introdurre la piastra nella camera con il lato dell’acetato di cellulosa verso il basso. Sistemare unpeso sulla piastra, per garantire il contatto con gli stoppini.

14. Eseguire l’elettroforesi: 350 Volt per 25 minuti.15. Rimuovere le piastre dalla camera e colorare con Ponceau S per 5 minuti.16. Decolorare in 3 bagni successivi con acido acetico al 5%. Lasciare le piastre in ogni bagno per 2

minuti.

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17. A questo punto le piastre possono essere essiccate e conservate in modo permanente. Se si desidera un fondo trasparente (per la densitometria), procedere alla fase successiva.

18. Disidratare le piastre in 2 bagni successivi con metanolo assoluto. Lasciare le piastre in ogni bagnoper 2 minuti.

19. Introdurre la piastra in soluzione chiarificante per 5-10 minuti.20. Rimuovere la piastra dalla soluzione chiarificante ed eliminare la soluzione in eccesso.21. Collocare la piastra, con il lato dell’acetato di cellulosa verso l’alto, su un blocchetto di blotter sotto

il Micro-Hood oppure in un forno di essiccazione a 56°C per 10 minuti o fino a quando non si saràessiccata.

Valutazione delle bande di emoglobina1. Valutazione qualitativa:

Le piastre di emoglobina possono essere ispezionate visivamente per verificare per la presenza dibande emoglobiniche anomale. Gli emocontrolli Helena forniscono un marker per l’identificazionedelle bande.

2. Valutazione quantitativa: Determinare la percentuale relativa di ciascuna banda di emoglobina analizzando le piastrechiarificate ed essiccate con il densitometro, utilizzando un filtro a 525 nm.

Stabilità del prodotto finale: Le piastre essiccate sono stabili per un tempo indefinito e possonoessere conservate nelle buste in plastica Titan.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATILe figure 1 e 2 illustrano il modo in cui la combinazione dell’elettroforesi su acetato di cellulosa e agarcitrato può essere utilizzata in tandem per l’identificazione delle emoglobine.

Figura 1. Mobilità elettroforetiche delle emoglobine su acetato di cellulosa Titan III.

Figura 2. Mobilità elettroforetiche delle emoglobine su Hb acida Titan Gel, da cui apparel’eliminazione di possibili emoglobine mutanti.

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Italiano

AA2DE

GJH

F O S C

+

A2

CEO

SDG

F A

ALKALINE Hb

La maggior parte delle varianti emoglobiniche non determina alcun sintomo clinico distinguibile,pertanto i ricercatori sono particolarmente interessati al loro studio. Le varianti sono clinicamenteimportanti quando la loro presenza conduce a disturbi come anemia drepanocitica, sindromitalassemiche, cianosi cronica, anemie emolitiche o eritrocitosi, oppure se l’eterozigote ha unadiffusione sufficiente per giustificare una consulenza genetica. Le combinazioni di Hb S-S, Hb S-D-LosAngeles e Hb S-0 Arab generano seri disturbi di anemia drepanocitica

2. Molte varianti, tra cui Hb H.E-

Fort Worth e Lepore, causano un quadro ematico talassemico2.

Negli Stati Uniti, le due emoglobine varianti di maggiore importanza in termini di frequenza e patologiasono l’HbS e l’HbC2. L’anemia a cellule falciformi (HbSS) è una patologia spietata e letale. Si manifestaper la prima volta a circa 5-6 mesi di età. L’andamento clinico presenta episodi di agonia, dolore einnalzamenti della temperatura, accompagnati da anemia, spossatezza, letargia e infarto praticamentein tutti gli organi del corpo. L’individuo con HbCC omozigote soffre di lieve anemia emolitica, attribuitaalla precipitazione o cristallizzazione di HbC all’interno degli eritrociti. I casi di emoglobinopatia SCsono caratterizzati da anemia emolitica, una forma più lieve rispetto all’anemia a cellule falciformi. Le talassemie sono un gruppo di emoglobinopatie caratterizzate da ipocromia e microcitosi dovute allaridotta sintesi di una catena di globina (la α o la β), mentre la sintesi dell’altra catena procedenormalmente

