1

AFP CAacuteC ẤN CHỈ SINH HOacuteA SIEcircU AcircM VAgrave LỆCH BỘI NHIỂM SẮC THỂ Ths Bs Trần Mộng Thuacutey MỤC TIEcircU - Biết được nguồn gốc của Alpha-fetoprotein vagrave những ứng dụng của APF trong thai kỳ - Biết được caacutec dấu hiệu bất thường trecircn siecircu acircm để tầm soacuteat hội chứng Down vagrave caacutec rối lọan nhiễm sắc thể - Biết được caacutec xeacutet nghiệm sinh hoacutea trong tầm soacuteat hội chứng rối lọan nhiễm sắc thể - Biết được một số phương phaacutep phacircn tiacutech nhiễm sắc thể thường dugraveng 1 ALPHA-FETOPROTEIN (AFP ) AFP lagrave một protein được sản xuất chủ yếu ở gan của thai nhi vagrave caacutec yolk sac của phocirci thai phaacutet triển Nồng độ AFP thường được tăng lecircn đến khi thai nhi được sinh ra vagrave sau đoacute giảm nhanh choacuteng Ở trẻ em khỏe mạnh vagrave người lớn khocircng mang thai AFP bigravenh thường chỉ phaacutet hiện ở mức rất thấp AFP được sản xuất bất cứ khi nagraveo caacutec tế bagraveo gan được taacutei sinh Với caacutec bệnh gan matilden tiacutenh chẳng hạn như viecircm gan vagrave xơ gan AFP coacute thể được nacircng cao kinh niecircn Nồng độ rất cao của AFP coacute thể được sản xuất bởi caacutec khối u nhất định Đặc tiacutenh nagravey lagravem cho caacutec xeacutet nghiệm AFP hữu iacutech như lagrave một điểm đaacutenh dấu khối u Số lượng tăng của AFP được tigravem thấy ở nhiều người bị một loại ung thư gan được gọi lagrave ung thư biểu mocirc tế bagraveo gan AFP cũng được tigravem thấy ở một số người bị ung thư tinh hoagraven vagrave buồng trứng (69)

2

Ứng dụng trong thai kỳ Dugraveng trong tầm soaacutet dị tật thai nhi bị hở ống thần kinh Alpha-fetoprotein Huyết thanh mẹ (Maternal serum alpha-fetoprotein - MSAFP) Thai đang phaacutet triển coacute 2 loại protein maacuteu chiacutenh lagrave Albumin vagrave alpha-6 fetoprotein (AFP) Vigrave người trưởng thagravenh chỉ coacute albumin trong maacuteu necircn xeacutet nghiệm MSAFP được sử dụng để xaacutec định giaacuten tiếp lượng AFP trong maacuteu thai nhi Noacutei chung chỉ coacute một lượng nhỏ AFP trong dịch ối coacute thể qua baacutenh nhau để đi vagraveo maacuteu người mẹ Tuy nhiecircn khi coacute bất thường ống thần kinh do một phần ống thần kinh phocirci thai khocircng được đoacuteng kiacuten necircn AFP sẽ thoaacutet vagraveo dịch ối Caacutec bất thường ống thần kinh bao gồm

- Thai vocirc natildeo (do ống thần kinh phần đầu khocircng đoacuteng được) - Tật hở khe đốt sống (spina bifida do phần đuocirci ống thần kinh

khocircng đoacuteng được) Ở Mỹ tỷ lệ mắc caacutec loại bệnh nagravey 1-21000 trường hợp sinh Tương tự như vậy trong tật hở thagravenh bụng (gastroschisis) hay thoaacutet vị rốn (omphalocele) thigrave AFP từ thai sẽ đi vagraveo trong maacuteu mẹ với một lượng lớn hơn bigravenh thường (3) ETHể xeacutet nhiệm MSAFP coacute giaacute trị thigrave phải xaacutec định chiacutenh xaacutec tuổi thai vigrave MSAFP tăng theo tuổi thai (tăng theo kiacutech thước thai) MSAFP được tiacutenh theo bội số giaacute trị trung bigravenh (MoM) MoM tăng cao hơn bigravenh thường thigrave cagraveng coacute khả năng bị dị tật bẩm sinh MSAFP coacute độ nhạy lớn nhất trong tuổi thai 16-18 tuần nhưng thường người ta sử dụng noacute để tiacutenh nguy cơ trong giới hạn tuổi thai 15-22 tuần MSAFP coacute thể gia tăng vigrave nhiều lyacute do magrave khocircng liecircn quan đến tật hở ống thần kinh hoặc hở thagravenh bụng vigrave vậy xeacutet nghiệm nagravey khocircng đạt độ đặc hiệu 100 Lượng MSAFP cũng thay đổi theo caacutec yếu tố chủng tộc bệnh lyacute đaacutei đường của người mẹ Hơn nữa nguyecircn nhacircn phổ biến nhất gacircy tăng MSAFP giả lagrave do ước tiacutenh tuổi thai bị sai

3

Kết hợp sagraveng lọc MSAFP vagrave siecircu acircm coacute thể phaacutet hiện được hầu như tất cả caacutec thai vocirc natildeo (anencephaly) vagrave hầu hết caacutec trường hợp bị tật hở khe đốt sống (spina bifida) Tật khiếm khuyết ống thần kinh (neural tube defect NTDs) coacute thể được phacircn biệt với caacutec dị tật thai khaacutec (như hở thagravenh bụng) bằng caacutech dugraveng xeacutet nghiệm acetylcholinesterase từ dịch ối lấy được qua chọc ối Nếu acetylcholinesterase tăng song hagravenh với MSAFP thigrave khả năng coacute thể do khuyết ống thần kinh nhiều hơn Trường hợp khocircng phaacutet hiện được acetylcholinesterase thigrave cũng lagrave một dấu hiệu gợi yacute của một vagravei dị tật thai khaacutec (3 5 6) MSAFP coacute iacutech trong sagraveng lọc hội chứng Down vagrave một số coacute 3 nhiểm sắc thể khaacutec 2 CAacuteC ẤN CHỈ SIEcircU AcircM - Trong tam caacute nguyệt thứ nhất caacutec ấn chỉ bất thường về thai nhi trecircn siecircu acircm rất iacutet khoacute nhận thấy những khiếm khuyết về cấu truacutec chỉ coacute thể đo được độ mờ da gaacutey - Ở tam caacute nguyệt II trecircn siecircu acircm coacute nhiều dấu hiệu ghi nhận coacute thể gacircy bất thường cho thai nhi

- Nếp gaacutey dagravey (Nuchal Fold Thickening) - Nang đaacutem rối mạch mạc (Choroid Plexus Cyst) - Xương mũi ngắn hoặc khocircng coacute (Nasal Bone ndash Absence or

Hypoplasia) - Datilden natildeo thất (Ventriculomegaly) - Thận datilden (Renal Pyelectasis) - Điểm saacuteng ở tim (Echogenic Cardiac Focus ) - Điểm saacuteng ở ruột (Echogenic Bowel) - Xương caacutenh tay ngắn(Short Humerus ) - Một động mạch rốn (Single Umbilical Artery)

4

3 CAacuteC ẤN CHỈ SINH HOacuteA 31 Double test Xeacutet nghiệm Double test được thực hiện ở quyacute I của thai kỳ (từ 11 tuần 1 ngagravey đến 13 tuần 6 ngagravey) Double test coacute khả năng phaacutet hiện khoảng 85-95 thai bị hội chứng Down với 5 dương tiacutenh giả 95 thai bị hội chứng Edwards hoặc hội chứng Patau với 03 dương tiacutenh giả Double test được thực hiện bằng caacutech đo lượng β-hCG tự do (free beta-human chorionic gonadotropin) vagrave PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A) trong maacuteu thai phụ sau đoacute được tiacutenh toaacuten cugraveng với cacircn nặng chiều cao của mẹ tuổi thai độ mờ da gaacutey (nuchal translucency-NT) vagrave chiều dagravei đầu mocircng (fetal crown-rump length-CRL) đo bằng siecircu acircm nhờ một phần mềm chuyecircn dụng để đaacutenh giaacute nguy cơ caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ Caacutec chất hoacutea sinh necircu trecircn được thai sản xuất một caacutech bigravenh thường vagrave xuất hiện trong maacuteu mẹ trong quaacute trigravenh phaacutet triển của thai vagrave nhau thai Nếu thai coacute sự lệch bội lẻ nhiễm sắc thể (aneuploidies) nồng độ của caacutec chất nagravey sẽ thay đổi trong maacuteu mẹ vagrave việc định lượng chuacuteng trong maacuteu mẹ cugraveng với kết quả siecircu acircm coacute thể giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ dị tật bẩm sinh của thai(8) - β-hCG lagrave một glycoprotein được sản xuất bởi bagraveo thai giai đoạn sớm vagrave sau đoacute bởi lớp hợp bagraveo laacute nuocirci (syncytiotrophoblast) của nhau thai - PAPP-A lagrave hormone estriol dạng tự do được sản xuất từ gan vagrave nhau thai của thai Giaacute trị bigravenh thường của caacutec thocircng số β-hCG tự do vagrave PAPP-A maacuteu thai phụ sau khi hiệu chỉnh đều bằng 1 MoM Giaacute trị ngưỡng (cut-off) thấp vagrave cao của caacutec thocircng số để đaacutenh giaacute nguy cơ dị tật bẩm sinh như sau (4)

5

b-hCG tự do lt 04 hoặc gt 25 MoM PAPP-A lt 04 MoM b-hCG

PAPP-A

Độ nờ da gaacutey Nguy cơ mắc bệnh

Tăng Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Down Giảm Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Edward Thấp Thấp Hội chứng Patau - Trong hội chứng Down mức độ b-hCG tự do tăng đaacuteng kể mức độ PAPP-A coacute xu hướng giảm vagrave độ dagravey da gaacutey tăng Độ mờ da gaacutey coacute giaacute trị rất cao trong việc đaacutenh giaacute nguy cơ bất thường nhiễm sắc thể Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey lt 3mmm thigrave được xếp vagraveo nhoacutem nguy cơ thấp (iacutet coacute nguy cơ bị hội chứng Down) Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave 35-44 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lagrave 211 Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave ge 65 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lecircn tới 645 - Trong hội chứng Edward mức độ cả b-hCG tự do vagrave PAPP-A đều giảm - Trong hội chứng Patau mức độ b-hCG tự do vagrave PAPP-A noacutei chung lagrave thấp 32 Triple test Xeacutet nghiệm Triple test được lagravem ở quyacute II của thai kỳ (từ tuần thứ 14 đến tuần thứ 22) Lagrave một xeacutet nghiệm tầm soaacutet dị tật thai nhi bằng caacutech lấy maacuteu của mẹ thử ba chất alpha-fetoprotein (AFP) human chorionic gonadotropin (hCG) and unconjugated estriol (uE3)

