These Thym

5/28/2018 These Thym

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Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire

Ministre de lEnseignement Suprieur et de la Recherche Scientifique

Universit Mentouri Constantine

Facult des sciences de la nature et de la vieDpartement de biologie vgtale et cologie

N dordre: .

N de srie : .

Mmoire en vue de lobtention du diplme de magister (Ecole doctorale)Option : Biotechnologie vgtale

Thme

Prsent par : Zeghad Nadia

Devant le jury :

Prsident : Mr Benlaribi M.

Rapporteur : Mr Merghem R.

Examinateur : Mr Arhab R.

Examinateur : Mr Belkhiri A. M.

Prof. Univ. Constantine

Prof. Univ. Constantine

M. C. Univ. Tebessa

M. C. Univ. Constantine

Anne universitaire : 2008 / 2009

Etude du contenu polyphnolique de deux plantes mdicinales

dintrt conomique (Thymus vulgaris, Rosmarinus officinalis) et

valuation de leur activit antibactrienne


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Introduction

1repartie : Synthse bibliographique

Chapitre I : La phytothrapie et les plantes

I-1 / Dfinition de la Phytothrapie.

I-2 / Diffrents types de la Phytothrapie

I-3 / Les avantages de la phytothrapieI-4 / Les plantes mdicinales ...

I-5 / Le pouvoir des plantes..

I-6 / Efficacit des plantes entires .

I-7 / Les plantes mdicinales slectionnes..

I-7-1 / Thymus vulgaris

I-7-2 / Rosmarinus officinalis

Chapitre II : Les composs phnoliques

II-1 / Gnralits .

II-2 / biosynthse des composs phnoliques.............................................................

II-2-1 / La voie de shikimate..

II-2-2 / La voie de phnylpropanoide

II-2-3 / La voie de biosynthse des flavonodes

II-3 / Principales classes des composs phnoliques

II-3-1 / Les acides phnoliques simples.

II-3-2 / Les flavonodes

II-3-2-1 / Gnralits..

II-3-2-2 / Structure

II-3-2-3 / Classification..

II-3-2-4 / Localisation.

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SommaireSommaireSommaireSommaire


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II-3-2-5 / Distribution.

II-3-2-6/ Proprits des flavonoides...

A- Proprits antiradicalaires.

B- Proprits chlatrices des ions mtalliques

C- Proprits antibactriennes

D- Proprits anticancreuses.

E- Proprits anti inflammatoires

F- Proprits antivirales..

G- Proprits antiallergiques

H- Les flavonodes sont des produits nutraceutiques.

I- Biodisponibilit des flavonodes.

J- Autres proprits des flavonodes.

2mepartie : Matriel et mthodes

Chapitre I : Etude phytochimique

I-1 / Matriel vgtal

I-2 / Extraction des flavonodes.......

I-3 / La chromatographie analytique sur couche mince

I-4 / Mise en vidence des flavonodes.

I-5 / Dosage des composs phnoliques........................................................................

I-6 / Dosage des flavonodes.

I-7 / Techniques chromatographiques de sparation des flavonodes..

I-7-1 / La chromatographie sur colonne...

I-7-2 / La chromatographie sur papier.

I-8 / La spectrophotomtrie..

I-8-1 / Dfinition.

I-8-2 / Principe.

I-8-3 / Spectre UV-Vis des flavonodes..

I-8-4 / Etude spectrale des flavonodes

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Chapitre II : Etude des activits biologiques

II-1 / Activit antiradicalaire des flavonodes..

II-2/ Evaluation de l'activit antibactrienne des flavonodes..

3mepartie : Rsultats et discussion

Chapitre I : Etude phytochimique

I-1 / Extraction.

I-2 / Chromatographie analytique sur couche mince

I-3 / Mise en vidence des flavonodes

I-4 / Dosage des composs phnoliques et des flavonodes

I-5 / Les fractions obtenues par les techniques chromatographiques de sparation.

I-5-1 / Les flavonodes isols de Thymus vulgaris..

I-5-2 / Les flavonodes isols deRosmarinus officinalis....

I-6 / Identification structurale des flavonodes isols ..