9,10. Questa sintesi squilibrata determina catene globiniche instabili. Queste precipitano

nell’eritrocita, formando corpi inclusi che accorciano la durata di vita della cellula. Nelle talassemie di tipo a, le catene a sono in numero inferiore al normale o assenti, mentre nellatalassemia β il problema riguarda le catene β. Un altro disturbo quantitativo della sintesidell’emoglobina, la persistenza di emoglobina fetale ereditaria (HPFH), rappresenta una disfunzionegenetica dei meccanismi che interrompono la sintesi della catena gamma a circa quattro mesi dallanascita, provocando una continua alta percentuale di HbF. Si tratta di una condizione meno graverispetto alle talassemie vere e proprie; i pazienti omozigoti con persistenza di HPFH hanno unosviluppo normale, non presentano sintomi e non hanno alcuna anemia

10.

Le anomalie emoglobiniche più frequenti sono:Tratto dell’anemia falciformeÈ uno stato eterozigote che presenta l’HbA, l’HbS e una quantità normale di emoglobina A2 su acetatodi cellulosa. I risultati su agar citrato presentano le emoglobine nelle posizioni migratorie emoglobinaA e emoglobina S (zone).Anemia a cellule falciformiSi tratta di uno stato omozigote che mostra quasi esclusivamente emoglobina S, sebbene possa esserepresente anche una piccola quantità di emoglobina F.Anemia drepanociticaSi tratta di uno stato eterozigote che presenta l’HbS e l’HbC.Talassodrepanocitosi Questa condizione presenta le emoglobine A, F, S e A2. Nella talassodrepanocitosi beta è assentel’emoglobina A.Malattia talassemica CQuesta condizione presenta le Hb A, F e C.Malattia da emoglobina CSi tratta di uno stato omozigote che presenta quasi esclusivamente l’emoglobina C.Talassemia majorQuesta condizione presenta l’HbF, la A e la A2.

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Calcolo dei valori non noti: L’EDC Helena, il CliniScan ed altri densitometri Helena con accessoriper computer sono in grado di stampare automaticamente la percentuale relativa delle bande.

Ulteriori esami necessari:1. L’elettroforesi su agar citrato può essere un test di controllo necessario per la conferma delle

emoglobine anomale rilevate su acetato di cellulosa.2. Può essere necessario effettuare l’analisi della catena globinica (sia acida sia alcalina) e alcuni studi

strutturali al fine di identificare positivamente alcune delle emoglobine più rare.3. La cromatografia a colonna a scambio anionico rappresenta il metodo più accurato per quantificare

l’emoglobina A2. Si raccomanda il metodo a colonna Quik Sickle-Thal di Helena BioSciencesEurope per la quantificazione dell’emoglobina A2 in presenza di emoglobina S, o la procedura acolonna Quik HBA2 Beta-Thal di Helena. La quantificazione dell’emoglobina A2 è uno dei testdiagnostici più importanti per la diagnosi del tratto beta-talassemico.

4. Livelli bassi di emoglobina F (1-10%) possono essere quantificati accuratamente medianteimmunodiffusione radiale utilizzando la procedura HbF-QUIPlate di Helena.

CONTROLLO QUALITÀPer l’elettroforesi dell’emoglobina sono disponibili i seguenti controlli presso Helena BioSciencesEurope:Cod. N. 5328 AA2 EmocontrolloCod. N. 5329 ASA2 EmocontrolloCod. N. 5330 AFSA2 EmocontrolloCod. N. 5331 AFSC Emocontrollo

I controlli devono essere utilizzati come marcatori per l’identificazione delle bande emoglobiniche epossono essere quantificati per la verifica dell’accuratezza della procedura. Fare riferimento all’insertocontenuto nella confezione del controllo per conoscere i valori di dosaggio e i pattern di migrazione.Utilizzare almeno uno di questi controlli su ogni piastra analizzata.

