Thèse - VetAgro Sup % 11% tables(des(illustrations((figure1...

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2011 -‐ Thèse n° 59

ÉTUDES ÉPIDÉMIOLOGIQUES SUR LE SURRA (TRYPANOSOMA EVANSI) CHEZ LES ÉLEPHANTS ET LES

CHEVAUX EN THAÏLANDE

THÈSE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-‐BERNARD -‐ LYON I (Médecine -‐ Pharmacie)

Et soutenue publiquement le 18 novembre 2011 Pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

Par

Margot Camoin Née le 07 janvier 1986

À Paris (11°)

1

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2011 -‐ Thèse n° 59

ÉTUDES ÉPIDÉMIOLOGIQUES SUR LE SURRA (TRYPANOSOMA EVANSI) CHEZ LES ÉLEPHANTS ET LES

CHEVAUX EN THAÏLANDE

THÈSE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-‐BERNARD -‐ LYON I (Médecine -‐ Pharmacie)

Et soutenue publiquement le 18 novembre 2011 Pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

Par

Margot Camoin Née le 07 janvier 1986

À Paris (11°)

3

Liste du Corps Professoral

5

Remerciements

Au Professeur Dominique Peyramond, De l’Université Claude Bernard, Qui nous a fait l’honneur d’accepter la présidence de notre jury de thèse, Hommages respectueux.

Au Professeur Gilles Bourdoiseau, De Vetagrosup – Campus Vétérinaire de Lyon, Qui nous a fait l’honneur et le plaisir d’accepter la direction de cette thèse, Sincères remerciements.

Au Professeur Marc Artois, De Vetagrosup – Campus Vétérinaire de Lyon, Qui a accepté de juger ce travail, Toute ma reconnaissance.

To Professor Sathaporn Jittapalapong, From Kasetsart University, Bangkok, For welcoming me in the parasitology department, For your help in the quest for new samples.

Au Docteur Marc Desquesnes, Chercheur au CIRAD-‐Bangkok, Pour l’encadrement : sur place, et à distance, Pour votre soutien face aux échecs de PCR récurrents, Pour toutes les lettres envoyées aux services vétérinaires thaïlandais et aux associations « pro-‐éléphants » dans l’espoir d’avoir quelques échantillons de plus ! Bon courage pour la suite des négociations…

Au Professeur Philippe Jacquiet, De l’École Nationale Vétérinaire de Toulouse, Pour votre aide « pré-‐stage », et vos corrections « post-‐stage ».

7

À mes parents, pour le soutien ensoleillé à distance : indéfectible !

À ma grande sœur irréprochable !

À mes amis (d’ici, d’ailleurs, de nulle part) : tous ceux qui persistent et signent !

Mention particulière à tous les colocataires qui m’ont supportée : mes nombreuses petites « familles de substitution »

À ma famille plus éloignée, pour les escales nogentaises et montpelliéraines,

Spéciale dédicace à mes deux compagnonnes apprenties thaïlandaises,

À l’ancien réaliste et au poulot méconnu,

To my Thai and lab teacher,

Aux touristes de passage en Thaïlande…

À mes maîtres de stage : divers et variés.

9

Table des matières

INTRODUCTION 15

PREMIÈRE PARTIE : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE 17

I. RAPPELS SUR LE PARASITE ET LA MALADIE PROVOQUEE 17

1. IMPORTANCE ET IMPACT 17 2. DESCRIPTION MORPHOLOGIQUE EN MICROSCOPIE OPTIQUE SUR FROTTIS COLORES 18 2.1. CHEZ L’HOTE 18 2.2. CHEZ LES VECTEURS 19 3. CLASSIFICATION 19 4. BIOLOGIE 20 4.1. L’ADN NUCLEAIRE 20 4.2. LE KINETOPLASTE 20 4.3. NUTRITION 21 4.4. REPRODUCTION 21 4.5. LES MECANISMES DE RESISTANCE DU PARASITE FACE AU SYSTEME IMMUNITAIRE DE L’HOTE 23 5. ÉPIDEMIOLOGIE 24 5.1. REPARTITION GEOGRAPHIQUE 24 5.2. HOTES ET RESERVOIRS 24 5.3. VECTEURS 26 5.4. TRANSMISSION 27 5.5. FACTEURS INFLUENÇANT L’EPIDEMIOLOGIE DE LA MALADIE 28 6. ÉVOLUTION 28 7. LA MALADIE 30 7.1. PATHOGENIE 30 7.2. EXPRESSION CLINIQUE 30 8. DIAGNOSTIC 32 9. TRAITEMENT 32 9.1. SURAMINE (NAGANOL ®) 32 9.2. METHYLSULFATE, SULFATE OU MELANGE CHLORURE/SULFATE DE QUINAPYRAMINE 32 9.3. CHLORURE D’ISOMETAMIDIUM (SAMORIN ®, TRYPAMIDIUM ®) 32 9.4. ACETURATE DE DIMINAZENE (BERENIL ®, VERIBEN ®) 32 9.5. MELARSONINE (CYMELARSAN ®) 33 10. MEDECINE ALTERNATIVE 33 11. RESISTANCES 33 12. PROPHYLAXIE 34

II. LES HOTES ETUDIES 35

1. L’ÉLEPHANT 35 1.1. PLACE DE L’ELEPHANT DANS LA SOCIETE THAÏLANDAISE 35 1.2. PARTICULARITES ANATOMO-‐PHYSIOLOGIQUES 36 1.3. ÉLEVAGE ET UTILISATION 40 1.4. ORGANISATION DE LA FILIERE 42 1.5. LE SURRA ET LES ELEPHANTS EN THAÏLANDE 47 2. LE CHEVAL 48 2.1. L’ELEVAGE DE CHEVAUX EN THAÏLANDE 48 2.2. LE SURRA ET LES CHEVAUX EN THAÏLANDE 49 2.3. DESCRIPTION D’UNE FERME MIXTE DANS LA PROVINCE DE SURAT THANI 49

10

DEUXIÈME PARTIE : ÉTUDES DE TERRAIN 53

I. ENQUETES EPIDEMIOLOGIQUES CHEZ LES CHEVAUX ET LES ELEPHANTS EN THAÏLANDE 53

1. MATERIEL ET METHODES 53 1.1. ÉCHANTILLONNAGE DES ELEPHANTS 53 1.2. ÉCHANTILLONNAGE DES CHEVAUX 53 1.1. PRELEVEMENTS 57 1.2. METHODES DE DIAGNOSTIC 57 1.3. ANALYSE GEOGRAPHIQUE 59 2. RESULTATS 60 2.1. ÉCHANTILLONS D’ELEPHANTS 61 2.2. ÉCHANTILLONS DE CHEVAUX 61 3. DISCUSSION 61 3.1. ÉCHANTILLONNAGE 61 3.2. REALISATION DES PRELEVEMENTS 63 3.3. CHOIX ET INTERPRETATION DES TESTS 63 3.4. CONFRONTATION DES DIFFERENTS TESTS ET DEFINITION DU CAS 65 3.5. ANALYSES STATISTIQUES 67 3.6. REMISE DANS LE CONTEXTE… 67

II. ETUDE D’UN FOYER DE SURRA DANS UN ELEVAGE MIXTE 69

1. ANAMNESE DU FOYER 69 2. MATERIEL ET METHODE 69 2.1. ECHANTILLONNAGE ET PRELEVEMENTS 69 2.2. METHODES DE DIAGNOSTIC 69 2.3. PIEGEAGE D’INSECTES 70 2.4. ANALYSES STATISTIQUES 70 3. RESULTATS 70 3.1. PRELEVEMENTS 71 3.2. EXAMEN DIRECT : METHODE DE WOO 71 3.3. SEROLOGIE 71 3.4. PCR 71 3.5. PIEGEAGE 71 3.6. ANALYSES STATISTIQUES 72 3.7. CONDUITE A TENIR 73 3.8. SUIVI EFFECTIVEMENT REALISE PAR LE DLD 73 4. DISCUSSION 74

III. DIFFICULTES RENCONTREES 79

1. LINGUISTIQUES 79 2. TECHNIQUES 79 3. ADMINISTRATIVES 79

CONCLUSION 81

BIBLIOGRAPHIE 83 ANNEXES 91

11

Tables des illustrations FIGURE 1 -‐ TRYPANOSOMA EVANSI SUR FROTTIS COLORÉ 18

FIGURE 2 -‐ TRYPANOSOMA EVANSI "SLENDER FORM" – ULTRASTRUCTURE 20

FIGURE 3 -‐ TABANUS STRIATUS PIÉGÉ À SURAT THANI 26

FIGURE 4 -‐ COMPARAISON ÉLÉPHANT D'ASIE VS. ÉLÉPHANT D'AFRIQUE 35

FIGURE 5 -‐ LE OU LES DOIGTS DE LA TROMPE DE L’ÉLÉPHANT D’ASIE ET D’AFRIQUE 36

FIGURE 6 -‐ CYCLE OESTRAL DE L'ÉLÉPHANTE 39

FIGURE 7 -‐ CYCLE SEXUEL DE L'ÉLÉPHANTE 39

FIGURE 8 -‐ MÉLANGE D'ESPÈCES SENSIBLES À T. EVANSI DANS UN CAMPS D'ÉLÉPHANTS 41

FIGURE 9 -‐ LECTURE DE PUCE ÉLECTRONIQUE 44

FIGURE 10 -‐ PRÉLÈVEMENT DE SANG DANS UNE VEINE AURICULAIRE 44

FIGURE 11 -‐ PLAN DE LA PALMERAIE DE SURAT THANI VICTIME DU FOYER DE SURRA 49

FIGURE 12 -‐ COHABITATION DE PLUSIEURS ESPÈCES AUTOUR D'UN "SMUDGE FIRE" 51

FIGURE 13 -‐ ORIGINE GÉOGRAPHIQUE DES ÉCHANTILLONS ANALYSÉS ET RÉPARTTION DES POPULATIONS D’ÉLÉPHANTS 55

FIGURE 14 -‐ LOCALISATION DES PRÉLÈVEMENTS DE SANG DE CHEVAUX ET DES FOYERS DE SURRA 56

TABLEAU I -‐ RÉSULTATS DES TESTS DIAGNOSTIQUES CHEZ LES CHEVAUX ÉCHANTILLONNÉS 60

TABLEAU II -‐ RÉSULTATS DES TESTS DIAGNOSTIQUES CHEZ LES ÉLÉPHANTS ÉCHANTILLONNÉS 60

TABLEAU III -‐ COMPARAISON DES RÉSULTATS DE CATT/T. EVANSI, ELISA PROTÉINE A ET PCR-‐TBR DES ÉLÉPHANTS PRÉSENTANT AU MOINS UN RÉSULTAT POSITIF À UN DES TESTS 65

TABBLEAU IV -‐ COMPARAISON DES RÉSULTATS DE CATT/T. EVANSI, ELISA PROTÉINE A ET PCR-‐TBR DES CHEVAUX PRÉSENTANT AU MOINS UN RÉSULTAT POSITIF À UN DES TESTS 66

FIGURE 15 -‐ CACHEXIE ET ABATTEMENT SUR UN CHEVAL ATTEINT DE SURRA À SURAT THANI 69

FIGURE 16 -‐ ZÉBU À OREILLES TOMBANTES TRYPANOSOMÉ ET CACHECTIQUE À SURAT THANI 69

TABLEAU IV -‐ RÉSULTATS DES TESTS DIAGNOSTIQUES DE SURAT THANI LE 16 JUIN 2011 70

FIGURE 17 -‐ FORTE DENSITÉ D'HEMATOBIA SPP. SUR LA BOSSE D'UN BOVIN À SURAT THANI 72

FIGURE 18 -‐ SORTIE R DU TEST DE WILCOXON 72

FIGURE 19 -‐ ELECTROPHORÈSE DES PRODUITS DE PCR APRÈS TRAITEMENT DU BUFFY COAT DES CHÈVRES AU CHELEX 75

FIGURE 20 -‐ ELECTROPHORÈSE DES PRODUITS DE PCR APRÈS EXTRACTION D'ADN DU BUFFY COAT DES CHÈVRES AU "PHÉNOL-‐CHLOROFORME" 75

12

Table des annexes ANNEXE 1 -‐ POPULATION D'ÉLÉPHANTS DOMESTIQUES EN THAÏLANDE EN 2005 ET 2011 91

ANNEXE 2 -‐ CARTE 93

ANNEXE 3 -‐ POPULATION DE CHEVAUX PAR PROVINCE EN THAÏLANDE EN 2010 94

ANNEXE 4 -‐ EXTRACTION ADN 95

ANNEXE 5 -‐ CARTE 96

ANNEXE 6 -‐ CYCLE ÉPIDÉMIOLOGIQUE PARTIEL DE T. EVANSI EN THAÏLANDE 97

ANNEXE 7 -‐ SYNTHÈSE DE L’ÉVOLUTION DU FOYER DE SURAT THANI 98

ANNEXE 8 -‐ PROTOCOLE TRAITEMENT AU CHELEX 100 SODIUM FORM ® 100

13

Liste des abréviations ADN : Acide désoxyribo-‐nucléique ARN : Acide ribo-‐nucléique APOL 1 : Apolipoprotéine L1 BB : Blocking Buffer CATT/T. evansi : Card Agglutination Test for Trypanosomiasis due to T. evansi COV : Cut off value DLD : Department of Livestock Development ELC : Expression Linked Copy ELISA : Enzyme Linked Immuno-‐Sorbent Assay FIO : Forest Industry Organisation HDL : High Density Lipoprotein HPR : Haptoglobin Related Protein IC : Intervalle de confiance IFAT : Indirect fluorescent Antibody Test Ig : Immunoglobulines MHCT : Micro Haematocrit Centrifugation Technique NIAH : National Institute for Animal Health OIE : Organisation Mondiale pour la Santé Animale PCR : Polymerase Chain Reaction RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RPP : Relative Percentage of Positivity SRA : Serum Resistance Associated UV : Ultra Violet VAT : Variable antigen type VSG : Variable Surface Glycoprotein VSG-‐ES : Variable Surface Glycoprotein Expression Site

15

Introduction Trypanosoma evansi est l’agent pathogène responsable du Surra, une parasitose sanguine répandue sous des latitudes tropicales, sur trois continents : l’Afrique, l’Asie, et l’Amérique, à la différence des trypanosomes africains qui se limitent à la ceinture à glossines. Ce parasite hématophage peut atteindre de nombreuses espèces de mammifères, dont des animaux de production : bovins, buffles, chevaux et camélidés principalement, d’où les pertes économiques qu’il engendre. En effet, même si les cas d’issue fatale de la maladie sont plus rares que les cas d’évolution chronique, ces derniers sont souvent caractérisés par une forte baisse de production : perte de poids, baisse de fertilité, force de travail diminuée, production laitière inférieure…

Malheureusement, du fait de sa chronicité, l’impact de cette maladie est bien souvent sous-‐estimé par les autorités qui ont la charge de la gestion de la santé animale dans les pays infectés. Trypanosoma evansi est par conséquent rarement inclus dans un plan de lutte à l’échelle nationale, même dans les pays les plus touchés. C’est pourtant l’adoption de mesures de contrôle efficaces que visent les équipes scientifiques qui travaillent pour une meilleure connaissance de l’épidémiologie et de l’impact du Surra. Notamment en Thaïlande où, suite aux récents cas de Surra chez les chevaux et les éléphants, il est apparu nécessaire d’approfondir les connaissances sur l’épidémiologie de cette maladie chez ces deux espèces. Car si la situation chez les bovins et les buffles (hôtes « réservoirs ») est bien connue, il n’en va pas de même pour les chevaux et les éléphants, sur lesquels les publications sont moins nombreuses.

Pour ce faire, des études sérologiques, parasitologiques et moléculaires ont été mises en place grâce à la coopération existant entre le CIRAD (Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement), le département de parasitologie de l’Université de Kasetsart, à Bangkok et la TICA (Agence Thaïlandaise de Coopération Internationale). Elles devraient permettre à terme, par une visualisation plus précise de la circulation du parasite entre les différents hôtes et grâce aux données de prévalences sérologique, parasitologique et clinique, de mieux appréhender la gestion des foyers.

En effet, le traitement trypanocide actuellement disponible en Thaïlande est le Bérénil ® qui, malgré sa faible efficacité sur T. evansi, est toujours largement utilisé. C’est probablement ce qui a concouru à l’apparition de résistances du parasite à cette molécule. Ces résistances se traduisent par des rechutes, c’est-‐à-‐dire par la réapparition de parasites dans le courant sanguin d’animaux infectés suite à l’administration de Bérénil ®. Le contrôle du Surra en Thaïlande n’en est pas facilité, d’autant plus que le Cymelarsan ® (dernier trypanocide mis sur le marché, et développé spécifiquement pour la lutte contre T. evansi), n’est pas commercialisé dans le pays.

Parallèlement aux objectifs de cumuler les savoirs sur l’épidémiologie du Surra, il s’agissait aussi de pénétrer la filière « éléphant » en Thaïlande et de standardiser les tests ELISA : prérequis nécessaires à la réalisation des enquêtes de prévalence du Surra, mais également d’évaluer le traitement au Cymelarsan ®, en cas d’infection active chez les éléphants, puisque cela a déjà été effectué chez les chevaux.

17

PREMIÈRE PARTIE : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE

I. Rappels sur le parasite et la maladie provoquée Trypanosoma evansi est un protozoaire, parasite extracellulaire du sang, ou plus rarement des tissus (ganglions ou liquide céphalo-‐rachidien), c’est un Flagellé kinétoplastida appartenant à la famille des Trypanosomatidés, et au sous-‐genre Trypanozoon.

Le nom « Trypanosoma » a été créé par Gruby, après l’observation, en 1843, de ces hémoflagellés chez des grenouilles (Hoare 1972). Il est formé sur les racines grecques « trypanon » qui signifie tarière, et « soma », corps, faisant référence aux mouvements et mode de déplacement du parasite. Trypanosoma evansi, quant à lui, tient son nom d’Evans qui a été le premier en 1880, à mettre en évidence un trypanosome pathogène chez des chevaux et des dromadaires du sous-‐continent indien, même si la maladie causée, le Surra, y sévissait depuis « des temps immémoriaux » (Hoare 1972).

Du fait de sa large répartition géographique et de son large spectre d’hôtes, des souches locales ont été décrites sous d’autres noms à plusieurs reprises, et ce malgré la constance de sa morphologie et le peu de variation génétique rencontrée entre les souches de T. evansi, infectant différentes espèces et zones géographiques (Hoare 1972, Ventura et al. 2002).

1. Importance et impact Longtemps resté dans l’ombre des trypanosomes africains, et par conséquent moins étudié, T. evansi a été ajouté en 2008 à la liste des maladies ayant un impact sur le commerce international par l’organisation mondiale de la santé animale (OIE), et est donc de plus en plus surveillé. Il est également inscrit sur la liste des maladies à déclaration obligatoire de l’OIE, quelque soit l’espèce infectée. Il fait notamment l’objet d’un plan de surveillance et de contrôle en cas d’introduction en Australie, ce qui aurait des conséquences néfastes sur les exportations et sur la faune endémique (les marsupiaux étant particulièrement sensibles) (Reid 2002).

Le surra est en effet considéré comme l’une des maladies ayant le plus d’impact économique sur l’élevage aux Philippines (notamment les petits élevages familiaux ou « back yard »), alors que son impact est difficile à évaluer. Il est vrai que la maladie est souvent sous diagnostiquée car présente sous forme chronique, mais causant tout de même d’importantes pertes directes : baisse de production (GMQ, lait, fertilité, force de travail), abattage trop précoce des animaux atteints...

L’éloignement des zones atteintes, la réticence des éleveurs à déclarer les cas de mortalité, le manque d’information et les erreurs de diagnostic n’aident pas à apprécier les dégâts causés par le parasite. Et même lorsque diagnostic il y a, la déclaration des cas aux autorités compétentes fait parfois défaut (Reid 2002, Dobson et al. 2009). De là proviennent les difficultés rencontrées pour convaincre les gouvernements des pays atteints et indemnes de la nécessité de mettre en place des mesures pour respectivement diminuer la prévalence, et prévenir l’introduction du parasite. Le fait que T. evansi ne soit pas mentionné dans les normes internationales concernant les maladies animales pour le commerce international et la protection de la santé publique, la non-‐concertation des pays européens pour convenir d’un plan de contrôle commun des éventuels foyers, alors même que l’OIE avait émis en 2005, des recommandations pour prévenir l’introduction du parasite dans les pays indemnes, témoignent du

18

désintérêt des autorités pour cette pathologie (Desquesnes et al. 2008, Tamarit et al. 2010a).

Pourtant, les estimations de pertes économiques (mortalité et frais de traitement mis en œuvre) dues à la maladie sont alarmantes : respectivement 7.8, 28 et 2.4 milliards de dollars en 9 ans aux Philippines, et par an en Indonésie et au Brésil. En Thaïlande, le coût du traitement de tous les animaux infectés au Bérénil ®, s’élèverait à 7,67 millions de dollars (Tuntasuvan & Luckins 1998)

Par ailleurs, Dobson et al (2009) sont parvenus à établir un modèle de la maladie dans les villages philippins atteints afin d’estimer les pertes et les bénéfices de six plans thérapeutiques. Ils ont pu conclure que l’idéal serait de surveiller l’état de santé des animaux régulièrement et de ne traiter que les animaux atteints cliniquement. Cela permettrait, entre autres, de limiter le risque d’apparition de résistances au traitement, mais nécessite une bonne formation des éleveurs, ainsi que la disponibilité de trypanocides. L’intérêt de cette étude est que le plan de lutte conseillé pour les Philippines serait également valable dans d’autres pays, pour autant qu’ils aient une organisation de l’élevage similaire (Dobson et al. 2009).

Un récent cas humain en Inde a mis en évidence le caractère zoonotique potentiel, au moins chez les personnes présentant un déficit en apolipoprotéine L1, dû à une mutation dont la fréquence au sein de la population n’est pas connue (Vanhollebeke et al. 2006).

De plus, le dérèglement climatique observé actuellement, pourrait provoquer l’extension de la zone de répartition et le rallongement de la période d’activité des Tabanidés. À partir de là T. evansi pourrait être transmis sous des latitudes plus élevées.

2. Description morphologique en microscopie optique sur frottis coloré

2.1. Chez l’hôte T. evansi est une espèce monomorphique, et se retrouve, dans le courant sanguin, quasi exclusivement sous la forme dite « slender » ou « longue », contrairement aux trypanosomes africains, qui présentent également des trypomastigotes sous les formes intermédiaire et « stumpy » ou « courte ». Il est par ailleurs morphologiquement indistinguable des formes « slender » de T. brucei ou de T. equiperdum (Hoare 1972, Luckins 1988).

Figure 1 Trypanosoma evansi sur frottis coloré (Cliché M. Desquesnes)

19

La forme « slender » est élancée : sa longueur variant entre 15 et 34 µm, avec une moyenne de 24 µm, soit plus de trois fois le diamètre d’un globule rouge (Hoare 1972), et sa largeur se situant entre 2 et 3 µm (Desquesnes et al. 2008). Les éléments notables du parasites sont entre autres : un flagelle dont la plus grande partie est recouverte par la membrane ondulante, pouvant former plusieurs vagues le long du parasite, et dont la partie libre se prolonge à l’extrémité antérieure. Son extrémité postérieure est pointue (fig 1). Pourtant lorsque la population est en forte multiplication (lors d’infections expérimentales par exemple), les parasites, et par voie de conséquence leur extrémité postérieure, apparaissent plus larges, du fait du doublement du matériel cytoplasmique en cours.

Des index permettent de caractériser morphologiquement les différentes espèces de trypanosomes. L’index nucléaire (soit la distance entre l’extrémité postérieure et le centre du noyau divisée par la distance entre le centre du noyau et l’extrémité antérieure du parasite) qualifie la position du noyau dans la longueur du trypanosome, alors que l’index kinétoplastique (soit la distance entre l’extrémité postérieure et le kinétoplaste divisée par la distance entre le kinétoplaste et le milieu du noyau) décrit celle du kinétoplaste. Chez les trois espèces du sous-‐genre Trypanozoon, les index nucléaires sont quasiment identiques et égaux à 1 ; ils n’aident pas à la différenciation morphologique de T. brucei, T. evansi ou T. equiperdum.

Le kinétoplaste est petit (0,6µm), en position subterminale et submarginale ou marginale ; il peut être absent, chez un certain pourcentage d’individus d’une même population, ou de façon permanente chez quelques souches (Hoare 1972), notamment chinoises et brésiliennes (Ventura et al. 2000).

Récemment en Espagne, T. evansi a été observé sous des formes non typiques à extrémité postérieure tronquée ou arrondie et à kinétoplaste terminal, à tel point qu’on aurait pu croire à T. vivax. Leur coexistence, au sein d’un même foyer, avec des formes typiques aurait pu laisser penser à une co-‐infection par différentes espèces de trypanosomes (Tamarit et al. 2011). Le diagnostic de Surra a pourtant bien été confirmé par des analyses sérologique (CATT/T. evansi) et moléculaire (PCR-‐pMURTec) (Tamarit et al. 2010a).

2.2. Chez les vecteurs Trypanosoma evansi a perdu sa capacité à effectuer un cycle de développement chez les glossines, il est transmis par des vecteurs mécaniques, chez lesquels le parasite conserve la même forme que lorsqu’il se situe dans le courant sanguin. Il ne se présentera donc pas sous forme procyclique ou métacyclique et, n’étant pas adapté à survivre chez l’insecte, sa persistance y est très brève.

3. Classification Sous-‐règne : Protozoa Phylum : Sarcomastigophora Sous-‐phylum : Mastigophora Classe : Zoomastigophora Ordre : Kinétoplastida Sous-‐ordre : Trypanosomatina Famille : Trypanosomatidae Genre : Trypanosoma Sous-‐genre : Trypanozoon Clade : Brucei Espèce : Evansi

20

Au sein du clade de T. brucei, les espèces possèdent des similarités, que ce soit au niveau de leur morphologie ou de leur génome. Pourtant T. evansi et T. equiperdum peuvent être considérés comme des espèces à part entière du fait de leur transmission et pathologie singulières (Ventura et al. 2002).

4. Biologie

4.1. L’ADN nucléaire Il se constitue de chromosomes qui ne se condensent pas en structures distinguables en microscopie, mais qui ont néanmoins été rassemblés en classes : mini-‐chromosome, chromosome intermédiaire ou méga-‐chromosome, selon que leur taille se situe respectivement dans les fourchettes 50-‐150kb, 200-‐900Kb, ou 1-‐6Mb, et ce pour plus de facilité de nomenclature. La taille et le nombre de ces chromosomes varient entre et à l’intérieur même des espèces (Desquesnes & Dávila 2002).

L’ADN satellite, répétitif, abondant, ubiquitaire et hypervariable, est localisé dans les mini-‐chromosomes. Il peut notamment être utilisé pour le design d’amorces en vue d’un diagnostic moléculaire d’espèce de trypanosome (Desquesnes & Dávila 2002).

4.2. Le kinétoplaste En microscopie électronique, les différents organites du trypanosome sont visibles (fig 2), le kinétoplaste compris. Il représente 20% de l’ADN total et est habituellement composé d’un réseau de cercles d’ADN de différentes tailles : environ 50 copies de maxi-‐cercles (20Kb) et 5.000-‐10.000 copies de mini-‐cercles (1Kb). Les maxi-‐cercles sont l’équivalent de l’ADN mitochondrial, ils codent les ARN ribosomaux et les sous-‐unités protéiques des complexes respiratoires. Ils nécessitent pour leur transcription l’intervention d’une grande variété et quantité d’ARN guides, codés par les mini-‐cercles (Desquesnes & Dávila 2002, Lun & Desser 1995).

Cependant, T. evansi se caractérise par une faible hétérogénéité au sein des mini-‐cercles, et l’absence de maxi-‐cercles. Les mini-‐cercles de T. equiperdum ne montrent pas une grande hétérogénéité non plus, néanmoins ses maxi-‐cercles sont quasiment intacts.

Figure 2 Trypanosoma evansi "slender form" – ultrastructure (http://www.fao.org/DOCREP/006/X0413E/X0413E02.htm)

21

Ainsi l’ADN kinétoplastique est l’unique différence conséquente identifiée jusqu’alors entre les sous-‐espèces de T. brucei. C’est d’ailleurs sur la diversité de taille et de séquence entre les différentes espèces de trypanosomes que se base la création d’amorces spécifiques utilisées dans le diagnostic par PCR. Cependant, il faut bien noter que ces tests ne seront pas applicables aux souches akinétoplastiques (Desquesnes & Dávila 2002, Masiga & Gibson 1990).

Le kinétoplaste est relié à l’unique mitochondrie, responsable de l’approvisionnement en ATP de la cellule parasitaire grâce au gradient transmembranaire de protons. En principe, ce dernier est créé par phosphorylation oxydative de coenzymes, préalablement réduites par le cycle de Krebs, au niveau de la chaîne respiratoire membranaire. Les enzymes mitochondriales en jeu, sont quant à elles, codées par l’ADN nucléaire et doivent donc être transportées depuis le cytosol, à travers la membrane mitochondriale : c’est le retour d’ions dans le cytoplasme dans le sens de leur gradient électrochimique qui génère l’énergie nécessaire au transport de ces molécules contre leur gradient (Lun & Desser 1995, Jensen et al. 2008).