I-6-1 /Analyse spectrale des flavonodes isols de Thymus vulgaris..

*Molcule 1

*Molcule 2.

*Molcule3...

*Molcule 4.

*Molcule 5.

*Molcule 6.

I-6-2 / Analyse spectrale des flavonodes isols deRosmarinus officinalis

* Molcule A

* Molcule B

* Molcule C

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Chapitre II : Etude des activits biologiques

II-1 / Evaluation du pouvoir antiradicalaire des flavonodes isols de Thymus

vulgarisetRosmarinus officinalis..

II-2 / Rsultats de l'activit antibactrienne des flavonodes isols de Thymus

vulgaris et Rosmarinus officinalis

Conclusion.

Rfrences bibliographiques..

Annexes

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Introduction


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Introduction

Introduction :

Depuis des milliers d'annes, l'humanit a utilis diverses plantes trouves dans son

environnement, afin de traiter et soigner toutes sortes de maladies, ces plantes reprsentent un

rservoir immense de composs potentiels attribus aux mtabolites secondaires qui ont

l'avantage d'tre d'une grande diversit de structure chimique et ils possdent un trs large

ventail d'activits biologiques. Cependant l'valuation de ces activits demeure une tche trs

intressante qui peut faire l'intrt de nombreuses tudes.

Le continent africain est dot dune biodiversit parmi les plantes riches dans le monde,

avec un nombre trs lev de plantes utilises comme herbes, comme aliments naturels et

pour des buts thrapeutiques. De nombreuses substances naturelles diffrentes ont t

identifies et beaucoup dentre elles se sont utilises dans la mdecine traditionnelle pour la

prophylaxie et le traitement des maladies.

Malgr la nature htrogne d'une biodiversit immense du continent africain en gnral etde l'Algrie en particulier, il y a eu peu d'efforts consacrs au dveloppement des agents

thrapeutiques de ces plantes. C'est pourquoi nous nous sommes intresss tudier Thymus

vulgarisetRosmarinus officinalis, des labies trs frquemment employes dans le pourtour

mditerranen.

L'objectif de notre travail vise dmontrer la richesse de nos plantes en flavonodes et

dterminer leurs proprits biologiques. Pour cela notre tude englobe deux aspects, dont le

premier est dordre phytochimique bas principalement sur l'extraction et la quantification

des composs phnoliques. Il porte galement sur le diagnostic et la sparation des

principaux flavonodes par lutilisation des diffrentes techniques chromatographiques.

Le second aspect est consacr une valuation de l'activit antioxydante des flavonodes

vis--vis du radical libre DPPH. Un test antibactrien est galement ralis afin de dterminer

l'efficacit des produits flavoniques contre Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Enterobacter spp pouvant tre pathognes pour lhomme.

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Chapitre I

La phytothrapie et

Les plantes


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Synthse bibliographique Chapitre I La phytothrapie et les plantes

Si l'on ne sait pas prcisment ce que nos anctres mangeaient au dbut de l'humanit il y'a

5 7 millions d'annes, il est certain que les plantes faisaient partie de leur alimentation

quotidienne. Ils dcouvraient trs tt dans leur volution que ces plantes ne reprsentaient pas

uniquement une source d'alimentation mais pouvaient galement soulager voire gurir

certaines maladies.

Aujourd'hui les principes actifs des plantes sont des composants essentiels d'une grande

partie de nos mdicaments et produits de soins (Hans, 2007). Malgr les multiples progrs de

la mdecine moderne, il y 'a un net regain d'intrt vis--vis de la phytothrapie. Selon OMS

(Organisation Mondiale de la Sant) plus de 80% de la population mondiale ont recours la

pharmacope traditionnelle pour faire face aux problmes de la sant (Farnsworth et al, 1986).

En effet sur les 300 000 espces vgtales recenses sur la plante plus de 200 000 espces

vivent dans les pays tropicaux d'Afrique ont des vertus mdicinales (Millogo et al, 2005)

I-1 / Dfinition de la Phytothrapie :

Traitement ou prvention des maladies par l'usage des plantes, la phytothrapie fait partie

des mdecines parallles ou des mdecines douces.