LIMITAZIONIAlcune emoglobine anomale hanno mobilità elettroforetiche simili e devono essere differenziatemediante altre metodologie.

VALORI DI RIFERIMENTOAlla nascita, la maggior parte dell’emoglobina negli eritrociti dell’individuo normale è emoglobina fetale,HbF. Sono presenti anche una parte della più importante emoglobina adulta, l’HbA, e una piccolaquantità di HbA2. Al termine del primo anno di vita e in età adulta, l’emoglobina principale presente èl’HbA, di cui fino al 3,5% di HbA2 e meno del 2% di HbF.

BIBLIOGRAFIA1. Wintrobe, Maxwell M Cynical Hemaotogy 6th Edition. LaFebiger. Philadelphia. 1967.2. Fairbanks, VF, Diagnostic Medicine. Nov/Dec, 53-58. 1980.3. Schneider, RG, et al. Laboratory Identification of the Hemoglobins, Lab Management, August. 29-



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Italiano



7. Huisman.THJ and Schroeder. WA. New Aspects of the Structure, Function and Synthesis ofHemoglobins. CRC Press. Cleveland. 1971.



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USO PREVISTOEl procedimiento de electroforesis de hemoglobina de Helena utilizando acetato de celulosa en untampón alcalino tiene como objeto la determinación cualitativa y cuantitativa de las hemoglobinasanormales.

Las hemoglobinas (Hb) son un grupo de proteínas cuya principal función es transportar oxígeno desdelos pulmones a los tejidos y dióxido de carbono en sentido inverso. Están formadas por cadenas depolipéptidos denominadas globinas y grupos heme de protoporfirina con hierro. Una secuenciaespecífica de aminoácidos contiene cada una de cuatro cadenas polipetídicas, que se denominan α, β,γ y δ. Hay otras dos cadenas, ξ y Z formadas en el embrión. Cada molécula de hemoglobina normalcontiene un par de cadenas alfa y otro par de cadenas no alfa. En la hemoglobina adulta normal (HbA)las cadenas no alfa se denominan beta y la estructura se expresa como α2β2. Las cadenas no alfa dela hemoglobina fetal se denominan gamma y su estructura es α2γ2. Una fracción de hemoglobinamenor (3%) denominada HbAg contiene cadenas alfa y delta y su estructura es α2δ2. En una inhibiciónhereditaria de la síntesis de la cadena de globina denominada talasemia, las cadenas no alfa puedenagruparse para formar HbH (β4) o Hb de Bart (α4). Además de la globina, cada molécula dehemoglobina contiene cuatro grupos heme (uno para cada cadena) localizado dentro de bolsillosformados por el pliegue de las cadenas. La hemoglobina predominante en los eritrocitos de un adultonormal es la HbA, y hay pequeñas cantidades de HbAg y HbF. Además, en la actualidad se conocenalrededor de 400 hemoglobinas mutantes, algunas de ellas causantes de efectos clínicos graves,especialmente en estado homocigótico o en combinación con otras hemoglobinas anormales.Wintrobe

1divide las anormalidades de síntesis de la hemoglobina en tres grupos:

I. Producción de moléculas proteínicas anormales (por ejemplo, anemia falciforme).2. Reducción de la cantidad de síntesis de proteínas normales (por ejemplo, talasemia).3. Desarrollo de anomalías (por ejemplo, persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH)).