6

Trước kia coacute nơi chỉ tầm soaacutet một yếu tố AFP để lagravem test gọi lagrave maternal serum AFP hay MSAFP nhưng ngagravey nay hầu hết caacutec phograveng thiacute nghiệm đều thực hiện test với ba yếu tố trecircn (3 8) Kết quả thử Triple test AFP UE3 hCG Nguy cơ mắc bệnh

Thấp Thấp Cao Hội chứng Down (Trisomy 21) Thấp Thấp Thấp Trisomy 18(Edwards syndrome) Cao Bigravenh

thường Bigravenh thường

Khiếm khuyết ống thần kinh spina bifida nếu kết hợp với tăng acetylcholinesterase nước ối coacute thể gặp trong thoaacutet vị rốn hở thagravenh bụng hoặc đa thai

Khi xeacutet nghiệm Double test vagrave Triple test rotilde nguy cơ cao thigrave sẽ thực hiện thủ thuật chọc ối Việc chọc ối để xeacutet nghiệm nhiễm sắc thể sẽ biết chiacutenh xaacutec coacute bị thai Down hay khocircng Nhưng một điều chuacute yacute giữa Double test vagrave Triple test lagrave Double test giuacutep phaacutet hiện sớm nguy cơ bị Down cograven Triple test phaacutet hiện thecircm nguy cơ thai coacute bị dị tật ống thần kinh 4 Quadruple test Nhiều bệnh viện cograven thử thecircm hormone inhibin A được gọi lagrave quadruple screen test Phograveng xeacutet nghiệm phacircn tiacutech caacutec mức độ của AFP hCG and uE3 and inhibin A

7

inhibin A tăng cao trong trisomy 21 vagrave thấp trong trisomy 18 (11)

Inhibin A Nguy cơ mắc bệnh Cao Trisomy 21 (Down Syndrome) Thấp Trisomy 18 (Edwards syndrome) Thay đổi Trisomy 13 (Patau syndrome)

CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH LỆCH BỘI NHIỂM SẮC

THỂ TRƯỚC SINH 1 ĐAacuteNH GIAacute MỘT SỐ PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NHIỄM SẮC THỂ

8

11 KỸ THUẬT LẬP KARYOTYPE BĂNG G

Để phacircn tiacutech đặc điểm bộ NST của một caacute thể về cả số lượng lẫn cấu truacutec người ta dựa trecircn bộ NST của tế bagraveo ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro-metaphase) của nguyecircn phacircn để lập karyotype Kỹ thuật được sử dụng phổ biến để lập karyotype lagrave kỹ thuật nhuộm băng G (higravenh1) hiện được sử dụng trong hầu hết caacutec phograveng xeacutet nghiệm di truyền tế bagraveo học vagrave được coi lagrave một trong những phương phaacutep phacircn tiacutech di truyền tế bagraveo học truyền thống Mặc dugrave đatilde coacute những phần mềm hỗ trợ cho việc lập karyotype nhưng để coacute một karyotype phục vụ tốt cho chẩn đoaacuten vagrave phacircn tiacutech caacutec băng trecircn NST đogravei hỏi rất nhiều đến kỹ năng vagrave kinh nghiệm của người lagravem tiecircu bản vagrave người đọc kết quả Với kỹ thuật nhuộm băng G độ phacircn giải của NST thường nằm trong giới hạn từ 350 - 850 băng trecircn bộ NST đơn bội với kiacutech thước mỗi băng từ 5-10Mb (Mb megabase 1Mb = 1000000 bases) ở độ phacircn giải bigravenh thường vagrave kiacutech thước mỗi băng từ 3 ndash 5 Mb đối ở độ phacircn giải cao do đoacute kỹ thuật nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước lớn hơn 3 Mb Caacutec trường hợp bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn kiacutech thước trecircn sẽ khocircng thể được phaacutet hiện Nhiều trường hợp taacutei sắp xếp của NST rất khoacute phaacutet hiện hoặc khocircng thể phaacutet hiện được bằng kỹ thuật nagravey do kiacutech thước quaacute nhỏ cường độ thuốc nhuộm khocircng đủ vagrave thiếu caacutec mẫu băng ở những đoạn NST đatilde bị thay đổi Để khắc phục nhược điểm nagravey caacutec phương phaacutep di truyền tế bagraveo - phacircn tử (molecular cytogenetic methods) đatilde được phaacutet triển trong caacutec thập niecircn 1980 vagrave 1990

9

Higravenh 1 Keacuteo dagravei băng nhiễm sắc thể ở người nam bigravenh thường 46XY

12 KỸ THUẬT LAI TAI CHỖ HUgraveYNH QUANG ( FISH FLUORESENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

Cugraveng với sự tiến bộ của siecircu acircm higravenh thể chẩn đoaacuten dị tật thai caacutec kỹ thuật hiện đại về sinh hoacutea miễn dich di truyền sinh học phacircn tử ngagravey cagraveng phaacutet triển mở ra những khả năng mới cho cocircng taacutec chẩn đoaacuten trước sinh Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH Fluorescence insitu hybridization) lagrave kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bagraveo vagrave sinh học phacircn tử trong đoacute đầu dograve đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa vagravehoặc nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ nhằm phaacutet hiện một caacutech chiacutenh xaacutec caacutec bất thường NST Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoaacuten trước sinh lagrave nhằm phaacutet hiện caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821 XY Trong chẩn đoaacuten trước sinh kỹ thuật nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối cổ điển đatilde được xem như một ứng dụng hiệu quả vagrave chiacutenh xaacutec trong

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

2

Ứng dụng trong thai kỳ Dugraveng trong tầm soaacutet dị tật thai nhi bị hở ống thần kinh Alpha-fetoprotein Huyết thanh mẹ (Maternal serum alpha-fetoprotein - MSAFP) Thai đang phaacutet triển coacute 2 loại protein maacuteu chiacutenh lagrave Albumin vagrave alpha-6 fetoprotein (AFP) Vigrave người trưởng thagravenh chỉ coacute albumin trong maacuteu necircn xeacutet nghiệm MSAFP được sử dụng để xaacutec định giaacuten tiếp lượng AFP trong maacuteu thai nhi Noacutei chung chỉ coacute một lượng nhỏ AFP trong dịch ối coacute thể qua baacutenh nhau để đi vagraveo maacuteu người mẹ Tuy nhiecircn khi coacute bất thường ống thần kinh do một phần ống thần kinh phocirci thai khocircng được đoacuteng kiacuten necircn AFP sẽ thoaacutet vagraveo dịch ối Caacutec bất thường ống thần kinh bao gồm

- Thai vocirc natildeo (do ống thần kinh phần đầu khocircng đoacuteng được) - Tật hở khe đốt sống (spina bifida do phần đuocirci ống thần kinh

khocircng đoacuteng được) Ở Mỹ tỷ lệ mắc caacutec loại bệnh nagravey 1-21000 trường hợp sinh Tương tự như vậy trong tật hở thagravenh bụng (gastroschisis) hay thoaacutet vị rốn (omphalocele) thigrave AFP từ thai sẽ đi vagraveo trong maacuteu mẹ với một lượng lớn hơn bigravenh thường (3) ETHể xeacutet nhiệm MSAFP coacute giaacute trị thigrave phải xaacutec định chiacutenh xaacutec tuổi thai vigrave MSAFP tăng theo tuổi thai (tăng theo kiacutech thước thai) MSAFP được tiacutenh theo bội số giaacute trị trung bigravenh (MoM) MoM tăng cao hơn bigravenh thường thigrave cagraveng coacute khả năng bị dị tật bẩm sinh MSAFP coacute độ nhạy lớn nhất trong tuổi thai 16-18 tuần nhưng thường người ta sử dụng noacute để tiacutenh nguy cơ trong giới hạn tuổi thai 15-22 tuần MSAFP coacute thể gia tăng vigrave nhiều lyacute do magrave khocircng liecircn quan đến tật hở ống thần kinh hoặc hở thagravenh bụng vigrave vậy xeacutet nghiệm nagravey khocircng đạt độ đặc hiệu 100 Lượng MSAFP cũng thay đổi theo caacutec yếu tố chủng tộc bệnh lyacute đaacutei đường của người mẹ Hơn nữa nguyecircn nhacircn phổ biến nhất gacircy tăng MSAFP giả lagrave do ước tiacutenh tuổi thai bị sai

3

Kết hợp sagraveng lọc MSAFP vagrave siecircu acircm coacute thể phaacutet hiện được hầu như tất cả caacutec thai vocirc natildeo (anencephaly) vagrave hầu hết caacutec trường hợp bị tật hở khe đốt sống (spina bifida) Tật khiếm khuyết ống thần kinh (neural tube defect NTDs) coacute thể được phacircn biệt với caacutec dị tật thai khaacutec (như hở thagravenh bụng) bằng caacutech dugraveng xeacutet nghiệm acetylcholinesterase từ dịch ối lấy được qua chọc ối Nếu acetylcholinesterase tăng song hagravenh với MSAFP thigrave khả năng coacute thể do khuyết ống thần kinh nhiều hơn Trường hợp khocircng phaacutet hiện được acetylcholinesterase thigrave cũng lagrave một dấu hiệu gợi yacute của một vagravei dị tật thai khaacutec (3 5 6) MSAFP coacute iacutech trong sagraveng lọc hội chứng Down vagrave một số coacute 3 nhiểm sắc thể khaacutec 2 CAacuteC ẤN CHỈ SIEcircU AcircM - Trong tam caacute nguyệt thứ nhất caacutec ấn chỉ bất thường về thai nhi trecircn siecircu acircm rất iacutet khoacute nhận thấy những khiếm khuyết về cấu truacutec chỉ coacute thể đo được độ mờ da gaacutey - Ở tam caacute nguyệt II trecircn siecircu acircm coacute nhiều dấu hiệu ghi nhận coacute thể gacircy bất thường cho thai nhi

- Nếp gaacutey dagravey (Nuchal Fold Thickening) - Nang đaacutem rối mạch mạc (Choroid Plexus Cyst) - Xương mũi ngắn hoặc khocircng coacute (Nasal Bone ndash Absence or

Hypoplasia) - Datilden natildeo thất (Ventriculomegaly) - Thận datilden (Renal Pyelectasis) - Điểm saacuteng ở tim (Echogenic Cardiac Focus ) - Điểm saacuteng ở ruột (Echogenic Bowel) - Xương caacutenh tay ngắn(Short Humerus ) - Một động mạch rốn (Single Umbilical Artery)