I-2 / Diffrents types de la Phytothrapie :

Aromathrapie :est une thrapeutique qui utilise les essences des plantes, ou huiles

essentielles, substances aromatiques secrtes par de nombreuses familles de plantes,

ces huiles sont des produits complexes utiliser souvent travers la peau.

Gemmothrapie : se fonde sur l'utilisation d'extrait alcoolique de tissus jeunes de

vgtaux tels que les bourgeons et les radicelles.

Herboristerie :correspond la mthode de phytothrapie la plus classique et la plus

ancienne. L'herboristerie se sert de la plante fraiche ou sche; elle utilise soit la plante

entire, soit une partie de celle-ci (corce, fruits, fleurs). La prparation repose sur des

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mthodes simples, le plus souvent base d'eau : dcoction, infusion, macration. Ces

prparations existent aussi sous forme plus moderne de glule de poudre de plante sche

que le sujet avale.

Homopathie :a recours aux plantes d'une faon prpondrante, mais non exclusive;

les trois quarts des souches sont d'origine vgtale, le reste tant d'origine animale et

minrale.

Phytothrapie pharmaceutique : utilise des produits d'origines vgtales obtenus par

extraction et qui sont dilus dans de l'alcool thylique ou un autre solvant. Ces extraits

sont doss en quantits suffisantes pour avoir une action soutenue et rapide. Ils sont

prsents sous forme de sirop, de gouttes, de glules, de lyophilisats (Strang, 2006)

I-3 / Les avantages de la phytothrapie :

Malgr les normes progrs raliss par la mdecine moderne, la phytothrapie offre de

multiples avantages. N'oublions pas que de tout temps l'exception de ces cent dernires

annes, les hommes n'ont pas eu que les plantes pour se soigner, qu'il s'agisse de maladies

bnignes, rhume ou toux ou plus srieuses, telles que la tuberculose ou la malaria.

Aujourd'hui, les traitements base des plantes reviennent au premier plan, car l'efficacit des

mdicaments tels que les antibiotiques (considrs comme la solution quasi universelle aux

infections graves) dcroit, les bactries et les virus se sont peu peu adapts aux mdicaments

et leur rsistent de plus en plus.

La phytothrapie qui repose sur des remdes naturels est bien accepte par l'organisme, et

souvent associe aux traitements classiques. Elle connait de nos jours un renouveau

exceptionnel en occident, spcialement dans le traitement des maladies chroniques comme

l'asthme ou l'arthrite (Iserin et al, 2001)

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I-4 / Les plantes mdicinales :

La dfinition d'une plante mdicinale est trs simple. En fait il s'agit d'une plante qui est

utilise pour prvenir, soigner ou soulager divers maux. Les plantes mdicinales sont des

drogues vgtales dont au moins une partie possde des proprits mdicamenteuses

(Farnsworth et al, 1986). Environ 35 000 espces de plantes sont employes par le monde

des fins mdicinales, ce qui constitue le plus large ventail de biodiversit utilis par les tres

humains. Les plantes mdicinales continuent de rpondre un besoin important malgr

l'influence croissante du systme sanitaire moderne (Elqaj et al, 2007)

I-5 / Le pouvoir des plantes :

L'action de la phytothrapie sur l'organisme dpend de la composition des plantes, depuis

XVIIIme sicle, au cours duquel des savants ont commenc extraire et isoler les

substances chimiques qu'elles contiennent. On considre les plantes et leurs effets en fonction

de leurs principes actifs. La recherche des principes actifs extraits des plantes est d'une

importance capitale car elle a permis la mise au point de mdicaments essentiels.

Aujourd'hui les plantes sont de plus en plus utilises par l'industrie pharmaceutique, il est

impossible d'imaginer le monde sans la quinine qui est employe contre la malaria ou sans la

diagoxine qui soigne le cur, ou encore l'phdrine que l'on retrouve dans de nombreuses

prescriptions contre les rhumes (Iserin et al, 2001)

I-6 / Efficacit des plantes entires :

La phytothrapie la diffrence de la mdecine classique, recommande d'utiliser la plante

entire, appele aussi "totum" plutt que des extraits obtenus en laboratoire. Une plante

entire est plus efficace que la somme de ses composants, les plantes contiennent des

centaines voire des milliers de substances chimiques actives (Iserin et al, 2001)

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I-7 / Les plantes mdicinales slectionnes :

Les plantes tudies ont t choisies en fonction de leur emploi trs frquent en Algrie.