Las dos hemoglobinas mutantes más comunes en Estados Unidos son HbS y HbC. Otras que sepueden encontrar son Hb Lepore, E.G-Philadelphia, D-Los Ángeles y O-Arab

2. La electroforesis se

considera generalmente el mejor método para separar e identificar las hemoglobinas presentes en unamuestra de sangre y, óptimamente, el protocolo para la electroforesis de la hemoglobina implica el usoescalonado de dos sistemas

3-8. La electroforesis inicial se realiza en tampones alcalinos. El acetato de

celulosa es el medio de soporte principal empleado porque produce una separación rápida de HbA, F,S y C, y muchos otros mutantes con un tiempo de separación mínimo. De todos modos, dada lasimilitud electroforética de muchas hemoglobinas estructuralmente diferentes, la evaluación debe complementarse con una electroforesis de tampón ácido que mide la propiedaddistinta de la carga eléctrica. Un procedimiento sencillo que confirma la identificación de HbS y HbC,así como de HbA, HbF y muchos otros mutantes es la electroforesis en agar citrato. Este método sebasa en las interacciones complejas de la hemoglobina con el tampón electroforético (PH ácido) y elsoporte de agar. La electroforesis es un procedimiento simple que exige sólo cantidades mínimas dehemolisato para dar una confirmación muy específica (pero no absoluta) de la presencia de HbS, HbCy HbF, así como de varias otras hemoglobinas anormales.

Se aplican cantidades muy pequeñas de hemolisatos preparados de sangre entera a la Placa de acetatode celulosa Titan III. Las hemoglobinas de la muestra se separan mediante electroforesis utilizando untampón alcalino (pH 8.2-8.6) y se colorean con un Colorante Ponceau S. Se estudian los patrones enun densitómetro de estudio y se determina el porcentaje relativo de cada banda.

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ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA TITAN III

Español

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONESTodos los reactivos son exclusivamente para uso diagnóstico in-vitro. No ingerir ni chupar con la bocaningún componente del kit. Usar guantes para manejar todos los componentes del kit. Consultar lahoja con los datos de seguridad del producto acerca de los riesgos de los componentes, avisos deseguridad y consejos para su eliminación.

COMPOSICIÓN1. Tampón Supre-Heme® (Nº Cat 5802)

El tampón contiene Tris-EDTA y ácido bórico pH 6,2 – 8,6. Disolver un paquete de tampón en980 ml de agua destilada. El tampón está listo para usar cuando todo el material está disuelto ycompletamente mezclado.

2. Reactivo hemolisato (N° Cat. 5125)El reactivo contiene 0,005 M EDTA en agua destilada con cianuro potásico al 0,01% añadido comoconservante. El reactivo viene envasado listo para usar.

3. Colorante Ponceau S (Nº Cat. 5526)La tinción se suministra en forma de polvo y es una mezcla de Ponceau S y ácido sulfosalicílico.Disolver el contenido del frasco en 1 litro de agua desionizada y mezclar durante 30 minutos ohasta que esté completamente disuelto.

4. Ayuda de limpieza (Nº Cat. 5005)El reactivo contiene polietilenglicol. La ayuda de limpieza se usa para preparar la solución delimpieza usada en el PROCEDIMIENTO PASO A PASO. Mezclar 30 partes de ácido acéticoglacial, 70 partes de metanol absoluto y 4 partes de Ayuda a la limpieza.

5. Otros componentes del kitCada kit contiene instrucciones de uso

ALMACENAMIENTO Y PERÍODO DE VALIDEZ1. Tampón Supre-Heme® (Nº Cat. 5802)

El tampón envasado debe almacenarse a 15...30°C y permanece estable hasta la fecha decaducidad indicada en la etiqueta del frasco. La solución tampón es estable durante dos meses a15...30°C. Puede indicarse deterioro por humedad o decoloración o si muestra signos decontaminación bacteriana.

2. Reactivo hemolisato (N° Cat. 5125)El reactivo ha de almacenarse a 15...30°C y permanece estable hasta la fecha de caducidad indicadaen la etiqueta del envase.