4.3. Nutrition Les trypanosomes se nourrissent par pinocytose, l’invagination de la membrane a principalement lieu au niveau de la poche flagellaire. Les vésicules sont ensuite dirigées vers les lysosomes où se produit la digestion enzymatique des molécules endocytées : essentiellement le glucose (Hoare 1972, Cuny et al. 2010).

Par ailleurs, les parasites étant incapables de synthétiser leurs propres cholestérol et acides gras, ils dépendent pour leur croissance des « low density lipoprotein particles», quant à elles internalisées par l’intermédiaire d’un récepteur. Ces particules seront endocytées dans les lysosomes et les lipides ainsi produits entreront dans la composition des membranes (Coppens et al. 1995).

Si la plupart des trypanosomes ont un cycle biologique dixène, dont les hôtes alternent, le plus souvent, entre un insecte hématophage et un mammifère, ce n’est pas le cas de T. evansi qui n’effectue pas de cycle chez l’insecte, ce dernier est par conséquent qualifié de vecteur mécanique. Les formes sanguines de ce trypanosome ne présentent pas de cycle de Krebs fonctionnel et sont dépourvues des cytochromes de la chaine respiratoire, elles dépendent donc entièrement de la glycolyse pour l’approvisionnement en ATP, contrairement aux formes retrouvées chez les vecteurs biologiques qui utilisent les transporteurs membranaires (Lun & Desser 1995).

De part leur statut de parasites permanents et leur localisation interne, les trypanosomes puisent leurs ressources directement dans le milieu où ils se trouvent, c’est à dire le sang. Ils sont ainsi responsables de la spoliation d’une partie du glucose circulant dans le milieu sanguin, mais aussi de la libération de composés toxiques. Pourtant l’infection qui en résulte passe parfois inaperçue sur le plan clinique, grâce à un équilibre qui s’établit entre la virulence du parasite, et les défenses immunitaires de l’hôte (Hoare 1972).

4.4. Reproduction Jusqu’à récemment, la reproduction sexuée était considérée « tellement improbable, qu’elle méritait à peine discussion » (Robertson, 1926, dans Hoare 1972). Il était alors tout simplement envisagé que la cellule mère se divisait pour donner deux cellules filles identiques, en commençant par le flagelle, puis le kinétoplaste et enfin le noyau. Mais depuis les travaux sur le sujet de Jenni et al. (1986) et de Gibson & Garside (1991), l’existence d’un échange de matériel génétique lors de la division de T. brucei chez le vecteur biologique semble acquise (Cuny et al. 2010). Reste encore à détecter les

22

stades haploïdes du parasite issus de la méiose, et dont la fusion aboutirait à un nouvel organisme, car il n’a jusqu’à présent pas été montré que ce mécanisme ait lieu.

Les arbres phylogénétiques réalisés grâce à un marqueur localisé au sein de l’ARNr 18S, ont mis en évidence le caractère monophylétique des trypanosomes, ce qui suggèrerait que le parasitisme et le cycle de vie dixène ne soient apparus qu’une fois au cours de l’évolution des trypanosomes. Il en va de même pour ce qui est de la reproduction sexuée. Cependant, T. brucei est le seul trypanosome chez lequel elle a été prouvée, ceci serait à l’origine d’un répertoire antigénique plus diversifié dans cette espèce. Mais du fait de la monophylie des trypanosomes, comment expliquer que seule une branche de l’arbre ait retenu ce caractère ? Ou encore que les espèces proches de T. brucei, comme T. evansi et T. brucei gambiense, aient pu si bien se développer en l’absence de multiplication sexuée, et/ou avec un répertoire antigénique restreint ? (Gibson 2001, Stevens et al. 2001)

Cependant, en ce qui concerne T. evansi, la question n’est pas encore résolue ! En effet, sa transmission mécanique le prive de la partie du cycle où a lieu la recombinaison génétique chez les trypanosomes transmis par les glossines, à savoir le stade épimastigote dans les glandes salivaires. Ainsi, T. evansi se multiplierait de façon purement clonale, et les seules sources de variabilité entre les différentes souches seraient : les mutations, la dérive génétique, et les « founder effects » (perte de variation génétique lors de l’établissement d’une nouvelle population à partir d’un petit nombre d’individus) (Tait et al. 2007, Ventura et al. 2002).

Pourtant, le pléotropisme du tableau clinique de la trypanosomose à T. evansi laisse présager d’une grande variation génétique entre les différentes souches de T. evansi de par le monde. Diverses études ont tenté de mettre en évidence cette variabilité : sans grand succès (Luckins 1998, Njiru et al. 2007) ! Cette homogénéité génétique apparente, au sein de l’espèce T. evansi, pouvait alors être attribuée à un manque d’outils suffisamment sensibles, ne détectant donc pas la variabilité, si tant est qu’elle existât (Ventura et al. 2002).

Plus tard, avec le développement de la biologie moléculaire, des micro-‐hétérogénéités dans le profil enzymatique ou dans les séquences des mini-‐cercles d’ADN kinétoplastique au sein de l’espèce T. evansi ont été mises en évidence, notamment par RFLP, comparaison des isoenzymes, RAPD, étude de l’ADN micro-‐satellite… (Ventura et al. 2002, Njiru et al. 2007, Watanapokasin et al. 1998, Njiru & Constantine 2007)

La question qui vient alors légitimement est : ces micro-‐hétérogénéités suffisent-‐elles à expliquer les variations de morphologie, de spectre d’hôtes, de clinique associée… des souches de T. evansi ? La différence de virulence des infections par T. evansi chez différents hôtes pourrait aussi bien être due à l’ « effet-‐hôte », à savoir : la sensibilité de l’espèce, l’état physiologique de l’individu, la dose de parasite inoculée, leur viabilité, le lieu d’inoculation… (Njiru & Constantine 2007).

De plus, la caractérisation moléculaire des souches de T. evansi serait utile dans l’étude de la dynamique des populations, et plus particulièrement pour mieux appréhender son épidémiologie à l’échelle mondiale. On pourrait alors déterminer l’espèce réservoir ayant servi de point de départ à tel ou tel foyer de Surra (en Thaïlande en 1998, par exemple), ou encore retracer le parcours d’une souche lors de son importation dans un pays indemne (Luckins 1998, Watanapokasin et al. 1998).

23

4.5. Les mécanismes de résistance du parasite face au système immunitaire de l’hôte

La variation antigénique est le principal phénomène responsable de la résistance des trypanosomes au système immunitaire de l’hôte mammifère, puisqu’elle n’est pas présente chez les vecteurs.

Le manteau antigénique est composé d’environ 107 molécules d’une même glycoprotéine, d’approximativement 50KDa, ancrées dans la membrane et fortement adhérentes entre elles, empêchant ainsi les anticorps de l’hôte d’atteindre les antigènes internes et constants du parasite. Ces glycoprotéines variables de surface (VSG) varient donc au fur et à mesure que le système immunitaire de l’hôte développe des anticorps contre elles et neutralise les parasites les portant (une grande majorité de la population totale : 99%). Cela se produit en partie grâce au large éventail (1000 séquences) de gènes codant ces VSG (même si T. evansi présente une variation antigénique moindre, comparé aux trypanosomes africains transmis par les glossines (Luckins 1988)), et à une enzyme spécifique du parasite qui peut rapidement cliver le glycolsylphosphatidylinositol (GPI), responsable de l’ancrage des glycoprotéines dans la membrane.

Les parasites survivants, après avoir activé la transcription d’un autre gène de VSG, vont se multiplier, et exposer au système immunitaire de l’hôte une nouvelle glycoprotéine, qui sera à l’origine de la synthèse d’autres anticorps neutralisant une grande partie de la population de trypanosomes et ainsi de suite… Ce changement de gène de VSG actif est couramment appelé le « Switch » (Taylor & Rudenko 2006).

L’expression d’une glycoprotéine donnée peut s’expliquer par deux mécanismes différents, au niveau des gènes codant ces glycoprotéines variables de surface : -‐ La transposition d’une copie basique d’un de ces gènes préalablement dupliqué, vers un site d’expression (VSG-‐ES) à l’extrémité d’un chromosome, on aura alors affaire à une ELC (« expression linked copy ») -‐ L’activation d’un de ces gènes localisés de manière permanente sur les télomères.

Plusieurs activations indépendantes du même gène de VSG, sur différents chromosomes expliqueraient la présence dans le sang de l’hôte, à un moment donné, d’un seul profil antigénique. Ainsi, tous les parasites d’une même population, ie issus d’un unique parasite, expriment à leur surface la même VSG, au même moment. De plus, une même souche d’une espèce de trypanosome donnera le même enchaînement synchronisé des profils antigéniques lors de son développement chez différents individus. Le mécanisme régissant l’ordre dans lequel apparaissent les variants antigéniques au sein d’une même souche, n’a pas encore été élucidé (Van der Ploeg et al. 1984, Pays et al. 2006, Lee & Van der Ploeg 1987).

Par ailleurs, la forme allongée des VSG empêche l’accès des toxines à la membrane du parasite. En ce qui concerne la résistance des parasites aux attaques non spécifiques des macrophages (sécrétion de radicaux nitrogénés et oxygénés, responsables du stress oxydatif), elle passe par l’intermédiaire d’un récepteur qui permet l’internalisation du hème de l’hémoglobine dans le parasite, et sa fixation aux cytochromes, d’où une plus grande résistance au stress oxydant (Pays & Vanhollebeke 2008b).

24

5. Épidémiologie

5.1. Répartition géographique Du fait de son émancipation de la transmission biologique par les glossines, T. evansi n’est pas contraint à un spectre strict de vecteurs, mais peut être transmis par de nombreux insectes hématophages (Lun & Desser 1995). Il est donc devenu le trypanosome pathogène d’origine africaine le plus largement répandu, dans les zones tropicales et sub-‐tropicales (Luckins 1988).

Il sévit de façon enzootique en Afrique, principalement en dehors de la ceinture à glossines : Afrique sahélienne et du nord. L’Amérique du Sud n’est pas épargnée, le parasite y aurait été introduit suite à l’importation de chevaux infectés depuis l’Afrique de l’ouest, lors de la colonisation européenne des Amériques (Hoare 1972).

Sa présence en Asie et au Moyen Orient est probablement plus ancienne : même si le premier cas a été décrit par Evans date de 1880 au Punjab, la maladie devait sévir depuis bien plus longtemps, puisque des écrits indiens, datant du VIII° s. av JC, font état d’une maladie aux caractéristiques cliniques similaires (Vittoz 1955). La propagation du parasite en Asie du Sud-‐Est serait plus récente selon Reid (2002), et daterait du vingtième siècle : il a par exemple été rencontré pour la première fois en Thaïlande en 1916 d’après Tuntasuvan & Luckins (1998) et Indrakamhang (1998) chez des mules importées d’Algérie, mais ce cas n’aurait été reporté qu’en 1949.

Depuis, il s’y est installé de manière enzootique, et de nombreuses études parasitologiques ou sérologiques ont été réalisées pour mettre en évidence l’impact de la maladie dans le pays. Le NIAH (National Institue for Animal Health) rapportait en 1997 des prévalences nationales de 12,5, 20 et 4,6% respectivement chez les bovins, buffles et porcs suite à des tests parasitologiques, alors que Kashemsant et al. (1989) donnaient des prévalences de 20, 13 et 57% chez les buffles, bovins et chevaux, par IFAT (indirect fluorescent antibody test). Les dernières études en date révèlent une séroprévalence de la maladie chez les bovins et les buffles se situant autour de 10% (Desquesnes & Kamyingkird, et al. 2009, Leboucher 2009). T. evansi est le seul trypanosome pathogène présent en Asie, si l’on exclue T. equiperdum, agent de la dourine. Ceci aura des conséquences au niveau de la démarche diagnostique.

Il faut bien remarquer que l’introduction accidentelle du parasite dans une zone auparavant indemne, s’est le plus souvent soldée par la pérennisation de l’infection à T. evansi : aux Canaries en 1997, les mesures de contrôle du foyer (immobilisation et traitement au Cymelarsan ®) n’ont pas été suffisantes (Gutierrez et al. 2000).

En revanche, plus récemment en 2006 et 2008, les foyers apparus à la suite de l’importation de dromadaires des Canaries respectivement en France (foyer de l’Aveyron) et en Espagne continentale (province d’Alicante) semblent avoir été maîtrisés.

5.2. Hôtes et réservoirs Trypanosoma evansi a un très large spectre d’hôtes, parmi lesquels, des espèces sauvages et domestiques, mais l’hôte principal n’est pas le même selon la localisation (Tamarit et al. 2010b). Ainsi, le parasite est principalement retrouvé chez les Camélidés et les petits ruminants en Afrique et au Moyen Orient, chez les Équidés, les chameaux de Bactriane, les bovins, les buffles et les porcs en Asie, et chez les chevaux et les chiens en Amérique du Sud (Luckins 1998, Njiru et al. 2007).

25

Tous ces hôtes ne présentent pas la même sensibilité à l’infection, les manifestations cliniques seront donc différentes. La maladie se développera par exemple sous une forme aiguë et le plus souvent fatale chez les chevaux et les dromadaires, bien que l’évolution puisse être chronique chez ces derniers. Chez les bovins, les bubalins, l’infection est rare et principalement subclinique en Amérique Latine, alors qu’elle est fréquente et régulièrement accompagnée d’une expression clinique en Asie. Chez les petits ruminants la réceptivité et la sensibilité sont modérées, et si certains auteurs les soupçonnent d’avoir un rôle de réservoir, d’autres les considèrent comme des culs-‐de-‐sac épidémiologiques à cause de la trop faible parasitémie développée.

En ce qui concerne la faune sauvage, les capybaras, les coatis, les chiroptères, les marsupiaux, les cerfs, les mouflons, les antilopes, les loups, les renards, les tigres, les jaguars et plusieurs autres espèces de rongeurs peuvent être atteints de Surra et éventuellement jouer le rôle de réservoir, lorsqu’ils développent la maladie sous une forme chronique, comme les coatis et les capybaras par exemple.

Le statut épidémiologique de ces espèces n’est pas forcément défini précisément, en particulier pour les rongeurs, une étude n’est pas parvenue à mettre en évidence le rôle des rongeurs dans la maintenance de T. evansi aux Canaries, d’autant plus que les rongeurs sont des animaux nocturnes et que les vecteurs connus de T. evansi ont une activité diurne. Par ailleurs les chauves-‐souris vampires en Amérique du Sud, jouent le rôle de vecteur, d’hôte et de réservoir. En effet, elles s’infectent lors de repas sanguins sur bovins ou équins infectés, développent la maladie, et peuvent alors la transmettre à l’intérieur de la population de chauve souris, mais également à d’autres hôtes (Desquesnes et al. 2008, Bauer et al. 2010, Rodríguez et al. 2010, Antoine-‐Moussiaux & Desmecht 2008).

Même si ce parasite n’est pas considéré comme un agent de zoonose, un cas a été rapporté en Inde en 2006, chez un éleveur de bétail (Joshi et al. 2005, Powar et al. 2006). En effet, les humains sont naturellement résistants à T. evansi, tout comme quelques primates non humains. Chez T. brucei brucei, ce phénomène de résistance résulte de l’activité trypanolytique de l’apoliprotéine L1 (APOL1) contenue dans une particule HDL « high density lipoprotein ». Cette particule complexe pénètre dans le parasite par endocytose, par l’intermédiaire de l’HPR « haptoglobin related protein », également contenue dans la particule HDL, qui possède un récepteur spécifique sur le parasite, suite à quoi, l’APOL1 se fixe sur la membrane lysosomiale où elle forme des pores sélectifs pour les anions, créant un flux entrant d’ions Cl-‐ depuis le cytoplasme. Une entrée massive d’eau dans le lysosome pour rétablir l’équilibre des pressions osmotiques, de part et d’autre de sa membrane, est à l’origine de son gonflement incontrôlé, ce qui provoque la lyse de la membrane plasmique et donc la mort de la cellule parasitaire par éclatement (Pays & Vanhollebeke 2008a).

Pourtant les humains sont sensibles à T. brucei rhodesiense et T. brucei gambiense, parasites africains responsables de la maladie du sommeil, qui ont acquis une résistance au sérum humain. Le mécanisme de résistance constitutive de T. brucei gambiense au sérum humain n’a pas encore été élucidé, mais en ce qui concerne T. brucei rhodesiense, la protéine « serum resistance associated » (SRA) conférerait une résistance conditionnelle au parasite. En effet, le gène codant la protéine SRA est localisé dans un site d’expression des gènes codant un certain profil de VSG systématiquement exprimé lors d’infections humaines à T. brucei rhodesiense. Ainsi l’activation de ce site d’expression de VSG entraînerait la transcription du gène SRA, ce qui ne se produira pas lors d’infection d’animaux autres que des primates. La protéine SRA est une VSG

26

tronquée, elle est donc dirigée vers le lysosome, où elle a été repérée interagissant spécifiquement avec l’apolipoprotéine L1. Elle a donc été identifiée comme la protéine conférant à T. brucei rhodesiense la résistance au sérum humain (Pays et al. 2006).

Dans le cas du patient indien, sa sensibilité inattendue à T. evansi a été attribuée à un déficit en APOL1, dû à la présence de deux mutations dans le gène codant, et non à l’apparition d’une nouvelle résistance au sérum humain chez une souche de T. evansi, qui aurait des conséquences dévastatrices du fait de la large répartition du parasite (Vanhollebeke et al. 2006).

5.3. Vecteurs Les vecteurs mécaniques de premier rang pour la transmission de la trypanosomose à T. evansi sont les Tabanidés : en particulier les genres Tabanus (fig 3) Hæmatopota et Chrysops. En effet, de nombreuses caractéristiques biologiques les prédisposent à la transmission d’agents pathogènes : l’hétérogénie des femelles de la plupart des espèces, qui les contraint à faire un repas sanguin nécessaire à la maturation des œufs et ce à chaque ponte, la telmophagie qui est à l’origine du drainage des agents présents dans les tissus superficiels ou le sang périphérique, la grande quantité de sang ingurgité (jusqu’à 0,5mL) et la durée de gorgement (5 minutes en moyenne, mais 5 secondes suffisent au tabanide pour acquérir le parasite, et pour infecter un hôte sain) qui augmentent la probabilité d’ingestion de l’agent pathogène par le diptère ; enfin, le comportement particulier des Tabanidés qui consiste à terminer un repas sanguin interrompu sur le même hôte ou, le plus souvent, sur un hôte à proximité immédiate (Luckins 1988, Krinsky 1976, Foil & Hogsette 1994).

Quant aux stomoxes, « stable flies » en anglais, ils sont cités dans un second temps et seraient plus incriminés dans la transmission mécanique de T. evansi dans les étables et les écuries où ils sont présents en grand nombre que dans les pâturages (Luckins 1998).

Certains travaux rapportent la possibilité de contamination d’un hôte sain jusqu’à 3 jours après la piqûre sur un hôte infecté pour les stomoxes (Stomoxys calcitrans pour la présente expérience), contre 22 heures seulement pour les Tabanidés (Bouet & Roubaud 1912, Sergent & Sergent 1905). De plus, deux espèces de stomoxes : S. niger et S. calcitrans auraient joué un rôle majeur dans les foyers de Surra à Maurice ou en France (Moutia 1928, Desquesnes et al. 2008). Pourtant, des échecs de transmission expérimentale du Surra par l’intermédiaire de Stomoxys calcitrans ont été relatés par

Figure 3 Tabanus Striatus piégé à Surat Thani (original)

27

Ngeranwa & Kilalo (1994). Ainsi la capacité de transmission mécanique des mouches piqueuses diffèrerait selon la localisation géographique et les conditions environnementales ou expérimentales. La potentielle transmission retardée du Surra par les stomoxes serait due à la survie des parasites dans leur jabot, dont ils régurgiteraient une partie lors de la piqûre, mais rien n’a encore été démontré.

En Thaïlande, les espèces de stomoxes les plus représentées sont S. calcitrans (90%) et S. indicus, les autres espèces plus rares sont S. bengalensis, S. Uruma, , et S. sitiens. L’implication de toutes ces espèces dans la transmission de T. evansi n’a pas été prouvée : S. calcitrans est l’espèce qui a été la plus incriminée, pourtant elle est peu fréquente dans le sud de la Thaïlande, où sévissent actuellement des foyers de Surra, chez les chevaux et les éléphants (Muenworn et al. 2010).

Les tiques pourraient être responsables de la transmission de T. evansi, lors de la consommation par un animal sain, de tiques gorgées sur animal infecté, puisque le parasite survit jusqu’à 3 heures post-‐gorgement, dans le système digestif de la tique. Cependant, les essais expérimentaux dans ce domaine n’ont pas abouti, et la consommation de tiques infectées, par un bovin ou par des rats, n’a conduit à une parasitémie décelable chez aucune de ces deux espèces. Cela aurait pourtant pu permettre d’expliquer le mode de contamination par T. evansi des rats, animaux nocturnes et donc à l’abri des insectes hématophages (Vergne 2009).

5.4. Transmission Même si au XIXème siècle, Evans a attribué par erreur la transmission de la maladie à de l’eau polluée consommée par les chevaux, les propriétaires, eux, avaient déjà attribué ce rôle aux Tabanidés ou « horse flies ». La première preuve scientifique de la transmission par ces diptères a été apportée ensuite par Rogers en 1901 (Evans 1910).

Plus précisément, Trypanosoma evansi appartient à la section des Salivaria. En effet, sa transmission se fait par inoculation, par opposition à la section des Stercoraria, dont les parasites se développent dans l’intestin moyen et terminal des insectes et se transmettent par contamination d’une plaie par les matières fécales du vecteur. Mais le parasite ne se situe pas pour autant dans le milieu salivaire chez le vecteur, il demeure entre deux piqûres, sur les pièces buccales du vecteur.

Lors du repas sanguin d’un insecte hématophage, la douleur provoquée par la piqûre entraîne une réaction de défense de la part de l’animal. Son repas ainsi interrompu, l’insecte tentera de le compléter sur un autre mammifère. Si le premier animal était infecté et que le délai entre les deux piqûres est limité, la survie des trypanosomes dans les pièces buccales de l’insecte est possible, et le second animal devient infecté.

Les carnivores, notamment les chiens errants aux alentours des abattoirs, ou les carnivores sauvages captifs, s’infectent également par consommation de viande fraiche, de carcasses ou de vecteurs et donc de sang infecté (Raina et al. 1985, Eloy & Lucheis 2009, Parija & Bhattacharya 2001). La pénétration des parasites dans la circulation sanguine pourrait avoir lieu à travers les muqueuses buccales et/ou intestinales saines en ce qui concerne les rats et les souris, contrairement aux bovins, chez qui elle ne peut se produire qu’en présence de plaies sur la muqueuse (Vergne 2009, Silva et al. 2007). Les carnivores ainsi infectés, peuvent ensuite entrer dans le cycle épidémiologique du parasite, s’ils sont piqués par un vecteur potentiel, même si certains auteurs considèrent leur fourrure comme une protection suffisante contre les piqûres d’insectes (Raina et al. 1985).

28

La transmission iatrogène est également possible comme le prouve la contamination de deux dromadaires au Kenya, à partir d’aiguilles ayant préalablement piqué des chèvres expérimentalement infectées, et pourtant en phase chronique de la maladie. Il ne faut donc pas négliger cette voie de transmission, notamment lors de campagnes de vaccination, ou au cours des opérations de tatouage ou d’entaille des oreilles à la chaîne et mélangeant plusieurs espèces sensibles et réservoirs (Ngeranwa & Kilalo 1994).

Des femelles buffles d’eau infectées aux Philippines auraient récemment transmis la maladie à leur bufflons, soulevant de nouveau le problème de la transmission congénitale, peu fréquemment rencontrée (Loehr et al. 1986).

5.5. Facteurs influençant l’épidémiologie de la maladie

5.5.1. Sensibilité des hôtes Selon l’espèce, l’âge, le statut physiologique, et ses antécédents de Surra, l’animal sera plus ou moins sensible à l’infection. En l’occurrence, aux Philippines, c’est lorsque les buffles travaillent intensivement au labour des rizières que les pics d’incidence de la maladie apparaissent (Reid 2002).

5.5.2. Capacité de transmission des vecteurs Elle sera d’autant plus grande que la prévalence de l’agent pathogène dans la population hôte est élevée, que l’infection est présente à un stade aigu, et donc que les parasitémies développées sont importantes. Pourtant les animaux apparemment sains suite à un traitement cliniquement efficace ou suite au passage à une phase chronique asymptomatique de l’infection, peuvent héberger le parasite et constituer une source d’infection pour les espèces sensibles, malgré leur faible parasitémie (Luckins 1998).

Elle dépend également de la proximité des animaux sensibles entre eux, du nombre de prises alimentaires et de leur espacement dans le temps, de la quantité de sang présente sur les pièces buccales du vecteur (10 nl pour Tabanus fuscicostatus), et de la survie de l’agent chez le vecteur. Un insecte interrompu pendant un repas infectant pourrait contaminer jusqu’à deux animaux lors de ses tentatives pour compléter sa prise alimentaire (Foil et al. 1987).

Les effectifs des populations de vecteurs conditionnent également la réussite de la transmission, c’est de cette façon que l’on peut expliquer l’influence de la saison sur la prévalence de la maladie. En Thaïlande par exemple, les cas cliniques sont plus abondants à la fin de la saison des pluies et au début de l’hiver (août – février), du fait d’un climat particulièrement adapté à la multiplication des Tabanidés et des stomoxes (Tuntasuvan & Luckins 1998). Le nord-‐est apparaît plus particulièrement à risque pour le Surra, puisque le climat qui y règne est plus humide, mais également parce que le maintien de troupeaux de chevaux, bovins et buffles sur les mêmes pâturages est une pratique d’élevage courante.

6. Évolution T. evansi, tout comme T. equiperdum, dériverait de T. brucei.

Suite à une mutation spontanée, affectant les maxi-‐cercles de l’ADN kinétoplastique, les complexes respiratoires de T. evansi sont endommagés. Le parasite aurait perdu sa capacité à générer un potentiel de membrane au niveau de la mitochondrie par l’intermédiaire des pompes à protons. Il reposerait alors uniquement sur la transformation d’ATP, fourni par la glycolyse, en ADP grâce à l’activité inverse de l’ATP-‐synthase, pour créer ce gradient de protons et donc ce potentiel de membrane. La

29

synthèse de la sous-‐unité F0 ou « pompe à protons » de l’enzyme est sous la dépendance du gène A6 issu d’un maxi-‐cercle, qui n’aurait donc pas été touché par la mutation (Jensen et al. 2008).

De ce fait le métabolisme du parasite devient plus dépendant de l’approvisionnement en glucose pour fournir de l’ATP, or le glucose ne se retrouve pas en grande quantité dans le système digestif des insectes. Le parasite ne peut désormais plus se développer et encore moins subir une multiplication sexuée chez ses ex-‐vecteurs biologiques que sont les glossines. Des preuves du rôle du kinétoplaste dans le développement des formes procycliques chez les vecteurs sont apportées par : -‐ la survie des seules formes kinétoplastiques lors de l’infestation mixte de glossines avec une souche mutante à 70% akinétoplastique de T. br. Gambiense -‐ l’absence de transformation morphologique en forme procyclique de souches dyskinétoplastiques de T. brucei induite expérimentalement par traitement à l’acriflavine. La recombinaison génétique n’a plus lieu chez le vecteur, ce qui expliquerait la faible variation génétique entre les différents isolats de T. evansi du monde entier, récemment décrite (Lun & Desser 1995).

Le déplacement d’animaux parasités -‐ des chameaux principalement -‐ en dehors de la zone à glossines, avant ou après l’apparition de cette mutation, a été largement aidé par le fort taux de porteurs sains dans cette espèce. Il résulte de cette migration que seules les souches de T. brucei suffisamment productives survivent. En effet, la parasitémie induite doit être telle que la faible quantité de sang (10 nl) présente sur les pièces buccales d’insectes hématophages suffise, sans multiplication du parasite, à infecter un autre animal sensible.

Dès lors, le large répertoire de mini-‐cercles n’a plus lieu d’être conservé puisqu’il n’est plus utile qu’à la transcription du gène A6 des maxi-‐cercles, d’où l’homogénéité de mini-‐cercles à laquelle on a abouti actuellement.

Une autre mutation spontanée, dans la séquence codant la sous unité γ de l’ATP-‐synthase, serait à l’origine d’une augmentation d’activité de l’enzyme : ainsi le parasite pouvait se détacher de toute dépendance à l’ADN kinétoplastique. La perte des maxi-‐cercles provoque la suppression de la sous unité F0 de l’ATP-‐synthase, et la libération de la sous-‐unité F1 dans la matrice mitochondriale.

Le fonctionnement dans le lumen de cette sous-‐unité F1 de l’ATP-‐synthase permet donc le maintien du potentiel de membrane par l’hydrolyse d’ATP en ADP et les échanges membranaires de ces deux métabolites (Jensen et al. 2008).

À partir de là, T. evansi peut étendre sa zone de répartition bien en dehors de la ceinture à glossines.

La question qui se pose concerne le nombre d’occurrences de cette émergence de T. evansi à partir de T. brucei. Le phénomène pourrait se produire encore actuellement et même régulièrement, toujours lors de déplacement d’animaux parasités en dehors de la zone à glossines : il s’agit de la théorie des « petits mutants ». Les différentes souches ainsi produites ne survivent pas toutes, elles sont en effet désavantagées du fait de la perte de la transmission biologique et donc de la recombinaison génétique chez le vecteur. Elles ne constituent pas un groupe monophylétique, mais plutôt des souches indépendantes, c’est pourquoi certains auteurs considèrent T. evansi comme une sous espèce de T. Brucei (Lai et al. 2008).