4

3 CAacuteC ẤN CHỈ SINH HOacuteA 31 Double test Xeacutet nghiệm Double test được thực hiện ở quyacute I của thai kỳ (từ 11 tuần 1 ngagravey đến 13 tuần 6 ngagravey) Double test coacute khả năng phaacutet hiện khoảng 85-95 thai bị hội chứng Down với 5 dương tiacutenh giả 95 thai bị hội chứng Edwards hoặc hội chứng Patau với 03 dương tiacutenh giả Double test được thực hiện bằng caacutech đo lượng β-hCG tự do (free beta-human chorionic gonadotropin) vagrave PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A) trong maacuteu thai phụ sau đoacute được tiacutenh toaacuten cugraveng với cacircn nặng chiều cao của mẹ tuổi thai độ mờ da gaacutey (nuchal translucency-NT) vagrave chiều dagravei đầu mocircng (fetal crown-rump length-CRL) đo bằng siecircu acircm nhờ một phần mềm chuyecircn dụng để đaacutenh giaacute nguy cơ caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ Caacutec chất hoacutea sinh necircu trecircn được thai sản xuất một caacutech bigravenh thường vagrave xuất hiện trong maacuteu mẹ trong quaacute trigravenh phaacutet triển của thai vagrave nhau thai Nếu thai coacute sự lệch bội lẻ nhiễm sắc thể (aneuploidies) nồng độ của caacutec chất nagravey sẽ thay đổi trong maacuteu mẹ vagrave việc định lượng chuacuteng trong maacuteu mẹ cugraveng với kết quả siecircu acircm coacute thể giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ dị tật bẩm sinh của thai(8) - β-hCG lagrave một glycoprotein được sản xuất bởi bagraveo thai giai đoạn sớm vagrave sau đoacute bởi lớp hợp bagraveo laacute nuocirci (syncytiotrophoblast) của nhau thai - PAPP-A lagrave hormone estriol dạng tự do được sản xuất từ gan vagrave nhau thai của thai Giaacute trị bigravenh thường của caacutec thocircng số β-hCG tự do vagrave PAPP-A maacuteu thai phụ sau khi hiệu chỉnh đều bằng 1 MoM Giaacute trị ngưỡng (cut-off) thấp vagrave cao của caacutec thocircng số để đaacutenh giaacute nguy cơ dị tật bẩm sinh như sau (4)

5

b-hCG tự do lt 04 hoặc gt 25 MoM PAPP-A lt 04 MoM b-hCG

PAPP-A

Độ nờ da gaacutey Nguy cơ mắc bệnh

Tăng Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Down Giảm Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Edward Thấp Thấp Hội chứng Patau - Trong hội chứng Down mức độ b-hCG tự do tăng đaacuteng kể mức độ PAPP-A coacute xu hướng giảm vagrave độ dagravey da gaacutey tăng Độ mờ da gaacutey coacute giaacute trị rất cao trong việc đaacutenh giaacute nguy cơ bất thường nhiễm sắc thể Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey lt 3mmm thigrave được xếp vagraveo nhoacutem nguy cơ thấp (iacutet coacute nguy cơ bị hội chứng Down) Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave 35-44 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lagrave 211 Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave ge 65 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lecircn tới 645 - Trong hội chứng Edward mức độ cả b-hCG tự do vagrave PAPP-A đều giảm - Trong hội chứng Patau mức độ b-hCG tự do vagrave PAPP-A noacutei chung lagrave thấp 32 Triple test Xeacutet nghiệm Triple test được lagravem ở quyacute II của thai kỳ (từ tuần thứ 14 đến tuần thứ 22) Lagrave một xeacutet nghiệm tầm soaacutet dị tật thai nhi bằng caacutech lấy maacuteu của mẹ thử ba chất alpha-fetoprotein (AFP) human chorionic gonadotropin (hCG) and unconjugated estriol (uE3)

6

Trước kia coacute nơi chỉ tầm soaacutet một yếu tố AFP để lagravem test gọi lagrave maternal serum AFP hay MSAFP nhưng ngagravey nay hầu hết caacutec phograveng thiacute nghiệm đều thực hiện test với ba yếu tố trecircn (3 8) Kết quả thử Triple test AFP UE3 hCG Nguy cơ mắc bệnh

Thấp Thấp Cao Hội chứng Down (Trisomy 21) Thấp Thấp Thấp Trisomy 18(Edwards syndrome) Cao Bigravenh

thường Bigravenh thường

Khiếm khuyết ống thần kinh spina bifida nếu kết hợp với tăng acetylcholinesterase nước ối coacute thể gặp trong thoaacutet vị rốn hở thagravenh bụng hoặc đa thai

Khi xeacutet nghiệm Double test vagrave Triple test rotilde nguy cơ cao thigrave sẽ thực hiện thủ thuật chọc ối Việc chọc ối để xeacutet nghiệm nhiễm sắc thể sẽ biết chiacutenh xaacutec coacute bị thai Down hay khocircng Nhưng một điều chuacute yacute giữa Double test vagrave Triple test lagrave Double test giuacutep phaacutet hiện sớm nguy cơ bị Down cograven Triple test phaacutet hiện thecircm nguy cơ thai coacute bị dị tật ống thần kinh 4 Quadruple test Nhiều bệnh viện cograven thử thecircm hormone inhibin A được gọi lagrave quadruple screen test Phograveng xeacutet nghiệm phacircn tiacutech caacutec mức độ của AFP hCG and uE3 and inhibin A

7

inhibin A tăng cao trong trisomy 21 vagrave thấp trong trisomy 18 (11)

Inhibin A Nguy cơ mắc bệnh Cao Trisomy 21 (Down Syndrome) Thấp Trisomy 18 (Edwards syndrome) Thay đổi Trisomy 13 (Patau syndrome)

CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH LỆCH BỘI NHIỂM SẮC

THỂ TRƯỚC SINH 1 ĐAacuteNH GIAacute MỘT SỐ PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NHIỄM SẮC THỂ

8

11 KỸ THUẬT LẬP KARYOTYPE BĂNG G

Để phacircn tiacutech đặc điểm bộ NST của một caacute thể về cả số lượng lẫn cấu truacutec người ta dựa trecircn bộ NST của tế bagraveo ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro-metaphase) của nguyecircn phacircn để lập karyotype Kỹ thuật được sử dụng phổ biến để lập karyotype lagrave kỹ thuật nhuộm băng G (higravenh1) hiện được sử dụng trong hầu hết caacutec phograveng xeacutet nghiệm di truyền tế bagraveo học vagrave được coi lagrave một trong những phương phaacutep phacircn tiacutech di truyền tế bagraveo học truyền thống Mặc dugrave đatilde coacute những phần mềm hỗ trợ cho việc lập karyotype nhưng để coacute một karyotype phục vụ tốt cho chẩn đoaacuten vagrave phacircn tiacutech caacutec băng trecircn NST đogravei hỏi rất nhiều đến kỹ năng vagrave kinh nghiệm của người lagravem tiecircu bản vagrave người đọc kết quả Với kỹ thuật nhuộm băng G độ phacircn giải của NST thường nằm trong giới hạn từ 350 - 850 băng trecircn bộ NST đơn bội với kiacutech thước mỗi băng từ 5-10Mb (Mb megabase 1Mb = 1000000 bases) ở độ phacircn giải bigravenh thường vagrave kiacutech thước mỗi băng từ 3 ndash 5 Mb đối ở độ phacircn giải cao do đoacute kỹ thuật nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước lớn hơn 3 Mb Caacutec trường hợp bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn kiacutech thước trecircn sẽ khocircng thể được phaacutet hiện Nhiều trường hợp taacutei sắp xếp của NST rất khoacute phaacutet hiện hoặc khocircng thể phaacutet hiện được bằng kỹ thuật nagravey do kiacutech thước quaacute nhỏ cường độ thuốc nhuộm khocircng đủ vagrave thiếu caacutec mẫu băng ở những đoạn NST đatilde bị thay đổi Để khắc phục nhược điểm nagravey caacutec phương phaacutep di truyền tế bagraveo - phacircn tử (molecular cytogenetic methods) đatilde được phaacutet triển trong caacutec thập niecircn 1980 vagrave 1990

9

Higravenh 1 Keacuteo dagravei băng nhiễm sắc thể ở người nam bigravenh thường 46XY

12 KỸ THUẬT LAI TAI CHỖ HUgraveYNH QUANG ( FISH FLUORESENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

Cugraveng với sự tiến bộ của siecircu acircm higravenh thể chẩn đoaacuten dị tật thai caacutec kỹ thuật hiện đại về sinh hoacutea miễn dich di truyền sinh học phacircn tử ngagravey cagraveng phaacutet triển mở ra những khả năng mới cho cocircng taacutec chẩn đoaacuten trước sinh Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH Fluorescence insitu hybridization) lagrave kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bagraveo vagrave sinh học phacircn tử trong đoacute đầu dograve đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa vagravehoặc nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ nhằm phaacutet hiện một caacutech chiacutenh xaacutec caacutec bất thường NST Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoaacuten trước sinh lagrave nhằm phaacutet hiện caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821 XY Trong chẩn đoaacuten trước sinh kỹ thuật nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối cổ điển đatilde được xem như một ứng dụng hiệu quả vagrave chiacutenh xaacutec trong

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

3

Kết hợp sagraveng lọc MSAFP vagrave siecircu acircm coacute thể phaacutet hiện được hầu như tất cả caacutec thai vocirc natildeo (anencephaly) vagrave hầu hết caacutec trường hợp bị tật hở khe đốt sống (spina bifida) Tật khiếm khuyết ống thần kinh (neural tube defect NTDs) coacute thể được phacircn biệt với caacutec dị tật thai khaacutec (như hở thagravenh bụng) bằng caacutech dugraveng xeacutet nghiệm acetylcholinesterase từ dịch ối lấy được qua chọc ối Nếu acetylcholinesterase tăng song hagravenh với MSAFP thigrave khả năng coacute thể do khuyết ống thần kinh nhiều hơn Trường hợp khocircng phaacutet hiện được acetylcholinesterase thigrave cũng lagrave một dấu hiệu gợi yacute của một vagravei dị tật thai khaacutec (3 5 6) MSAFP coacute iacutech trong sagraveng lọc hội chứng Down vagrave một số coacute 3 nhiểm sắc thể khaacutec 2 CAacuteC ẤN CHỈ SIEcircU AcircM - Trong tam caacute nguyệt thứ nhất caacutec ấn chỉ bất thường về thai nhi trecircn siecircu acircm rất iacutet khoacute nhận thấy những khiếm khuyết về cấu truacutec chỉ coacute thể đo được độ mờ da gaacutey - Ở tam caacute nguyệt II trecircn siecircu acircm coacute nhiều dấu hiệu ghi nhận coacute thể gacircy bất thường cho thai nhi