3. Colorante Ponceau S (Nº Cat. 5526)El colorante ha de almacenarse a 15...30°C y permanece estable hasta la fecha de caducidadindicada en la etiqueta del envase. Guardar en un frasco herméticamente cerrado o en un platode tinción. El colorante se puede utilizar varias veces si se guarda correctamente. Puede indicardeterioro la evaporación excesiva o la aparición de grandes cantidades de precipitado.

4. Ayuda de limpieza (Nº Cat. 5005)La ayuda de limpieza ha de almacenarse a 15...30°C y permanece estable hasta la fecha decaducidad indicada en la etiqueta. Guardar la solución de limpieza preparada en un recipienteherméticamente cerrado para evitar la evaporación del metanol. Cuando se produce laevaporación, las placas pueden deslaminarse. La contaminación con agua por el uso excesivo dela solución de limpieza hará que las placas sean turbias.

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RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE MUESTRASLa sangre entera recogida en tubos con EDTA o heparina. La preparación de la muestra se detalla enel PROCEDIMIENTO PASO A PASO. Las muestras de sangre entera pueden conservarse durante hasta una semana a 2...6°C.

Procedimiento de preparación de muestras alternativo:Si se considera necesaria la retirada de hemoglobinas desnaturalizadas de las muestras, realizar lossiguientes pasos:a. Centrifugar la muestra de sangre a 3.500 rpm durante 5 minutos.b. Retirar el plasma de la muestra y lavar los eritrocitos en solución salina al 0,85% (v/v) tres veces.

Después de cada lavado, centrifugar las células durante 10 minutos a 3.500 rpm.c. Añadir 1 volumen de agua destilada y ¼ de volumen de tolueno (o tetracloruro de carbono) a los

eritrocitos lavados.d. Someter a vórtex a alta velocidad durante un minuto.e. Centrifugar las muestras a 3.500 rpm durante 10 minutos.f. Si se usa tolueno, la capa superior en el tubo contendrá estroma celular y debe retirarse con una

pipeta capilar antes de pasar al paso siguiente. La capa media transparente contiene la muestradeseada. Si se usa tetracloruro de carbono, todo el material de desecho de glóbulos rojos estarácontenido en el fondo del tubo después de la centrifugación.

g. Filtrar la solución roja transparente a través de dos capas de papel de filtro Whatman n° 1.

ARTÍCULOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS;Nº Cat. 5116 I.O.DNº Cat. 1520 Fuente de alimentación digital EWSNº Cat. 3021 Acetato de celulosa Titan Ill-H (25 placas 94 x 76 mm)Nº Cat. 3022 Acetato de celulosa Titan® Ill-H (25 placas 76 x 60 mm)Nº Cat. 5802 Tampón Supre Heme (10 x 14,6 g)Nº Cat. 5125 Reactivo hemolisato (1 x 250 ml)Nº Cat. 5526 Ponceau SÁcido acético al 5%Metanol absolutoNº Cat. 5005 Ayuda de limpieza (1 x 250 ml)Nº Cat. 5090 Prep. Zip Zone®Nº Cat. 5081 Mechas de cámara Zip Zone® (500/caja)Nº Cat. 5053 Sobres de plástico Titan (12 muestras 100/envase)Nº Cat. 5052 Sobres de plástico Titan (200 env)Nº Cat. 5037 Láminas secantes Titan (100/caja 89 x 108 mm)Nº Cat. 5034 Láminas secantes Titan (100/caja 76 x 102 mm)Nº Cat. 5000 Marcador HelenaNº Cat. 5015 Etiquetas de identificaciónNº Cat. 5212 Formularios de informe de hemoglobina (100/taco)Nº Cat. 5002 Palo de pegamento

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PROCEDIMIENTO PASO A PASO1. Disolver un paquete de tampón Supre-Heme en 980 ml de agua destilada.2. Codificar adecuadamente el número necesario de Placas Titan III-H marcando en el lado brillante,

duro, con un Marcador Helena.3. Empapar el número necesario de placas en tampón Supre-Heme durante 5 minutos. Las placas

deben empaparse en el Tamponizador según las instrucciones suministradas. De forma alternativa,pueden humedecerse las placas bajando lenta y uniformemente un soporte de placas hacia eltampón. NOTA: Puede usarse el mismo tampón de empapar para empapar hasta 12 placas odurante aproximadamente una semana si se conserva herméticamente cerrado. Si se usan duranteun período prolongado, los solventes residuales de las placas pueden acumularse y hacer que hayamala separación de las proteínas o la evaporación puede producir mayor concentración detampón.