30

Toutefois, une telle théorie d’émergence continue de souches dyskinétoplastiques, irait à l’encontre de l’avis de plusieurs chercheurs, et plus particulièrement des travaux de Ventura (2002), qui décrit un fragment d’ADN présent en plusieurs copies sur les mini-‐chromosomes ou les intermédiaires, et commun à un grand nombre de souches de T. evansi de par le monde (Ventura et al. 2002).

7. La maladie Connue sous le nom de « Mal de Caderas » en Amérique du Sud, la trypanosomose à T. evansi est désignée en Asie par le terme « Surra », qui viendrait de l’hindi et signifierait « pourri », en relation avec l’évolution chronique de la maladie.

7.1. Pathogénie Les anomalies hématologiques (anémie, malformations des globules rouges, leucopénie puis leucocytose,) sont retrouvées de manière systématique dans les infections cliniques à T. evansi. L’hémolyse intra-‐ et extravasculaire présente lors de l’infection est principalement due à la production d’hémolysines mais également à la réponse immunitaire de l’hôte. Mais l’adhésion des parasites sur les érythrocytes matures ainsi que sur les réticulocytes, est également impliquée puisqu’elle sensibilise ces globules rouges les destinant à l’érythrophagocytose par l’hôte lui même. D’autre part, l’adhésion des parasites à l’endothélium vasculaire est responsable d’une vascularite. Le degré d’anémie ne serait proportionnel à la parasitémie qu’en début d’évolution de la maladie, car en fin d’évolution, un épuisement de la moelle osseuse hématopoïétique se produit. Parallèlement, la leucopénie initiale, serait remplacée en fin d’évolution, par une leucocytose réactionnelle.

Par ailleurs, un grand nombre d’anomalies de structure des globules rouges peuvent être identifiées lors de l’examen de frottis sanguins colorés : microsphérocytes, acanthocytes, dacryocytes, présence de vacuoles, poïkilocytose, anisocytose, polychromasie (Silva et al. 1995).

7.2. Expression clinique Après une incubation d’une à quelques semaines, elle peut évoluer sous forme aiguë ou chronique selon l’espèce hôte et selon la souche.

Certains signes cliniques retrouvés chez les animaux parasités sont caractéristiques et permettent un diagnostic de présomption. Néanmoins, du fait de l’évolution chronique possible de la maladie, ils n’apparaissent pas toujours, et souvent le diagnostic de certitude exige le recours à des tests de laboratoire.

Chez les dromadaires, l’évolution est le plus souvent chronique, après une courte période d’incubation, l’animal présente des fièvres intermittentes, de l’anémie, et une perte de condition. Plus spécifiquement lors des épisodes fiévreux, qui correspondent à des parasitémies élevées, une baisse d’appétit, un épiphora bilatéral et un état léthargique viennent s’ajouter au tableau clinique. La mortalité survient généralement après 2 ou 3 années de portage chronique.

Les chamelons et les chamelles gestantes sont prédisposés à une évolution plus rapide de la maladie, au cours de laquelle les principaux signes cliniques présents sont des œdèmes des parties déclives, des pétéchies conjonctivales, de l’épiphora, des avortements, et parfois des manifestations nerveuses, aboutissant rapidement à la mort dans un état de maigreur extrême dans 50% des cas (Bauer et al. 2010, Desquesnes et al. 2008).

31

La maladie se développe sur un mode aigu et fatal chez les chevaux. Les épisodes fiévreux récurrents sont caractérisés par de l’hyperthermie, de la fatigue, une perte de condition malgré un appétit conservé, un épiphora bilatéral et une conjonctivite, de l’anémie, des œdèmes en parties déclives (membres, abdomen, fourreau), une hypertrophie des nœuds lymphatiques, notamment pré-‐scapulaires, et un pelage terne (Luckins 1988).

Chez les chevaux, des signes nerveux peuvent parfois apparaître, témoignant bien de l’affinité de T. evansi pour le système nerveux, avec notamment : de l’hyperesthésie, et l’apparition graduelle d’une parésie, ataxie ou paralysie du train postérieur puis des quatre membres, d’où une démarche hésitante. De la marche en cercle et une inclinaison latérale de la tête ont également été rapportées chez ces animaux (Luckins 1988, Berlin et al. 2009, Silva et al. 1995).

Les bovins et les bubalins sont en général nettement moins sensibles, la forme chronique de la maladie peut se retrouver chez les zébus et les buffles d’eau, ce qui provoque une considérable diminution de la force de traction de ces animaux de travail. Dans les zones d’introduction récente du Surra en Asie, les buffles d’eau peuvent développer la maladie de façon aiguë, avec une mortalité élevée dans le mois qui suit l’infection (Bauer et al. 2010, Lun et al. 1991, Dargantes et al. 2009). Il faut garder à l’esprit que même les animaux infectés sub-‐cliniquement peuvent, à la faveur d’un stress environnemental ou d’une maladie intercurrente, développer une forme clinique.

Les descriptions du tableau clinique de la maladie sont moins nombreuses chez les éléphants, néanmoins de la somnolence, de la réticence et de la fatigabilité au travail, ainsi que de l’anémie, ont été rapportées lors d’un récent cas de Surra chez un éléphant de travail en Thaïlande. En milieu enzootique, la maladie passerait le plus souvent inaperçue, entraînant uniquement faiblesse et anémie lors d’évolution chronique (la plus fréquente). Les cas aigus sont encore moins nombreux et se distinguent par une hyperthermie fluctuante, de l’abattement, un écoulement oculaire, des œdèmes déclives, de l’hémoglobinurie, de l’anémie et de la pâleur des muqueuses. Par ailleurs le grand gabarit des animaux ne permet pas de remarquer la perte d’état général sans baisse d’appétit (Hin On et al. 2003, Evans 1910, Gerbet 1994).

Les porcs et les chiens font également partie des hôtes possibles pour T. evansi, et tandis que l’infection est rarement symptomatique et la parasitémie basse chez les premiers, les derniers développent une forme aiguë avec des signes similaires aux autres espèces (fièvre, anorexie, œdèmes, démarche ébrieuse… aboutissant rapidement à la mort de l’animal) mais également des signes oculaires (opacification de la cornée).

Le parasite est également à l’origine d’une immunodépression générale chez son hôte : les réponses immunitaires humorale et cellulaire, toutes deux nécessaires au développement d’une protection vaccinale efficace, seraient diminuées. Un certain nombre d’échecs de campagnes vaccinales dans les régions où T. evansi est enzootique (par exemple contre la septicémie hémorragique chez les bovins ou la peste porcine classique chez les porcs) seraient donc à relier à l’infection par T. evansi (Holland et al. 2003, Singla et al. 2010, Holland et al. 2001). Cependant, l’administration d’un traitement trypanocide permettrait aux animaux, auparavant infectés, de recouvrir une réponse immunitaire similaire à celle développée par des animaux sains. Cet effet pathogène est responsable d’une part conséquente de l’impact économique de la maladie, il serait donc bénéfique de mener à bien des campagnes de traitement contre T. evansi, avant d’envisager de vacciner dans les régions d’endémicité du parasite !

32

8. Diagnostic cf. III. 1. 3.

9. Traitement La chimiothérapie visant spécifiquement le parasite permet de limiter les manifestations cliniques de la maladie et donc de réduire les pertes engendrées, mais, la protection conférée par le traitement est de courte durée (Bouyer et al. 2010).

La plupart des trypanocides utilisés pour le traitement des trypanosomoses africaines sont mal adaptés et faiblement efficaces contre T. evansi car ils ne passent pas la barrière hémato-‐méningée. La capacité des espèces du genre Trypanozoon à franchir cet obstacle, permettrait aux parasites d’échapper au traitement et de se retrouver dans le courant sanguin plus tard, à la faveur d’un stress quelconque (Schillinger & Rottcher 1986).

Le seul trypanocide disponible en Thaïlande est le Bérénil ®.

9.1. Suramine (Naganol ®) Utilisée depuis plus de 70 ans pour le traitement du Surra, quelle que soit l’espèce atteinte, son mode d’administration par voie intraveineuse peut s’avérer problématique sur le terrain (Luckins 1988). L’apparition de résistances a limité son emploi.

9.2. Méthylsulfate (Antrycide ®) Sulfate (Quintrycide ®) ou mélange chlorure/sulfate (Trypacide ®) de Quinapyramine

Le méthylsulfate de quinapyramine est un des trypanocides les plus anciennement utilisés, il a été retiré du marché. Il entraînait l’apparition d’un nodule sous cutané au point d’injection. Ce principe actif est par ailleurs déconseillé d’utilisation chez les chevaux, car à l’origine d’effets secondaires systémiques.

Fabriqués à partir du même principe actif que l’Antrycide®, le Quintrycide ® et le Trypacide ® ont donc hérité des résistances que ce premier trypanocide avait provoquées lors de son utilisation. Le Quintrycide ® aurait des vertus curatives, alors que le Trypacide ® serait plutôt utilisé à des fins prophylactiques.

9.3. Chlorure d’isométamidium (Samorin ®, Trypamidium ®) Son efficacité limitée sur T. evansi, l’existence de souches résistantes et sa toxicité font qu’il n’est utilisé qu’en cas de résistance à la quinapyramine. Il est notamment responsable, lors de prescription de doses supérieures à 1 mg/kg, de manifestations locales et durables au point d’injection et générales : tremblements, salivation, epiphora, augmentation de l’activité digestive, diarrhées. Il est mieux toléré par voie intramusculaire (0,5 -‐ 1 mg/kg) que par voie intraveineuse (<0,5 mg/kg), et la voie sous-‐cutanée serait préférentiellement utilisée en préventif (Schillinger & Rottcher 1986, Bouyer et al. 2010).

9.4. Acéturate de diminazène (Bérénil ®, Veriben ®) Son effet trypanocide est insuffisant contre T. evansi, il est pourtant utilisé en intramusculaire profonde à des doses variant entre 7 et 10 mg/kg chez les bovins, les chevaux et les truies. Il reste contre indiqué chez les chiens et les dromadaires du fait des effets secondaires qu’il provoque. Il est, chez le dromadaire africain, à l’origine de symptômes similaires à ceux provoqués par l’isométamidium, pouvant même aller jusqu’à la mort de l’animal, alors qu’il pourrait être utilisé à 3,5 mg/kg chez le chameau de Bactriane, moins sensible aux effets secondaires (Schillinger & Rottcher 1986, Tuntasuvan et al. 2003).

33

9.5. Mélarsonine (Cymelarsan ®) Il s’agit d’un composé arsenical qui a été développé plus tardivement et spécifiquement pour le traitement de la trypanosomose à T. evansi chez les dromadaires (puisqu’inactif sur T. congolense et T. vivax, agents majeurs des trypanosomoses animales en Afrique). Il est capable de passer la barrière hémato-‐méningée, contrairement aux autres trypanocides, et donc curatif même après l’apparition de symptômes nerveux. Il est injecté par voie intramusculaire à des doses comprises entre 0,2 et 0,5 mg/kg, en une seule injection chez les dromadaires. Il reste efficace là où la quinapyramine, la suramine et le diminazène se sont heurtés à des résistances. Malheureusement, ce médicament ne bénéficie pas d’une action prolongée (Bouyer et al. 2010, Lun et al. 1991). Concernant les effets secondaires du traitement, seule une réaction inflammatoire au point d’injection serait à déplorer (Payne et al. 1994, Lun et al. 1991).

10. Médecine alternative Des études seraient en cours pour élargir l’éventail thérapeutique contre T. evansi : l’écorce de la racine de la vigne rampante (Vitis repens) aurait des propriétés trypanocides particulièrement intéressantes (Bawm et al. 2010).

Le traitement des animaux en phase clinique au cas par cas, bien que nécessaire à la guérison et utile d’un point de vue économique, ne diminuera pas la prévalence de la maladie, car n’agira pas sur les infections sub-‐cliniques, qui représentent une grande source de parasites (Luckins 1998).

11. Résistances L’utilisation massive des différents trypanocides et leur éventuel sous dosage, ont conduit à l’apparition de souches résistantes. Même le Cymelarsan ®, de développement relativement récent, ne fait pas exception, puisque son mécanisme d’entrée dans le parasite est similaire à celui de l’acéturate de diminazène, par l’intermédiaire des transporteurs à adénosine P2. Ces deux molécules ont une forte affinité pour les transporteurs P2 et inhibe ainsi l’entrée d’adénosine depuis l’hôte dans le parasite, qui l’utiliserait alors pour la synthèse d’ADN, puisqu’il n’est pas capable de synthétiser des purines. Des résistances croisées de souches de T. evansi sélectionnées au laboratoire envers le Cymelarsan ® et le Bérénil ® existeraient, par absence, mutation ou plus faible activité de P2 ; d’autres transporteurs de nucléosides prendraient alors le relais pour l’apport en nucléosides. Par ailleurs, le gène codant le transporteur P2 pourrait éventuellement être utilisé comme marqueur de résistance chez les différentes souches de T. evansi (Delespaux & de Koning 2007, Suswam et al. 2001, Witola et al. 2004). Dans tous les cas, il semblerait utile de tester la sensibilité au Cymelarsan ®, des souches de terrain détectées résistantes au Bérénil ®.

En Thaïlande, les cas de récidive post traitement sont assez fréquents, comme par exemple chez des mules traitées au Bérénil ® 3,5 mg/kg (Tuntasuvan et al. 2003), mais il y a toujours possibilité de réinfection à partir d’un réservoir à proximité, il est donc difficile de conclure. Le même scénario a été relaté par Monzon et al. (2003), après un traitement au sulfate de quinapyramine (3-‐4mg/kg), mais l’auteur conclut ici à une résistance du parasite, puisqu’aucun cheval n’a été introduit sur l’exploitation depuis le traitement, le risque de réinfection est donc limité.

De plus, des tests de sensibilité de différentes souches de T. evansi à différents traitements ont été réalisés, mettant en évidence que certaines souches isolées sur le terrain étaient aussi résistantes que celles sélectionnées en conditions expérimentales pour leur résistance (Zhang et al. 1991).

34

12. Prophylaxie Aucun pays ne l’applique rigoureusement dans le cadre d’un plan de contrôle, cependant depuis que les éleveurs sont convaincus de l’intervention d’insectes hématophages dans la transmission du Surra, ils ont développé des mesures de protection de leur bétail, dont certaines sont aujourd’hui encore utilisées. Le brulage de végétaux ou de fumier dont les fumées éloignent les insectes (« smudge fire » en anglais), le confinement des animaux à l’étable, l’emploi de moustiquaires, la réduction des gîtes de pontes, le piégeage, la prédation par d’autres insectes restent anecdotiques comparés à l’application d’insecticides sur les animaux (Luckins 1988, Bouyer et al. 2010).

De plus puisqu’il suffit d’un parasite pour transmettre l’infection d’un animal contaminé à un animal sain, ces mesures de contrôle vis-‐à-‐vis des insectes hématophages ne pourront pas empêcher la transmission du parasite, mais ils soulageront tout de même les animaux des effets directs de ces parasites externes.

Le Trypacide ® cité dans les traitements du Surra, protègerait les animaux jusqu’à 2-‐3mois, grâce au relargage lent de ces sels injectés en sous-‐cutané. Lorsque utilisé en implant sous cutané, le trypamidium procurerait une protection contre l’infection par T. evansi jusqu’à 20 mois.

La vaccination contre le Surra en est toujours aux essais sur souris. Des protéines du cytosquelettes : la β-‐tubuline recombinante de T. evansi par exemple, sont les actuels candidats pour la vaccination. L’injection de cette protéine adjuvée chez des souris ultérieurement infectées, entraine la production d’anticorps protecteurs contre T. evansi, T. brucei et T. equiperdum. Du fait de la variation antigénique, les protéines de surface ne sont pas adaptées à la conception d’un vaccin. C’est pourquoi la recherche s’est tournée vers des protéines internes comme celles du cytosquelette, mais une question demeure : comment les cellules immunitaires parviennent-‐elles à atteindre ces antigènes (S. Q. Li et al. 2009) ?

En ce qui concerne la protection des pays indemnes vis à vis de l’introduction du parasite sur leur territoire, ils ne devraient importer que de pays indemnes ou exiger trois contrôles sérologiques négatifs en 3 mois lorsque l’animal provient d’une région où le Surra sévit, et mettre en place une quarantaine à l’arrivée en cas de contamination pendant le transport.

35

II. Les hôtes étudiés

1. L’Éléphant [En partie rédigée grâce au questionnement de vétérinaires des hôpitaux pour éléphants de Lampang et Surin, de vétérinaires employés dans les camps, de vétérinaires des bureaux locaux du DLD, de propriétaires de camps, de cornacs]

De son nom scientifique Elephas maximus, l’éléphant d’Asie est l’un des deux derniers représentants de la famille des Elephantidae.

L’éléphant d’Asie se distingue anatomiquement de l’éléphant d’Afrique (fig 4), notamment par une hauteur (2 à 3,5 mètres à l’épaule) et par conséquent un poids moins importants, un nombre d’ongles supérieur (5 sur les antérieurs, 4 ou 5 sur les postérieurs contre 4 ou 5 sur les antérieurs 3 à 5 sur les postérieurs pour l’éléphant d’Afrique), de plus petites oreilles ne dépassant pas le sommet du cou, un dos plus convexe, la présence d’un creux sur le sommet du crâne qui est le point le plus haut du corps, la présence d’un seul doigt à l’extrémité supérieure de la trompe, et enfin la présence de défenses quasi uniquement chez le mâle (Suttipat et al. 2009).

Figure 4 Comparaison éléphant d'Afrique (a) vs. éléphant d'Asie (b); d’après Suttipat et al. 2009

Trois sous-‐espèces existent actuellement, Elephas maximus indicus est celle présente en Thaïlande.

Actuellement, sur les 4016 éléphants recensés en Thaïlande, 2779 sont des femelles, 1237 sont des mâles, dont 1080 ont des défenses (cf. Annexe 1). En plus de cette population, d‘éléphants sur lesquels des puces électroniques ont été implantées, il y en a quelques centaines qui ne le sont pas : majoritairement des jeunes. Malgré une légère et récente augmentation du nombre de naissances d’éléphanteaux dans les camps d’éléphants, la population d’éléphants sur le sol thaïlandais reste en majorité composée de vieux animaux.

1.1. Place de l’éléphant dans la société thaïlandaise Les éléphants tiennent une place prépondérante dans la culture thaï, ils sont présents partout : dans les temples, sur les monuments officiels, dans la publicité… Cela est en partie dû à la religion bouddhiste, principale religion en Thaïlande, selon laquelle Bouddha aurait été conçu par l’union de la reine Mahamaya et d’un éléphant blanc dont elle aurait rêvé, et ce bien qu’elle eût fait vœu de chasteté. D’un autre côté, le spiritisme est également très présent dans le pays, et les esprits adorés sont parfois empruntés à d’autres religions. C’est le cas de Ganesh, issu de la religion Hindou, Dieu de la connaissance et de la patience, qui est représenté avec une tête d’éléphant.

Les éléphants blancs tiennent également un rôle dans la consécration des éléphants en Thaïlande. Même si à première vue, ils ne sont pas différents des éléphants

36

gris habituels, la dépigmentation de sept zones du corps permet aux experts de les reconnaître. On leur prête une parenté avec un éléphant que côtoya Bouddha, et le roi est connu comme le « maître des éléphants blancs », ce qui explique qu’ils soient considérés comme des Dieux en Thaïlande, qu’ils ne travaillent pas mais soient offerts au roi. Ils sont uniquement utilisés lors de la cérémonie du roi qui se tient régulièrement à quelques années d’intervalle.

Si le métier de cornac se transmet généralement de père en fils, de jeunes garçons (environ 12 ans) se destinent à devenir cornac, alors qu’ils ne sont pas issus de ce milieu, et cette décision est, selon les régions, une fierté pour la famille. Aucune fille cornac n’a été rencontrée dans aucun camp, car auparavant la partie inférieure du corps des filles était considérée comme impure et elles n’étaient donc pas autorisées à monter sur ces animaux considérés comme sacrés. Par contre les propriétaires de camps sont parfois des femmes qui ont hérité des éléphants de leur père qui travaillait avec eux à l’exploitation des forêts.

Enfin, les éléphants sont une des raisons de la fréquentation du pays par les touristes, et les thaïlandais le savent (Gerbet 1994).

1.2. Particularités anatomo-‐physiologiques

1.2.1. Croissance À la naissance, l’éléphant pèse environ 100 kg pour 90 cm de hauteur, et à l’âge adulte, une femelle pèsera entre 2300 et 3700 kg, alors que le poids d’un mâle pourra atteindre 4500 kg. Il grandit pendant quasiment toute sa vie.

On peut avec l’habitude estimer le poids d’un éléphant, ou bien le calculer grâce à la formule établie pour les éléphants quel que soit son âge :

Poids = (21,11 x périmètre thoracique) – 4.425

Où le poids est exprimé en kilogrammes, le périmètre thoracique en centimètres et mesuré juste en arrière de l’épaule.

1.2.2. La trompe Elle est dépourvue d’os et composée de très nombreux muscles issus de la fusion du nez, de la lèvre supérieure et des joues. Outre le fait qu’elle permette la respiration (elle porte les narines et les canaux nasaux), c’est l’organe de la préhension : à l’aide du doigt ou de la trompe entièrement (fig 5), et elle sert également à l’abreuvement puisqu’elle peut contenir jusqu’à 10 litres d’eau.

Figure 5 Le ou les doigts de la trompe de l’éléphant d’Asie A et d’Afrique B (CW Andrews "A Guide to the elephants" 1908)

37

1.2.3. Squelette Les éléphants possèdent des os larges capables de supporter leur poids important. Cela ajouté à la disposition quasi rectiligne des os des membres, et au développement important du coussin plantaire, autorise le maintien de la position debout pendant de longues heures.

Une autre particularité de leur squelette est plus étonnante : leur crâne est composé d’os pneumatique ou spongieux qui apparaît vers l’âge de 3 ans, et allège le poids de la tête de l’éléphant, lui offrant ainsi plus de liberté de mouvement.

1.2.4. Dentition • Les molaires

Elles sont adaptées au régime herbivore, et sont au nombre de quatre, chacune sera remplacée six fois, de l’arrière vers l’avant des mâchoires, au fur et à mesure de son usure. Lorsque le dernier jeu de molaires est usé, l’éléphant peine à s’alimenter, et finit par mourir de faim. Les molaires possèdent jusqu’à vingt crêtes transversales, et sont animées d’un mouvement d’avant en arrière qui permet de broyer l’herbe. Malgré cela l’éléphant ne digère que 60% de ce qu’il ingurgite, ce qui l’oblige à ingurgiter d’énormes quantités d’aliment.

• Les défenses

Seule une partie de la population d’éléphants mâles en porte, l’autre partie ne possédant que des vestiges de défenses, appelées « tushes » en anglais. Il s’agit des incisives supérieures, dont la structure est comparable à celle d’une dent classique, avec de l’extérieur vers l’intérieur : émail, ivoire (dentine), et canal pulpaire. Elles sont pour un tiers incluses dans l’os maxillaire, et un tiers de la partie visible à l’extérieur abrite le canal pulpaire. Elles poussent pendant toute la vie de l’animal, elles sont tout d’abord « de lait », puis définitives à partir de 2 ou 3 ans.

Au temps où les éléphants étaient principalement employés pour l’exploitation des forêts, les propriétaires leur coupaient régulièrement les défenses afin d’éviter qu’ils ne soient sujets au braconnage, durant la nuit où ils restaient sans surveillance dans la forêt. Les braconniers coupaient alors les défenses à ras sans tenir compte du canal pulpaire où se trouvent vaisseaux et nerfs, provoquant souvent des infections qui pouvaient devenir fatales.

De nos jours l’exploitation des forêts est interdite, excepté dans les plantations privées ou dans les zones de forêts autorisées par le FIO. Les propriétaires craignent moins le braconnage au sein des camps touristiques, et la coupe des défenses est donc de moins en moins pratiquée. Cependant, on coupe toujours les défenses cassées ou infectées, dans un but thérapeutique, ainsi que celles des éléphants agressifs,

Néanmoins, le propriétaire de l’éléphant est également le propriétaire de ses défenses, il a donc le droit d’en récupérer l’ivoire au fur et à mesure de leur pousse pour l’utiliser à la confection d’objets d’artisanat. La plupart des cornacs connaissent la zone de coupe, et font rarement appel au vétérinaire pour ce genre d’intervention. Si à sa mort, l’éléphant possède de longues défenses le propriétaire doit non seulement déclarer la mort de l’animal, mais également la possession des défenses.

Le trafic d’ivoire est toujours d’actualité y compris en Thaïlande, mais étant donné la diminution de la population d’éléphants en Asie du Sud Est, il s’agit principalement d’ivoire en provenance d’Afrique.

38

1.2.5. Physiologie de l’alimentation L’éléphant n’est pas un ruminant, son tractus digestif est similaire à celui d’un cheval : la digestion de la cellulose par la flore bactérienne produit des acides gras volatiles.

La quantité d’aliment ingurgité par jour représente entre 2 et 12% du poids de l’éléphant selon qu’il s’agisse de fourrage frais ou séché : en moyenne dans les camps, l’éléphant reçoit 200 kg de fourrage frais par jour.

Selon la taille, la localisation et les pratiques du camp, le mode d’alimentation des éléphants varie. Les plus petits camps (1 à 10 éléphants) préfèrent relâcher leurs éléphants dans la forêt avoisinante, où ils pourront se nourrir par eux mêmes. Cependant, cela ne suffit pas à nourrir les animaux et la plupart de ces camps doivent leur fournir une source d’aliment supplémentaire : herbe, maïs, canne à sucre, bananes, tronc de bananier, plant d’ananas, branchage de flamboyant et compléments minéraux.

Les camps plus importants et localisés en banlieue des villes, dans des zones plus accessibles aux touristes, ne disposent pas d’accès à la forêt. Les éléphants sont donc gardés attachés en dehors des périodes de promenades pour touristes. La totalité de leur alimentation doit leur être apportée par l’homme : fourrage, additionné de fruits et légumes, le plus souvent distribués par les touristes.

1.2.6. Physiologie de la reproduction Concernant le mâle, la maturité sexuelle est atteinte à 7 ans. Il est intéressant de noter que les testicules sont en position intra abdominale (à la différence de nombreux mammifères), sans que cela ne nuise à la spermatogénèse puisque la température corporelle de l’éléphant est naturellement basse (36-‐37°C). Cela serait à relier aux origines marines de l’éléphant. Le « musth » est également une particularité propre à l’éléphant, il s’agit d’une période pendant laquelle l’éléphant mâle est particulièrement agressif, ne mange pas, présente un gonflement et un écoulement au niveau des glandes temporales et un taux sanguin de testostérone très élevé. La cause et le but de ce changement comportemental sont inconnus, cependant il serait favorisé par un apport alimentaire trop riche, de l’inactivité, et dépendrait également de la saison. La pastèque serait un « anti musth ».

La puberté (cycle œstral en place, mais pas encore apte à supporter la gestation) de la femelle se produit chez la femelle entre 10 et 12 ans, alors que la maturité sexuelle (la femelle peut concevoir : son score corporel est suffisant, le développement de son squelette est achevé) apparaît à l’âge de 20 ans. Les mamelles de l’éléphante sont pectorales.

La femelle présente trois cycles sexuels par an, son cycle œstral durant 4 mois (fig 6). Par ailleurs l’éléphant possède un très bon odorat qui permet au mâle de déterminer le stade du cycle sexuel de la femelle en sentant ses urines.

39

Figure 6 Cycle oestral de l'éléphante

Le diagnostic de gestation peut se faire par la répétition de dosages de progestérone dans le sang : maintien d’un taux élevé pendant plus de 16 semaines. Le diagnostic visuel est impossible pendant une grande partie de la gestation. Il ne pourra être réalisé que quatre ou cinq mois avant la mise bas, en observant le développement du tissu mammaire. Le diagnostic échographique par voie intra rectale n’est envisageable que pendant les trois premiers mois, puisqu’au delà le fœtus bascule au fond de la cavité abdominale et est difficile à mettre en évidence par l’extérieur du fait de l’épaisseur de la paroi abdominale.

La gestation dure en 18 et 24 mois selon les individus, elle est significativement plus longue pour les éléphanteaux mâles. Du fait de la longueur, un seul corps jaune ne suffit pas à maintenir l’embryon, il y aura donc la succession de plusieurs corps jaunes au cours de la gestation, phénomène que l’on ne retrouve pas chez les autres espèces animales, et qui est responsable de légères variations de la progestéronémie.

À un an post-‐partum, la femelle peut être fécondée à nouveau. La lactation dure deux ans. Une femelle éléphant peut avoir jusqu’à dix petits (si l’on considère un petit tous les quatre ans entre 2O et 60 ans), mais ce nombre est rarement atteint et s’élève plutôt à quatre en ce qui concerne les éléphants de camps (fig 7).

Figure 7 Cycle sexuel de l'éléphante

40

1.2.7. Vieillesse Chez l’animal âgé, des taches de dépigmentation roses apparaissent sur la trompe et l’extrémité des oreilles. Ce phénomène est dû à une diminution de la synthèse du pigment mélanique avec l’âge.