- Nếp gaacutey dagravey (Nuchal Fold Thickening) - Nang đaacutem rối mạch mạc (Choroid Plexus Cyst) - Xương mũi ngắn hoặc khocircng coacute (Nasal Bone ndash Absence or

Hypoplasia) - Datilden natildeo thất (Ventriculomegaly) - Thận datilden (Renal Pyelectasis) - Điểm saacuteng ở tim (Echogenic Cardiac Focus ) - Điểm saacuteng ở ruột (Echogenic Bowel) - Xương caacutenh tay ngắn(Short Humerus ) - Một động mạch rốn (Single Umbilical Artery)

4

3 CAacuteC ẤN CHỈ SINH HOacuteA 31 Double test Xeacutet nghiệm Double test được thực hiện ở quyacute I của thai kỳ (từ 11 tuần 1 ngagravey đến 13 tuần 6 ngagravey) Double test coacute khả năng phaacutet hiện khoảng 85-95 thai bị hội chứng Down với 5 dương tiacutenh giả 95 thai bị hội chứng Edwards hoặc hội chứng Patau với 03 dương tiacutenh giả Double test được thực hiện bằng caacutech đo lượng β-hCG tự do (free beta-human chorionic gonadotropin) vagrave PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A) trong maacuteu thai phụ sau đoacute được tiacutenh toaacuten cugraveng với cacircn nặng chiều cao của mẹ tuổi thai độ mờ da gaacutey (nuchal translucency-NT) vagrave chiều dagravei đầu mocircng (fetal crown-rump length-CRL) đo bằng siecircu acircm nhờ một phần mềm chuyecircn dụng để đaacutenh giaacute nguy cơ caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ Caacutec chất hoacutea sinh necircu trecircn được thai sản xuất một caacutech bigravenh thường vagrave xuất hiện trong maacuteu mẹ trong quaacute trigravenh phaacutet triển của thai vagrave nhau thai Nếu thai coacute sự lệch bội lẻ nhiễm sắc thể (aneuploidies) nồng độ của caacutec chất nagravey sẽ thay đổi trong maacuteu mẹ vagrave việc định lượng chuacuteng trong maacuteu mẹ cugraveng với kết quả siecircu acircm coacute thể giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ dị tật bẩm sinh của thai(8) - β-hCG lagrave một glycoprotein được sản xuất bởi bagraveo thai giai đoạn sớm vagrave sau đoacute bởi lớp hợp bagraveo laacute nuocirci (syncytiotrophoblast) của nhau thai - PAPP-A lagrave hormone estriol dạng tự do được sản xuất từ gan vagrave nhau thai của thai Giaacute trị bigravenh thường của caacutec thocircng số β-hCG tự do vagrave PAPP-A maacuteu thai phụ sau khi hiệu chỉnh đều bằng 1 MoM Giaacute trị ngưỡng (cut-off) thấp vagrave cao của caacutec thocircng số để đaacutenh giaacute nguy cơ dị tật bẩm sinh như sau (4)

5

b-hCG tự do lt 04 hoặc gt 25 MoM PAPP-A lt 04 MoM b-hCG

PAPP-A

Độ nờ da gaacutey Nguy cơ mắc bệnh

Tăng Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Down Giảm Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Edward Thấp Thấp Hội chứng Patau - Trong hội chứng Down mức độ b-hCG tự do tăng đaacuteng kể mức độ PAPP-A coacute xu hướng giảm vagrave độ dagravey da gaacutey tăng Độ mờ da gaacutey coacute giaacute trị rất cao trong việc đaacutenh giaacute nguy cơ bất thường nhiễm sắc thể Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey lt 3mmm thigrave được xếp vagraveo nhoacutem nguy cơ thấp (iacutet coacute nguy cơ bị hội chứng Down) Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave 35-44 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lagrave 211 Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave ge 65 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lecircn tới 645 - Trong hội chứng Edward mức độ cả b-hCG tự do vagrave PAPP-A đều giảm - Trong hội chứng Patau mức độ b-hCG tự do vagrave PAPP-A noacutei chung lagrave thấp 32 Triple test Xeacutet nghiệm Triple test được lagravem ở quyacute II của thai kỳ (từ tuần thứ 14 đến tuần thứ 22) Lagrave một xeacutet nghiệm tầm soaacutet dị tật thai nhi bằng caacutech lấy maacuteu của mẹ thử ba chất alpha-fetoprotein (AFP) human chorionic gonadotropin (hCG) and unconjugated estriol (uE3)

6

Trước kia coacute nơi chỉ tầm soaacutet một yếu tố AFP để lagravem test gọi lagrave maternal serum AFP hay MSAFP nhưng ngagravey nay hầu hết caacutec phograveng thiacute nghiệm đều thực hiện test với ba yếu tố trecircn (3 8) Kết quả thử Triple test AFP UE3 hCG Nguy cơ mắc bệnh

Thấp Thấp Cao Hội chứng Down (Trisomy 21) Thấp Thấp Thấp Trisomy 18(Edwards syndrome) Cao Bigravenh

thường Bigravenh thường

Khiếm khuyết ống thần kinh spina bifida nếu kết hợp với tăng acetylcholinesterase nước ối coacute thể gặp trong thoaacutet vị rốn hở thagravenh bụng hoặc đa thai

Khi xeacutet nghiệm Double test vagrave Triple test rotilde nguy cơ cao thigrave sẽ thực hiện thủ thuật chọc ối Việc chọc ối để xeacutet nghiệm nhiễm sắc thể sẽ biết chiacutenh xaacutec coacute bị thai Down hay khocircng Nhưng một điều chuacute yacute giữa Double test vagrave Triple test lagrave Double test giuacutep phaacutet hiện sớm nguy cơ bị Down cograven Triple test phaacutet hiện thecircm nguy cơ thai coacute bị dị tật ống thần kinh 4 Quadruple test Nhiều bệnh viện cograven thử thecircm hormone inhibin A được gọi lagrave quadruple screen test Phograveng xeacutet nghiệm phacircn tiacutech caacutec mức độ của AFP hCG and uE3 and inhibin A

7

inhibin A tăng cao trong trisomy 21 vagrave thấp trong trisomy 18 (11)

Inhibin A Nguy cơ mắc bệnh Cao Trisomy 21 (Down Syndrome) Thấp Trisomy 18 (Edwards syndrome) Thay đổi Trisomy 13 (Patau syndrome)

CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH LỆCH BỘI NHIỂM SẮC

THỂ TRƯỚC SINH 1 ĐAacuteNH GIAacute MỘT SỐ PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NHIỄM SẮC THỂ

8

11 KỸ THUẬT LẬP KARYOTYPE BĂNG G

Để phacircn tiacutech đặc điểm bộ NST của một caacute thể về cả số lượng lẫn cấu truacutec người ta dựa trecircn bộ NST của tế bagraveo ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro-metaphase) của nguyecircn phacircn để lập karyotype Kỹ thuật được sử dụng phổ biến để lập karyotype lagrave kỹ thuật nhuộm băng G (higravenh1) hiện được sử dụng trong hầu hết caacutec phograveng xeacutet nghiệm di truyền tế bagraveo học vagrave được coi lagrave một trong những phương phaacutep phacircn tiacutech di truyền tế bagraveo học truyền thống Mặc dugrave đatilde coacute những phần mềm hỗ trợ cho việc lập karyotype nhưng để coacute một karyotype phục vụ tốt cho chẩn đoaacuten vagrave phacircn tiacutech caacutec băng trecircn NST đogravei hỏi rất nhiều đến kỹ năng vagrave kinh nghiệm của người lagravem tiecircu bản vagrave người đọc kết quả Với kỹ thuật nhuộm băng G độ phacircn giải của NST thường nằm trong giới hạn từ 350 - 850 băng trecircn bộ NST đơn bội với kiacutech thước mỗi băng từ 5-10Mb (Mb megabase 1Mb = 1000000 bases) ở độ phacircn giải bigravenh thường vagrave kiacutech thước mỗi băng từ 3 ndash 5 Mb đối ở độ phacircn giải cao do đoacute kỹ thuật nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước lớn hơn 3 Mb Caacutec trường hợp bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn kiacutech thước trecircn sẽ khocircng thể được phaacutet hiện Nhiều trường hợp taacutei sắp xếp của NST rất khoacute phaacutet hiện hoặc khocircng thể phaacutet hiện được bằng kỹ thuật nagravey do kiacutech thước quaacute nhỏ cường độ thuốc nhuộm khocircng đủ vagrave thiếu caacutec mẫu băng ở những đoạn NST đatilde bị thay đổi Để khắc phục nhược điểm nagravey caacutec phương phaacutep di truyền tế bagraveo - phacircn tử (molecular cytogenetic methods) đatilde được phaacutet triển trong caacutec thập niecircn 1980 vagrave 1990

9

Higravenh 1 Keacuteo dagravei băng nhiễm sắc thể ở người nam bigravenh thường 46XY

12 KỸ THUẬT LAI TAI CHỖ HUgraveYNH QUANG ( FISH FLUORESENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

Cugraveng với sự tiến bộ của siecircu acircm higravenh thể chẩn đoaacuten dị tật thai caacutec kỹ thuật hiện đại về sinh hoacutea miễn dich di truyền sinh học phacircn tử ngagravey cagraveng phaacutet triển mở ra những khả năng mới cho cocircng taacutec chẩn đoaacuten trước sinh Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH Fluorescence insitu hybridization) lagrave kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bagraveo vagrave sinh học phacircn tử trong đoacute đầu dograve đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa vagravehoặc nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ nhằm phaacutet hiện một caacutech chiacutenh xaacutec caacutec bất thường NST Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoaacuten trước sinh lagrave nhằm phaacutet hiện caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821 XY Trong chẩn đoaacuten trước sinh kỹ thuật nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối cổ điển đatilde được xem như một ứng dụng hiệu quả vagrave chiacutenh xaacutec trong