4. Verter aproximadamente 100 ml de tampón Supre-Heme en cada una de las secciones externasde la cámara.

5. Humedecer dos mechas desechables en el tampón y envolver una sobre cada puente de soporte,asegurándose de que hace contacto con el tampón y de que no hay burbujas de aire bajo lasmechas.

6. Cubrir la cámara para impedir la evaporación del tampón.7. Preparar un hemolisato de las muestras del paciente del siguiente modo:a. Utilizando sangre entera: Añadir 1 parte de sangre entera a 3 partes de reactivo hemolisato.

Mezclar bien y dejar reposar durante 5 minutos.b. Utilizando concentrados de hematíes: Mezclar 1 parte de concentrados de hematíes a 6 partes de

reactivo de hemolisato. Mezclar bien y dejar reposar durante 5 minutos.NOTA: Si la retirada de hemoglobinas desnaturalizadas de la muestra se considera necesaria, verel Procedimiento Alternativo de Preparación de la Muestra.

8. Colocar 5 µl de los hemolisatos preparados del paciente o 5 µl de, al menos, uno de loshemocontroles de Helena en los pozos de las placas de pozo de muestra utilizando elmicrodispensador. NOTA: Los hemocontroles de Helena se utilizan directamente del vial. No preparar un hemolisato.

9. Si no se van a utilizar las muestras en el plazo de 2 minutos, cubrir las placas de pozo de muestracon un portaobjetos de vidrio para evitar la evaporación.

10. Cebar el aplicador hundiendo las puntas en los pozos de muestra 3 ó 4 veces. Aplicar esta cargaa una pieza de papel secante. No cargar de nuevo el aplicador y pasar al siguiente paso.

11. Retirar la placa Titan III humedecida del tampón y secar una vez con firmeza entre dos secantes.Colocar la placa en la base de alineación, con el lado de acetato de celulosa hacia arriba, alineandoel borde inferior de la placa con la línea negra marcada “APLICACIÓN DEL CÁTODO”. La marcade identificación debe alinearse con la muestra Nº 1. Antes de colocar la placa en la base dealineación, poner una gota de agua o tampón en el centro de la base. Así se evitará que la placa sedesplace durante la aplicación de la muestra.

12. Aplicar la muestra a la placa deprimiendo las puntas del aplicador en el pozo de muestra 3 ó 4 vecesy transferir el aplicador a la base de alineación. Pulsar el botón y mantenerlo pulsado 5 segundos.

13. Colocar la placa en la cámara, con el lado de acetato de celulosa hacia abajo. Colocar un pesosobre la placa para asegurar el contacto con las mechas.

14. Electroforesis: 25 minutos, 350 voltios.15. Retirar las placas de la cámara y colorear con Ponceau S durante 5 minutos.16. Decolorar en 3 lavados sucesivos de ácido acético al 5%. Dejar reposar las placas en cada lavado

2 minutos.

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17. En este punto, las placas se pueden secar y guardar durante un registro permanente. Si se desealograr un fondo transparente (es decir, para una densitometría), pasar al siguiente paso.

18. Deshidratar las placas en 2 lavados sucesivos de metanol absoluto. Dejar reposar las placas en cadalavado 2 minutos.

19. Colocar la placa en la solución de limpieza durante 5-10 minutos.20. Retirar la placa de la solución de limpieza y drenar el exceso de solución.21. Colocar la placa, con el lado de acetato hacia arriba, en una lámina secante bajo la microcapucha y

en un horno de secado a 56°C durante 10 minutos o hasta que esté seco.