I-7-1 /Thymus vulgaris(Lamiaces)

I-7-1-1 / Origine du nom: le nom thym proviendrait aussi bien du latin que du grec

Thymus : parfumer (latin)

Thumus : courage (grec)

I-7-1-2 / Description botanique :

Thymus vulgaris, est un sous arbrisseau, vivace, touffu et trs aromatique de 7-30 cm de

hauteur, dun aspect gristre ou vert gristre. Ses tiges ligneuses la base, herbaces

suprieurement sont presque cylindriques, ces tiges ligneuses et trs rameuses sont regroupes

en touffe ou en buisson trs dense. Ses feuilles sont trs petites, ovales, bord rouls en

dessous nervures latrales distinctes, au ptiole extrmement court et blanchtres leur face

inferieure. Ses fleurs sont presque roses ou presque blanches, font de 4 6 mm de longueur,

sont pdicelles et runies ordinairement au nombre de trois laisselle des feuilles

suprieures. Le limbe du calice est bilabi, un peu bossu. La corolle de taille variable, un peu

plus longue que le calice mais la partie tubulaire de la corolle ne dpasse pas celle du calice,

les tamines sont incluses. La priode de la floraison commence en mai-dbut de juin

(Wikipdia, 2008)

Figure 1: Photo de Thymus vulgaris(Wikipdia, 2008)

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I-7-1-3 / Classification :

a / Classification classique :

Rgne: Plantae

S / rgne: Tracheobionta

Division: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopsida

S / Classe: Asterdae

Ordre: LamialesFamille: Lamiaceae

Genre:Thymus

Espce : Thymus vulgaris

b / Classification phylogntique :

Ordre : LamialesFamille : Lamiaceae

I-7-1-4 / Distribution gographique :

Le thym est une plante originaire de louest des rgions mditerranennes (zcan et

Chalchat, 2004) et aussi autochtone du sud dEurope (Takeuchi et al, 2004). Plus

prcisment, le thym commun prfre un sol lgrement acide, bien drain et rocailleux(calcaire), en plein soleil et au sec, mais la plante se dveloppe galement sur un sol alcalin

filtrant, lger ou compact (dargile et de limon) ou trs poreux (sableux), un peu humide et

frais. La capacit de cette plante rsister de trs forte chaleur provient de son huile

essentielle qui est produite la nuit et svapore la journe ; cest par cette action que la chaleur

sera consomme.

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I-7-1-5 / Proprits du thym :

Assaisonnement des aliments et des boissons.

Antiseptique, dsinfectant dermique et un spasmolytique bronchique dont il est

indiqu pour traiter les infections des voies respiratoires suprieures.

Les principaux constituants du thym montrent des proprits vermifuges et vermicides

(Bazylko et Strzelecka, 2007)

Proprits antivirales, antifongiques, anti inflammatoires, et antibactriennes dont une

tude rcente a montr que les extraits mthanoliques et hexaniques des parties

ariennes de Thymus vulgaris inhibent la croissance deMycobacterium tuberculosis

(bactrie qui cause la tuberculose) (Jiminez-Arellanes et al, 2006)

Proprits anthelminthiques (Al-Bayati, 2008)

Proprits antioxydantes (Takeuchi et al, 2004 ; Golmakani et Rezaei, 2008) en

raison de ces proprits, le thym est utilis comme un conservateur afin de prolonger

la dure de conservation des poissons Thunnus thymnus durant leur stockage (Selmi

et Sadok, 2008)

I-7-1-6 / Principes actifs du thym:

Les acides phnoliques : acide cafique (Cowan, 1999), acide rosmarinique

(Takeuchi et al, 2004)

Les flavonodes: hesperdine, eriotrcine, narirutine (Takeuchi et al, 2004),

lutoline (Bazylko et Strzelecka, 2007)

Les polyphnols: tanin (Cowan, 1999 ; zcan et Chalchat, 2004)