Les plus vieux éléphants que l’on rencontre actuellement en Thaïlande, étaient autrefois utilisés pour le débardage dans les forêts, nombreux sont ceux qui en gardent des cicatrices, sur la trompe en particulier.

Certains de ces vieux éléphants ne sont pas nés en captivité mais ont été capturés au sein de troupeaux d’éléphants sauvages lorsque cela était encore autorisé. Ils gardent donc les traces de la technique de capture au lasso, autour des membres postérieurs. Il peut également s’agir d’éléphants dont le dressage a été délicat et qui ont donc été entravés.

1.2.8. Examen clinique Il est réalisé lorsque l’animal est attaché car certains éléphants donnent des coups de pieds, de trompe ou de queue. L’auscultation respiratoire au stéthoscope est possible mais délicate du fait de l’épaisseur de la paroi thoracique : l’animal doit donc rester complètement immobile, et on utilise la capsule creuse du stéthoscope pour éviter le crissement des poils très drus. La plupart du temps elle n’est pas réalisée, et on observera juste la courbe respiratoire, qui présentera des modifications en cas de pathologie. La fréquence normale est de 6-‐7 mouvements par minute, et elle est considérée comme pathologique au delà de 10 mouvements par minute. L’auscultation cardiaque n’est pas non plus pratiquée, la fréquence cardiaque est mesurée grâce au pouls sur une artère auriculaire, elle est d’environ 25-‐35 battements par minutes. La température corporelle peut être mesurée en intra-‐rectal ou dans une bouse fraîchement émise, il faudra alors rajouter 1°C pour une meilleure estimation.

1.2.9. Signification des cris et comportements de l’éléphant • Son aigu long : émis par l’animal excité, méfiant vis-‐à-‐vis de son environnement,

ou lorsqu’un danger a été identifié • Son aigu court : adressé au cornac, l’animal le salue, ou lui réclame à manger ;

adressé à d’autres éléphants, c’est une sorte d’entrée en matière ; émis à la demande du cornac dans les villes, en vue de faire venir les touristes curieux

• Son à basse fréquence : destiné à signaler sa présence à d’autres animaux très éloignés, inaudible par l’homme

• Résonance provoquée par la trompe cognée contre le sol ou souffle vers le sol et nuage de poussière ou maintien des oreilles écartées et fixes : avertissement, l’animal prévient que ce qu’on lui fait ne lui plait pas, et qu’il serait temps d’arrêter

1.3. Élevage et utilisation La domestication des éléphants en Asie est une tradition vieille de plus de 4000 ans, et serait originaire de la vallée de l’Indus. Les éléphants étaient alors la possession de riches rois qui les employaient comme force guerrière ou pour le prestige.

1.3.1. Dressage Le sevrage peut commencer à partir de 2 ans ½-‐ 3 ans. Auparavant les cornacs séparaient définitivement l’éléphanteau de sa mère à cet âge, mais actuellement l’entraînement de l’éléphanteau débute de plus en plus fréquemment aux côtés de sa mère. L’éléphanteau doit tout d’abord faire connaissance avec son jeune cornac : au cours d’une période de privation où il est le seul à apporter à l’animal eau et alimentation. Puis vient l’apprentissage du crochet et des commandes de base. À 4 ans,

41

l’éléphant peut commencer à travailler en tant que promeneur de touristes, ou entamer une spécialisation vers une carrière d’éléphant de spectacle, ou d’éléphant de travail, pour laquelle il ne sera pleinement apte qu’à l’âge de 15 ans.

1.3.2. Travail dans les camps La grande majorité des éléphants de Thaïlande sont employés dans les camps pour le transport de touristes : activité qui s’avère moins éprouvante que ne l’était le travail en forêt autrefois. Ainsi au cours d’une journée, un animal enchaînera au maximum 6 promenades, allant de 20 à 45 minutes.

Dans certains grands camps (plus de 40 éléphants) l’habileté des éléphants est exploitée dans des spectacles au cours desquels, sous les ordres de leur cornac, ils effectuent toutes sortes d’acrobaties impliquant bien souvent la participation des touristes ravis, ou font des démonstrations de l’ancienne utilisation des éléphants : « timber » éléphant, guerre, parade, capture d’éléphants sauvages… Dans ces camps, les éléphants ne travaillent que le matin entre 08 et 14 heures, l’accès au public est interdit l’après midi. Ils proposent assez souvent des séjours de 1 à 3 jours au cours desquels les touristes peuvent jouer à l’apprenti cornac en se familiarisant aux commandes utilisées pour guider l’animal, et aux soins qu’il faut lui prodiguer quotidiennement.

Il existe également quelques rares camps qui utilisent encore leurs éléphants pour pratiquer encore le débardage dans des plantations ou des zones de forêts encore autorisées, puisque l’exploitation des forêts est devenue illégale. L’éléphant y a alors une activité plus soutenue ! D’autres camps encore plus anecdotiques proposent juste de mettre en contact les touristes avec les éléphants dans un milieu plus naturel : une prairie où se trouve un troupeau d’éléphants. Les touristes sont invités à leur donner des fruits et des légumes fournis par le camp et à participer aux activités de baignade des éléphants.

Tous ces camps doivent être déclarés au DLD district office (bureau local du « Department of Livestock Development ») du lieu où ils s’installent, qui viendra vérifier l’adéquation des installations à la possession d’éléphants.

Il n’est pas rare de rencontrer d’autres espèces animales dans les camps d’éléphants : bovins, buffles, chevaux, ânes, chiens, chats… qui peuvent entre autres être utilisés à des fins touristiques (fig 8).

Figure 8 Mélange d'espèces sensibles à T. evansi dans un camp d'éléphants à Chiang Mai (original)

42

1.3.3. Aspects économiques Le prix de vente actuel d’un éléphant adulte et donc dressé s’élèverait à 800 000 Baths (environ 20 000 euros), plus du double de son prix il y a quarante ans. Les camps, plutôt que d’acheter des éléphants, peuvent également les louer à leur propriétaire et engager un cornac pour s’en occuper, il en résulte des changements de cornacs au cours de la vie d’un éléphant, ce qui si l’on en croit les dires des propriétaires de camps rencontrés, pose d’autant moins de problèmes que la transition (environ 3 mois) se fait en présence de l’ancien et du nouveau cornac. Le prix de location d’un éléphant varie de 7500 à 15000 baths par mois.

Les éléphants, s’ils ne sont pas nés sur le camps pour les plus jeunes, ou capturés dans un troupeau sauvage pour les plus vieux, sont achetés par un camp à un autre camp. Par exemple un éléphant travaillant dans un camp de la province de Chiang Rai (à l’extrême nord de la Thaïlande) peut avoir été ramené depuis la province d’Ayutthaya (à proximité de Bangkok). Il existe donc une certaine rotation des animaux sur le territoire thaïlandais, ce qui rend possible la propagation d’agents pathogènes comme T. evansi.

1.4. Organisation de la filière

1.4.1. Organismes impliqués Il faut savoir que deux ministères thaïlandais se partagent la gestion des

éléphants sauvages et domestiques, ce qui n’est pas sans poser quelques problèmes : lourdeur du protocole pour la prise de décisions, mauvaise communication, chevauchement des différentes équipes, et surnombre des agents lors des interventions…

Le ministère de l’agriculture a la charge du suivi de la santé et du contrôle des maladies des éléphants domestiques, ainsi que de la surveillance des éléphants sauvages. De ce ministère dépendent la DLD en totalité, et le FIO (« Forest Industry Organisation ») en partie. Le ministère de l’intérieur est quant à lui responsable du recensement des populations d’éléphants, de l’identification des individus grâce à un descriptif de leur apparence et de leurs marques distinctives, mais aussi de la délivrance de différents documents comme le certificat d’autorisation de transport…

• Department of livestock development, DLD (département du développement de l’élevage)

Ce département gère l’hôpital pour éléphants de Surin, qui n’accueille pas de résidents de longue durée, les seuls animaux présents sont ceux hospitalisés pour soins (au maximum quatre, car l’hôpital ne dispose pas d’une superficie suffisante pour les nourrir et doit donc faire venir de grandes quantités d’aliments. Le personnel de l’hôpital est constitué de quatre vétérinaires, trois assistants vétérinaires, et un technicien animalier. L’équipe mobile de cet hôpital effectue en association avec celle de l’hôpital de Lampang, deux visites par an des camps existants dans toute la Thaïlande.

D’autre part, la province de Surin est le centre névralgique de l’élevage d’éléphants en Thaïlande, elle possède en effet le plus grand effectif d’éléphants domestiques, et de nombreux projets/associations ayant trait à l’éléphant y sont basés. De plus la ville de Surin organise tous les ans le « Elephant Round-‐up Festival », qui a lieu fin novembre et regroupe plus de 300 éléphants provenant de différentes provinces du pays. D’autres festivals secondaires se tiennent à Surin à d’autres périodes de l’année, comme le « Surin Elephant Ordination Festival », mi mai. Ces évènements impliquent donc de nombreux mouvements et rassemblements d’animaux, propices à la diffusion d’agents pathogènes (cf. Annexe 2).

43

• DLD district office (bureau du DLD local)

Il est le premier interlocuteur des camps pour éléphants, un vétérinaire public en fait partie dans la majorité des cas. En cas de problème, le manager du camp le contactera et le vétérinaire d’état fera le déplacement pour effectuer les premiers soins. S’il est dans l’incapacité de traiter le cas, il fera appel à l’équipe mobile des hôpitaux de Lampang, Surin ou Krabi.

• Forest Industry Organization

Organisme mi privé – mi public, soutenu par la « World Society for Protection of Animals » (WSPA), il a mis en place le « National Elephant Institute » (NEI) qui a récemment remplacé l’ancien « Training Elephant Conservation Center » (TECC) dans le but d’acquérir une visibilité et un crédit plus grands, au sein de la population thaïlandaise. Cet institut est basé dans la province de Lampang, il possède une clinique mobile et deux centres : le site de Hang Chat, qui accueille l’hôpital où huit vétérinaires travaillent, une école pour cornacs et un centre d’entraînement pour éléphants ; et le centre de Panloc, visité hebdomadairement par un vétérinaire de l’hôpital, qui héberge une trentaine d’éléphants provenant de toute la Thaïlande (vieux éléphants incapables de travailler, « man killer », ou éléphants confisqués par l’état car travaillant à l’exploitation illégale des forêts). Le NEI a également un hôpital dans le sud de la Thaïlande, à Krabi, où deux vétérinaires sont employés.

1.4.2. Interventions • Pose de puce électronique et vérification de l’identité des

animaux

Tous les éléphants domestiques sur le sol thaïlandais sont en passe d’être identifiés à l’aide de puces électroniques, même s’il n’existe encore aucune loi rendant obligatoire la pose de la puce. Elle a pour but :

o d’identifier les animaux afin de contrôler l’introduction d’animaux illégaux d’autres pays ou la capture d’éléphants sauvages

o de permettre un meilleur suivi médical des éléphants en enregistrant les nouveaux évènements dans le dossier de l’animal

o de gérer les mouvements des animaux entre les camps, selon la saison et donc le tourisme.

La pose se fait selon le bon vouloir du gérant du camp qui présente ou non la totalité de ses animaux lors de la visite biannuelle de l’équipe mobile du DLD

La puce est implantée dans le cou, en arrière de l’oreille gauche (fig 9), dès l’âge de 6 mois. C’est la clinique mobile de Surin, dépendant de la DLD qui se charge des campagnes d’identification, qui ont débuté en 2003, et qui sont subventionnées par le gouvernement (aucun frais pour le propriétaire).

Il existe 3 types de puces électroniques, mais seules les deux premières sont utilisées pour l’identification des éléphants thaïlandais :

o FACAVA composée de 9 chiffres et une lettre, sur le marché depuis 6 ans o AVID sur le modèle : 3 chiffres * 3 chiffre * 3 chiffres, mise en place il y a 10 ans o ISO comportant 15 chiffres

44

La pose s’accompagne de la remise d’une carte au propriétaire qui contient le numéro de la puce, la date de la pose, le sexe de l’animal, le nom du propriétaire, les différents traitements qu’a reçu l’éléphant et leur cause.

• Vérification de l’état de santé des animaux et traitement des éventuels pathologies rencontrées

Toutes les informations nouvelles ou interventions sur l’animal sont répertoriées dans son dossier, conservé au centre de Surin, ce qui permet un suivi individuel de l’animal. Les principales pathologies rencontrées sont les plaies et boiteries dues aux combats entre éléphants, les troubles d’ordre digestif, et les problèmes oculaires.

• Distribution de médicaments

Tout l’intérêt de présenter ses éléphants aux contrôles d’identité réalisés par le DLD réside dans le fait que les camps sont approvisionnés gratuitement en médicaments. L’arsenal thérapeutique est néanmoins limité, et les traitements restent le plus souvent symptomatiques. Vitamines, antiparasitaires, antibiotiques, antipyrétiques, antifongiques, régulateurs de la flore intestinale, antiseptiques externes, pommade de massage… sont notamment distribués.

• Prélèvement d’échantillons de sang

La prise de sang est préférentiellement réalisée sur la face externe de l’oreille (face interne également possible mais moins appréciée des cornacs, car les éventuels

Figure 9 Lecture de puce électronique (original) Figure 10 Prélèvement de sang dans une veine auriculaire (original)

45

saignements post prélèvements seront visibles), dans une des veines auriculaires visibles à la surface du cartilage (fig 10). Il faut bien les différencier des artères auriculaires dont la structure n’est pas dépressible. La contention de l’animal est effectuée par le cornac, qui ne doit pas tirer de manière excessive sur l’oreille pour ne pas faire obstacle au remplissage des veines. La réalisation de la prise de sang à l’oreille est plus aisée par temps chaud du fait de leur rôle important dans la régulation thermique. En effet, la grande surface des oreilles, la finesse de la peau et la dilatation des veines à ce niveau, permettent le refroidissement du sang qui y circule.

• Vaccinations

Aucune n’est obligatoire. Elles se font à la demande du propriétaire et sont conseillées lors de foyers proches. La région de Surin, par exemple, est considérée comme une région à risques pour la septicémie hémorragique, puisque des bovins sont élevés à proximité des éléphants et que les mouvements d’éléphants sont fréquents.

Cependant lors de l’importation dans les règles d’un animal d’une zone d’endémie vers une zone indemne, les vaccinations contre l’anthrax, la fièvre aphteuse, ou la septicémie hémorragique sont obligatoires. Et ces vaccinations doivent être mentionnées sur le certificat d’autorisation de transport.

Des cas d’anthrax chez les éléphants étaient signalés en Thaïlande auparavant, mais à présent on en retrouve surtout au Myanmar. La fièvre aphteuse est toujours présente en Thaïlande mais à une prévalence moindre que dans les pays voisins (Myanmar, Laos, Vietnam).

1.4.3. Les différents projets « éléphant » • Dépendant de l’université de Chiang Mai

Étude de la tuberculose au sein de la population d’éléphants domestiques : Elle doit en partie son existence à de récents cas de tuberculose à Mycobacterium tuberculosis chez les éléphants domestiques, mais concerne également les autres mycobactéries (bovis, africanum et microti).

Un rapport annuel pour chaque maladie est publié, mais l’accès y est restreint. Il y aurait eu des éléphants séropositifs en tuberculose l’an passé. Le test de choix qui devrait être effectué annuellement chez tous les éléphants thaïlandais est la culture bactérienne. Mais d’autres tests sont également employés : coloration de Ziehl Neelsen pour bactéries acido-‐alcoolo-‐résistances, PCR, interféron gamma, ELISA en cours de standardisation pour être utilisée comme test de screening.

Lorsqu’un éléphant est positif à la culture bactérienne ou à la PCR suite au lavage de la trompe, un traitement de 12 mois à base d’Isoniazide et de Rifampicine est envisagé, l’animal est soumis à une interdiction de mouvement et de contact avec le public d’au moins 6 mois et jusqu’à l’obtention de deux cultures négatives consécutives. Les éléphants dont la culture est négative, mais qui ont été en contact avec des éléphants positifs doivent également respecter un protocole de traitement et restriction de déplacement.

Étude de l’ADN : Les collectes de sang d’éléphant menées en parallèle par l’hôpital de Lampang, celui de Surin et la faculté vétérinaire de Chiang Mai (et se chevauchant parfois), servent également à implémenter les études de l’ADN des éléphants thaïlandais supervisées par Chiang Mai justement.

46

Le but de ce projet est de permettre l’identification de chaque éléphant thaïlandais, par le séquençage de l’ADN. Pour ce faire, on utilise 12 marqueurs microsatellites. Les applications directes de cette identification supplémentaire sont les mêmes que celles de la puce électronique. Cependant les autorités compétentes en ce qui concerne les éléphants craignent que certaines personnes mal intentionnées récupèrent les puces sur des animaux morts afin de les réimplanter dans un éléphant sauvage capturé illégalement. La vérification de cette identification ne se fera pas en routine, mais face à un éléphant à l’identité douteuse, ou déplacé subitement sans certificat, la prise de sang et le séquençage ADN aboutira rapidement à une conclusion. Par ailleurs, cet outil pourrait permettre à terme de mieux gérer la génétique des populations, en partenariat avec le projet d’insémination artificielle.

• Dépendant de la reine

L’ « Elephant Reintroduction Foundation» vise à réintégrer des éléphants domestiques de tout âge, dans leur habitat naturel. En effet, depuis l’interdiction d’exploiter les forêts de teck, les possibilités d’utilisation des éléphants s’amenuisent, et de nombreux cornacs sont obligés de parcourir des kilomètres avec leur éléphant pour trouver un emploi et subvenir à leurs besoins et à ceux de leur animal. Certains se retrouvent même à errer dans les grandes villes, à proposer aux touristes de nourrir l’éléphant contre rémunération. C’est dans ce cadre que s’inscrit l’initiative de la reine. Il va sans dire qu’avant de relâcher l’éléphant tout un travail d’habituation de l’animal est nécessaire, au cours duquel le cornac viendra voir de moins en moins souvent son animal. Mais c’est une période qui se passe sans difficulté pour un animal qui était relâché toutes les nuits dans la forêt et qui a gardé intacts ses instincts pour y vivre. Le principal problème que rencontre ce programme, est la délimitation de la zone que les éléphants vont parcourir, une fois en liberté : il n’est pas rare qu’ils soient responsables de détérioration des cultures.

• Dépendant du FIO

Il s’agit du programme de recherche sur l’insémination artificielle des éléphants mené par le vétérinaire-‐chef de l’hôpital de Lampang. Il ne s’est développé que récemment car auparavant il était plus facile de capturer des jeunes éléphants sauvages que d’en faire naître en captivité.

Actuellement au centre de Lampang la monte naturelle est utilisée, et l’insémination n’est encore qu’à l’état de recherche. Elle a tout de même permis de donner naissance à un éléphanteau, aujourd’hui âgé de 4 ans, suite à une insémination en semence fraîche.

Outre la volonté de maîtriser les techniques d’insémination chez les éléphants, ce programme souhaite à terme pouvoir offrir un service d’insémination artificielle en semence congelée, dans toute la Thaïlande et à l’étranger. Cela permettrait d’augmenter le brassage génétique, puisque la consanguinité pourrait dans le futur s’avérer être un problème majeur pour la population d’éléphants du fait de sa diminution. Ce serait également un moyen de conserver l’espèce, puisqu’il s’agit d’une espèce menacée d’extinction selon l’ « International Union for the Conservation of Nature » (IUCN), et listée en annexe I de la Convention sur le Commerce International des espèces de faune et de flore sauvages menacées d'extinction (CITES), qui interdit son commerce.

En semence fraîche, le taux de réussite de l’insémination est de 20%, ce qui est comparable avec les résultats obtenus chez l’homme. La semence a une durée de survie de 24 heures ce qui ne permet donc pas de la distribuer dans toute la Thaïlande. Suite à

47

la détermination du moment de l’ovulation chez la femelle : diminution du taux de progestérone et deux pics de LH ou Test de flehmen, la collecte de la semence peut avoir lieu. Elle est réalisée manuellement à l’aide d’un électro stimulateur, à n’importe quelle période, même si le mâle n’est pas en musth. On vérifie alors la viabilité, la motilité, la concentration et le rapport morts/vivants des spermatozoïdes. La récolte peut varier de 5 à 40mL par éléphant, et on utilise généralement une dose de 10mL pour inséminer une femelle. Jusqu’à présent, la semence congelée, conservée dans l’azote liquide suivant le même protocole de congélation que pour les bovins, est nettement moins efficace, du fait d’une forte mortalité après décongélation. L’insémination est réalisée sous guidage échographique à l’aide d’un cathéter flexible long, la femelle étant tranquillisée, la semence est déposée juste en amont du col de l’utérus.

• Dépendant du village d’éléphants de Surin

« Bring Thaï éléphant home » L’association qui existe depuis 2006, vise à sauver les éléphants qui errent dans les rues des grandes villes, à leur trouver un lieu de vie approprié.

Elle a déjà acheté plus de 70 éléphants et salarié leurs cornacs : elle les paye environ 8000 Baths par mois (5000 Baths pour le cornac et 3000 Baths pour nourrir l’éléphant), fournit un terrain de 6400m2 à Surin, et une maison pour le cornac. Les éléphants seront par la suite utilisés pour promener des touristes, ou participer à des parades. L’association, à qui la province attribue un budget conséquent, prévoit de ramener à Surin 120 éléphants supplémentaires.

Tous les éléphants rachetés par l’association, ne sont pas rapatriés à Surin, car l’association a des partenariats avec certains camps d’éléphants réputés pour les bons soins qu’ils prodiguent aux animaux, et elle y envoie quelques éléphants. On peut retenir « Elephant Nature Park », où les éléphants ne travaillent pas du tout et sont regroupés en un même troupeau dans une grande prairie.

« Elephant Knowledge Center » Toujours à l’état de projet, ce centre devrait regrouper toutes les informations disponibles sur l’éléphant d’Asie : son mode de vie, son alimentation, ses capacités… Tout cela en vue d’éduquer et de sensibiliser les populations au devenir de cet animal.

1.5. Le Surra et les éléphants en Thaïlande

1.5.1. Historique des cas Entre août 1999 et mars 2005, un cas clinique de Surra chez un éléphant fût

répertorié dans la province de Surin, s’inscrivant dans une série de 79 cas chez sept espèces domestiques différentes, dans le nord est de la Thaïlande (Wongnak et al. 2006).

Un éléphant mâle de 22 ans utilisé pour le travail forestier dans la province de Chiang Mai, a été référé pour Surra, il y a 7 ans, à l’hôpital pour éléphants de Lampang. Il présentait pour seuls signes cliniques, de l’abattement et de la réticence au travail, et avait été diagnostiqué positif par examen d’un frottis sanguin coloré, dans un premier temps, puis par PCR et ELISA. Le traitement de choix avait alors été l’acéturate de diminazène à 5mg/kg, suite à quoi les tests de suivi (MHCT, frottis coloré, et inoculation à des souris) ont été négatifs pendant environ deux semaines, puis le parasite a de nouveau été mis en évidence (Hin On et al. 2003). Cela traduit la faible efficacité de cette molécule sur T. evansi. Depuis, aucun cas n’a été rapporté sur le terrain dans le nord de la Thaïlande.

48

Plus récemment, en Avril 2010, les cinq éléphants d’un troupeau employé pour le débardage dans le district de Thungsong de la province de Nakhon Si Thammarat, dans le sud de la Thaïlande ont été touchés par un épisode de Surra. Le troupeau vivait en permanence dans une zone de forêt depuis un an, avec un troupeau d’environ 500 buffles et bovins qui paissait aux alentours, et une densité importante d’insectes vecteurs potentiels du Surra. Seuls trois animaux ont montré des signes de la maladie, à savoir : anorexie, faiblesse, anémie, œdème ventral et réticence au travail. Des prélèvements de sang ont été réalisés avant et après (jusqu’à 28 jours de suivi) le traitement au Bérénil ® 5mg/kg de cinq éléphants, et testés par frottis colorés, MHCT et PCR (TR3&TR4) au « Northern Diagnosis Center ». Pour les besoins du suivi, et afin de soustraire ces animaux à la pression parasitaire exercée par les insectes, ils ont été déplacés vers une zone aménagée. Si la PCR s’est révélée négative 48 heures après le traitement, elle a de nouveau mis en évidence la présence de parasites dans le courant sanguin, deux semaines après l’administration de Bérénil ®. Cela a conduit à la mort de l’éléphant le plus parasité, à cause d’une anémie et d’une déshydratation sévère, 30 jours après le traitement (Arjkumpa et al. 2010).

D’après les vétérinaires responsables de ce foyer, le traitement aurait été répété à une dose supérieure, sans meilleur résultat. Et si les éléphants ont été efficacement isolés des bovins et buffles, réservoirs potentiels du parasite, dans une zone protégée des insectes, ces nouvelles infections seraient des résurgences et témoigneraient de la résistance de la souche de T. evansi présente dans ce foyer à l’acéturate de diminazène.

1.5.2. Études épidémiologiques antérieures Pendant les éditions 1995 et 1996 du festival de Surin, 115 éléphants furent prélevés

(sang et sérum), les frottis colorés, le test de Woo et l’inoculation sur souris ne donnèrent que des résultats négatifs, alors que 4 échantillons étaient positifs en IFAT et en ELISA indirect (Tuntasuvan et al. 1997, d’après Tuntasuvan & Luckins 1998).

2. Le cheval

2.1. L’élevage de chevaux en Thaïlande La population totale de chevaux s’élevait à 5525 individus en 2010 (Information and Statistics group, Information Technology Center, Department of Livestock Development) (cf. Annexe 3). Deux groupes de chevaux coexistent : les chevaux de race importés (Arabes, Pur-‐sang…) et les chevaux de race locale thaïlandaise, qui sont en réalité des poneys, retrouvés originellement au Myanmar. Ces derniers servent principalement pour les célébrations religieuses, le loisir et le transport dans les zones reculées de montagne, alors que les chevaux de race sont plutôt utilisés pour les courses (Phetudomsinsuk et al. 2008).

Les courses de chevaux sont populaires en Thaïlande depuis plus d’un siècle, suite au retour du Roi Rama V d’une visite en Europe. L’élevage des chevaux de course s’est alors rapidement développé, principalement au Nord Est de la Thaïlande. La taille des fermes est variable, mais on retrouve majoritairement de petites exploitations familiales. Les courses ont lieu au « Royal Turf Club of Thailand », l’hippodrome de Bangkok, un dimanche sur deux, et sont l’occasion pour les Thaïlandais de se laisser aller à la fièvre du jeu. Ces courses provoquent également de nombreux mouvements de chevaux, qui pourraient héberger d’éventuels trypanosomes et ainsi contribuer à la propagation de la maladie au sein des élevages de chevaux. De plus, lors de ces manifestations sportives des contrôles sanitaires sont réalisés, et sont donc la source d’échantillons pour d’éventuelles études épidémiologiques. Cependant il s’agit d’un milieu assez fermé et duquel il est difficile d’obtenir des informations.

49

2.2. Le Surra et les chevaux en Thaïlande

2.2.1. Historique des cas En 1975, quatre juments pur-‐sang du camp militaire de la province de Nakhon

Ratchasima furent atteintes cliniquement de Surra : inappétence, fièvre intermittente, anémie et œdème. Le diagnostic de certitude fut apporté par examen direct de sang frais entre lame et lamelle et inoculation à des souris, et le traitement employé fut composé de 1mg/animal de méthyl sulfate de quinapyramine 10% (Boonyawong et al. 1975). Entre août 1999 et mars 2005, parmi les 72 foyers qui se sont déclarés dans le nord est du pays (provinces de Surin, Buriram, Ubon Ratchathani, Mahasaracam et Chaiyaphom), un seul a touché un cheval (Wongnak et al. 2006).

Aux mois de juin et juillet 2000, un élevage de chevaux de la province de Khonkaen, essuya un important épisode de Surra, 40% des chevaux et 10% des mules, présents sur l’exploitation, moururent probablement de l’infection par T. evansi, et environ 42% des juments gestantes, avortèrent ou donnèrent naissance à des poulains morts nés. Le mois suivant des analyses parasitologiques (frottis coloré et/ou technique de Woo), chez les animaux survivant, prouvèrent la présence du parasite (Tuntasuvan et al. 2003).

2.2.2. Études épidémiologiques antérieures Entre 1984 et 1989, le Northeast Regional Veterinary Diagnostic center in Khonkaen, examina selon des techniques parasitologiques 33 échantillons provenant de 9 provinces ; les résultats donnèrent une prévalence de 57% (Kashemsant et al. 1989).

2.3. Description d’une ferme mixte dans la province de Surat Thani Un foyer clinique de Surra a été détecté chez des chevaux en avril 2011 dans un élevage mixte (chevaux, bovins et chèvres), à Tharong Chang dans la province de Surat Thani, dans le sud de la Thaïlande.

2.3.1. Contexte L’élevage est situé au beau milieu d’une palmeraie, les animaux sont donc relativement isolés des autres troupeaux puisque la palmeraie est entourée d’autres palmeraies qui ne pratiquent pas l’élevage. Comparée à la palmeraie de 500 hectares dans laquelle la ferme se situe (fig 11), l’élevage a une importance économique anecdotique pour son propriétaire.