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

4

3 CAacuteC ẤN CHỈ SINH HOacuteA 31 Double test Xeacutet nghiệm Double test được thực hiện ở quyacute I của thai kỳ (từ 11 tuần 1 ngagravey đến 13 tuần 6 ngagravey) Double test coacute khả năng phaacutet hiện khoảng 85-95 thai bị hội chứng Down với 5 dương tiacutenh giả 95 thai bị hội chứng Edwards hoặc hội chứng Patau với 03 dương tiacutenh giả Double test được thực hiện bằng caacutech đo lượng β-hCG tự do (free beta-human chorionic gonadotropin) vagrave PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A) trong maacuteu thai phụ sau đoacute được tiacutenh toaacuten cugraveng với cacircn nặng chiều cao của mẹ tuổi thai độ mờ da gaacutey (nuchal translucency-NT) vagrave chiều dagravei đầu mocircng (fetal crown-rump length-CRL) đo bằng siecircu acircm nhờ một phần mềm chuyecircn dụng để đaacutenh giaacute nguy cơ caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ Caacutec chất hoacutea sinh necircu trecircn được thai sản xuất một caacutech bigravenh thường vagrave xuất hiện trong maacuteu mẹ trong quaacute trigravenh phaacutet triển của thai vagrave nhau thai Nếu thai coacute sự lệch bội lẻ nhiễm sắc thể (aneuploidies) nồng độ của caacutec chất nagravey sẽ thay đổi trong maacuteu mẹ vagrave việc định lượng chuacuteng trong maacuteu mẹ cugraveng với kết quả siecircu acircm coacute thể giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ dị tật bẩm sinh của thai(8) - β-hCG lagrave một glycoprotein được sản xuất bởi bagraveo thai giai đoạn sớm vagrave sau đoacute bởi lớp hợp bagraveo laacute nuocirci (syncytiotrophoblast) của nhau thai - PAPP-A lagrave hormone estriol dạng tự do được sản xuất từ gan vagrave nhau thai của thai Giaacute trị bigravenh thường của caacutec thocircng số β-hCG tự do vagrave PAPP-A maacuteu thai phụ sau khi hiệu chỉnh đều bằng 1 MoM Giaacute trị ngưỡng (cut-off) thấp vagrave cao của caacutec thocircng số để đaacutenh giaacute nguy cơ dị tật bẩm sinh như sau (4)

5

b-hCG tự do lt 04 hoặc gt 25 MoM PAPP-A lt 04 MoM b-hCG

PAPP-A

Độ nờ da gaacutey Nguy cơ mắc bệnh

Tăng Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Down Giảm Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Edward Thấp Thấp Hội chứng Patau - Trong hội chứng Down mức độ b-hCG tự do tăng đaacuteng kể mức độ PAPP-A coacute xu hướng giảm vagrave độ dagravey da gaacutey tăng Độ mờ da gaacutey coacute giaacute trị rất cao trong việc đaacutenh giaacute nguy cơ bất thường nhiễm sắc thể Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey lt 3mmm thigrave được xếp vagraveo nhoacutem nguy cơ thấp (iacutet coacute nguy cơ bị hội chứng Down) Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave 35-44 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lagrave 211 Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave ge 65 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lecircn tới 645 - Trong hội chứng Edward mức độ cả b-hCG tự do vagrave PAPP-A đều giảm - Trong hội chứng Patau mức độ b-hCG tự do vagrave PAPP-A noacutei chung lagrave thấp 32 Triple test Xeacutet nghiệm Triple test được lagravem ở quyacute II của thai kỳ (từ tuần thứ 14 đến tuần thứ 22) Lagrave một xeacutet nghiệm tầm soaacutet dị tật thai nhi bằng caacutech lấy maacuteu của mẹ thử ba chất alpha-fetoprotein (AFP) human chorionic gonadotropin (hCG) and unconjugated estriol (uE3)

6

Trước kia coacute nơi chỉ tầm soaacutet một yếu tố AFP để lagravem test gọi lagrave maternal serum AFP hay MSAFP nhưng ngagravey nay hầu hết caacutec phograveng thiacute nghiệm đều thực hiện test với ba yếu tố trecircn (3 8) Kết quả thử Triple test AFP UE3 hCG Nguy cơ mắc bệnh

Thấp Thấp Cao Hội chứng Down (Trisomy 21) Thấp Thấp Thấp Trisomy 18(Edwards syndrome) Cao Bigravenh

thường Bigravenh thường

Khiếm khuyết ống thần kinh spina bifida nếu kết hợp với tăng acetylcholinesterase nước ối coacute thể gặp trong thoaacutet vị rốn hở thagravenh bụng hoặc đa thai

Khi xeacutet nghiệm Double test vagrave Triple test rotilde nguy cơ cao thigrave sẽ thực hiện thủ thuật chọc ối Việc chọc ối để xeacutet nghiệm nhiễm sắc thể sẽ biết chiacutenh xaacutec coacute bị thai Down hay khocircng Nhưng một điều chuacute yacute giữa Double test vagrave Triple test lagrave Double test giuacutep phaacutet hiện sớm nguy cơ bị Down cograven Triple test phaacutet hiện thecircm nguy cơ thai coacute bị dị tật ống thần kinh 4 Quadruple test Nhiều bệnh viện cograven thử thecircm hormone inhibin A được gọi lagrave quadruple screen test Phograveng xeacutet nghiệm phacircn tiacutech caacutec mức độ của AFP hCG and uE3 and inhibin A

7

inhibin A tăng cao trong trisomy 21 vagrave thấp trong trisomy 18 (11)

Inhibin A Nguy cơ mắc bệnh Cao Trisomy 21 (Down Syndrome) Thấp Trisomy 18 (Edwards syndrome) Thay đổi Trisomy 13 (Patau syndrome)

CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH LỆCH BỘI NHIỂM SẮC

THỂ TRƯỚC SINH 1 ĐAacuteNH GIAacute MỘT SỐ PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NHIỄM SẮC THỂ

8

11 KỸ THUẬT LẬP KARYOTYPE BĂNG G

Để phacircn tiacutech đặc điểm bộ NST của một caacute thể về cả số lượng lẫn cấu truacutec người ta dựa trecircn bộ NST của tế bagraveo ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro-metaphase) của nguyecircn phacircn để lập karyotype Kỹ thuật được sử dụng phổ biến để lập karyotype lagrave kỹ thuật nhuộm băng G (higravenh1) hiện được sử dụng trong hầu hết caacutec phograveng xeacutet nghiệm di truyền tế bagraveo học vagrave được coi lagrave một trong những phương phaacutep phacircn tiacutech di truyền tế bagraveo học truyền thống Mặc dugrave đatilde coacute những phần mềm hỗ trợ cho việc lập karyotype nhưng để coacute một karyotype phục vụ tốt cho chẩn đoaacuten vagrave phacircn tiacutech caacutec băng trecircn NST đogravei hỏi rất nhiều đến kỹ năng vagrave kinh nghiệm của người lagravem tiecircu bản vagrave người đọc kết quả Với kỹ thuật nhuộm băng G độ phacircn giải của NST thường nằm trong giới hạn từ 350 - 850 băng trecircn bộ NST đơn bội với kiacutech thước mỗi băng từ 5-10Mb (Mb megabase 1Mb = 1000000 bases) ở độ phacircn giải bigravenh thường vagrave kiacutech thước mỗi băng từ 3 ndash 5 Mb đối ở độ phacircn giải cao do đoacute kỹ thuật nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước lớn hơn 3 Mb Caacutec trường hợp bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn kiacutech thước trecircn sẽ khocircng thể được phaacutet hiện Nhiều trường hợp taacutei sắp xếp của NST rất khoacute phaacutet hiện hoặc khocircng thể phaacutet hiện được bằng kỹ thuật nagravey do kiacutech thước quaacute nhỏ cường độ thuốc nhuộm khocircng đủ vagrave thiếu caacutec mẫu băng ở những đoạn NST đatilde bị thay đổi Để khắc phục nhược điểm nagravey caacutec phương phaacutep di truyền tế bagraveo - phacircn tử (molecular cytogenetic methods) đatilde được phaacutet triển trong caacutec thập niecircn 1980 vagrave 1990

9

Higravenh 1 Keacuteo dagravei băng nhiễm sắc thể ở người nam bigravenh thường 46XY

12 KỸ THUẬT LAI TAI CHỖ HUgraveYNH QUANG ( FISH FLUORESENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

Cugraveng với sự tiến bộ của siecircu acircm higravenh thể chẩn đoaacuten dị tật thai caacutec kỹ thuật hiện đại về sinh hoacutea miễn dich di truyền sinh học phacircn tử ngagravey cagraveng phaacutet triển mở ra những khả năng mới cho cocircng taacutec chẩn đoaacuten trước sinh Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH Fluorescence insitu hybridization) lagrave kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bagraveo vagrave sinh học phacircn tử trong đoacute đầu dograve đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa vagravehoặc nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ nhằm phaacutet hiện một caacutech chiacutenh xaacutec caacutec bất thường NST Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoaacuten trước sinh lagrave nhằm phaacutet hiện caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821 XY Trong chẩn đoaacuten trước sinh kỹ thuật nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối cổ điển đatilde được xem như một ứng dụng hiệu quả vagrave chiacutenh xaacutec trong

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

5

b-hCG tự do lt 04 hoặc gt 25 MoM PAPP-A lt 04 MoM b-hCG

PAPP-A

Độ nờ da gaacutey Nguy cơ mắc bệnh

Tăng Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Down Giảm Giảm Tăng gt 3mm Hội chứng Edward Thấp Thấp Hội chứng Patau - Trong hội chứng Down mức độ b-hCG tự do tăng đaacuteng kể mức độ PAPP-A coacute xu hướng giảm vagrave độ dagravey da gaacutey tăng Độ mờ da gaacutey coacute giaacute trị rất cao trong việc đaacutenh giaacute nguy cơ bất thường nhiễm sắc thể Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey lt 3mmm thigrave được xếp vagraveo nhoacutem nguy cơ thấp (iacutet coacute nguy cơ bị hội chứng Down) Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave 35-44 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lagrave 211 Nếu thai coacute độ mờ da gaacutey dagravey lagrave ge 65 mm tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể lecircn tới 645 - Trong hội chứng Edward mức độ cả b-hCG tự do vagrave PAPP-A đều giảm - Trong hội chứng Patau mức độ b-hCG tự do vagrave PAPP-A noacutei chung lagrave thấp 32 Triple test Xeacutet nghiệm Triple test được lagravem ở quyacute II của thai kỳ (từ tuần thứ 14 đến tuần thứ 22) Lagrave một xeacutet nghiệm tầm soaacutet dị tật thai nhi bằng caacutech lấy maacuteu của mẹ thử ba chất alpha-fetoprotein (AFP) human chorionic gonadotropin (hCG) and unconjugated estriol (uE3)

6

Trước kia coacute nơi chỉ tầm soaacutet một yếu tố AFP để lagravem test gọi lagrave maternal serum AFP hay MSAFP nhưng ngagravey nay hầu hết caacutec phograveng thiacute nghiệm đều thực hiện test với ba yếu tố trecircn (3 8) Kết quả thử Triple test AFP UE3 hCG Nguy cơ mắc bệnh