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I-7-2 /Rosmarinus officinalis(Lamiaces)

I-7-2-1 / Origine du nom: le mot romarin (Rosmarinus) drive du latin

Ros : rose

Marinus : marin ou de marin

I-7-2-2 / Description botanique :

Le romarin est un arbrisseau de la famille des labies, peut atteindre jusqu 1,5 mtre de

hauteur, il est facilement reconnaissable en toute saison ses feuilles persistantes sans ptiole,

coriaces beaucoup plus longues que larges, aux bords lgrement enrouls, vert sombre

luisant sur le dessus, blanchtres en dessous. La floraison commence ds le mois de fvrier

(ou janvier parfois) et se poursuit jusquau avril mai. La couleur des fleurs varie du bleu

ple au violet (on trouve plus rarement la varit fleurs blanches Rosmarinus officinalis

albiflorus). Le calice velu dents bordes de blanc, elles portent deux tamines ayant une

petite dent vers leur base .Comme pour la plupart des Lamiaces, le fruit est un tetrakne (de

couleur brune) (Wikipdia, 2008)

Figure 2: Photo deRosmarinus officinalis(Wikipdia, 2008)

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I-7-2-3 / Classification :

a / Classification classique:

Rgne : Plantae

Division: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopsida

Ordre : Lamiales

Famille : LamiaceaeGenre:Rosmarinus

Espce:Rosmarinus officinalis

b / Classification phylogntique :

Ordre : Lamiales

Famille: Lamiaceae

I-7-2-4 / Distribution gographique:

Le romarin se trouve dans toutes les contres mondiales de lEurope, plus particulirement

sur le pourtour mditerranen, de prfrence dans les lieux secs et arides, exposs au soleil,

ltat sauvage il se trouve sur des sols calcaires.

I-7-2-5 / Proprits pharmacologiques et thrapeutiques du romarin :

Cette plante est utilise en mdicine en raison de ses diffrentes proprits :

Anti spasmolytiques, diurtiques, hpato protectrices, soulagement des dsordres

respiratoires (Lemonica et al 1996 ; Souza et al2008)

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Antibactriennes, antimutagniques, antioxydantes, chmoprventives (Ibaez et al,

2000 ; Prez et al,2007 ; Wang et al, 2008)

Anti-inflammatoires, antimtastasiques (Cheung et Tai, 2007)

Inhibition de la gense des tumeurs mammaires (Singletary et Nelshoppen , 1991) et

la prolifration des tumeurs cutanes (Huang et al,1994)

Dautres tudes montrent que les composants du romarin inhibent les phases

d'initiation et de promotion de cancrognse (Offord et al, 1995)

Carnosol du romarin possde une activit antivirale contre le virus du SIDA (HIV)

(Aruoma et al, 1996) alors que lacide carnosique a un effet inhibiteur trs puissant

contre la protase de HIV-1 (Paris et al, 1993)

I-7-2-6 / Principes actifs :

Les principaux constituants du romarin responsables des diffrentes proprits sont :

Les acides phnoliques: acide vanillique, acide cafique, acide p-coumarique

(Ibaez et al, 2003 ; Ramirez et al, 2004 ; Cavero et al,2005 ; Herrero et al, 2005 ;

Muchuweti et al, 2007 ; Prez et al, 2007)

Les flavonodes: genkwanine, cirsimaritine (Ibaez et al ,2000; Cavero et al, 2005),

riocitrine, hesperdine, diosmine, lutoline (Okamura et al, 1994 ; Del Bao etal,

2004), apignine (Yang et al,2008)

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Chapitre II

Les composs phnoliques


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Synthse bibliographique Chapitre II-Les composs phnoliques

II-1 / Gnralits :

Les composs phnoliques sont des mtabolites secondaires vgtaux. Ils peuvent tre

dfinis comme des molcules indirectement essentielles la vie des plantes (do la

dnomination de mtabolites secondaires). Par opposition aux mtabolites primaires qui

alimentent les grandes voies du mtabolisme basal, mais ils sont essentiels dans l'interaction

de la plante avec son environnement.