Figure 11 Plan de la palmeraie de Surat Thani victime du foyer de Surra

50

2.3.2. Climat et Culture La principale culture dans cette province est le palmier, exploité pour son huile (la plus consommée au monde). Les champs de palmiers sont inondés de manière quasi permanente, du fait d’une saison des pluies très longue dans cette zone de la Thaïlande. En l’occurrence, des inondations importantes et durables se sont produites entre octobre 2010 et fin mars 2011, atteignant 3 mètres de hauteur, paralysant la circulation, et obligeant le manager de la ferme à regrouper les animaux sur la route la plus proche, avec des troupeaux d’origines différentes.

2.3.3. Effectifs animaux • Bovins

Le troupeau est constitué de 41 têtes de zébus locaux à oreilles tombantes, dont environ dix sont vendus pour la consommation de viande à l’intérieur de la province, au cours d’une année. Le manager introduit très rarement des animaux de l’extérieur pour le renouvellement du troupeau, toutefois il a importé, en janvier 2011, un zébu issu d’un centre gouvernemental d’élevage d’une région centrale de Thaïlande (détails non communiqués).

• Chèvres

Au moment de notre passage, elles étaient au nombre de 103, de race Angol et utilisées pour la production de viande (30 têtes/mois) : des acheteurs se fournissent directement sur le site.

• Chevaux

La ferme en comptait 12 initialement et seulement 11 au moment de notre passage ; ils ne sont utilisés à aucune fin particulière.

• Autres

Un mouton fait partie intégrante du troupeau de chèvres.

Quelques chats et quelques poules errent dans la palmeraie. Cependant, ni les bovins ni les caprins ne sont abattus sur le site de la palmeraie (même pour la consommation familiale), les animaux sont vendus vivants. Ainsi il y a très peu de risque qu’un chat se retrouve infecté par T. evansi, la principale voie de contamination des petits carnivores étant la consommation de viande fraîche ou de sang parasités.

2.3.4. Bâtiments Des constructions en bois, ouvertes sur l’extérieur abritent les animaux la nuit, Les trois destinées aux chèvres ont été construites sur pilotis et caillebotis au sol et bardage aéré au mur. Les deux qui hébergent les chevaux et les bovins sont situés dans deux enclos distincts, et ne sont composées que d’un toit.

2.3.5. Conduite d’élevage Alimentation : les trois troupeaux sont laissés en liberté la journée, pour qu’ils puissent pâturer à leur gré : de 14H à 18H pour les chèvres, et de 9h à 18H pour les chevaux et les bovins. Ils reçoivent tout de même une alimentation complémentaire, à savoir : des concentrés, du foin, et également de l’herbe coupée en ce qui concerne les bovins et les chevaux.

Auparavant les chevaux étaient en liberté sur l’exploitation jour et nuit, mais depuis l’apparition des premiers symptômes de Surra, le manager les a confinés dans

Figure 12. Cachexie chez un zébu à oreille

51

l’enclos de manière permanente, sur les conseils de la vétérinaire, mais ils ressortent la journée depuis quelques jours.

En réalité le mélange des trois espèces est continu puisque les bovins, les chevaux et les chèvres sont amenés à pâturer ensemble à l’extérieur et à l’intérieur des enclos (les chèvres pénétrant dans l’enclos des chevaux) et se trouvent très proches en de nombreuses circonstances.

Figure 12 Cohabitation de plusieurs espèces autour d’un “smudge fire” à Surat Thani (original)

Lutte contre les insectes : des feux lents dégageant de la fumée sont allumés régulièrement dans les enclos des chevaux et des bovins pour écarter les insectes, les animaux restent à proximité du nuage de fumée, preuve que cela est efficace (fig 12)

De plus, les bovins sont traités avec de la Cydectine Pour on Cattle ® (moxidectine 5mg/ml), tous les 3 mois : traitement qui ne protège pas les animaux contre les piqûres, mais qui diminue tout de même la pression vectorielle. De leur coté les chevaux ne reçoivent jamais de traitement insecticide.

Dans les enclos des chevaux et des bovins, le fumier accumulé la nuit est ramassé et utilisé comme engrais. En revanche, les refus alimentaires entrent en décomposition dans les enclos et forment des gîtes larvaires de premier choix pour les stomoxes.

53

DEUXIÈME PARTIE : ÉTUDES DE TERRAIN

I. Enquêtes épidémiologiques chez les chevaux et les éléphants en Thaïlande

L’objectif de ces enquêtes était de déterminer la prévalence du Surra chez les éléphants et les chevaux, à l’échelle nationale et éventuellement provinciale, afin de distinguer les provinces les plus à risque. L’analyse par différents tests diagnostiques des échantillons de sang collectés, ainsi que la compilation des données obtenues ont été réalisées au sein du département de parasitologie de l’université de Kasetsart, à Bangkok.

1. Matériel et méthodes

1.1. Échantillonnage des éléphants Pour connaître la prévalence du Surra chez les éléphants en Thaïlande, avec une précision relative de 40%, il est nécessaire de connaître approximativement la prévalence attendue de la maladie, ainsi que la taille de la population afin de vérifier la fraction de sondage. Le nombre d’éléphants domestiques en Thaïlande a été estimé à 4016 en 2011 (Information fournie par un vétérinaire de l’hôpital pour éléphants de Surin). Par ailleurs, la prévalence attendue au terme de l’étude chez les éléphants est faible, car moins de 10 cas cliniques ont été signalés chez cette espèce, ces vingt dernières années. L’unique étude épidémiologique réalisée antérieurement sur cette espèce ne permet pas de déterminer une prévalence attendue de manière acceptable. Mais si l’on admet arbitrairement que cette prévalence est d’environ 7%, 319 échantillons répartis sur l’ensemble du territoire thaïlandais seraient nécessaires, ce qui n’aboutit pas à un taux de sondage supérieur à 10%. La formule appliquée est:

Le choix individuel des animaux dans les élevages s’est un peu imposé de lui même, puisque pour les éléphants, nous devions suivre les équipes mobiles des hôpitaux pour éléphants de Surin et de Lampang. Nous dépendions donc de leur propre échantillonnage, et si elles étaient censées visiter tous les camps de Thaïlande, elles ne prélevaient qu’un petit nombre d’animaux dans chaque camp : les animaux malades ou nouvellement acquis. De plus nous n’avons pas été autorisés à les rejoindre lors de chacune de leur « mission terrain ». Par ailleurs, 142 sérums nous ont été fournis par un vétérinaire de l’Université de Chiang Mai, ils provenaient des provinces de Chiang Mai et de Kanchanaburi. Au total 329 éléphants ont été prélevés et ils étaient relativement répartis sur le territoire thaïlandais, comme on peut le constater sur la figure 13.

1.2. Échantillonnage des chevaux Concernant les chevaux, 5525 individus ont été recensés en Thaïlande en 2010 ; la prévalence du Surra a été estimée à 57% en 1989 par (Kashemsant et al. 1989) mais l’étude n’avait concerné que le nord-‐est du pays, région plus à risque car frontalière, et à une période où vingt foyers s’étaient déclarés chez des chevaux. Ce serait donc surestimer la prévalence, et sous-‐estimer la taille de l’échantillon que de se baser sur cette valeur. Estimons que la prévalence attendue chez les chevaux est de 20%, cela aboutit à 384 animaux à prélever en appliquant la même formule avec une précision relative de 20% et un risque de 5% (Toma et al. 2001).

n = 3,84 (1 -‐ p) p . Pr2

n : taille de l’échantillon p : prévalence attendue de 7% Pr : Précision relative choisie à 40% et risque de 5% (Toma et al. 2001)

54

Dans ce but, une première enquête a été réalisée sur 282 chevaux de courses venant courir à l’hippodrome de Bangkok en 2010. La majorité des participants provenait de la province de Nakhon Ratchasima et des provinces adjacentes où se trouvent en grande partie les élevages de chevaux de course. Une seconde enquête a concerné une campagne de prélèvements réalisée par l’équipe du DLD local, dans le sud de la Thaïlande en juin 2010 : 161 échantillons provenant des provinces de Phuket, Krabi, Surat Thani et Nakhon Si Thammarat. La majorité, sinon la totalité, des élevages de chaque province devait être visitées par le DLD local, tout l’effectif de chevaux y était prélevé, et il s’agissait d’animaux sains, collectés dans le cadre d’un screening de l’anémie infectieuse équine dans la région. L’élevage localisé dans la palmeraie où s’est déclaré le foyer de Surra faisait partie intégrante de l’échantillon (fig 14).

Parallèlement, une étude de cas sur 17 échantillons de chevaux issus d’une ferme de la province de Ratchaburi, à l’ouest de Bangkok, dans laquelle un foyer de Surra s’était déclaré mi-‐juin, nous a été confiée. Seul le traitement des échantillons a été réalisé sans que nous puissions nous rendre sur place : ces échantillons ont été intégrés à l’échantillon (le vétérinaire avait pu suspecter T. evansi au regard des nombreux animaux atteints cliniquement, le diagnostic avait été confirmé par étalement de sang frais, et tous les chevaux ont été traités au Bérénil ® 3,5mg/kg le jour du prélèvement).

Au total 460 chevaux ont été prélevés. Il serait nécessaire à la fin de l’étude de vérifier, avec la prévalence obtenue, si les calculs de tailles d’échantillons initiaux étaient corrects.

55

Figure 13 Origine géographique des échantillons d’éléphants analysés et répartition des populations d’éléphants

56

Figure 14 Localisation des prélèvements de sang de chevaux et des foyers de Surra

57

1.1. Prélèvements Ils ont été réalisés à la veine auriculaire chez les éléphants et à la veine jugulaire chez les chevaux. Dans l’idéal, le sang récolté était divisé entre un tube sec en vue de l’obtention de sérum, et un tube EDTA pour la réalisation des différents tests parasitologiques et moléculaire (MHCT, frottis, PCR). Ils étaient ensuite transportés en glacière, puis conservés au congélateur à -‐20°C.

1.2. Méthodes de diagnostic

1.2.1. MHCT (« micro hæmatocrit centrifugation technique ») ou méthode de Woo

Il s’agit d’un test parasitologique développé par (Woo 1970). Environ 70µL de sang EDTA sont introduits par capillarité dans un tube capillaire hépariné (non nécessaire), (Hirschmann ® Laborgeräte, Eberstadt, Allemagne) ; l’extrémité du tube est comblée par un bouchon de pâte à modeler ; cinq minutes de centrifugation à 10 000tr/min permettent de séparer les globules rouges, le buffy coat et le plasma. L’hématocrite de l’animal peut ainsi être estimé, en pourcentage de la hauteur du culot d’hématies sur celle du volume de sang total, grâce à un micro capillary reader (Thermo Electron Corporation ®, Osterode am Harz, Allemagne). La mise en évidence du parasite se fait, après nettoyage du tube hématocrite à l’alcool 75%, par observation au microscope optique (grossissement x200) du buffy coat, où se concentrent les trypanosomes. En effet ils possèdent une capacité de décantation (basée sur leur forme et leur densité) légèrement inférieure à celle des globules blancs et très inférieure à celle des globules rouges qui sédimentent au fond du tube (Woo 1970, OIE 2010, Desquesnes & Tresse 1996). Cette technique rend également possible la détection de microfilaires qui se retrouvent juste au dessus du buffy coat et dont les mouvements perturbent parfois l’observation des trypanosomes.

1.2.2. Frottis sanguins La goutte de sang étalée sur la lame, fixée au méthanol et colorée au Giemsa, permet de détecter au microscope à immersion, des trypanosomes dans la queue du frottis, parmi les globules blancs, mais aussi d’autres parasites sanguins.

1.2.3. CATT/T. evansi ® (« Card agglutination test for trypanosomiasis due to Trypanosoma evansi »)

Il met en évidence par agglutination, les Ig M dirigées contre un type prédominant d’antigènes externes de T. evansi, RoTat 1.2. L’agglutination visible entre les trypanosomes, colorés au bleu de Coomassie et les Ig M pentavalentes présentes dans le sérum, signe le plus souvent une infection récente. D’après les recommandations du fabricant (Institute of Tropical Medicine « Prince Leopold », Antwerpen, Belgique), la dilution du sérum est la même quelle que soit l’espèce considérée, à savoir 1 : 4.

Les témoins positifs et négatifs, ainsi que l’antigène sont reconstitués avec respectivement 0,5, 0,5 et 2 ,5mL par flacon d’un tampon PBS (phosphate buffered saline pH 7,2) fournis. Les sérums sont dilués à 1 : 4 donc, dans ce même tampon. Puis la réaction d’agglutination se déroule sur une carte, sur laquelle sont dessinés dix cercles : un pour une réaction. À l’intérieur de chaque cercle, sont disposés 25µL de sérum dilué, et une goutte d’antigène (environ 45µL) ; les deux gouttes sont mélangées à l’aide d’une baguette en plastique ; une fois les dix mélanges réalisés, la carte est placée sur un rotateur à 70 tours/minute pendant 5 minutes. Les témoins positifs et négatifs ne sont pas nécessaires sur chaque carte, mais les contrôles doivent être effectués au moins une fois par flacon d’antigène. Les résultats se lisent au terme des cinq minutes

58

d’agitation, et varient de négatif (pas d’agglutination -‐) à fortement positif (agglutination importante +++).

1.2.4. ELISA (« Enzyme-‐Linked ImmunoSorbent Assay ») Le test ELISA/T. evansi vise à mettre en évidence, dans les sérums testés, des anticorps anti trypanosomes (Ig G), il s’agit donc d’un ELISA indirect. Le protocole dérive directement de celui utilisé lors d’une enquête sérologique chez les bovins laitiers en Thaïlande en 2009 (Desquesnes et al. 2009).

Les antigènes solubles de T. evansi utilisés ont été au préalable extraits à partir de sang de souris infectées par la souche Te Deer 2008 sur colonne de cellulose échangeuse d’anions. Le coating des plaques 96 puits Microtest Polysorp Nunc ® (Roskilde, Danemark), est réalisé sur une nuit à +4°C avec 100µL de tampon carbonate : 0,05 M, pH 9.6, contenant les antigènes à la concentration de 5µg/ml. Le blocage s’effectue grâce à 150µL de « blocking buffer » ou BB : PBS 1X pH 7,4, Tween 20 0,1%, lait écrémé en poudre (Wako Pure Chemical Industries ®, Osaka, Japon) 7%, placé à incuber pendant 45 minutes à 37°C sans agitation. Les sérums dilués au 1/100 dans le BB, sont déposés en double exemplaire horizontalement sur la plaque ensuite mise à incuber 30 minutes toujours à 37°C, mais avec agitation (300rpm). Suite à cela, les puits subissent sept lavages successifs à l’aide du « washing buffer » (PBS 1X pH 7,4, Tween 20 à 0,1%) avant de recevoir les différents conjugués spécifiques d’espèces et d’être mis à incuber dans les même conditions que précédemment. Après sept autres lavages, 100µl de substrat chromogène, 3,30,5,50-‐tétraméthylbenzidine (SureBlue TMB, KPL®, Gaitherburg, USA) sont placés dans chaque puits. Enfin, 30 min d’incubation à température ambiante et dans le noir, suffisent à la peroxydase (conjugué) éventuellement présente dans les puits de lyser l’hydrogène peroxyde et à libérer l’oxygène permettant d’oxyder le TMB, dont la coloration est mesurée par la lecture de densité optique ou DO à 620nm, grâce à un spectrophotomètre (Dynex Technologies®, VA, USA).

Chaque plaque devait comporter trois échantillons positifs et trois échantillons négatifs de référence, et tous les échantillons étaient testés en double. Un échantillon était considéré comme positif dés lors que son pourcentage relatif de positivité ou RPP (défini ci dessous) était supérieur au seuil de positivité de chaque espèce (19% pour les chevaux et 15% pour les éléphants).

RPPéchantillon = DO échantillon – DO moyenne échantillons négatifs , DO moyenne échantillons positifs – DO moyenne échantillons négatifs

Éléphants : Ne disposant pas de conjugué spécifique anti immunoglobuline d’éléphants, les protéines A et G – Peroxydase issue de Streptococcus spp. (respectivement P8651 et P 8170 Sigma-‐Aldrich ®, Singapour) ont été utilisées à la dilution 1 : 2500 (Tuntasuvan et al. 1996).

Chevaux : Les sérums de chevaux ont été testés avec un conjugué anti immunoglobulines de chevaux couplé à la peroxydase (A6917 Sigma ®) à la dilution 1 : 10 000.

1.2.5. PCR (« Polymerase chain reaction ») De plus grande sensibilité pour diagnostiquer les infections actives, la PCR permet d’amplifier une séquence d’ADN spécifique du parasite présent dans le sang de l’hôte, de manière à ce qu’elle soit visible par électrophorèse, marquage au bromure d’éthidium et lecture en U.V.

59

Extraction d’ADN : Elle est réalisée par la méthode phénol – chloroforme en suivant le protocole indiqué par (Sambrook & Russel 2001), (cf. Annexe 4).

Amorces utilisées : Il s’agit des amorces TBR1 (5’ GAATATTAAACAATGCGCAG 3’) et TBR2 (5’ CCATTTATTAGCTTTGTTGC 3’), décrites par (Moser et al. 1989), encadrant une séquence répétée d’ADN nucléaire satellite, spécifique du genre Trypanozoon, selon le protocole employé par (Masiga et al. 1992) modifié. La séquence ainsi amplifiée se distingue par un signal à 164pb sur gel d’agarose après électrophorèse, témoignant de l’atteinte de l’animal.

Une fois l’ADN extrait, ou l’échantillon traité au Chelex ®, la PCR peut commencer. Le master mix, solution dans laquelle se déroulent les réactions d’amplification, contient 10mM de Tris, 50mM de KCl et de MgCl2, 200µM de chacune des quatre bases azotées (dNTPs), 1µM de chaque amorce, 0,5 unité de Taq-‐Polymérase, le tout dilué dans de l’eau distillée. Pour 10µL de master mix, on ajoute 1µL d’échantillon à tester par réaction ; le vortex et la centrifugation assurant que le mélange soit homogène et bien situé au fond du micro-‐tube, avant qu’il soit placé dans le thermocycler. Les cycles d’amplification, adaptés aux amorces TBR se composent d’une minute de dénaturation initiale de l’ADN à 94°C, puis : 30 secondes de dénaturation, toujours à 94°C, 60 secondes d’hybridation à 60°C, et 30 secondes d’élongation à 72°C, se répètent trente fois. Lors du dernier cycle, l’extension est prolongée de deux minutes, afin de parachever les synthèses d’ADN en cours. Il convient maintenant de visualiser la taille de fragments amplifiés grâce à l’électrophorèse. La migration des produits de PCR se déroule sur un gel d’agarose (Agarose D1 Low EEO, Pronadisa ®, Conda, Madrid, Spain) à 2,5%, dans un tampon de TBE (1M Tris base, 1M acide borique, 20mM EDTA pH 8,3) sous une tension de 100V, entre 40 et 70 minutes, selon la taille du gel employé. 8µl de produit de PCR mélangé à 1,5µl de tampon de charge, sont placés dans les puits. Sur chaque gel, en plus des produits amplifiés, deux marqueurs de poids moléculaire (5µl), deux témoins positifs et un témoin négatif permettront d’interpréter correctement le résultat. Après 5 minutes de bain dans une solution de bromure d’éthidium (10mg/ml), suivies de 10 minutes de rinçage à l’eau, la révélation est réalisée par photographie du gel sur un banc à U.V (λ=320nm, DyNA Light®, Labnet, New Jersey, U.S.A).

1.2.6. Inoculation à des rongeurs Elle est pratiquée lorsque des trypanosomes sont observés par MHCT, en vue de conserver la souche, et d’éventuellement étudier sa chimiorésistance. Une souris reçoit 0,1-‐0,2 ml, alors qu’un rat peut recevoir jusqu’à 0,4 ml de sang EDTA, injecté par voie intra-‐péritonéale. Lorsque la parasitémie, évaluée par étalement d’une goutte de sang frais entre lame et lamelle, est importante (>60 parasites/champ, soit environ 400 000/ml) et dans la phase montante (afin d’éviter que la destruction des parasites ne soit initiée par le système immunitaire du rongeur, et ainsi assurer la bonne qualité du cryostable), l’animal est anesthésié au chloroforme et saigné par section d’un lobe pulmonaire. Le sang est alors récolté avec du citrate (1% du volume de sang), et un cryo-‐conservateur (PBS, additionné de glucose à 1%, et de glycérol à 15%), puis réparti dans plusieurs tubes de 2ml. Le refroidissement se fait en plaçant l’échantillon enveloppé d’un linge à -‐80°C pendant une nuit, puis le lendemain dans l’azote liquide à -‐195,79°C.

1.3. Analyse géographique Le logiciel gvSIG 1.11.0 a servi à la représentation des effectifs d’animaux selon les provinces, ainsi qu’à la localisation de l’origine des prélèvements ; les cartes administratives de la Thaïlande proviennent du site www.diva-‐gis.org et ont été projetées en WGS 84 UTM zone 47N.

60

2. Résultats Les résultats obtenus sont répertoriés dans les tableaux I et II et les pourcentages de prévalence sont assortis de leur intervalle de confiance (IC) à 95%, soit un risque d’erreur α de 5% (Toma et al. 2001) :

IC 95% = p ± 2 σ où σ = √ (pq/n) p : proportion estimée q : complément à 1 de la proportion n : nombre d’individus dans l’échantillon

Les prévalences d’infections actives correspondent aux animaux retrouvés positifs en PCR, puisque suite à un traitement stérilisant, la PCR ne reste positive que 24 à 48h, comme cela a été démontré pour T. vivax (Desquesnes 1997a). Les prévalences globales pour chaque test ont été calculées sur la totalité de l’échantillon.

Zone « Sud »

Zone « Nord-‐Est »

Zone « Ouest »

Total Prévalence globale pour chaque test

Population totale 255 782 196 1233 Échantillon 161 282 17 460 MHCT N.R. N.R. N.R.

CATT/T. evansi 9 26 13 48 10,4 ± 2,9% ELISA 6 0 8 14 3,0 ± 1,6 % PCR 11 0 14 25 5,4 ± 2,1%

Prévalence infections actives

6,8 ± 4,0%

0 82 ± 18% 5,4 ± 2,1%

Zone « Nord »

Zone « Est »

Zone « Ouest »

Total Prévalences globales pour chaque test

Population totale 634 1338 197 2169 Échantillon 86 129 114 329 MHCT 0 0 N.R.

CATT/T. evansi 0 0 5 5 1,5 ± 1,2% ELI SA

Protéine A 1 1 6 8 2,4 ± 1,7% Protéine G 0 0 0 0 PCR 0 0 4 4 1,2 ± 1,2%

Prévalence infections actives

0 0 3,5 ± 3,4% 1,2 ± 1,2%

Tableau I Résultats des tests diagnostiques chez les chevaux échantillonnés donnés en nombre d’animaux positifs pour chaque test et en pourcentages de prévalence globale et par zone ; zone “Sud” : provinces de Nakhon Si Thammarat, Surat Thani, Phuket, Ranong et Yala ; zone “Nord-‐Est” : provinces de Nakhon Ratchasima, Buri Ram, Sa Kaeo, Prachin Buri, Nakhon Nayok, Saraburi, Lop Buri et Chaiyaphum ; zone « Ouest » : province de Ratchaburi ; N.R : non réalisé.

Tableau II Résultats des tests diagnostiques chez les éléphants échantillonnés, donnés en nombre d’animaux positifs pour chaque test et en pourcentages de prévalence globale et par zone ; zone « Nord » : provinces de Chiang Mai, Chiang Rai et Mae Hong Son ; zone « Est » : provinces de Surin et Buri Ram ; zone « Ouest » : province de Kanchanaburi ; N.R : non réalisé.

61

2.1. Échantillons d’éléphants Parmi les échantillons prélevés courant 2010, dans la zone « Est », aucun ne s’est révélé positif, que ce soit par la technique de Woo, le CATT/T. evansi, ou la PCR, et un seul était positif en ELISA protéine A. Les 86 échantillons prélevés dans le nord de la Thaïlande lors des campagnes du DLD et du FIO, fin mars 2011, se sont tous avérés négatifs, hormis un positif en ELISA protéine A. La série de prélèvements provenant de la province de Kanchanaburi, a quant à elle donné quelques résultats positifs : cinq éléphants positifs en CATT/T. evansi, six en ELISA protéine A (dont trois ont finalement servi de témoins positifs) et quatre en PCR. Le vétérinaire ayant fourni ces échantillons a donc été contacté, afin de prélever à nouveau du sang sur ces animaux, ainsi que tous ceux du troupeau. Et une proposition de traitement au Cymelarsan 0,2mg/kg a été faite, dans l’optique d’évaluer ce produit chez les éléphants. Elle est restée sans réponse jusqu’à présent.

2.2. Échantillons de chevaux Les chevaux de course prélevés à l’hippodrome de Bangkok en 2010, étaient tous négatifs à l’issue de l’examen direct du sang par MHCT et de l’ELISA. Vingt-‐six animaux étaient positifs en CATT/T. evansi, mais les résultats de la PCR n’ont pas confirmé l’infection. Les prélèvements des provinces du Sud de la Thaïlande, regroupaient 9 animaux positifs en CATT/T. evansi, 6 en ELISA et 11 en PCR. Alors que parmi les 17 chevaux du foyer de Ratchaburi, 13 étaient positifs en CATT/T. evansi, 8 en ELISA et 14 en PCR.

3. Discussion

3.1. Échantillonnage Précision de l’échantillonnage : Le nombre de prélèvements nécessaire à l’estimation de la prévalence du Surra chez les éléphants avec une précision relative de 40% a été atteint (329 pour 319). Il en va de même pour l’enquête chevaux : 460 pour 384. Par contre, les séroprévalences obtenues avec le CATT/T. evansi respectivement chez les chevaux et chez les éléphants sont de 7,9 ± 2,6% (si l’on exclue les échantillons de la province de Ratchaburi, car nous ne disposons que des chevaux prélevés au sein du foyer, ce qui fausserait la prévalence) et de 1,5 ± 1,2%, ce qui ne correspond pas aux 20% et 7% attendus. Le taux de sondage de ces enquêtes n’a donc pas été suffisant, puisqu’avec des prévalences aussi faibles, pour conserver les mêmes précisions relatives (respectivement 20 et 40%), le même risque (5%), il aurait été nécessaire de prélever 1104 chevaux et 1576 éléphants sur tout le pays.

Exactitude de l’échantillonnage : La représentativité globale d’un échantillon sélectionné sur une population est assurée en pratique par un tirage au sort des individus. Cela aurait donc impliqué un échantillonnage à deux degrés, le premier degré étant les camps d’éléphants ou élevages de chevaux, et le second les animaux. Ainsi, dans chaque province un certain nombre de fermes auraient été sélectionnées au hasard, et au sein de chaque ferme le nombre d’animaux prélevés aurait été fonction de la taille de la ferme. Il fallait par ailleurs s’assurer que le nombre d’individus prélevés dans chaque province était proportionnel au nombre présent dans chaque province. Or, dans notre cas, cela n’a pas été envisageable, ni pour les chevaux ni pour les éléphants.

Prenons les exemples des provinces d’où proviennent la majorité de nos échantillons d’éléphants afin de voir si cet objectif de représentativité géographique de la population a été atteint. À Surin, 1062 éléphants ont été recensés en 2011, sur les 4016 éléphants domestiques vivant en Thaïlande cette année là : 1062 x 319/4016 = 85 éléphants auraient donc dû être prélevés dans cette province. À Chiang Mai, l’effectif

62

d’éléphants domestiques est de 497, l’échantillon d’éléphants étudié aurait dû comporter 40 individus. Dans la province de Kanchanaburi, possédant 197 éléphants, 16 échantillons auraient été nécessaires. Or 117, 44 et 114 échantillons ont été prélevés respectivement dans les provinces de Surin et Chiang Mai et Kanchanaburi (fig 13). Dans l’échantillon étudié, certaines zones sont donc surreprésentées alors que d’autres ne le sont pas du tout.

Cela est dû aux modalités d’échantillonnage qui nous ont été imposées. Nous devions suivre, sur une période de seulement six mois, les équipes mobiles des hôpitaux pour éléphants qui se rendent deux fois par an dans tous les camps d’éléphants de Thaïlande, nous n’allions donc pas couvrir la totalité des camps. De plus, le choix des animaux reste biaisé puisque dans les camps, tous les éléphants n’étaient évidemment pas échantillonnés, et plutôt que de dépendre de la taille de l’exploitation, le nombre d’échantillons collectés dépendait plutôt du nombre d’animaux malades ou nouvellement introduits dans l’exploitation (prélevés en priorité). Ces animaux ayant subi un stress, ils étaient plus susceptibles de développer la maladie, et de ce fait, la prévalence aurait été surestimée.

D’autre part, pour ce qui est des échantillons d’éléphants provenant de Kanchanaburi, très peu d’informations nous avaient été fournies, nous ne connaissons donc ni l’âge ni le sexe, ni les éventuels signes cliniques ni les modalités d’échantillonnage de ces animaux. La décision de traitement sera plus délicate à faire adopter au propriétaire si les éléphants sont asymptomatiques. Mais si l’on veut éviter toute propagation du parasite à d’autres animaux, un traitement stérilisant systématique de tous les animaux des troupeaux infectés (ie contenant au moins un animal avec une infection active) est nécessaire.