Evaluación de las bandas de hemoglobina1. Evaluación cualitativa:

Las placas de hemoglobina pueden inspeccionarse visualmente en cuanto a la presencia de bandasde hemoglobina anormales. Los Hemocontroles de Helena proporcionan un marcador para laidentificación de bandas.

2. Evaluación cuantitativa: Determinar el porcentaje relativo de cada banda de hemoglobina estudiando las placas limpias ysecas en el densitómetro utilizando un filtro de 525 nm.

Estabilidad del producto final: Las placas secas son estables durante un período de tiempoindefinido y pueden conservarse en sobres de plástico Titan,

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSLas figuras 1 y 2 ilustran cómo puede usarse la combinación de acetato de celulosa y electroforesis enagar citrato en tándem para la identificación de las hemoglobinas.

Figura 1. Movilidades electroforéticas de las hemoglobinas en acetato de celulosa Titan III.

Figura 2. Movilidades electroforéticas de hemoglobinas en Hb Ácida Titan Gel que muestranla eliminación de posibles mutantes de Hb.

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Español

AA2DE

GJH

F O S C

+

A2

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SDG

F A

ALKALINE Hb

La mayor parte de las variantes de hemoglobina no producen síntomas clínicos a simple vista, por elloson de interés fundamentalmente para los científicos investigadores. Las variantes son clínicamenteimportantes cuando su presencia lleva a trastornos falciformes, síndromes de talasemia, cianosis delarga duración, anemias hemolíticas o eritrocitosis, o si el heterocigoto tiene la suficiente prevalenciacomo para justificar el consejo genético. Las combinaciones de Hb S-S, Hb S-D-Los Ángeles, y Hb S-O Arab producen trastornos falciformes graves

2. Algunas variantes, como Hb H.E-Fort Worth y

Lepore provocan un cuadro sanguíneo talasémico2.

Las dos variantes de hemoglobina más importantes en EE.UU. en cuanto a frecuencia y patología son:HbS y HbC

2. La anemia falciforme (HbSS) es una enfermedad cruel y mortal. Se manifiesta por

primera vez a los 5-6 meses de vida. El curso clínico presenta episodios de dolor intensísimo yaumento de la temperatura además de anemia, apatía, letargo, e infarto en prácticamente todos losórganos del cuerpo. El individuo con HbCC homocigótica padece anemia hemolítica leve que seatribuye a la precipitación o cristalización de HbC en los eritrocitos. Los casos de enfermedad HbSCse caracterizan por anemia hemolítica que es menos grave que la anemia falciforme. Las talasemias sonun grupo de trastornos de la hemoglobina que se caracterizan por hipocromia y microcitosis debido ala síntesis reducida de una cadena de globina (α ó β) mientras que la síntesis de la otra se producenormalmente

9, 10. Esta síntesis desequilibrada da como resultado cadenas de globina poco estables.

Estas se precipitan en el interior de los hematíes, formando cuerpos de inclusión que acortan la vidamedia de la célula. En la talasemia alfa, las cadenas alfa disminuyen o desaparecen y en la beta, las cadenas beta estánafectadas. Otro trastorno cuantitativo de la síntesis de la hemoglobina, la persistencia hereditaria dehemoglobina fetal (HPFH), representa un fallo genético de los mecanismos que cortan la síntesis de lacadena gamma aproximadamente a los cuatro meses después del nacimiento, lo que da como resultadoun continuo porcentaje elevado de HbF. No es una enfermedad tan grave como la verdadera talasemiay las personas homocigóticas por el HPFH tienen un desarrollo normal, no tienen síntomas e inclusono padecen anemia

10.