Ces composs ont tous en commun la prsence dun ou de plusieurs cycles benzniquesportant une ou plusieurs fonctions hydroxyles (Urquiaga et Leighton, 2000). La structure

des composs phnoliques naturels varie depuis les molcules simples (acides phnoliques

simples) vers les molcules les plus hautement polymrises (tanins condenss) (Macheix et

al, 2005). Avec plus de 8000 structures phnoliques identifies (Urquiaga et Leighton, 2000)

Les composs phnoliques participent activement aux interactions de la plante avec son

environnement en jouant soit le rle des signaux de reconnaissance entre les plantes

(Alllopathie), entre les plantes et les symbioses, ou bien lui permettant de rsister aux

diverses agressions vis--vis des organismes pathognes. Ils participent de manire trs

efficace la tolrance des vgtaux des stress varis, donc ces composs jouent un rle

essentiel dans l'quilibre et ladaptation de la plante au sein de son milieu naturel (Macheix et

al, 2005)

D'un point de vue appliqu, ces molcules constituent la base des principes actifs que l'on

trouve chez les plantes mdicinales, allies leur difficult de production. Chez l'homme, ces

molcules traces jouent un rle important en agissant directement sur la qualit nutritionnelle

des fruits et lgumes et leur impact sur la sant des consommateurs (effet antioxydant, effet

protecteur contre l'apparition de certains cancers...) (Macheix et al, 2005)

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II-2 / biosynthse des composs phnoliques :

A / La voie de shikimate : cest souvent la voie de biosynthse des composs

aromatiques, elle joue un rle critique pour contrler le mtabolisme de la voie de

phnylpropanoide (Kening et al, 1995)

Figure 3 : La voie de shikimate (Floss, 1997)

II

PO COOH

CH2

Acide

Phosphopyruvique

(PEP )

+

CHO

OH

OH

H

H

CH2OP

Erythrose 4 P

COOH

O

H

OH H

OHH

OHH

CH2OP

H

Acide 3 dsoxy D arabino

heptulosique 7 P (DHAP )

COOHOH

OH

OH

O

1

2

3 5

6

Acide 3 dhydroquinique

(DHQ )

COOH

O

OH

OH

Acide 3 dhydroshikimique (DHS )

COOH

OH

OH OH

Acide shikimique

4

COOH

OH

OH

OP

Shikimate 3 P

PEP

O

II

COOH

OP

OH

COOH

CH2

5-Enolpyruvylshikimate 3 P

(EPSP )

COOH

OH

O

II

CH2

COOH

Acide chorismique

(CA )

COOHO

COOH

OH

Acide prphnique

NH2

H

L-Phnylalanine

COOHNH2

H

OH

COOH

L-Tyrosine

enol

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B / La voie de phnylpropanoide:

La voie de phnylpropanoide commence par la phnylalanine (Phe) qui fournit en plus des

principaux acides phnoliques simples, coumarines, isoflavonodes, flavonodes, acide

salicylique, des prcurseurs de lignine, qui est quantitativement le second biopolymre le plus

important aprs la cellulose

Figure 4:La voie de phnylpropanoide (Hoffmann et al, 2004)

NH2 O

OHPhenylalanine

O

OH

Acide cinnamique

PAL

C4H

OH

O

OH

Acide p coumarique

Acide salycilique

O

SCoAOH

p Coumaroyl CoA

Stilbnes

Anthocyanines

Isoflavonoides

Flavonoides

p Hydroxyphenyl lignine

O

OHOH

OH Acide caffeique

O

SCoAOH

OH Caffeoyl CoA

OH

MeO

O

OH

Acide frulique

OH

MeO

O

SCoAGuaiacyl lignine

O

OH

OH

OH

MeO Acide 5 hydroxy frulique

OH

MeO

OMeO

OH

Acide sinapique

O

SCoA

OH

OH

MeO5 Hydroxy feruloyl CoA

Syringyl lignine

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C / La voie de biosynthse des flavonodes :

Figure5: La voie de biosynthse des flavonodes (WinkelShirley, 2001; Subsamanian et al,2007)

II

OH

O

OHOH

OH

4'

2

4 6

2, 4, 6, 4' tetrahydroxy chalcone

Chalcone isomrase

O

IIO

OH

OH

OH4'