Thấp Thấp Cao Hội chứng Down (Trisomy 21) Thấp Thấp Thấp Trisomy 18(Edwards syndrome) Cao Bigravenh

thường Bigravenh thường

Khiếm khuyết ống thần kinh spina bifida nếu kết hợp với tăng acetylcholinesterase nước ối coacute thể gặp trong thoaacutet vị rốn hở thagravenh bụng hoặc đa thai

Khi xeacutet nghiệm Double test vagrave Triple test rotilde nguy cơ cao thigrave sẽ thực hiện thủ thuật chọc ối Việc chọc ối để xeacutet nghiệm nhiễm sắc thể sẽ biết chiacutenh xaacutec coacute bị thai Down hay khocircng Nhưng một điều chuacute yacute giữa Double test vagrave Triple test lagrave Double test giuacutep phaacutet hiện sớm nguy cơ bị Down cograven Triple test phaacutet hiện thecircm nguy cơ thai coacute bị dị tật ống thần kinh 4 Quadruple test Nhiều bệnh viện cograven thử thecircm hormone inhibin A được gọi lagrave quadruple screen test Phograveng xeacutet nghiệm phacircn tiacutech caacutec mức độ của AFP hCG and uE3 and inhibin A

7

inhibin A tăng cao trong trisomy 21 vagrave thấp trong trisomy 18 (11)

Inhibin A Nguy cơ mắc bệnh Cao Trisomy 21 (Down Syndrome) Thấp Trisomy 18 (Edwards syndrome) Thay đổi Trisomy 13 (Patau syndrome)

CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH LỆCH BỘI NHIỂM SẮC

THỂ TRƯỚC SINH 1 ĐAacuteNH GIAacute MỘT SỐ PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NHIỄM SẮC THỂ

8

11 KỸ THUẬT LẬP KARYOTYPE BĂNG G

Để phacircn tiacutech đặc điểm bộ NST của một caacute thể về cả số lượng lẫn cấu truacutec người ta dựa trecircn bộ NST của tế bagraveo ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro-metaphase) của nguyecircn phacircn để lập karyotype Kỹ thuật được sử dụng phổ biến để lập karyotype lagrave kỹ thuật nhuộm băng G (higravenh1) hiện được sử dụng trong hầu hết caacutec phograveng xeacutet nghiệm di truyền tế bagraveo học vagrave được coi lagrave một trong những phương phaacutep phacircn tiacutech di truyền tế bagraveo học truyền thống Mặc dugrave đatilde coacute những phần mềm hỗ trợ cho việc lập karyotype nhưng để coacute một karyotype phục vụ tốt cho chẩn đoaacuten vagrave phacircn tiacutech caacutec băng trecircn NST đogravei hỏi rất nhiều đến kỹ năng vagrave kinh nghiệm của người lagravem tiecircu bản vagrave người đọc kết quả Với kỹ thuật nhuộm băng G độ phacircn giải của NST thường nằm trong giới hạn từ 350 - 850 băng trecircn bộ NST đơn bội với kiacutech thước mỗi băng từ 5-10Mb (Mb megabase 1Mb = 1000000 bases) ở độ phacircn giải bigravenh thường vagrave kiacutech thước mỗi băng từ 3 ndash 5 Mb đối ở độ phacircn giải cao do đoacute kỹ thuật nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước lớn hơn 3 Mb Caacutec trường hợp bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn kiacutech thước trecircn sẽ khocircng thể được phaacutet hiện Nhiều trường hợp taacutei sắp xếp của NST rất khoacute phaacutet hiện hoặc khocircng thể phaacutet hiện được bằng kỹ thuật nagravey do kiacutech thước quaacute nhỏ cường độ thuốc nhuộm khocircng đủ vagrave thiếu caacutec mẫu băng ở những đoạn NST đatilde bị thay đổi Để khắc phục nhược điểm nagravey caacutec phương phaacutep di truyền tế bagraveo - phacircn tử (molecular cytogenetic methods) đatilde được phaacutet triển trong caacutec thập niecircn 1980 vagrave 1990

9

Higravenh 1 Keacuteo dagravei băng nhiễm sắc thể ở người nam bigravenh thường 46XY

12 KỸ THUẬT LAI TAI CHỖ HUgraveYNH QUANG ( FISH FLUORESENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

Cugraveng với sự tiến bộ của siecircu acircm higravenh thể chẩn đoaacuten dị tật thai caacutec kỹ thuật hiện đại về sinh hoacutea miễn dich di truyền sinh học phacircn tử ngagravey cagraveng phaacutet triển mở ra những khả năng mới cho cocircng taacutec chẩn đoaacuten trước sinh Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH Fluorescence insitu hybridization) lagrave kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bagraveo vagrave sinh học phacircn tử trong đoacute đầu dograve đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa vagravehoặc nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ nhằm phaacutet hiện một caacutech chiacutenh xaacutec caacutec bất thường NST Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoaacuten trước sinh lagrave nhằm phaacutet hiện caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821 XY Trong chẩn đoaacuten trước sinh kỹ thuật nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối cổ điển đatilde được xem như một ứng dụng hiệu quả vagrave chiacutenh xaacutec trong

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

6

Trước kia coacute nơi chỉ tầm soaacutet một yếu tố AFP để lagravem test gọi lagrave maternal serum AFP hay MSAFP nhưng ngagravey nay hầu hết caacutec phograveng thiacute nghiệm đều thực hiện test với ba yếu tố trecircn (3 8) Kết quả thử Triple test AFP UE3 hCG Nguy cơ mắc bệnh

Thấp Thấp Cao Hội chứng Down (Trisomy 21) Thấp Thấp Thấp Trisomy 18(Edwards syndrome) Cao Bigravenh

thường Bigravenh thường

Khiếm khuyết ống thần kinh spina bifida nếu kết hợp với tăng acetylcholinesterase nước ối coacute thể gặp trong thoaacutet vị rốn hở thagravenh bụng hoặc đa thai

Khi xeacutet nghiệm Double test vagrave Triple test rotilde nguy cơ cao thigrave sẽ thực hiện thủ thuật chọc ối Việc chọc ối để xeacutet nghiệm nhiễm sắc thể sẽ biết chiacutenh xaacutec coacute bị thai Down hay khocircng Nhưng một điều chuacute yacute giữa Double test vagrave Triple test lagrave Double test giuacutep phaacutet hiện sớm nguy cơ bị Down cograven Triple test phaacutet hiện thecircm nguy cơ thai coacute bị dị tật ống thần kinh 4 Quadruple test Nhiều bệnh viện cograven thử thecircm hormone inhibin A được gọi lagrave quadruple screen test Phograveng xeacutet nghiệm phacircn tiacutech caacutec mức độ của AFP hCG and uE3 and inhibin A

7

inhibin A tăng cao trong trisomy 21 vagrave thấp trong trisomy 18 (11)

Inhibin A Nguy cơ mắc bệnh Cao Trisomy 21 (Down Syndrome) Thấp Trisomy 18 (Edwards syndrome) Thay đổi Trisomy 13 (Patau syndrome)

CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH LỆCH BỘI NHIỂM SẮC

THỂ TRƯỚC SINH 1 ĐAacuteNH GIAacute MỘT SỐ PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NHIỄM SẮC THỂ

8

11 KỸ THUẬT LẬP KARYOTYPE BĂNG G

Để phacircn tiacutech đặc điểm bộ NST của một caacute thể về cả số lượng lẫn cấu truacutec người ta dựa trecircn bộ NST của tế bagraveo ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro-metaphase) của nguyecircn phacircn để lập karyotype Kỹ thuật được sử dụng phổ biến để lập karyotype lagrave kỹ thuật nhuộm băng G (higravenh1) hiện được sử dụng trong hầu hết caacutec phograveng xeacutet nghiệm di truyền tế bagraveo học vagrave được coi lagrave một trong những phương phaacutep phacircn tiacutech di truyền tế bagraveo học truyền thống Mặc dugrave đatilde coacute những phần mềm hỗ trợ cho việc lập karyotype nhưng để coacute một karyotype phục vụ tốt cho chẩn đoaacuten vagrave phacircn tiacutech caacutec băng trecircn NST đogravei hỏi rất nhiều đến kỹ năng vagrave kinh nghiệm của người lagravem tiecircu bản vagrave người đọc kết quả Với kỹ thuật nhuộm băng G độ phacircn giải của NST thường nằm trong giới hạn từ 350 - 850 băng trecircn bộ NST đơn bội với kiacutech thước mỗi băng từ 5-10Mb (Mb megabase 1Mb = 1000000 bases) ở độ phacircn giải bigravenh thường vagrave kiacutech thước mỗi băng từ 3 ndash 5 Mb đối ở độ phacircn giải cao do đoacute kỹ thuật nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước lớn hơn 3 Mb Caacutec trường hợp bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn kiacutech thước trecircn sẽ khocircng thể được phaacutet hiện Nhiều trường hợp taacutei sắp xếp của NST rất khoacute phaacutet hiện hoặc khocircng thể phaacutet hiện được bằng kỹ thuật nagravey do kiacutech thước quaacute nhỏ cường độ thuốc nhuộm khocircng đủ vagrave thiếu caacutec mẫu băng ở những đoạn NST đatilde bị thay đổi Để khắc phục nhược điểm nagravey caacutec phương phaacutep di truyền tế bagraveo - phacircn tử (molecular cytogenetic methods) đatilde được phaacutet triển trong caacutec thập niecircn 1980 vagrave 1990

9

Higravenh 1 Keacuteo dagravei băng nhiễm sắc thể ở người nam bigravenh thường 46XY

12 KỸ THUẬT LAI TAI CHỖ HUgraveYNH QUANG ( FISH FLUORESENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

Cugraveng với sự tiến bộ của siecircu acircm higravenh thể chẩn đoaacuten dị tật thai caacutec kỹ thuật hiện đại về sinh hoacutea miễn dich di truyền sinh học phacircn tử ngagravey cagraveng phaacutet triển mở ra những khả năng mới cho cocircng taacutec chẩn đoaacuten trước sinh Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH Fluorescence insitu hybridization) lagrave kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bagraveo vagrave sinh học phacircn tử trong đoacute đầu dograve đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa vagravehoặc nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ nhằm phaacutet hiện một caacutech chiacutenh xaacutec caacutec bất thường NST Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoaacuten trước sinh lagrave nhằm phaacutet hiện caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821 XY Trong chẩn đoaacuten trước sinh kỹ thuật nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối cổ điển đatilde được xem như một ứng dụng hiệu quả vagrave chiacutenh xaacutec trong