Concernant les échantillons de chevaux, leur répartition géographique ne permet pas de représenter fidèlement la population équine de Thaïlande, puisqu’ils ne proviennent que de trois zones, dans lesquelles le taux de sondage a été suffisant, alors qu’il a été nul dans tout le reste de la Thaïlande (fig 14). Par exemple, dans la zone « Est » du pays, 282 échantillons ont été prélevés, alors que 55 animaux auraient suffi, proportionnellement à la population de cette zone (cf. Annexe 5). Les chevaux de course ne constituaient pas non plus une image exacte de la population de chevaux de l’est de la Thaïlande, puisqu’ils n’ont pas été tirés de manière aléatoire. Il s’agit d’animaux à forte valeur économique, donc très bien traités, en très bon état général, et vivant dans des endroits où les conditions sanitaires sont contrôlées et la pression vectorielle est moins importante. La probabilité qu’un cheval atteint de trypanosomose soit envoyé courir une course à Bangkok est par conséquent très limitée, alors que les chevaux de loisir sont plus à risque puisqu’en contact avec des espèces « réservoirs » de T. evansi.

Il aurait donc été plus judicieux de considérer ces échantillons de la zone « Nord-‐Est » et de la zone « Sud » comme deux enquêtes distinctes étant donné les différences d’environnement, et donc de prélever 384 échantillons dans chaque zone. Les conclusions seraient donc : une estimation de la prévalence d’infections actives dans la zone « Sud » de 5,6 ± 1,8%, à laquelle une précision relative de 63% seulement pourrait être attribuée (du fait d’un nombre d’échantillons inférieur) ; l’intervalle de confiance à 95% des 0% de prévalence d’infections actives dans la zone « Nord-‐Est » serait alors [0 ; 1,19%] en fonction du nombre d’échantillons prélevés dans cette zone (Toma et al. 2001). Alors que pour la zone « Ouest », la prévalence du Surra obtenue de 82 ± 18%, est bien évidemment surestimée, puisque nous ne disposons pas d’échantillons de sang de chevaux en dehors du foyer. Ainsi les résultats de prévalence globale obtenus n’ont pas beaucoup de valeur !

63

Que ce soit pour les éléphants ou pour les chevaux, il aurait également fallu veiller à ce que l’échantillonnage respecte l’organisation de la population et que le nombre d’individus de chaque classe d’âge dans notre échantillon soit représentatif des proportions réelles, étant donné la corrélation entre l’âge et la séropositivité envers T. evansi.

3.2. Réalisation des prélèvements Même si cela était prévu dans notre protocole, lorsque l’éléphant était particulièrement récalcitrant à la manipulation, nous ne parvenions pas toujours à avoir suffisamment de sang pour le partager entre l’équipe du DLD et notre équipe. Nous ne disposions donc parfois que d’un prélèvement sur tube sec, l’extraction d’ADN parasitaire précédant la PCR était alors réalisée à partir du caillot sanguin, méthode moins efficace comparée à l’extraction à partir du buffy coat. Lorsque nous ne pouvions nous procurer que du sang en tube EDTA, les tests sérologiques étaient réalisés sur plasma. Cela ne correspondait pas aux protocoles habituels, mais le plasma s’avère tout de même un bon substrat pour la réalisation de certains tests ELISA (Cherpes et al. 2003). Quand nous n’étions pas présents lors de la récolte des échantillons, et que ces derniers nous étaient expédiés, nous ne travaillions que sur sérum, et en cas de positivité des tests sérologiques, la confirmation du statut actif de l’infection se faisait par PCR, après traitement du culot de sérum au chelex 100 Sodium Form ® (Sigma-‐Aldrich, St Louis, USA). Il fallait alors envisager de prélever à nouveau l’animal pour isoler la souche du parasite.

3.3. Choix et interprétation des tests Micro hæmatocrit centrifugation technique : Elle a été retenue pour cette étude, car bien qu’elle se soit avérée de sensibilité inférieure à l’inoculation à des rongeurs, (Monzón et al. 1990), elle est facilement réalisable sur le terrain et permet un diagnostic rapide des animaux fortement positifs, qu’il faut traiter rapidement et/ou isoler. Et d’après les mêmes auteurs, l’observation de deux tubes de chaque échantillon pallierait ce manque de sensibilité.

Card agglutination Test for Trypanosomiasis due to T. evansi : Selon les auteurs, les espèces animales testées, et le but de l’étude, le CATT/T. evansi est plus ou moins apprécié. Ainsi pour les porcs, il ne serait pas adapté aux enquêtes de séroprévalence, puisque sa sensibilité et sa spécificité diminuent rapidement après l’infection, et que l’utilisation de moindres dilutions n’améliore pas la détection des animaux infectés (Holland et al. 2005). Et même en cas d’infections expérimentales, il ne détecterait pas toujours les animaux atteints (Leboucher 2009). Par contre, chez les chèvres, Gutierrez et al. (2004) l’utilisent sans problème. Hilali et al. (2004) mettent en garde sur le fait que la négativation du CATT/T. evansi ne signifie pas l’absence d’anticorps contre d’autres antigènes spécifiques de T. evansi. De la même manière, certaines souches de parasites, pourraient avoir perdu le gène codant le VSG RoTat 1.2 et apparaître ainsi négatives en CATT/T. evansi, mais de telles souches n’ont pas été identifiées en Asie. Quant aux réactions croisées observées chez les chevaux atteints de dourine, elles ne sont pas non plus problématiques : d’une part la maladie n’a pas été reportée chez les éléphants, et d’autre part chez les chevaux, la clinique et le mode de transmission de la maladie sont bien différents de ceux du Surra (Claes et al. 2005). Dans tous les cas le CATT/T. evansi possède un avantage non négligeable comparé aux tests de fixation du complément par exemple, il est réalisable sur le terrain et permet de comparer l’agglutination des sérums d’animaux obtenue dans différents pays, car l’antigène utilisé est standardisé. Cependant, sa lecture reste dépendante de l’opérateur.

64

Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay : C’est un test sérologique indirect plus sensible que le CATT/T. evansi, car le réactif utilisé comprend des antigènes somatiques constants de T. evansi à la différence du CATT/T. evansi. De plus, si la population de parasite utilisée pour la fabrication d’antigène n’est pas issue d’un clone, elle contient potentiellement différents VAT, ce qui aboutit à un antigène hétérologue, améliorant encore la sensibilité du test (Reyna-‐Bello et al. 1998). C’est pourquoi il est plus adapté aux enquêtes de prévalence, mais sa sensibilité n’est pas suffisante pour qu’il soit utilisé dans le cadre de programme d’épidémio-‐vigilance (ce qui n’est pas notre cas). Par ailleurs, le CATT/T. evansi et l’ELISA indirecte ne font pas redondance puisque les anticorps mis en évidence ne sont pas les mêmes. Ainsi un CATT/T. evansi positif accompagné d’une ELISA négative, signera une circulation du parasite relativement récente, alors que dans le cas contraire, le parasite sera présent depuis plus longtemps et la situation donc plus stable.

Plus particulièrement pour les chevaux, nous disposions de témoins positifs et d’une population négative de référence : les chevaux de course, un seuil de positivité a donc été déterminé à 19% pour cette espèce.

COV = Σ (DOpopulation négative de référence) + 3σ où σ : écart type Effectif population négative de référence COV : « Cut off value » (Desquesnes 1997b)

En ce qui concerne les tests ELISA des éléphants, par manque de conjugué anti Ig G spécifique à cette espèce, il a fallu faire appel aux protéines A et G conjugués à la peroxydase. Ces conjugués se lient spécifiquement à la fraction constante des immunoglobulines de mammifères (Bhide et al. 2004), et se sont montrés efficaces pour le diagnostic sérologique de plusieurs maladies et dans plusieurs espèces, notamment chez le porc pour T. evansi (Tuntasuvan et al. 1996). La validation de ces deux tests pour les éléphants, aurait dû être effectuée, mais cela n’a pas été possible, par manque de population positive de référence… La sensibilité de ce test s’en est donc trouvée diminuée. Les six éléphants de Kanchanaburi à forte DO en ELISA-‐protéine A ne sont apparus qu’à la fin de l’étude, si bien que pour tous les échantillons précédemment analysés, il n’y avait pas de témoin positif permettant d’exprimer les résultats en RPP, ils étaient donc exprimés en densité optique. Il a donc fallu tester à nouveau tous les éléphants, en ajoutant sur chaque plaque les sera des trois éléphants positifs choisis comme témoins positifs. Un seuil de positivité a alors été défini à 15%, selon la formule indiquée ci dessus, avec comme population négative de référence la totalité des échantillons auxquels les animaux de DO > 65nm avaient été retirés.

Ces six animaux n’ont donné de résultats positifs qu’avec le protocole ELISA utilisant la protéine A, la question est pourquoi ! D’après Bhide et al. (2004), l’affinité des protéines G et A envers les différentes espèces de mammifères sauvages pour lesquels elles sont principalement employées, varient selon l’espèce, il pourrait donc y avoir une différence d’affinité pour les Ig G des éléphants entre la protéine A et la protéine G. Une autre explication de l’échec du protocole ELISA pourrait être une trop forte concentration du « blocking buffer » qui ne laisserait plus aucun site de liaison disponible pour l’anticorps secondaire, mais dans ce cas, pourquoi y aurait-‐ il une différence entre la protéine A et la protéine G ?

Polymerase Chain Reaction : Ces amorces sont aujourd’hui considérées comme le « gold standard » en matière de diagnostic moléculaire des trypanosomes du genre Trypanozoon. Elles peuvent en effet détecter jusqu’à 0,01pg d’ADN parasitaire, sachant que l’ADN total d’un parasite est estimé à 0,075pg, du fait qu’elles sont complémentaires

65

d’une séquence hautement répétitive (10-‐20000 copies) (Pruvot et al. 2010). Ces amorces sont spécifiques du genre Trypanozoon, or les seuls représentants du genre Trypanozoon présents en Asie sont T. evansi et T. equiperdum, ce dernier n’atteignant pas les éléphants, et possédant chez les chevaux, des manifestations cliniques et un mode de transmission distincts. Mais les risques de confusion existent puisque des réactions croisées sont observées, y compris avec les tests sérologiques tels le CATT/T. evansi (Claes et al. 2005).

Par ailleurs, il faut savoir que l’interprétation diffère selon l’état physiologique de l’animal : selon son âge en particulier (Greiner et al. 1997). En effet plus un animal est âgé, plus grandes sont ses chances d’avoir rencontré le parasite et donc d’avoir développé une réponse anticorps spécifique. Ainsi, après traitement ou guérison spontanée, les animaux peuvent encore apparaître positifs en ELISA, ce sont des faux positifs puisque chez eux, l’infection n’est pas active, comme le témoigne une PCR négative, ou bien des animaux en phase chronique, avec une parasitémie très basse, ou encore des animaux chez lesquels les trypanosomoses sont en position extravasculaire (Van den Bossche et al. 2000, Monzon et al. 2003). C’est pourquoi nous avons fait le choix d’associer aux méthodes sérologiques, cette technique de diagnostic parasitologique très sensible.

La PCR n’a pourtant pas toujours été réalisée : lorsque nous n’avions que le sérum à disposition, nous ne la faisions que si l’animal était positif en CATT et/ou ELISA, ce qui a été le cas pour les échantillons d’éléphants de Kanchanaburi, et ceux de chevaux des régions du Sud échantillonnés par le DLD En ce qui concerne les chevaux de course, la PCR n’a été faite que dans les cas cités précédemment, car s’agissant de chevaux de course la probabilité qu’ils soient infectés nous avait paru moins élevée.

Frottis colorés et inoculation à des rongeurs : Les frottis n’ont pas été utilisés à des fins de diagnostic, car la sensibilité de ce test est faible. Cependant ils rendent possible l’identification visuelle des espèces de trypanosomes contrairement aux autres tests d’examination directe des parasites (étalement de sang frais entre lame et lamelle, Techniques de Murray et de Woo), pour lesquels les parasites sont encore vivants et mobiles, donc difficilement reconnaissables (Monzón et al. 1990). Dans notre étude, l’identification du parasite était réalisée de façon certaine avec la PCR-‐TBR. Les frottis permettaient donc uniquement de conserver une trace de l’aspect de la souche de parasite isolée. La technique d’inoculation à des rongeurs n’avait pas non plus de visée diagnostique, mais plutôt la conservation et la multiplication de la souche : du terrain jusqu’au laboratoire sur animal vivant, et à plus long terme sous forme de cryostable.

3.4. Confrontation des différents tests et définition du cas La concordance entre les différents tests n’a pas été indiquée dans les résultats : un animal positif en ELISA n’était pas forcément positif en PCR ou en CATT et inversement, comme indiqué dans les tableaux III et IV.

Nombre d’éléphants CATT/T. evansi ELISA protéine A PCR

5 0 1 0

3 1 1 0

2 0 0 1

2 1 0 1

Tableau III Comparaison des résultats de CATT/T. evansi, ELISA protéine A et PCR-‐TBR des éléphants présentant au moins un résultat positif à un des tests

66

Nombre de chevaux CATT/T. evansi ELISA protéine A PCR

28 1 0 0

11 1 1 1

4 1 0 1

2 1 1 0

1 0 1 1

Ce phénomène est à relier à la signification des tests : le CATT, l’ELISA et la PCR mettent respectivement en évidence des Ig M, Ig G et ADN. La détection des Ig M précède celle des Ig G au début de l'infection, puis, comme la PCR, le CATT devient irrégulièrement positif au cours de l'infection (en fonction des vagues parasitémiques et du fait que les Ig M sont consommées sous la forme d'immuns complexes), alors que le suivi quotidien des Ig G montre une grande stabilité.

Avoir une PCR positive et un CATT négatif n’est pas anormal et correspond à une infection extrêmement récente, puisque le système immunitaire de l’hôte n’a pas encore synthétisé d’Ig M. Une ELISA positive seule équivaut à une infection plus ancienne, les Ig M ayant été consommées, et le parasite éliminé du courant sanguin grâce à un traitement ou par « self-‐cure ».

Certains résultats sont tout de même à relever car ils semblent aberrants : PCR négative et CATT positif pour un même animal par exemple. Ils témoignent soit d’un défaut de spécificité du CATT, hypothèse qui peut être écartée puisque seules des réactions croisées avec la dourine ont été rapportées, maladie différenciable du Surra par sa clinique et son mode de transmission. Ils peuvent également être dus à un défaut de sensibilité de la PCR, dont l’intensité des bandes suit les vagues parasitémiques de l’hôte, et qui peut donner un résultat négatif chez un animal infecté en période de rémission entre deux épisodes fiévreux.

Même si dans le cadre des études chevaux et éléphants, aucun animal n’a été détecté positif par la technique de Woo, la positivité de ce test implique forcément la positivité de la PCR, et généralement du CATT. De cette façon, estimer la sensibilité et la spécificité du CATT et de l’ELISA par rapport à un test de référence que serait la PCR n’apporterait rien, puisque le statut des animaux (infection récente ou ancienne) n’est pas connu, d’où l’importance des commémoratifs cliniques et thérapeutiques. Il conviendrait donc de réaliser ces mesures de sensibilité et spécificité sur des troupeaux expérimentalement infectés, dont le stade d’infection est connu.

Ainsi cela n’a pas vraiment de sens de confronter les résultats des différents tests, sauf lorsqu’un suivi longitudinal des animaux est réalisé, ce qui n’a pas été notre cas. En conséquence, un cas n’a pas été défini par une PCR, une ELISA ou un CATT positif, puisque cela dépend de ce que l’on veut évaluer : les infections actives, la circulation ancienne ou récente du parasite.

Tableau IV Comparaison des résultats de CATT/T. evansi, ELISA protéine A et PCR-‐TBR des chevaux présentant au moins un résultat positif à un des tests

67

3.5. Analyses statistiques Étant donné le faible nombre de positifs, il ne serait pas très judicieux de vouloir comparer l’âge moyen ou l’hématocrite des animaux infectés et non infectés, d’autant plus que les échantillons positifs font partie de prélèvements que nous n’avons pas eu la chance d’aller collecter nous mêmes, nous ne disposons donc pas des valeurs d’hématocrite. De plus, pour les éléphants de la province de Kanchanaburi, les âges ne nous ont pas été communiqués. L’« effet troupeau » est fréquemment observé lors d’infections à T. evansi, puisque les animaux élevés à proximité ont toutes les chances de se faire infecter si la pression des insectes est suffisante. Cependant, si c’est ce que l’on observe au sein du foyer mixte de la province de Surat Thani (cf. IV) et du foyer chez les chevaux de la province de Ratchaburi, ce n’est pas le cas chez les éléphants, où les neuf positifs (PCR, CATT et ELISA confondus) proviennent de six élevages différents séparés de plus de 10 km.

3.6. Remise dans le contexte… Même si les prévalences obtenues sont beaucoup plus faibles qu’attendues, que ce soit dans le cas de chevaux ou celui des éléphants, cette étude confirme que le parasite circule bien sur le territoire thaïlandais, que ce soit parmi les bovins, les chevaux ou les éléphants (cf. Annexe 6). Ainsi les éléphants positifs de la province de Kanchanaburi, ne sont pas la seule espèce atteinte. En effet ils proviennent en partie du sous-‐district de Sai Yok où une étude de prévalence du Surra a été réalisée sur 91 bovins, dévoilant un fort taux d’infections actives : 46% ± 15%, mais aucun signe clinique rapporté par les éleveurs ou relevé par le vétérinaire du DLD (résultats non publiés). Dans cette zone, les troupeaux bovins sont élevés en liberté, et se retrouvent mélangés sur les pâtures. Il est donc raisonnable de supposer que les éléphants aient pu être en contact avec ces bovins, potentiels réservoirs, et que les insectes hématophages présents se soient chargés de la transmission. La preuve de cette circulation inter-‐espèce a aussi été apportée par le foyer de Surra chez les cinq éléphants de Nakhon Si Thammarat. Il en va de même pour les chevaux positifs détectés dans le Sud, qui sont probablement entourés d’espèces « réservoir » (bovins, buffles). Une étude récente de la prévalence sérologique du Surra sur 1500 bovins des provinces de Surat Thani et voisines a mis en évidence des animaux positifs en ELISA (résultats non publiés) De plus une autre étude chez les buffles et dans la province de Songkhla cette fois-‐ci (extrême sud de la péninsule) évaluait la prévalence du Surra à 23% (Leboucher 2009).

Si l’on se concentre sur les cas les plus récents de Surra en Thaïlande, il semblerait qu’ils se concentrent plutôt dans la partie sud de la Thaïlande. De plus il est désormais reconnu que le Surra présente ici une occurrence saisonnière, les plus fortes prévalences coïncident avec le pic d’activité des insectes vecteurs (Tuntasuvan & Luckins 1998). C’est entre la fin de la saison des pluies et le début de l’hiver (août -‐ février), que les conditions climatiques sont le plus favorables au développement des populations d’insectes. Dans notre étude, les dates de prélèvements sont assez variées, elle s’étendent entre juin 2010 et août 2011, il est donc difficile de conclure à une sur-‐ ou sous-‐estimation de la prévalence obtenue. Mais nous pouvons tout de même supposer qu’en plus de suivre les variations saisonnières, la population de vecteurs présente des variations géographiques, étant plus présentes là où leurs conditions de développement sont réunies sur la plus longue période. De cette façon, le sud de la Thaïlande, avec ses pluies plus prononcées, ses fréquentes et récentes inondations, a pu héberger des densités importantes d’insectes hématophages, d’où la plus grande occurrence de cas de trypanosomose à T. evansi dans le sud du pays.

69

II. Étude d’un foyer de Surra dans un élevage mixte

1. Anamnèse du foyer En janvier 2011, un bovin originaire du centre de la Thaïlande a été introduit sur l’exploitation. En mars, le manager détectait chez les chevaux les premiers signes cliniques qui pouvaient être dus au Surra, à savoir : amaigrissement, hémoglobinurie (urines marc de café), poil piqué, et œdème ventral (fig 15). Suite à quoi des échantillons de sang de chevaux et de bovins furent analysés par la technique de Woo au bureau du DLD local, courant avril, confirmant l’infection par T. evansi chez deux chevaux et deux bovins. Seuls les chevaux furent traités au Bérénil ® 3,5 mg/kg (les aiguilles sont changées entre chaque animal), d’où une rapide régression des signes, puis 7 mg/kg à deux reprises (avril et mai), du fait de la régulière réapparition de signes cliniques. Début mai, le bovin importé en janvier a présenté de la prostration et de l’hémoglobinurie (fig 16), d’où l’administration de Bérénil ® 7mg/kg. Début juin, un cheval préalablement traité trois fois, a eu des manifestations cliniques plus prononcées : œdème ventral, hémoglobinurie, parésie des postérieurs et décubitus prolongé, il reçoit à nouveau du Bérénil ® à 7mg/kg (cf. annexe 7). Depuis l’apparition des premiers symptômes de Surra, seules quelques chèvres ont été vendues, mais aucun bovin, ce qui limite nettement le risque de sortie du parasite de la palmeraie, puisque les chèvres sont moins fréquemment porteuses du parasite.

2. Matériel et méthode

2.1. Echantillonnage et prélèvements Tous les animaux présents sur l’élevage étaient censés être prélevés lors de notre visite. À cette occasion et pour les besoins du suivi du foyer, les chèvres recevront un collier numéroté, les chevaux et les bovins seront marqués d’un numéro au spray sur la croupe, même si la majorité de ces derniers portent une boucle à l’oreille. Pour la réalisation des tests diagnostiques T. evansi, le sang est divisé entre tube sec et tube EDTA. Tous les animaux sont prélevés à la veine jugulaire.

2.2. Méthodes de diagnostic La MHCT, le CATT, l’ELISA et la PCR sont réalisés conformément aux protocoles décrits préalablement.

Figure 16 Zébu à oreilles tombantes trypanosomé et cachectique à Surat Thani (original)

Figure 15 Cachexie et abattement sur un cheval atteint de Surra à Surat Thani

70

MHCT : En cas de positivité du test, la parasitémie est quantifiée par examen direct d’une goutte de sang frais entre lame et lamelle, afin d’estimer le risque de transmission à partir de l’animal infecté, puisque l’incidence journalière de nouvelles infections est proportionnelle à la parasitémie quotidienne totale des animaux infectés (Desquesnes et al. 2009). Du sang infecté de ces animaux est injecté à une souris afin de pouvoir ultérieurement isoler, conserver et caractériser la sensibilité au traitement de la souche.

ELISA : Pour mettre en évidence les anticorps anti trypanosomes des bovins, nous disposions d’un conjugué anti immunoglobulines de bovin -‐ Peroxydase (A 5295 Sigma ®), utilisé à la dilution 1 : 20 000 (dilution recommandée par le fabricant). Pour ce qui est des chèvres, un conjugué spécifique des caprins et ovins a été commandé pour le suivi du foyer, il s’agit d’anticorps de lapin anti caprins, conjugués à la peroxydase (A5420 Sigma ®). Les onze chevaux ont été testés avec un conjugué anti immunoglobulines de chevaux couplé à la peroxydase (A6917 Sigma ®) à la dilution 1 : 10 000 dans du blocking buffer.

PCR : L’extraction d’ADN est réalisée selon le protocole classique d’extraction au Phénol-‐Chloroforme pour les échantillons de bovins et de chevaux, alors que pour les chèvres, les échantillons sont traités au Chelex 100 Sodium Form ® (Sigma-‐Aldrich, St Louis, USA) (cf. Annexe 8), ce qui permet un gain de temps (protocole réalisable en une demi journée), mais implique une moins bonne conservation de l’ADN ainsi traité.

2.3. Piégeage d’insectes Un piège Vavoua est placé à proximité des bâtiments des chèvres, et deux Nzi sont placés à proximité des enclos des chevaux et des bovins (fig 11). Ils sont relevés matin et soir, et les insectes ne seront conservés que le dernier jour pour éventuellement alimenter un élevage de stomoxes.

2.4. Analyses statistiques Les résultats sont donnés, assortis de leur intervalle de confiance à 95%, comme c’était le cas dans la partie précédente.

Afin de comparer les valeurs d’hématocrite et d’âge sur les groupes de bovins infectés et d’animaux non infectés (ELISA respectivement positive et négative), le test non paramétrique de comparaison de médianes de Wilcoxon sera employé, car il ne nécessite pas que la distribution des variables suive une loi normale, ni que les variances sur les deux groupes soient égales et peut s’appliquer sur de petits échantillons, comme c’est la cas dans notre étude (Borsali 2010).

Le logiciel R 2.11 sera utilisé pour appliquer ce test.

3. Résultats L’ensemble des résultats diagnostiques obtenus sur les échantillons prélevés le 16 juin est consigné dans le tableau V.

MHCT CATT ELISA PCR Prévalence infections actives

Chevaux 4/11 5/11 6/11 10/11 91 %

Bovins 9/34 26/34 29/34 29/34 85 %

Chèvres & mouton 0/104 1/104 38/104 1/104 1 %

Tableau V Résultats des tests diagnostiques effectués sur les échantillons de chevaux, bovins et chèvres prélevés à Surat Thani, le 16 juin 2011 ; donnés en nombre d’animaux positifs sur nombre d’animaux testés ; prévalences données en pourcentage avec intervalle de confiance à 95% ; N.R : non réalisé.

71

3.1. Prélèvements Que ce soient les chèvres, les chevaux ou les bovins, aucun n’animal n’est habitué à être manipulé. La contention des bovins a notamment requis une main d’œuvre importante, et pourtant, au total 6 bovins se sont échappés pendant la campagne. Ils seront échantillonnés à nouveau la semaine suivante, lors d’une visite de suivi. Les chevaux et les chèvres ont quant à eux pu être prélevés intégralement.

3.2. Examen direct : Méthode de Woo Quatre chevaux sont positifs par la méthode de micro-‐hématocrite centrifugation (MHCT). Un cheval présente une parasitémie très importante (10-‐15 trypanosomes par champs à X400, soit environ 80 000 parasites/ml de sang) et un hématocrite très bas (14%), la décision est prise de le traiter le jour même avec une injection intramusculaire de Bérénil ® 7% à 3,5 mg/kg (le poids de l’animal étant estimé à 200 kg) du fait du risque d’évolution fatale et rapide. Cette dose, délibérément faible, vise à ne pas provoquer une destruction immédiate de tous les parasites afin d’éviter une libération trop massive d’antigènes (risque de choc chez un animal en très mauvaise condition) ; un deuxième traitement à 7 mg/kg est programmé quelques jours après, pour compléter ce premier traitement et éliminer les parasites résiduels. Après l’injection, l’animal reste un peu prostré, ne mange pas, présente une hyperpnée, et ne se défend pas contre les nombreux insectes. Le lendemain, il est toujours en vie.

Au total 4 souris ont reçu des injections de sang de 3 chevaux parasités et 3 souris celui de 2 bovins parasités en vue d’isoler des souches parasitaires différentes. Concernant l’hématocrite moyen du troupeau de bovins, il s’élève à 29,44 +/-‐ 12,56, pour les chevaux il est de 34,91 +/-‐ 23,26, alors que celui du troupeau de chèvres est de 29,39 +/-‐ 9,22. Tandis que chez des animaux sains il se situe respectivement aux alentours de 35, entre 37 et 48, et vers 39, chez ces trois espèces.

3.3. Sérologie

3.3.1. CATT Le nombre de positifs, chez les chevaux, et les bovins, est bien supérieur à celui déterminé grâce à la technique de Woo, alors que seule une chèvre a présenté une forte agglutination.

3.3.2. ELISA Le nombre de bovins de chevaux et de chèvres positifs en ELISA est encore supérieur à celui des positifs en CATT.

3.4. PCR Une seule chèvre apparaît légèrement positive en PCR suite au traitement au Chelex ® du buffy coat. Son ADN, ainsi que celui de la chèvre positive en CATT, est donc extrait à partir du buffy coat, en suivant le protocole « phénol – chloroforme », qui aboutit à des échantillons plus riches en ADN. La PCR est alors fortement positive pour cet échantillon. La chèvre, détectée positive par la méthode CATT, reste négative malgré l’extraction au phénol – chloroforme, elle a tout de même été réceptive à l’infection, même si aucun parasite n’a pu être mis en évidence ce jour.

3.5. Piégeage Le piège Vavoua a permis de capturer principalement des stomoxes : S. calcitrans en grande majorité et S. indicus en petit nombre, alors que les Nzi ne capturent que quelques stomoxes mais beaucoup de Tabanidés : exclusivement de l’espèce Tabanus striatus. Le piège Nzi placé entre l’enclos des chevaux et celui des bovins s’est avéré moins productif (Densité apparente au piège par jour : 15 Tabanidés + stomoxes, contre

72

20 dans l’autre Nzi), cela pourrait être attribué à sa moins bonne visibilité. En effet il reste à l’ombre une partie de la journée, et n’est pas suffisamment orienté vers les bovins.

Hæmatobia spp. n’est retrouvée dans aucun des deux pièges, alors qu’elle est présente en grande quantité sur les bovins (sur leur bosse en particulier ; fig 17). Ce phénomène peut être attribué à la plus grande dépendance de cette espèce vis-‐à-‐vis de son hôte, elle est en effet localisée en quasi permanence sur l’hôte.

3.6. Analyses statistiques En ce qui concerne le troupeau de bovins, le test de Wilcoxon permet de conclure à une différence significative entre l’hématocrite moyen des bovins séropositifs et celui des séronégatifs. Il y a donc un effet de l’infection sur l’hématocrite, que l’on peut relier directement à la pathogénie des parasites dont l’adhésion aux globules rouges provoque la destruction de ces derniers par le système immunitaire de l’hôte. Aucune différence significative d’âge n’a pu être mise en évidence entre les groupes de bovins séropositifs et séronégatifs (fig 18).