Las anomalías más comunes de la hemoglobina:Rasgo anemia falciforme.Es un estado heterocigótico que muestra presencia de HbA y HbS y una cantidad normal de HbA2 enacetato de celulosa. Los resultados con agar citrato muestran la presencia de hemoglobinas en lasposiciones (zonas) migratorias HbA y HbS.Anemia falciforme.Se trata de un estado homocigótico que muestra la presencia casi exclusiva de HbS, aunque tambiénpuede estar presente una pequeña cantidad de HbF.Enfermedad falciforme-C.Es un estado heterocigótico que muestra presencia de HbS y HbC.Enfermedad falciforme-talasemia.Este trastorno muestra la presencia de HbA, HbF, HbS y HbA2. En la enfermedad falciforme-talasemiaβ, no hay presencia de HbA.Enfermedad talasemia-C.Este trastorno muestra presencia de HbA, HbF y HbC.Enfermedad C.Se trata de un estado homocigótico que muestra la presencia casi exclusiva de HbC.Talasemia MayorEste trastorno muestra la presencia de HbF, HbA y HbA2.

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Cálculo de los desconocidos: Los densitómetros EDC, CliniScan y otros densitómetros de Helenacon accesorios informáticos imprimirán automáticamente el porcentaje relativo de las bandas.

Otras pruebas adicionales necesarias son:1. La electroforesis en agar citrato puede ser una prueba de seguimiento necesaria para confirmar las

hemoglobinas anormales detectadas en el acetato de celulosa.2. Pueden ser necesarios el análisis de cadenas de globinas (tanto ácidas como alcalinas) y estudios

estructurales para identificar positivamente algunas de las hemoglobinas más raras.3. La cromatografía de columna de intercambio aniónica es el método más preciso para la

cuantificación de HbA2. Se recomiendan el método de columna Quik para talasemia falciforme deHelena BioSciences Europa para la cuantificación de HbA2 ante la presencia de HbS, o elprocedimiento de columna Quik para talasemia beta de Helena para HbA2. La cuantificación deHbA2 es una de las pruebas de diagnóstico más importantes en el diagnóstico de rasgos detalasemia β.

4. Niveles bajos de HbF (1-10%) se pueden cuantificar con exactitud mediante inmunodifusión radialutilizando el procedimiento HbF-QUIPlate de Helena.

CONTROL DE CALIDADHelena BioSciences Europa dispone de los siguientes controles para la electroforesis de hemoglobina:Nº Cat. 5328 AA2 HemocontrolNº Cat. 5329 ASA2 HemocontrolNº Cat. 5330 AFSA2 HemocontrolNº Cat. 5331 AFSC Hemocontrol

Los controles deben usarse como marcadores para la identificación de bandas de hemoglobina ypueden cuantificarse para verificar la precisión del procedimiento. Para obtener los valores de losensayos y los patrones de migración, consultar el folleto adjunto en el envase. Utilizar al menos unode estos controles en cada desarrollo.

LIMITACIONESAlgunas hemoglobinas anormales tienen movilidades electroforéticas similares y deben diferenciarseaplicando otras metodologías.

VALORES DE REFERENCIAAl nacer, la mayoría de la hemoglobina en los eritrocitos de un individuo normal es hemoglobina fetal,HbF. También hay presencia de algo de la principal hemoglobina adulta, HbA, y una pequeña cantidadde HbA2. Al término del primer año de vida y durante la vida adulta, la principal hemoglobina presentees HbA, con hasta un 3,5% de HbA2 y menos de un 2% de HbF.

BIBLIOGRAFÍA1. Wintrobe, Maxwell M Cynical Hemaotogy 6th Edition. LaFebiger. Philadelphia. 1967.2. Fairbanks, VF, Diagnostic Medicine. Nov/Dec, 53-58. 1980.3. Schneider, RG, et al. Laboratory Identification of the Hemoglobins, Lab Management, August. 29-



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HL-2-1435P 2007/06 (4)

TITAN III Haemoglobin Electrophoresis - Pera...

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