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

7

inhibin A tăng cao trong trisomy 21 vagrave thấp trong trisomy 18 (11)

Inhibin A Nguy cơ mắc bệnh Cao Trisomy 21 (Down Syndrome) Thấp Trisomy 18 (Edwards syndrome) Thay đổi Trisomy 13 (Patau syndrome)

CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH LỆCH BỘI NHIỂM SẮC

THỂ TRƯỚC SINH 1 ĐAacuteNH GIAacute MỘT SỐ PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NHIỄM SẮC THỂ

8

11 KỸ THUẬT LẬP KARYOTYPE BĂNG G

Để phacircn tiacutech đặc điểm bộ NST của một caacute thể về cả số lượng lẫn cấu truacutec người ta dựa trecircn bộ NST của tế bagraveo ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro-metaphase) của nguyecircn phacircn để lập karyotype Kỹ thuật được sử dụng phổ biến để lập karyotype lagrave kỹ thuật nhuộm băng G (higravenh1) hiện được sử dụng trong hầu hết caacutec phograveng xeacutet nghiệm di truyền tế bagraveo học vagrave được coi lagrave một trong những phương phaacutep phacircn tiacutech di truyền tế bagraveo học truyền thống Mặc dugrave đatilde coacute những phần mềm hỗ trợ cho việc lập karyotype nhưng để coacute một karyotype phục vụ tốt cho chẩn đoaacuten vagrave phacircn tiacutech caacutec băng trecircn NST đogravei hỏi rất nhiều đến kỹ năng vagrave kinh nghiệm của người lagravem tiecircu bản vagrave người đọc kết quả Với kỹ thuật nhuộm băng G độ phacircn giải của NST thường nằm trong giới hạn từ 350 - 850 băng trecircn bộ NST đơn bội với kiacutech thước mỗi băng từ 5-10Mb (Mb megabase 1Mb = 1000000 bases) ở độ phacircn giải bigravenh thường vagrave kiacutech thước mỗi băng từ 3 ndash 5 Mb đối ở độ phacircn giải cao do đoacute kỹ thuật nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước lớn hơn 3 Mb Caacutec trường hợp bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn kiacutech thước trecircn sẽ khocircng thể được phaacutet hiện Nhiều trường hợp taacutei sắp xếp của NST rất khoacute phaacutet hiện hoặc khocircng thể phaacutet hiện được bằng kỹ thuật nagravey do kiacutech thước quaacute nhỏ cường độ thuốc nhuộm khocircng đủ vagrave thiếu caacutec mẫu băng ở những đoạn NST đatilde bị thay đổi Để khắc phục nhược điểm nagravey caacutec phương phaacutep di truyền tế bagraveo - phacircn tử (molecular cytogenetic methods) đatilde được phaacutet triển trong caacutec thập niecircn 1980 vagrave 1990

9

Higravenh 1 Keacuteo dagravei băng nhiễm sắc thể ở người nam bigravenh thường 46XY

12 KỸ THUẬT LAI TAI CHỖ HUgraveYNH QUANG ( FISH FLUORESENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

Cugraveng với sự tiến bộ của siecircu acircm higravenh thể chẩn đoaacuten dị tật thai caacutec kỹ thuật hiện đại về sinh hoacutea miễn dich di truyền sinh học phacircn tử ngagravey cagraveng phaacutet triển mở ra những khả năng mới cho cocircng taacutec chẩn đoaacuten trước sinh Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH Fluorescence insitu hybridization) lagrave kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bagraveo vagrave sinh học phacircn tử trong đoacute đầu dograve đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa vagravehoặc nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ nhằm phaacutet hiện một caacutech chiacutenh xaacutec caacutec bất thường NST Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoaacuten trước sinh lagrave nhằm phaacutet hiện caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821 XY Trong chẩn đoaacuten trước sinh kỹ thuật nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối cổ điển đatilde được xem như một ứng dụng hiệu quả vagrave chiacutenh xaacutec trong

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

8

11 KỸ THUẬT LẬP KARYOTYPE BĂNG G

Để phacircn tiacutech đặc điểm bộ NST của một caacute thể về cả số lượng lẫn cấu truacutec người ta dựa trecircn bộ NST của tế bagraveo ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro-metaphase) của nguyecircn phacircn để lập karyotype Kỹ thuật được sử dụng phổ biến để lập karyotype lagrave kỹ thuật nhuộm băng G (higravenh1) hiện được sử dụng trong hầu hết caacutec phograveng xeacutet nghiệm di truyền tế bagraveo học vagrave được coi lagrave một trong những phương phaacutep phacircn tiacutech di truyền tế bagraveo học truyền thống Mặc dugrave đatilde coacute những phần mềm hỗ trợ cho việc lập karyotype nhưng để coacute một karyotype phục vụ tốt cho chẩn đoaacuten vagrave phacircn tiacutech caacutec băng trecircn NST đogravei hỏi rất nhiều đến kỹ năng vagrave kinh nghiệm của người lagravem tiecircu bản vagrave người đọc kết quả Với kỹ thuật nhuộm băng G độ phacircn giải của NST thường nằm trong giới hạn từ 350 - 850 băng trecircn bộ NST đơn bội với kiacutech thước mỗi băng từ 5-10Mb (Mb megabase 1Mb = 1000000 bases) ở độ phacircn giải bigravenh thường vagrave kiacutech thước mỗi băng từ 3 ndash 5 Mb đối ở độ phacircn giải cao do đoacute kỹ thuật nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước lớn hơn 3 Mb Caacutec trường hợp bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn kiacutech thước trecircn sẽ khocircng thể được phaacutet hiện Nhiều trường hợp taacutei sắp xếp của NST rất khoacute phaacutet hiện hoặc khocircng thể phaacutet hiện được bằng kỹ thuật nagravey do kiacutech thước quaacute nhỏ cường độ thuốc nhuộm khocircng đủ vagrave thiếu caacutec mẫu băng ở những đoạn NST đatilde bị thay đổi Để khắc phục nhược điểm nagravey caacutec phương phaacutep di truyền tế bagraveo - phacircn tử (molecular cytogenetic methods) đatilde được phaacutet triển trong caacutec thập niecircn 1980 vagrave 1990

9

Higravenh 1 Keacuteo dagravei băng nhiễm sắc thể ở người nam bigravenh thường 46XY

12 KỸ THUẬT LAI TAI CHỖ HUgraveYNH QUANG ( FISH FLUORESENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

Cugraveng với sự tiến bộ của siecircu acircm higravenh thể chẩn đoaacuten dị tật thai caacutec kỹ thuật hiện đại về sinh hoacutea miễn dich di truyền sinh học phacircn tử ngagravey cagraveng phaacutet triển mở ra những khả năng mới cho cocircng taacutec chẩn đoaacuten trước sinh Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH Fluorescence insitu hybridization) lagrave kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bagraveo vagrave sinh học phacircn tử trong đoacute đầu dograve đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa vagravehoặc nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ nhằm phaacutet hiện một caacutech chiacutenh xaacutec caacutec bất thường NST Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoaacuten trước sinh lagrave nhằm phaacutet hiện caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821 XY Trong chẩn đoaacuten trước sinh kỹ thuật nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối cổ điển đatilde được xem như một ứng dụng hiệu quả vagrave chiacutenh xaacutec trong

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

9

Higravenh 1 Keacuteo dagravei băng nhiễm sắc thể ở người nam bigravenh thường 46XY

12 KỸ THUẬT LAI TAI CHỖ HUgraveYNH QUANG ( FISH FLUORESENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

Cugraveng với sự tiến bộ của siecircu acircm higravenh thể chẩn đoaacuten dị tật thai caacutec kỹ thuật hiện đại về sinh hoacutea miễn dich di truyền sinh học phacircn tử ngagravey cagraveng phaacutet triển mở ra những khả năng mới cho cocircng taacutec chẩn đoaacuten trước sinh Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH Fluorescence insitu hybridization) lagrave kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bagraveo vagrave sinh học phacircn tử trong đoacute đầu dograve đặc hiệu được lai với nhiễm sắc thể (NST) ở kỳ giữa vagravehoặc nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ nhằm phaacutet hiện một caacutech chiacutenh xaacutec caacutec bất thường NST Một trong những ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoaacuten trước sinh lagrave nhằm phaacutet hiện caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821 XY Trong chẩn đoaacuten trước sinh kỹ thuật nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối cổ điển đatilde được xem như một ứng dụng hiệu quả vagrave chiacutenh xaacutec trong

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

10

một thời gian dagravei Tuy nhiecircn với phương phaacutep cổ điển thời gian chờ đợi iacutet nhất lagrave 3 tuần gacircy tacircm lyacute lo acircu cho sản phụ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) lagrave một kỹ thuật mới coacute giaacute trị sagraveng lọc cao caacutec lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trecircn nhacircn tế bagraveo ở gian kỳ khocircng qua thời gian nuocirci cấy tế bagraveo coacute kết quả sau 24 - 48h mang lại lợi iacutech đaacuteng kể cho sản phụ vagrave cũng như caacutec nhagrave sản khoa đặc biệt trong trường hợp cần đưa ra caacutec quyết định liecircn quan đến đigravenh chỉ thai ngheacuten Nhiều nghiecircn cứu so saacutenh độ nhạy vagrave độ chiacutenh xaacutec giữa hai kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật FISH như một cocircng cụ chẩn đoaacuten nhanh chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten trước sinh đối với caacutec trường hợp thai kỳ nguy cơ cao với caacutec lệch bội NST thường gặp như 131821XY (1)

Phaacutet hiện caacutec lệch bội NST 131821XY từ tế bagraveo dịch ối bằng kỹ thuật FISH

Tiến trigravenh thực hiện Caacutec thai kỳ coacute kết quả siecircu acircm bất thường hoặc xeacutet nghiệm bộ ba (Triple test) thuộc nhoacutem nguy cơ cao được baacutec sỹ Sản khoa vagrave baacutec sỹ chuyecircn khoa Di truyền tư vấn về phương phaacutep chọc huacutet nước ối kỹ thuật FISH vagrave nuocirci cấy tế bagraveo ối những nguy cơ giới hạn của caacutec kỹ thuật nagravey

Mẫu dịch ối được lấy vagraveo ống Falcon 15ml vocirc trugraveng Bảo quản ở 40C từ 24 - 48h kể từ khi lấy mẫu Chuyển về Khoa Di truyền lagravem FISH với tế bagraveo ối trực tiếp song song với nuocirci cấy NST từ tế bagraveo ối Mục điacutech nuocirci cấy NST lagrave để kiểm chứng độ nhạy vagrave đặc hiệu của kỹ thuật FISH phaacutet hiện caacutec bất thường NST khaacutec khocircng nằm trong nhoacutem NST magrave kỹ thuật FISH sagraveng lọc