>ht_pos=c(26,19,35,24,36,29,27,26,27,34,18,31,28,20,28,25,30,34,21,28,31,25,34,26,20,35,22,36) >ht_neg=c(37,38,38,40,38) > wilcox.test(ht_neg, ht_pos)

Wilcoxon rank sum test with continuity correction data: A and B, W = 140, p-‐value = 0.0004723 alternative hypothesis: true location shift is not equal to 0

> age_pos=c(15,15,3,14,10,0.5,4,10,4,10,10,10,10,13,12,13,10,11,11,4,8,7,7,6,10,12,8,7,0.5) > age_neg=c(15,0.5,0.6,0.5,6) > wilcox.test(age_pos,age_neg)

Wilcoxon rank sum test with continuity correction data: C and D, W = 38.5, p-‐value = 0.1004

Chez les chevaux le test de Wilcoxon n’a pas donné de différence significative d’âge ou d’hématocrite entre les groupes « infectés » et « non infectés » (selon les résultats du CATT/T. evansi). Ce phénomène pourrait être attribué au fait qu’il s’agisse d’un foyer total avec quasiment 100% de prévalence chez les espèces sensibles et dans

Figure 17 Forte densité d'Hematobia Spp. sur la bosse d'un bovin à Surat Thani (original)

Figure 18 Sortie R du test de Wilcoxon pour la comparaison de l'hématocrite et de l'âge chez les bovins infectés ou non

73

lequel la transmission mécanique a été extrêmement efficace. Habituellement, plus l’animal est âgé plus il a de chances d’avoir été infecté par un parasite et par la même occasion d’avoir développé des anticorps spécifiques, d’où sa positivité en ELISA. Il faut également savoir que les jeunes animaux sont nettement moins attractifs pour les insectes vecteurs que les adultes, puisqu’ils sont plus petits, produisent moins de CO2 et sont en quelque sorte protégés par les adultes (Foil et al. 1985). Cependant ces assertions ne restent valables que lorsque la prévalence de la maladie est faible, car dans le cas contraire, comme dans ce foyer, la totalité des individus tendent à être séropositifs, même les plus jeunes. De plus, l’hypothèse de transmission congénitale du parasite vient nuancer cette tendance, car dans ce cas, même les tout jeunes animaux sont détectés positifs (Loehr et al. 1986). Dans ce foyer, on peut tout de même remarquer que le seul cheval négatif en PCR est âgé de 4 mois.

3.7. Conduite à tenir

3.7.1. À court terme Dans un premier temps les animaux les plus fortement parasités devraient être traités au Bérénil ® demi dose, et isolés afin qu’il n’y ait plus d’échange de parasites avec le reste du troupeau. Puis tous les animaux, chèvres comprises, présents sur l’élevage seront traités avec du Bérénil ® à 7mg/kg, la semaine suivant notre venue (le 21 juin 2011), le temps pour la vétérinaire de l’élevage de rassembler les quantités de produit nécessaires. Un suivi est mis en place par l’équipe du DLD, incluant, un contrôle de la parasitémie par examen direct à 3 semaines après l’administration du traitement.

3.7.2. À long terme Le gérant devrait revoir sa politique d’importation d’animaux, et envisager un protocole : traitement puis quarantaine, avant d’introduire un nouvel animal dans ses troupeaux. Les applications d’insecticides sont à généraliser à toutes les espèces, et à renforcer en fréquence, afin d’au moins diminuer la pression vectorielle et de minimiser les pertes directes sur les animaux. Enfin la mise en place d’un système d’identification durable des animaux est à envisager pour permettre leur suivi.

3.8. Suivi effectivement réalisé par le DLD Les vaches non identifiées de manière pérenne vont l’être grâce à la pose d’une boucle auriculaire, dans la semaine suivant notre venue. Lors du traitement trypanocide des troupeaux, tous les bovins reçoivent également des antiparasitaires interne et externe (Cydectine Pour on Cattle ®). Les prises de sang manquantes sur les bovins échappés ont aussi été réalisées, avant l’administration du Bérénil ®, afin d’avoir des données sur l’infection ante -‐ traitement. Ces nouveaux échantillons, analysés uniquement par la technique de Woo, ont révélé quelques positifs. Le suivi de la parasitémie post-‐traitement a dû être avancé pour les chevaux car, selon le manager du camp, trois des onze chevaux ne répondaient pas au traitement, allant jusqu’à la mort de l’un d’eux. Ainsi l’équipe du DLD s’est rendue à la ferme le 08 juillet, date à laquelle seuls les chevaux ont pu être prélevés car les bovins divaguaient dans la palmeraie. La recherche de parasites par la technique de Woo s’est avérée positive pour quatre chevaux, la décision a donc été prise de traiter ses animaux en récidive, avec du Cymelarsan ® à 0,25mg/kg de poids vif, mais ils n’ont pu être séparés du reste du troupeau. Fin août, le DLD a effectué une seconde visite de suivi post traitement : 37 bovins et 9 chevaux ont été prélevés (2 chevaux et 3 bovins sont morts entre temps, un bovin s’est échappé), les échantillons ont été analysés par la technique de Woo, aucun parasite n’a été mis en évidence dans le sang de bovins, alors que cinq chevaux étaient positifs. Si l’état général du troupeau de bovins présentait une nette amélioration, ce n’était pas le cas des chevaux, qui restaient abattus et cachexiques.

74

4. Discussion L’identification des animaux a été relativement problématique dans la gestion de ce foyer : seule une partie des bovins possédaient une identification pérenne sous la forme d’une boucle d’oreille. Ainsi, lors de ses précédentes interventions, l’équipe du DLD avait dû mettre en place une identification temporaire : attribution de numéros aux chevaux, et spray sur le poil de l’animal. Malheureusement, plus personne, pas même l’éleveur n’était par la suite capable d’établir à nouveau la correspondance : cheval -‐ numéro. Pour les besoins du suivi des animaux, les nouveaux numéros attribués aux chevaux lors de notre passage, seront définitifs, et un dossier photographique permettra ultérieurement d’attribuer à chaque cheval son numéro.

L’isolement des animaux les plus parasités ou des animaux traités aurait été souhaitable. La séparation des animaux traités au Cymelarsan ® du reste du troupeau, a aussi été recommandée, afin d’éviter qu’ils ne se contaminent à nouveau. Cependant, l’élevage ne possédant que trois enclos très proches (un par espèce), une telle séparation n’a pu être mise en place.

Le traitement de toutes les chèvres peut être sujet à discussion. En effet, elles ont une faible réceptivité au parasite (2/103), quasi uniquement en cas d’infection expérimentale, elles ne sont pas sensibles en conditions naturelles (aucune manifestation clinique), et les parasitémies développées sont faibles. De plus elles présentent une faible attractivité pour les Tabanidés par rapport aux bovins ou aux chevaux : elles sont plus petites et plus réactives pour les chasser, et reçoivent donc moins de piqûres d’insectes contaminés. De ce fait, leur rôle dans l’épidémiologie du Surra est limité (Jacquiet et al. 1993). Cependant, du fait de leur survie à l’infection, des possibles localisations extravasculaires du parasite (liquide synovial, espace intra-‐péritonéal, liquide céphalo-‐rachidien, nœuds lymphatiques), l’hypothèse d’espèce réservoir ne peut être écartée (Gutierrez et al. 2006, Dargantes et al. 2005). Dans notre cas, étant donné les fortes parasitémies décelées chez les chevaux et les bovins, et le pâturage commun des animaux en présence de vecteurs, il apparaît hautement probable que des parasites aient été transmis à des chèvres au cours de cet épisode. D’autre part, nous nous trouvons ici dans une optique d’éradication du parasite de l’élevage, puisque ce dernier est suffisamment isolé, il faut donc éliminer toute source potentielle de parasite. L’attente des résultats de PCR avant de commencer le traitement exhaustif des troupeaux, aurait été trop longue, puisque plusieurs chevaux se trouvaient alors dans un état critique. De plus, même si les résultats avaient été négatifs, cela n’aurait pas prouvé le statut indemne du troupeau de chèvres (parasitémie fluctuante, défaut de sensibilité de la PCR). Elles auraient ainsi pu être une source de recontamination ultérieure !

Le traitement du buffy coat des chèvres au Chelex 100 Sodium Form ® a été choisi car son protocole est nettement plus rapide à réaliser que celui de l’extraction « phénol-‐chloroforme ». De plus, étant donné la faible réceptivité à T. evansi chez cette espèce, nous ne nous attendions pas à obtenir des résultats positifs, d’où cette décision, qui pourrait cependant nous être reprochée du fait d’un moindre rendement de cette technique. Pourtant de nombreux auteurs la considèrent comme efficace (Yang et al. 2008). Mais compte tenu de la différence de la taille de la bande obtenue après PCR et électrophorèse, entre le buffy coat de la chèvre positive traitée au Chelex ®, et celui extrait par la méthode classique « phénol – chloroforme » (fig 19 & 20), nous avons voulu vérifier si le traitement au Chelex ® était une source d’erreur de diagnostic, par défaut donc. Vingt et une chèvres ont été choisies au hasard dans le troupeau (Tirage d’un chiffre entre 1 et 9 pour la première chèvre sélectionnée, puis ajout de 5 unités en 5 unités pour le choix des 20 autres échantillons), et leur ADN a été extrait en suivant le protocole « phénol – chloroforme ». Les résultats de la PCR réalisée par la suite peuvent

75

être comparés à ceux obtenus avec les mêmes échantillons traités au Chelex ® : les 21 chèvres étaient toujours négatives en PCR, il n’a donc pas été nécessaires de ré-‐extraire l’ADN des 103 chèvres.

L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17

L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 L17

La résistance de la souche de T. evansi au Bérénil ® n’a pas pu être mise en évidence de prime abord puisque le troupeau de bovins, dont certains étaient positifs à l’examen du sang par la technique de Woo, n’avait pas été traité en même temps que les chevaux. Il était donc difficile de savoir si la persistance de l’infection chez les chevaux après plusieurs traitements au Bérénil ® était due à des résurgences ou des réinfections à partir des bovins. Nous avons finalement pu conclure suite à la réapparition de signes cliniques chez quatre chevaux qui étaient également positifs par la technique de Woo, après le traitement des trois troupeaux dans leur totalité : les parasitémies de ces animaux sont la preuve que la souche de parasite présente dans cet élevage est résistante au Bérénil ® à la dose utilisée, ou alors que cette molécule possède d’emblée une efficacité faible, sans pour autant qu’une sélection progressive de souches résistantes ait eu lieu. En effet, la palmeraie est isolée des autres fermes et aucune nouvelle introduction d’animal n’a eu lieu depuis le traitement exhaustif de tous les animaux, on peut donc éliminer l’hypothèse de recontamination.

Figure 20 Electrophorèse des produits de PCR après extraction d'ADN des chèvres au "phénol-‐chloroforme". L1, L17 marqueurs de poids moléculaire ; L2, L3 témoins positifs ; L4-‐L15 échantillons ; L16 témoin négatif ; L14 (chèvre infectée) positif fort

Figure 19 Electrophorèse des produits de PCR après traitement des échantillons des chèvres au Chelex ; L1, L17 marqueurs de poids moléculaire ; L2 L3 témoins positifs ; L4-‐L15 échantillons ; L16 témoin négatif ; L13 (chèvre infectée) positif faible

76

Le passage au Cymelarsan ® s’est donc avéré la solution la plus adaptée puisque nous disposions d’un stock de ce médicament, initialement destiné à l’évaluation chez les éléphants, et ce malgré le fait qu’il ne soit pas encore distribué sur le territoire thaïlandais. Ce médicament a été développé spécifiquement pour T. evansi, plus récemment que les autres trypanocides employés à l’heure actuelle, d’où la faible probabilité de l’existence de souches résistantes à la mélarsonine. Nous aurions également pu avoir recours une fois de plus au Bérénil ® à une dose supérieure de 8 mg/kg, recommandée par le fabricant en cas de résistances, mais cela ne nous a pas paru judicieux vu le nombre de tentatives de traitements qui avaient déjà été réalisées avec l’acéturate de diminazène. Il aurait tout de même été préférable de traiter tous les animaux présents sur l’exploitation au Cymelarsan ®, pour pouvoir conclure sur l’efficacité de ce traitement. En effet, même si seuls quatre chevaux ont été diagnostiqués infectés, des chèvres et des bovins pouvaient encore héberger le parasite et être sources de résurgences. Mais cette molécule n’étant pas distribuée en Thaïlande, elle ne peut être introduite qu’à des fins de recherche, et dans le cas de ce foyer les quantités de produit nécessaires sont trop importantes.

Le suivi post-‐traitement aurait pu être plus précis. En effet, il aurait été souhaitable de refaire un examen direct du sang du cheval fortement parasité et traité au Bérénil ® demi dose, au lendemain de l’administration, pour voir si une évolution de la parasitémie était déjà notable. Cela n’a pourtant pas été techniquement possible. Pareillement, tous les prélèvements réalisés après notre visite n’ont été analysés que par MHCT, test qui malgré sa grande facilité d’utilisation sur le terrain ne vaut pas en termes de sensibilité, la PCR. On peut donc imaginer que les quatre chevaux ayant récidivé au 08 juillet n’étaient pas les seuls, mais que les autres individus du troupeau présentaient alors une parasitémie trop faible pour être décelée grâce au test de Woo. Il y a donc de fortes chances pour que de nouveaux positifs se déclarent parmi les chevaux.

Concernant l’origine de ce foyer, il est probable que le bovin importé dans la ferme en janvier, alors porteur sain du parasite, ait introduit le parasite dans cet élevage. Le stress engendré par ce changement de milieu de vie, ou un autre événement non identifié, aurait ainsi provoqué des manifestations cliniques (prostration et hémoglobinurie). Aucun autre bovin n’a présenté des signes cliniques caractéristiques du Surra, hormis un amaigrissement progressif, malgré des parasitémies conséquentes, ils auraient donc joué le rôle de réservoir, et les chevaux connus pour être plus sensibles à l’infection, auraient permis de mettre en évidence la circulation du parasite.

De plus, il est peu probable que les bovins aient été porteurs sains depuis longtemps et qu’à la faveur d’un stress (introduction d’un nouvel animal), ils aient développé des parasitémies plus importantes, à l’origine de la transmission aux chevaux. Il faudrait pour pouvoir confirmer ou infirmer cette hypothèse, connaître le stade de l’infection des bovins. Malheureusement, l’appréciation de la réponse immunitaire des bovins contre T. evansi au jour de notre visite du foyer ne permet pas de mettre en évidence ce stade, et de conclure à une infection récente ou non. Un seuil d’anticorps bas peut correspondre à un début ou une fin d’infection, ou encore à un porteur sain. La réalisation d’une cinétique des anticorps anti T. evansi s’avèrerait donc nécessaire.

L’évolution de ce foyer a été assez rapide : en 4 mois, la presque totalité des animaux naturellement réceptifs a été contaminée, cela suggère l’efficacité de la transmission mécanique, lorsque les populations d’insectes sont importantes. En effet, l’introduction d’un animal infecté dans un troupeau indemne de 100 têtes de bétail, peut aboutir à la contamination de tout l’effectif (Desquesnes et al. 2009). Cependant le foyer est toujours actif, puisque certains animaux sont positifs en PCR, mais négatifs en CATT

77

et en ELISA, il s’agit d’infections très récentes et cela concerne principalement les jeunes bovins. Même s’il s’agissait là d’un foyer isolé au sein d’une palmeraie, le risque de propagation de la maladie dans la province est non négligeable, puisque les animaux sont vendus sur pieds, cependant seules quelques chêvres auraient été vendues depuis la déclaration du foyer. De plus l’étude qui a été réalisée sur un échantillon de chevaux des provinces voisines a mis en lumière la circulation du parasite, puisque respectivement neuf, six et onze chevaux ont été détectés positifs en CATT, en ELISA et en PCR.

79

III. Difficultés rencontrées

1. Linguistiques Si les entretiens avec les vétérinaires se déroulaient relativement facilement, car en anglais, il n’en était pas de même avec les propriétaires de camps d’éléphants, ou de fermes, puisque la plupart ne parlaient que thaïlandais, et l’aide de Sarawut Yangtara, l’assistant de recherche du Dr. Marc Desquesnes, était plus que bienvenue.

Malgré cela la communication n’était pas évidente, et la reconstruction de l’historique d’un foyer nécessitait de revenir un certain nombre de fois sur les mêmes questions pour obtenir une information fiable.

2. Techniques La réalisation des tests diagnostic n’a pas toujours été aisée : quelques échecs ont été déplorés en particulier avec la PCR, où le choix initial des témoins positifs n’a pas été des plus heureux. En effet, l’un des deux témoins positifs était un clone de la séquence d’ADN de T. evansi encadrée par les amorces TBR, il était à une telle concentration, que non seulement les échantillons et les aliquotes de réactifs se sont retrouvés contaminés, mais également la hotte soufflante sous laquelle était préparé le mix. Et cela malgré l’application de rayons UV pendant les 30 minutes précédant son utilisation. Le changement des réactifs, de la salle de préparation, et la réextraction des échantillons se sont avérés nécessaires et suffisants pour se débarrasser de ce clone contaminant.

Si l’ELISA n’a pas posé de problème de réalisation, c’est l’approvisionnement en réactifs, et notamment en conjugués spécifiques d’espèces qui a fait défaut. Le laboratoire de parasitologie n’ayant pas pour habitude de travailler avec des échantillons de chevaux et de chèvres, les stocks de conjugués pour ces deux espèces dataient un peu, de telle sorte que les densités optiques des témoins positifs étaient inférieures à 0.3 unités. Il a donc fallu commander de nouveaux conjugués au plus vite, ce qui a nettement retardé l’obtention des résultats sérologiques.

3. Administratives Dans un premier temps, un accord oral avait été passé avec la vétérinaire de l’hôpital pour éléphants du DLD, responsable du suivi des éléphants pour que nous puissions participer à leur collecte annuelle d’échantillons. Par la suite, cet accord a été mis à mal et des ordres venus de plus haut ne nous ont pas permis de poursuivre la récolte d’échantillons aux côtés des équipes mobiles. Le nombre d’échantillons obtenus s’en est donc trouvé considérablement réduit.

Heureusement, d’autres contacts du directeur du laboratoire de parasitologie, susceptibles de posséder des échantillons de sang ou de sérum d’éléphants, ont pu être sollicités. Le problème a alors été d’obtenir les informations relatives aux animaux prélevés : nom, numéro de puce, âge, lieu de vie, date de prélèvement, présence de signes cliniques de Surra, antécédents de traitement, caractéristiques de la ferme…

Autre information délicate à obtenir de manière fiable : les effectifs animaux par province. Par exemple, la différence entre le nombre d’éléphants domestiques en 2005 et 2011 et très importante, mais cela pourrait être dû au nombre grandissant d’éléphants identifiés par une puce électronique, et donc à la plus grande facilité de recensement. Mais les chiffres annoncés sur le site du DLD (www.dld.go.th) étaient bien en dessous des estimations présentées en annexes (cf. Annexe 1), fournies par un vétérinaire de l’hôpital pour éléphants de Surin.

80

La même difficulté s’est présentée pour les effectifs de chevaux par province. En effet dans la province de Phuket, si l’on en croit les informations présentées sur le site du DLD il y aurait seulement quatre chevaux (cf. Annexe 3), or parmi les échantillons de chevaux qui nous ont été donnés par une vétérinaire du bureau local du DLD de Surat Thani, 90 proviendraient de cette même province. Il devient donc difficile de savoir sur quelle information se baser.

81

Conclusion

83

Bibliographie Antoine-‐Moussiaux, N. & Desmecht, D., 2008. Épidémiologie de l’infection par Trypanosoma

evansi. Annales de médecine vétérinaire, 3(152), p.191-‐201. Available at: http://www.facmv.ulg.ac.be/amv/resume.php?type=fr&id=270 [Consulté juin 4, 2011].

Arjkumpa, O., Cheewasereechon M., Suksaithaichana P., Worasing R., 2010. First report of trypanosomiasis in timber elephant in southern Thailand. Communication personnelle.

Bauer, B., Touratier, L. & Frézil, J.L., 2010. Trypanosomoses : clinical signs and lesions. Dans Infectious and parasitic diseases of livestock: Lefèvre, Blancou, Chermette, Uilenderg, p. 1657-‐1665.

Bawm, S. et al., 2010. Evaluation of Myanmar medicinal plant extracts for antitrypanosomal and cytotoxic activities. The Journal of Veterinary Medical Science / the Japanese Society of Veterinary Science, 72(4), p.525-‐528. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20032625 [Consulté juin 13, 2011].

Berlin, D., Loeb, E. & Baneth, G., 2009. Disseminated central nervous system disease caused by Trypanosoma evansi in a horse. Veterinary Parasitology, 161(3-‐4), p.316-‐319. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19251368 [Consulté juin 2, 2011].

Bhide, M.R. et al., 2004. Protein A/G dependent ELISA a promising diagnostic tool in Lyme disease seroprevalence in game animals and hunting dogs. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 27(3), p.191-‐199. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15001314 [Consulté août 17, 2011].

Boonyawong, T., Chataraprateep, P. & Mungyai, M., 1975. Surra in horses. Thai Journal of Veterinary Medicine, 5(1), p.665-‐672.

Borsali, F., 2010. Statistiques médicales et biologiques Ellipses., Paris. Van den Bossche, P., Chigoma, D. & Shumba, W., 2000. The decline of anti-‐trypanosomal antibody

levels in cattle after treatment with trypanocidal drugs and in the absence of tsetse challenge. Acta Tropica, 77(3), p.263-‐270. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11114388 [Consulté août 10, 2011].

Bouet, G. & Roubaud, E., 1912. Expériences de transmission des trypanosomiases animales de l’Afrique occidentale française par les stomoxes. Bulletin de la société de pathologie exotique, (5).

Bouyer, J. et al., 2010. Trypanosomoses : Control methods. Dans Infectious and parasitic diseases of livestock. Lefèvre, Blancou, Chermette, Uilenderg, p. 1695-‐1716.

Cherpes, T.L., Meyn, L.A. & Hillier, S.L., 2003. Plasma versus serum for detection of Herpes Simplex Virus Type 2-‐specific immunoglobulin G antibodies with a glycoprotein G2-‐based enzyme immunoassay. Journal of Clinical Microbiology, 41(6), p.2758-‐2759.

Claes, F. et al., 2005. Comparison of serological tests for equine trypanosomosis in naturally infected horses from Kazakhstan. Veterinary Parasitology, 131(3-‐4), p.221-‐225. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15951112 [Consulté août 15, 2011].

Coppens, I., Levade, T. & Courtoy, P.J., 1995. Host plasma low density lipoprotein particles as an essential source of lipids for the bloodstream forms of Trypanosoma brucei. The Journal of Biological Chemistry, 270(11), p.5736-‐5741. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7890701 [Consulté août 25, 2011].

Cuny, G. et al., 2010. Trypanosomoses : agents and epidemiology. Dans infectious and parasitic diseases of livestock. Tec&Doc ; EMinter. Lefèvre, Blancou, Chermette, Uilenderg, p. 1967.

Dargantes, A.P., Mercado, R.T., Dobson, R.J., Reid, S.A., 2009. Estimating the impact of Trypanosoma evansi infection (surra) on buffalo population dynamics in southern Philippines using data from cross-‐sectional surveys. International Journal for Parasitology, 39(10), p.1109-‐1114. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19268471 [Consulté mai 18, 2011].

Dargantes, A.P., Reid, S.A. & Copeman, D.B., 2005. Experimental Trypanosoma evansi infection in the goat. I. Clinical signs and clinical pathology. Journal of Comparative Pathology, 133(4), p.261-‐266. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16213515 [Consulté août 12, 2011].

Delespaux, V. & de Koning, H., 2007. Drugs and drug resistance in African trypanosomiasis. Drug Resistance Updates: Reviews and Commentaries in Antimicrobial and Anticancer Chemotherapy, 10(1-‐2), p.30-‐50. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17409013 [Consulté août 24, 2011].

84

Desquesnes, M., 1997a. International and regional standardization of immunoenzyme tests: methods, concerns and limitations. Revue Scientifique Et Technique (International Office of Epizootics), 16(3), p.809-‐823. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9567307 [Consulté juillet 19, 2011].

Desquesnes, M., 1997b. Evaluation of a simple PCR technique for the diagnosis of Trypanosoma vivax infection in the serum of cattle in comparison to parasitological techniques and antigen-‐enzyme-‐linked immuno sorbent assay. Acta Tropica, 65(3), p.139-‐148. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9177575 [Consulté avril 23, 2011].

Desquesnes, M. & Dávila, A.M.R., 2002. Applications of PCR-‐based tools for detection and identification of animal trypanosomes: a review and perspectives. Veterinary Parasitology, 109(3-‐4), p.213-‐231. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12423934 [Consulté avril 23, 2011].

Desquesnes, M. & Tresse, L., 1996. [Evaluation of the sensitivity of the Woo test for the detection of Trypanosoma vivax]. Revue D’élevage Et De Médecine Vétérinaire Des Pays Tropicaux, 49(4), p.315-‐321. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9244937 [Consulté avril 23, 2011].

Desquesnes, M., Biteau-‐Coroller, F., et al., 2009. Development of a mathematical model for mechanical transmission of trypanosomes and other pathogens of cattle transmitted by tabanids. International Journal for Parasitology, 39(3), p.333-‐346. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18755195 [Consulté juin 28, 2011].

Desquesnes, M. et al., 2008. First outbreak of Trypanosoma evansi in camels in metropolitan France. The Veterinary Record, 162(23), p.750-‐752. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18540034 [Consulté mai 11, 2011].

Desquesnes, M. et al., 2009. Antibody-‐ELISA for Trypanosoma evansi: application in a serological survey of dairy cattle, Thailand, and validation of a locally produced antigen. Preventive Veterinary Medicine, 90(3-‐4), p.233-‐241. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19477543 [Consulté avril 23, 2011].

Dobson, R.J., Dargantes, A.P., Mercado, R.T., Reid, S.A., 2009. Models for Trypanosoma evansi (surra), its control and economic impact on small-‐hold livestock owners in the Philippines. International Journal for Parasitology, 39(10), p.1115-‐1123. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19272392 [Consulté avril 23, 2011].

Eloy LJ & Lucheis SB, 2009. Canine trypanosomiasis: etiology of infection and implications for public health. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 15 (4), p.589-‐611.

Evans, G.H., 1910. Elephants and their diseases : A treatise on elephants. Superintendent, government printing., Rangoon, Burma, 334p.

Foil, L.D., Stage, D., Adams, W.V.Jr., Issel, C.J., 1985. Observations of tabanid feeding on mares and foals. American Journal of Veterinary Research, 46(5), p.1111-‐1113. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4003887 [Consulté août 22, 2011].

Foil, L.D. & Hogsette, J.A., 1994. Biology and control of tabanids, stable flies and horn flies. Revue Scientifique Et Technique (International Office of Epizootics), 13(4), p.1125-‐1158. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7711307 [Consulté juin 2, 2011].

Foil, L.D., Adams, W.V. Jr., Mc Manus, J.M., Issel, C.J., 1987. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. Journal of Medical Entomology, 24(6), p.613-‐616. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2826787 [Consulté juin 2, 2011].

Gerbet, S., 1994. L’éléphant de travail en Thaïlande. Etude des traditions locales d’élevage, de dressage et de traitement des affections courantes. Thèse de doctorat vétérinaire. Faculté de Médecine de Nantes. Available at: http://alex.vet-‐lyon.fr/Record.htm?idlist=1&record=19119802124919370849&context=1 [Consulté juin 3, 2011].

Gibson, W., 2001. Sex and evolution in trypanosomes. International Journal for Parasitology, 31(5-‐6), p.643-‐647. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11334957 [Consulté juin 11, 2011].

85

Gibson, W. & Garside, L., 1991. Genetic exchange in Trypanosoma brucei brucei: variable chromosomal location of housekeeping genes in different trypanosome stocks. Molecular and Biochemical Parasitology, 45(1), p.77-‐89. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1675762 [Consulté mai 31, 2011].

Greiner, M. et al., 1997. Impact of biological factors on the interpretation of bovine trypanosomosis serology. Preventive Veterinary Medicine, 30(1), p.61-‐73. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9234412 [Consulté avril 28, 2011].

Gutierrez, C., Corbera, J.A., Morales, M., Büscher, P., 2004. Performance of serological tests for Trypanosoma evansi in experimentally inoculated goats. Annals of the New York Academy of Sciences, 1026, p.152-‐153. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15604484 [Consulté avril 23, 2011].

Gutierrez, C et al., 2000. Camel trypanosomosis in the Canary Islands: assessment of seroprevalence and infection rates using the card agglutination test (CATT/T. evansi) and parasite detection tests. Veterinary Parasitology, 90(1-‐2), p.155-‐159. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10828522 [Consulté mai 18, 2011].

Gutierrez, C., Corbera, J.A., Morales, M., Büscher, P., 2006. Trypanosomosis in goats: current status. Annals of the New York Academy of Sciences, 1081, p.300-‐310. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17135529 [Consulté août 12, 2011].

Hilali, M. et al., 2004. Evaluation of the card agglutination test (CATT/T. evansi) for detection of Trypanosoma evansi infection in water buffaloes (Bubalus bubalis) in Egypt. Veterinary Parasitology, 121(1-‐2), p.45-‐51. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15110402 [Consulté août 15, 2011].

Hin On, W. et al., 2003. Surra in timber elephant in Northern Thailand -‐ diagnosis and treatment : A Case Study. Veterinary Medical Association of Thailand, 30th veterinary conference on husbandry.

Hoare, C., 1972. The trypanosomes of mammals -‐ A zoological monograph, Oxford and Edimburg: Blackwell Scientific Publications.

Holland, W.G. et al., 2003. The effect of Trypanosoma evansi infection on pig performance and vaccination against classical swine fever. Veterinary Parasitology, 111(2-‐3), p.115-‐123. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12531288 [Consulté mai 24, 2011].

Holland, W.G. et al., 2001. The influence of T. evansi infection on the immuno-‐responsiveness of experimentally infected water buffaloes. Veterinary Parasitology, 102(3), p.225-‐234. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11777602 [Consulté juin 2, 2011].

Holland, W.G. et al., 2005. Evaluation of diagnostic tests for Trypanosoma evansi in experimentally infected pigs and subsequent use in field surveys in north Vietnam and Thailand. Tropical Animal Health and Production, 37(6), p.457-‐467. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16248217 [Consulté août 15, 2011].

Indrakamhang, P., 1998. Trypanosoma evansi infection in livestock in Thailand. Journal of Protozoology Research, (8), p.153-‐161.

Jacquiet, P., Cheickh, D., Thiam, A., Dia, M.L., 1993. Trypanosomiasis caused by Trypanosoma evansi in small ruminants in Mauritania: results of experimental inoculation and field surveys. Revue D’élevage Et De Médecine Vétérinaire Des Pays Tropicaux, 46(4), p.574-‐578. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8073171 [Consulté juillet 22, 2011].

Jenni, L. et al., 1986. Hybrid formation between African trypanosomes during cyclical transmission. Nature, 322(6075), p.173-‐175. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3724860 [Consulté mai 31, 2011].

Jensen, R.E., Simpson, L. & Englund, P.T., 2008. What happens when Trypanosoma brucei leaves Africa. Trends in parasitology, 24(10), p.428-‐431.

Joshi, P.P. et al., 2005. Human trypanosomiasis caused by Trypanosoma evansi in India: the first case report. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 73(3), p.491-‐495. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16172469 [Consulté mai 23, 2011].

Kashemsant, M.R., Pholpark, S., Srihakim, S., Leidl, K., 1989. Epidemiological pattern of Trypanosoma evansi in Northeast Thailand and control measures. Journal of the Medical Association of Thailand, 40, p.84-‐92.

86

Krinsky, W.L., 1976. Animal disease agents transmitted by horse flies and deer flies (Diptera: Tabanidae). Journal of Medical Entomology, 13(3), p.225-‐275. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/137982 [Consulté juin 2, 2011].

Lai, D.H., Hashimi, H., Lun, Z.R., Ayala, F.J., Lukes, J., 2008. Adaptations of Trypanosoma brucei to gradual loss of kinetoplast DNA: Trypanosoma equiperdum and Trypanosoma evansi are petite mutants of T. brucei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(6), p.1999-‐2004. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18245376 [Consulté avril 28, 2011].

Leboucher, E., 2009. Etude sérologique de la trypanosomose (Trypanosoma evansi) et de la trichinellose (Trichinella spiralis) chez le buffle et le porc en Thaïlande et au Vietnam, Mémoire de master 2, CIRAD, UM2, ENVT, Montpellier, 65p.

Lee, M.G. & Van der Ploeg, L.H., 1987. Frequent independent duplicative transpositions activate a single VSG gene. Molecular and Cellular Biology, 7(1), p.357-‐364. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3031467 [Consulté mai 28, 2011].

Li, S.Q. et al., 2009. Immunization with recombinant actin from Trypanosoma evansi induces protective immunity against T. evansi, T. equiperdum and T. b. brucei infection. Parasitology Research, 104(2), p.429-‐435. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18923843 [Consulté août 22, 2011].

Loehr, K.F., Pholpark, S., Upatum, N., Leidl, K., Staak, C., 1986. Trypanosoma evansi infection, a frequent cause of abortion in buffaloes. Tropical Animal Health and Production, (18), p.103-‐108.

Luckins, A.G., 1998. Epidemiology of Surra: Unanswered Questions. Journal of Protozoology Research, 8(3), p.106-‐119. Available at: http://sciencelinks.jp/j-‐east/article/199916/000019991699A0558477.php [Consulté mai 29, 2011].

Luckins, A.G., 1988. Trypanosoma evansi in Asia. Parasitology Today (Personal Ed.), 4(5), p.137-‐142. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15463067 [Consulté mai 29, 2011].

Lun, Z.R. & Desser, S.S., 1995. Is the broad range of hosts and geographical distribution of Trypanosoma evansi attributable to the loss of maxicircle kinetoplast DNA? Parasitology Today (Personal Ed.), 11(4), p.131-‐133. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15275353 [Consulté mai 18, 2011].

Lun, Z.R. et al., 1991. Cymelarsan in the treatment of buffaloes naturally infected with Trypanosoma evansi in south China. Acta Tropica, 49(3), p.233-‐236. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1685304 [Consulté mai 23, 2011].

Masiga, D.K. & Gibson, W.C., 1990. Specific probes for Trypanosoma (Trypanozoon) evansi based on kinetoplast DNA minicircles. Molecular and Biochemical Parasitology, 40(2), p.279-‐283. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2163493 [Consulté mai 27, 2011].

Masiga, D.K., Smyth, A.J., Hayes, P., Bromidge, T.J., Gibson, W.C., 1992. Sensitive detection of trypanosomes in tsetse flies by DNA amplification. International Journal for Parasitology, 22(7), p.909-‐918. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1459784 [Consulté avril 23, 2011].

Monzón, C.M., Mancebo, O.A. & Roux, J.P., 1990. Comparison between six parasitological methods for diagnosis of Trypanosoma evansi in the subtropical area of Argentina. Veterinary Parasitology, 36(1-‐2), p.141-‐146. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2382382 [Consulté août 16, 2011].

Monzon, C.M., Mancebo, O.A. & Russo, A.M., 2003. Antibody levels by indirect ELISA test in Trypanosoma evansi infected horses following treatment with quinapyramine sulphate. Veterinary Parasitology, 111(1), p.59-‐63. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12523979 [Consulté août 16, 2011].

Moser, D.R. et al., 1989. Detection of Trypanosoma congolense and Trypanosoma brucei subspecies by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Parasitology, 99(1), p.57-‐66. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2797872 [Consulté juin 26, 2011].

87

Moutia, A., 1928. Surra in Mauritius and Its Principal Vector, Stomoxys Nigra. Bulletin of Entomological Research, 19(02), p.211-‐216. Available at: http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract?fromPage=online&aid=2438340 [Consulté juin 11, 2011].

Muenworn, V. et al., 2010. Geographic distribution of stomoxyine flies (Diptera: Muscidae) and diurnal activity of Stomoxys calcitrans in Thailand. Journal of Medical Entomology, 47(5), p.791-‐797. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20939373 [Consulté juin 12, 2011].

Ngeranwa, J.J. & Kilalo, D.C., 1994. The ability of Stomoxys calcitrans and mechanical means to transmit Trypanosoma (brucei) evansi from goats to camels in Kenya. Veterinary Research Communications, 18(4), p.307-‐312. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7831761 [Consulté juin 3, 2011].

Njiru, Z.K. & Constantine, C.C., 2007. Population sub-‐structuring among Trypanosoma evansi stocks. Parasitology Research, 101(5), p.1215-‐1224. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17587054 [Consulté mai 29, 2011].

Njiru, Z.K., Constantine, C.C, Gitonga, P.K., Thompson, R.C.A., Reid, S.A., 2007. Genetic variability of Trypanosoma evansi isolates detected by inter-‐simple sequence repeat anchored-‐PCR and microsatellite. Veterinary Parasitology, 147(1-‐2), p.51-‐60. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17452081 [Consulté mai 20, 2011].

OIE, 2010. Chapitre 2.1.17 -‐ Trypanosoma evansi infection (Surra). Dans OIE (office international des épizooties) Terrestrial Manual. p. 1-‐14.

Parija, S.C. & Bhattacharya, S., 2001. The tragedy of Tigers: lessons to learn frim Nandankanan episode. Indian Journal of Medical Microbiology, 19(3), p.116-‐118.

Payne, R.C. et al., 1994. Efficacy of Cymelarsan in Friesian Holstein calves infected with Trypanosoma evansi. Tropical Animal Health and Production, 26(4), p.219-‐226. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7900218 [Consulté juin 7, 2011].

Pays, E. & Vanhollebeke, B., 2008a. L’histoire controversée du facteur trypanolytique humain. médecine/sciences, 24(10), p.2.

Pays, E. & Vanhollebeke, B., 2008b. Mutual self-‐defence: the trypanolytic factor story. Microbes and Infection / Institut Pasteur, 10(9), p.985-‐989. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18675374 [Consulté mai 30, 2011].

Pays, E. et al., 2006. The trypanolytic factor of human serum. Nature Reviews. Microbiology, 4(6), p.477-‐486. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16710327 [Consulté mai 30, 2011].

Phetudomsinsuk, K., Sirinarumitr, K., Laikul, A., Pinyopummin, A., 2008. Morphology and head morphometric characters of sperm in Thai native crossbred stallions. Acta Veterinaria Scandinavica, 50(1), p.41-‐41.

Van der Ploeg, L.H., Gottesdiener, K., Lee, M.G., 1984. Antigenic variation in Trypanosoma brucei analyzed by electrophoretic separation of chromosome-‐sized DNA molecules. Cell, 37(1), p.77-‐84. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6202420 [Consulté mai 28, 2011].

Powar, R.M. et al., 2006. A rare case of human trypanosomiasis caused by Trypanosoma evansi. Indian Journal of Medical Microbiology, 24(1), p.72-‐74. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16505565 [Consulté mai 18, 2011].

Pruvot, M., Kamyingkird, K., Desquesnes, M., Sarataphan, N., Jittapalapong, S., 2010. A comparison of six primer sets for detection of Trypanosoma evansi by polymerase chain reaction in rodents and Thai livestock. Veterinary Parasitology, 171(3-‐4), p.185-‐193. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20466489 [Consulté avril 23, 2011].

Raina, A.K., Kumar, R., Rajora, V.S., Sridhar, Singh, R.P., 1985. Oral transmission of Trypanosoma evansi infection in dogs and mice. Veterinary Parasitology, 18(1), p.67-‐69. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4049728 [Consulté mai 18, 2011].

Reid, S.A., 2002. Trypanosoma evansi control and containment in Australasia. Trends in Parasitology, 18(5), p.219-‐224. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11983603 [Consulté mai 18, 2011].

88

Reyna-‐Bello, A., Garcia, F.A., Rivera, M., Sanso, B., Aso, P.M., 1998. Enzyme-‐linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of anti-‐Trypanosoma evansi equine antibodies. Veterinary Parasitology, 80(2), p.149-‐157. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9870367 [Consulté août 19, 2011].

Rodríguez, N.F., Tejedor-‐Junco, M.T., Hernández-‐Trujillo, Y., Gonzalez, M., Gutierrez, C., 2010. The role of wild rodents in the transmission of Trypanosoma evansi infection in an endemic area of the Canary Islands (Spain). Veterinary Parasitology, 174(3-‐4), p.323-‐327. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20888126 [Consulté mai 18, 2011].

Sambrook, J. & Russel, D., 2001. Molecular Cloning : A laboratory Manual 3e éd., Cold Spring Harbor, NY.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2344p.

Schillinger, D. & Rottcher, D., 1986. Traitement de l’infection cameline à Trypanosoma evansi (Surra). Revue mondiale de zootechnie, p.26-‐32.

Sergent, E. & Sergent, E., 1905. Trypanosomiase des dromadaires de l’Afrique du Nord. , (19), p.17-‐48.

Silva, A.S., Ceolin, L.V., Oliviera, C.B., Monteiro, S.G., Doyle, R.L., 2007. Infecção via oral por Trypanosoma evansi em animais de laboratório. Ciência Rural, 37(3), p.897-‐900. Available at: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0103-‐84782007000300049&script=sci_abstract [Consulté juin 3, 2011].

Silva, R.A.M.S., Herrera, H.M. & da Silviera Domingos, L., 1995. Pathogenesis of Trypanosoma evansi infection in dogs and horses: hematological and clinical aspects. Ciência Rural, 25(2), p.233-‐238.

Singla, L.D., Juyal, P.D. & Sharma, N.S., 2010. Immune responses to haemorrhagic septicaemia (HS) vaccination in Trypanosoma evansi infected buffalo-‐calves. Tropical Animal Health and Production, 42(4), p.589-‐595. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19784863 [Consulté juin 2, 2011].

Stevens, J.R., Noyes, H.A., Schofiels, C.J., Gibson, W.C., 2001. The molecular evolution of Trypanosomatidae. Advances in Parasitology, 48, p.1-‐56. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11013754 [Consulté juin 11, 2011].

Suswam, E.A., Taylor, D.W., Ross, C.A., Martin, R.J., 2001. Changes in properties of adenosine transporters in Trypanosoma evansi and modes of selection of resistance to the melaminophenyl arsenical drug, Mel Cy. Veterinary Parasitology, 102(3), p.193-‐208. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11777599 [Consulté août 24, 2011].

Suttipat, T. et al., 2009. The Elephant Health Care Training Course 8e éd., Chiang Mai: Elephant and Wildlife Clinic.

Tait, A., Macleod, A., Tweedie, A., Masiga, D.K., Turner, C.M.R., 2007. Genetic exchange in Trypanosoma brucei: evidence for mating prior to metacyclic stage development. Molecular and Biochemical Parasitology, 151(1), p.133-‐136. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17134768 [Consulté mai 31, 2011].

Tamarit, A. et al., 2010a. Trypanosoma evansi infection in mainland Spain. Veterinary Parasitology, 167(1), p.74-‐76. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19864069 [Consulté mai 15, 2011].

Tamarit, A. et al., 2011. Morphological and biometrical features of Trypanosoma evansi isolates from an outbreak in mainland Spain. Veterinary Parasitology, 177(1-‐2), p.152-‐156. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21194840 [Consulté mai 11, 2011].

Taylor, J.E. & Rudenko, G., 2006. Switching trypanosome coats: what’s in the wardrobe? Trends in Genetics: TIG, 22(11), p.614-‐620. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16908087 [Consulté août 30, 2011].

Toma, B., Dufour, B., Sanaa, M., 2001. Épidémiologie appliquée à la lutte collective contre les maladies animales transmissibles majeures 2e éd., Maisons-‐Alfort: Association pour l’étude de l’épidémiologie des maladies animales.

Tuntasuvan, D. & Luckins, A.G., 1998. Status of Surra in Livestock in Thailand. Journal of protozoology research, 8(3), p.162-‐170.

Tuntasuvan, D., Chompoochan, T., Vongpakorn, M., Mohkaew, K., 1996. Developing on the detection of Trypanosoma evansi antibodies in pigs using Enzyme Linked Immunosorbent Assay. Journal of the Thai Veterinary Medical Association

89

Tuntasuvan, D. et al., 2003. Chemotherapy of surra in horses and mules with diminazene aceturate. Veterinary Parasitology, 110(3-‐4), p.227-‐233. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12482651 [Consulté juin 13, 2011].

Tuntasuvan, D., Sarataphan, N., Siriaronnrat, B., Sukhapesna, V., 1997. A preliminary survey on Surra in Thai elephants. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology 97, South Africa, p.83.

Vanhollebeke, B. et al., 2006. Human Trypanosoma evansi infection linked to a lack of apolipoprotein L-‐I. The New England Journal of Medicine, 355(26), p.2752-‐2756. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17192540 [Consulté mai 18, 2011].

Ventura, R.M. et al., 2000. Molecular and morphological studies of Brazilian Trypanosoma evansi stocks: the total absence of kDNA in trypanosomes from both laboratory stocks and naturally infected domestic and wild mammals. The Journal of Parasitology, 86(6), p.1289-‐1298. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11191906 [Consulté mai 15, 2011].

Ventura, R.M. et al., 2002. Genetic relatedness among Trypanosoma evansi stocks by random amplification of polymorphic DNA and evaluation of a synapomorphic DNA fragment for species-‐specific diagnosis. International Journal for Parasitology, 32(1), p.53-‐63. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11796122 [Consulté mai 28, 2011].

Vergne, T., 2009. Epidémiologie de Trypanosoma evansi en Thaïlande : études expérimentales de la transmission vectorielle par les sangsues et les tiques. Thèse de doctorat vétérinaire, Université Paul Sabatier, Toulouse, 92p.

Vittoz, R., 1955. Prophylaxie du Surra en Asie. Bulletin de l’office international des épizooties, (44), p.83-‐106.

Watanapokasin, Y. et al., 1998. Intra-‐species differentiation of Trypanosoma evansi by DNA fingerprinting with arbitrary primered polymerase chain reaction. Veterinary Parasitology, 78(4), p.259-‐264. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9786626 [Consulté mai 28, 2011].

Witola, W.H., Inoue, N., Ohashi, K., Onuma, M., 2004. RNA-‐interference silencing of the adenosine transporter-‐1 gene in Trypanosoma evansi confers resistance to diminazene aceturate. Experimental Parasitology, 107(1-‐2), p.47-‐57. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15208037 [Consulté août 25, 2011].

Wongnak, P., Chreonpanitkul, Y., Boontarat, B., Sakhong, D., 2006. Outbreak of Trypanosomosis in lower North Eastern part of Thailand. Journal of Lower Eastern Veterinary Research and Development Center.

Woo, P.T., 1970. The haematocrit centrifuge technique for the diagnosis of African trypanosomiasis. Acta Tropica, 27(4), p.384-‐386. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4396363 [Consulté avril 28, 2011].

Yang, J.-‐L. et al., 2008. A simple and rapid method for extracting bacterial DNA from intestinal microflora for ERIC-‐PCR detection. World Journal of Gastroenterology: WJG, 14(18), p.2872-‐2876. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18473413 [Consulté août 11, 2011].

Zhang, Z.Q., Giroud, C. & Baltz, T., 1991. In vivo and in vitro sensitivity of Trypanosoma evansi and T. equiperdum to diminazene, suramin, MelCy, quinapyramine and isometamidium. Acta Tropica, 50(2), p.101-‐110. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1685865 [Consulté août 23, 2011].

91

Annexe 1 -‐ Population d'éléphants domestiques en Thaïlande en 2005 et 2011

Province En 2005 En 2011 Amnat Charoen 0 0 Ang Thong 0 0 Bangkok Metropolis 10 14 Buri Ram 107 276 Chachoengsao 0 3 Chai Nat 0 0 Chaiyaphum 10 65 Chanthaburi 0 0 Chiang Mai 388 497 Chiang Rai 43 62 Chon Buri 326 103 Chumphon 5 15 Kalasin 0 0 Kamphaeng Phet 0 0 Kanchanaburi 105 197 Khon Kaen 0 4 Krabi 16 59 Lampang 78 170 Lamphun 0 0 Loei 0 1 Lop Buri 8 0 Mae Hong Son 105 75 Maha Sarakham 0 6 Mukdahan 0 0 Nakhon Nayok 0 0 Nakhon Pathom 35 36 Nakhon Phanom 0 1 Nakhon Ratchasima 0 1 Nakhon Sawan 1 2 Nakhon Si Thammarat 79 97 Nan 17 17 Narathiwat 8 0 Nong Bua Lam Phu 0 0 Nong Khai 0 0 Nonthaburi 0 0 Pathum Thani 10 0 Pattani 1 0 Phangnga 12 241 Phatthalung 7 34 Phatthalung (Songkhla Lake)

0 0 Phayao 11 7 Phetchabun 0 3 Phetchaburi 1 2 Phichit 0 0 Phitsanulok 1 10 Phra Nakhon Si Ayutthaya 50 132 Phrae 28 49 Phuket 186 156 Prachin Buri 0 0 Prachuap Khiri Khan 37 35 Ranong 18 46 Ratchaburi 4 0 Rayong 0 0 Roi Et 0 5 Sa Kaeo 6 0 Sakon Nakhon 4 1 Samut Prakan 11 6 Samut Sakhon 0 0 Samut Songkhram 0 0

92

Saraburi 3 1 Satun 1 12 Si Sa Ket 0 1 Sing Buri 0 0 Songkhla 14 0 Songkhla (Songkhla Lake) 0 0 Sukhothai 32 65 Suphan Buri 1 1 Surat Thani 65 58 Surin 661 1062 Tak 173 235 Trang 43 118 Trat 22 13 Ubon Ratchathani 2 0 Udon Thani 0 0 Uthai Thani 0 5 Uttaradit 4 14 Yala 15 3 Yasothon 0 0 Totaux 2764 4016

Sources : Information and Statistics group, Information Technology Center, Department of Livestock Development, 2005 ; Hôpital pour éléphants de Lampang, 2011

93

Annexe 2 -‐ carte

94

Annexe 3 -‐ Population de chevaux par province en Thaïlande en 2010

Province Effectif Province Effectif Amnat Charoen 38 Ratchaburi 196 Ang Thong 24 Rayong 32 Bangkok Metropolis 47 Roi Et 58 Buri Ram 96 Sa Kaeo 16 Chachoengsao 59 Sakon Nakhon 57 Chai Nat 5 Samut Prakan 52 Chaiyaphum 85 Samut Sakhon 5 Chanthaburi 23 Samut Songkhram 4 Chiang Mai 292 Saraburi 195 Chiang Rai 350 Satun 49 Chon Buri 124 Si Sa Ket 48 Chumphon 28 Sing Buri 27 Kalasin 23 Songkhla 96 Kamphaeng Phet 41 Songkhla (Songkhla Lake) 0 Kanchanaburi 129 Sukhothai 8 Khon Kaen 119 Suphan Buri 130 Krabi 11 Surat Thani 89 Lampang 196 Surin 78 Lamphun 17 Tak 75 Loei 29 Trang 20 Lop Buri 158 Trat 1 Mae Hong Son 41 Ubon Ratchathani 155 Maha Sarakham 91 Udon Thani 33 Mukdahan 3 Uthai Thani 32 Nakhon Nayok 17 Uttaradit 54 Nakhon Pathom 7 Yala 42 Nakhon Phanom 117 Yasothon 43 Nakhon Ratchasima 44 Nakhon Sawan 589 Nakhon Si Thammarat 73 Total 5525 Nan 165 Narathiwat 45 Nong Bua Lam Phu 18 Nong Khai 15 Nonthaburi 34 Pathum Thani 17 Pattani 14 Phangnga 31 Phatthalung 0 Phatthalung (Songkhla Lake)

23 Phayao 55 Phetchabun 151 Phetchaburi 64 Phichit 71 Phitsanulok 55 Phra Nakhon Si Ayutthaya 99 Phrae 17 Phuket 4 Prachin Buri 32 Prachuap Khiri Khan 138 Ranong 6

Source : Information and Statistics group, Information Technology Center, Department of Livestock Development, 2010

95

Annexe 4 -‐ Extraction ADN

Elle a pour but de retirer les protéines de l’échantillon, et d’inactiver certaines enzymes, comme les nucléases, qui pourraient détruire l’ADN. Le phénol est un bon agent dénaturant des protéines, alors que le chloroforme est un solvant organique permettant d’éliminer les traces de phénol de la phase aqueuse. Le pH du phénol doit être supérieur à 7,8, car à pH acide, l’ADN est plus affin pour la phase organique ; l’ajustement du pH se fait par ajout de 0,1M Tris-‐Cl à pH 8.

Elle est réalisée à partir de 100µL de buffy coat, de sang total ou de caillot sanguin dans de rares cas, auxquels 500µL de « D-‐solution » (solution dénaturante ; 4M thiocyanate de guanidine, 25mM citrate de sodium-‐2H2O, 0,5% lauryl sarcosinate de sodium, 0,1M β-‐mercaptoéthanol) qui provoque la rupture cellulaire, solubilise les composants cellulaires et inhibe les DNases, sont ajoutés. Le tout est placé au vortex pendant 10 minutes.

Vient ensuite l’ajout d’un volume égal de phénol et de chloroforme (2 x 150µL), suivi d’une autre étape de 10 minutes au vortex, permettant la formation d’une émulsion. La phase organique et la phase aqueuse (contenant l’ADN et située au dessus dans le tube) sont séparées grâce à la centrifugation à 13000 tour/minute. La phase aqueuse peut donc être collectée (600µL environ) et transvasée dans un nouveau microtube.

Ce même protocole d’ajout de phénol et de chloroforme, de centrifugation et de collecte (400µL) du surnageant est répété une seconde fois.

La précipitation de l’ADN se fait alors par addition d’un ml d’éthanol absolu, sur une nuit à -‐20°C. Puis la centrifugation à 13000 tours/minute, permet la visualisation du pellet d’ADN qui adhère au fond du microtube. Le surnageant est éliminé et le pellet d’ADN est lavé avec 700µl d’éthanol 75%, passé de nouveau à la centrifugeuse (même programme). Après une deuxième élimination du surnageant, le tube est laissé ouvert et retourné sur une grille jusqu’à séchage complet.

Enfin 40µl de tampon TE (10mM Tris pH 8, 1mM EDTA) viennent dissoudre l’ADN qui peut être stocké à –20°C.

96

Annexe 5 -‐ Carte

97

Annexe 6 -‐ Cycle épidémiologique partiel de T. evansi en Thaïlande

98

Annexe 7 -‐ Synthèse de l’évolution du foyer de Surat Thani

100

Annexe 8 -‐ Protocole traitement au Chelex 100 Sodium Form ® (Sigma-‐Aldrich, St Louis USA)

Il est basé sur l’utilisation d’un unique tampon de lyse (Tris 10mM, KCl 50mM, MgCl2 1,5mM, Tween 20 2%) additionné de Chelex 100 ® 5%, qui sont en réalité de petites billes constituées de résine chélatrice. Leur affinité est forte pour les cations métalliques, notamment les cations divalents que sont Ca2+, Mg2+ et Mn2+, et qui peuvent endommagé l’ADN. Elles captent également les impuretés protéiques.

L’échantillon, buffy coat, sang total ou culot de sérum, est tout d’abord passé au vortex quelques secondes, puis 10µL d’échantillon sont ajoutés aux 40µL de tampon de lyse. Une première incubation de 20 minutes à 56°C est pratiquée, puis après un passage au vortex, une autre incubation de 10 minutes à 100°C cette fois, suit.

La centrifugation à 15 000 tours/minute pendant 2 minutes, permet la récolte du surnageant au dessus du pellet, que l’on éliminera. L’ADN ainsi séparé des inhibiteurs de la PCR peut être stocké à -‐20°C.

101

NOM PRÉNOM : Camoin Margot

TITRE : Études épidémiologiques sur le Surra (Trypanosoma evansi) chez les éléphants et les chevaux en Thaïlande

Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 18 novembre 2011

RESUME : Afin d’améliorer les connaissances sur l’épidémiologie du Surra en Thaïlande, des études de prévalence chez les éléphants et les chevaux, ainsi qu’un suivi de foyers ont été réalisés. Des objectifs supplémentaires étaient de savoir si les éléphants étaient une espèce réservoir et de standardiser un test sérologique.

Des méthodes diagnostiques sérologiques, parasitologiques et moléculaires ont été utilisées sur des échantillons de sang de chevaux et d’éléphants provenant de différentes zones de Thaïlande. Les prévalences sérologiques globales obtenues sont de 1,5 ± 1,2% et de 7,9 ± 2,6% respectivement chez les éléphants et les chevaux, mais du fait d’un nombre d’individus prélevés trop faible et d’un échantillonnage biaisé, il ne faut pas accorder trop de valeur à ces résultats. L’étude de deux foyers de Surra a mis en évidence des prévalences d’infections dépassant les 80%, témoignant d’une transmission mécanique performante de T. evansi par les tabanides et stomoxes. Le suivi de ces foyers a montré l’inefficacité des mesures vétérinaires, car des rechutes ont été observées, soulevant le problème de résistance de T. evansi au Berenil ®.

Finalement, cette étude aura révélé la circulation de T. evansi chez les chevaux, les éléphants, les chèvres et les bovins en Thaïlande. Cette circulation chez des animaux en voie de disparition, l’absence de plan de contrôle du parasite en cas de foyer, et les pertes économiques engendrées soulignent l’importance pour les vétérinaires, de disposer d’une molécule active contre le parasite, comme le Cymelarsan ® qui n’a pas pu être évalué chez les éléphants du fait de la réticence des autorités à tester ce produit sur ces animaux sacrés. MOTS CLES : Trypanosoma evansi, Épidémiologie, Thaïlande, Éléphant d’Asie, Cheval

JURY : Président : Monsieur le Professeur Dominique Peyramond 1er Assesseur : Monsieur le Professeur Gilles Bourdoiseau 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Marc Artois

DATE DE SOUTENANCE : 18 novembre 2011

ADRESSE DE L’AUTEUR : Résidence de Petit Havre 12 route de la Plage 97190 GOSIER

Thèse - VetAgro Sup % 11% tables(des(illustrations((figure1...

Documents

Transcript of Thèse - VetAgro Sup % 11% tables(des(illustrations((figure1...