Kết quả phacircn tiacutech NST từ tế bagraveo ối của kỹ thuật FISH Trisomy 21 (Higravenh A) Trisomy 18 (Higravenh B) Trisomy 13 (Higravenh C)

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

11

Kỹ thuật FISH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường NST coacute kiacutech thước beacute hơn 1Mb tugravey thuộc vagraveo kiacutech thước của caacutec đoạn dograve đượcsử dụng Caacutec đoạn dograve nagravey chủ yếu lagrave ADN lấy từ caacutec nhiễm sắc thể vi khuẩn nhacircn tạo (BAC bacterial artificial chromosome) coacute kiacutech thước khoảng từ 150 ndash 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ) Mặc dugrave lagrave một cocircng cụ chẩn đoaacuten khaacute hiệu quả nhưng FISH cũng coacute những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chiacutenh của kỹ thuật nagravey lagrave để chỉ định xeacutet nghiệm bằng kỹ thuật FISH baacutec sĩ cần định hướng tới một hội chứng liecircn quan đến bất thường NST dựa trecircn biểu hiện lacircm sagraveng điển higravenh của bệnh nhacircn hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy coacute caacutec bất thường đogravei hỏi phải coacute thecircm caacutec phacircn tiacutech sacircu hơn về NST để trecircn cơ sở đoacute quyết định lựa chọn đoạn dograve thiacutech hợp Caacutec đoạn dograve trong FISH cho pheacutep phaacutet hiện tigravenh trạng thừa mất hoặc taacutei sắp xếp của caacutec đoạn ADN đặc hiệu nhưng khocircng thể cung cấp thocircng tin về phần cograven lại của genome do đoacute ngoagravei caacutec đoạn dograve đatilde được định sẵn FISH khocircng thể phaacutet hiện thecircm những bất thường khaacutec trong genome Một hạn chế khaacutec nữa của FISH do hạn chế về loại magraveu huỳnh quang hiện coacute để đaacutenh dấu caacutec đoạn dograve dẫn đến sự giới hạn trong số lượng caacutec đoạn dograve khaacutec nhau coacute thể được sử dụng đồng thời trecircn cugraveng một mẫu đaacutenh giaacute

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

12

13 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng caacutec cặp mồi được thiết kế để khuếch đại caacutec trigravenh tự lặp nối tiếp ngắn (STR short tandem repeat sequences) của caacutec NST đặc hiệu vagrave của caacutec vugraveng coacute tiacutenh đa higravenh cao Bằng caacutech kết hợp magraveu huỳnh quang trong quaacute trigravenh khuếch đại necircn kỹ thuật nagravey cho pheacutep định lượng caacutec sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trecircn nguyecircn tắc nagravey QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng Đatilde coacute nhiều nghiecircn cứu cho thấy đacircy lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR lagrave khocircng đogravei hỏi phải thực hiện việc nuocirci cấy tế bagraveo vagrave tự động hoacutea do đoacute cho pheacutep trả kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST trong bộ NST như khi đaacutenh giaacute bằng phacircn tiacutech karyotype Chiacutenh vigrave liacute do nagravey magrave kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp magrave khocircng thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống 2 KỸ THUẬT ARRAY CGH Trong thập niecircn 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phaacutet triển Về bản chất kỹ thuật nagravey cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho pheacutep đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ genome tigravenh trạng mất cacircn bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phacircn giải kỹ thuật CGH trong giai đoạn nagravey chỉ cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường coacute kiacutech thước trong giới hạn 10 ndash 20 Mb [14] vagrave trong một số nghiecircn cứu kiacutech thước nằm trong giới hạn 5 ndash 10Mb [12] Vagraveo cuối thập niecircn 1990 kỹ thuật array

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

13

CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho pheacutep giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH vagrave khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype vagrave kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trecircn NST xảy ra ở dưới mức phaacutet hiện của kiacutenh hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn 5 (microdeletion) hoặc vi nhacircn đoạn (microduplication) coacute thể được phaacutet hiện một caacutech dễ Dagraveng (2) 21 ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH lagrave khả năng đaacutenh giaacute trecircn toagraven bộ 46 NST chỉ trong một xeacutet nghiệm duy nhất vagrave phaacutet hiện caacutec bất thường mất cacircn bằng của NST bao gồm caacutec trường hợp lệch bội mất hoặc nhacircn đoạn của NST chiacutenh xaacutec hơn nhiều so với phương phaacutep lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec bất thường của NST ngay cả khi khocircng coacute định hướng trong chẩn đoaacuten đacircy lagrave một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phaacutet hiện được caacutec trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiecircn sự chiacutenh xaacutec trong chẩn đoaacuten cograven phụ thuộc vagraveo tỷ lệ giữa dograveng tế bagraveo bigravenh thường vagrave tế bagraveo đột biến Array CGH cho pheacutep phaacutet hiện caacutec NST đaacutenh dấu (marker chromosome) loại NST khocircng thể phaacutet hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kiacutech thước của chuacuteng quaacute nhỏ khocircng đủ để cung cấp caacutec mẫu băng đặc hiệu vagrave khocircng thể quan saacutet được dưới kiacutenh hiển vi Một ưu điểm khaacutec của array CGH lagrave coacute thể thực hiện trecircn caacutec mẫu tế bagraveo khocircng cần qua nuocirci cấy để gia tăng số lượng tế bagraveo vagrave hoagraven toagraven tự động hoacutea nhờ đoacute giảm thiểu được thời gian xeacutet nghiệm vagrave tăng mức độ chiacutenh xaacutec của chẩn đoaacuten điều nagravey đặc biệt coacute yacute nghĩa rất lớn trong caacutec xeacutet nghiệm trước sinh (2) Caacutec bất thường NST coacute thể được xaacutec định bằng kỹ thuật array CGH

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

14

Caacutec bất thường NST ở mức hiển vi - Lệch bội vagrave caacutec trường hợp khảm - Caacutec loại chuyển đoạn khocircng cacircn bằng - Caacutec nhiễm sắc thể đaacutenh dấu (marker chromosomes) Caacutec bất thường NST ở mức dưới hiển vi - Caacutec hội chứng liecircn quan đến vi mất đoạn vi nhacircn đoạn của NST 22 SO SAacuteNH CAacuteC PHƯƠNG PHAacuteP PHAcircN TIacuteCH NST TRONG CHẨN ĐOAacuteN TRƯỚC SINH - Trong xeacutet nghiệm trước sinh để lập karyotype tế bagraveo nước ối hoặc tế bagraveo gai nhau phải qua nuocirci cấy để coacute đủ số tế bagraveo cần thiết cho việc phacircn tiacutech quy trigravenh nagravey cần thời gian khoảng từ 14 - 21 ngagravey - Đối với việc sử dụng kỹ thuật FISH để phaacutet hiện caacutec bất thường số lượng của caacutec NST 13 18 21 X vagrave Y do khocircng cần nuocirci cấy tế bagraveo necircn chỉ cần khoảng 2 - 3 ngagravey để coacute kết quả tuy nhiecircn FISH chỉ coacute thể phaacutet hiện caacutec trường hợp lệch bội phổ biến do đoacute trong một số trường hợp ngoagravei FISH vẫn cần phối hợp việc phacircn tiacutech karyotype - Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR coacute thể phaacutet hiện caacutec dạng lệch bội phổ biến vagrave caacutec bất thường số lượng NST giới tiacutenh một caacutech nhanh choacuteng thocircng qua chỉ một phản ứng lagrave một kỹ thuật chẩn đoaacuten coacute độ tin cậy cao kết quả chẩn đoaacuten trước sinh chỉ trong vograveng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiecircn hạn chế lớn nhất của kỹ thuật nagravey lagrave QF-PCR khocircng cho pheacutep đaacutenh giaacute toagraven bộ genome vagrave do đoacute khocircng thể phaacutet hiện hết được tất cả caacutec bất thường của caacutec NST - Kỹ thuật array CGH do cũng khocircng đogravei hỏi phải nuocirci cấy tế bagraveo necircn kết quả sẽ được trả trong khoảng từ 3 - 5 ngagravey Mặc dugrave kỹ thuật array CGH hứa hẹn lagrave một xeacutet nghiệm di truyền nhạy hơn coacute độchiacutenh xaacutec vagrave tiacutenh hiệu quả cao hơn so với caacutec loại xeacutet nghiệm trước sinh khaacutec tuy nhiecircn becircn cạnh đoacute cũng đặt ra những vấn đề cần phải được giải quyết vigrave coacute nhiều yacute kiến tranh catildei về vai trograve của array CGH trong giai đoạn trước sinh cho necircn caacutec nhagrave lacircm sagraveng cần lưu yacute đến những hạn chế của kỹ thuật nagravey

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom

15

TAgraveI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Thị Tacircn Sinh Ngocirc Diễm Ngọc An Thuỳ Lan Đinh Thị Hồng Nhung Lecirc Thị Liễu Nguyễn Thanh Liecircm 2011 - Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoaacuten trước sinh caacutec lệch bội nhiễm sẮc thể thường gặp httpditruyencom 10-03-2011 2 Nguyễn Viết Nhacircn Hagrave Thị Minh Thi Nguyễn Vũ Quốc Huy Kỹ thuật array cgh vagrave Ứng dụng trong chẩn đoaacuten trước sinh httpditatbamsinhvn 3 Ths BS votilde văn Đức Sagraveng lọc vagrave chẩn đoaacuten trước sanh Trung tacircm sagraveng lọc- Chẩn đoaacuten trước sinh vagrave sau sinh Trường ĐH Y Dược Huế 2010 httpditatbamsinhvn 4 Nguyễn nghiecircm luật Double test ndash Một số xeacutet nghiệm giuacutep đaacutenh giaacute nguy cơ mắc caacutec hội chứng Down Edward hoặc Patau của thai ở quyacute 1 của thai kỳ httpwwwmedlatecvn 5 Soft markers in second Trimester httpwwwradbazaarcom 6 Test ID MAFP Alpha-fetoprotein single marker Screeen Maternal serum httpwwwmayomedicallaboratoriescom 7 KH Nicolaides NJ Sebire RJM Snijders NT and chromosomal defects httpwwwpicsearchcom 8 Triple test From Wikipedia the free encyclopedia httpen wikipediaorgwikitriple_test 9 Tumor marker AFP hCG CA-125 httpwwwtc-cancercom 10 What is the AFP test httppregnancyandbabycom 11 Multiple marker ndash triple or quadruple screen httpwwwbabymedcom