21'

5

7

Flavanone : Naringnine

Flavone synthase

II

O

O

OH

OH

OH

Flavone : Apignine

(2S )flavanone 3 hydroxylase

II

OH

OH

OHO

O

Dihydroflavonol : (2R, 3R )dihydrokaempfrol

Flavonol synthase O

OH

II

OH

OHO

OH

Flavonol : Kaempfrol

Dihydroflavonol 4 rductase

O

OH

OHOH

OH

OH

Flavan 3, 4 diol : Leucoanthocyanidol

OH

OOH

OH

OH

OH

Flavan 3 ol

OH

OH

O+OH

OH

Anthocyanidol :Pelargonidol

3 O glycosyl transfrase

OH

O Glu

OH

OH

Anthocyanoside : Plargonidol 3 O glucoside

O+

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II-3 / Principales classes des composs phnoliques :

II-3-1 / Les acides phnoliques simples :

A / Acides hydroxybenzoques :

Sont des drivs de l'acide benzoque

Ont une structure gnrale de base de type (C6-C1)

Existent souvent sous forme d'esters ou de glycosides

Les acides hydroxybenzoques les plus abondants sont rpertoris dans le tableau I :

Tableau I:Principaux acides hydroxybenzoques (Sarni-Manchado et Cheynier, 2006)

Structure R1 R2 R3 R4 Acides phnoliques

H H H H Acide benzoque

H H OH H Acide p hydroxy

benzoque

H OH OH H Acide

protocatechique

H OCH3 OH H Acide vanillique

H OH OH OH Acide gallique

H OCH3 OH OCH3 Acide syringiqueOH H H H Acide salicylique

OH H H OH Acide gentisique

COOH

R1R2

R3

R4

15


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B / Acides hydroxycinnamiques :

Drivent de l'acide cinnamique Ont une structure gnrale de base de type (C6-C3)

Existent souvent sous forme combine avec des molcules organiques

Les degrs d'hydroxylation et de mthylation du cycle benznique, conduisent une

ractivit chimique importante de ces molcules, le tableau II reprsente les

principaux acides hydroxycinamiques

Tableau II :Principaux acides hydroxycinnamiques (Sarni-Manchado et Cheynier, 2006)

Structure R1 R2 R3 Acides phnoliques

H H H Acide cinnamique

H OH H Acide p coumarique

OH OH H Acide cafique

OCH3 OH H Acide frulique

OCH3 OH OCH3 Acide sinapique

C / Coumarines :

Les coumarines drivent des acides hydroxycinnamiques par cyclisation interne de la

chane latrale

Les coumarines ont frquemment un rle cologique ou biologique

Tableau III : Principaux types de coumarines (Macheix et al, 2005)

Structure R6 R7 R8 Acides phnoliques

H OH H Umbellifrol

OH OH H Aescultol

OCH3 OH H Scopoltol

OCH3 OH OH Fraxtol

H OH OH Daphntol

R1

R2

R3

COOH

O

C _

_O

R6

R7

R8

16


25/130


II-3-2 / Les flavonodes :

II-3-2-1 / Gnralits:

Le nom flavonode proviendrait du terme flavedo, dsignant la couche externe des corces

d'orange (Piquemal, 2008), cependant d'autres auteurs supposaient que le terme flavonode a

t plutt prt du flavus ; (flavus=jaune) (Karaali et al, 2004 ; Maleev et Kunti, 2007).

Les flavonodes ont t isols par le scientifique E.Chervreul en 1814, mais ont trellement dcouverts qu'en 1930 par Albert Szent-Gyrgyui, dsigns sous le nom de

vitamine P, en raison de leur efficacit normaliser la permabilit des vaisseaux sanguins,

cette dnomination fut abandonne lorsqu'on se rendit compte que ces substances ne

correspondaient pas la dfinition officielle des vitamines, il devient clair que ces substances

appartiennent aux flavonodes (Nijveldt et al, 2001)

Les travaux relatifs aux flavonodes sont multiples depuis la dcouverte du clbre "frenchparadox" correspondant un bas taux de mortalit cardiovasculaire observ chez les

habitants des rgions mditerranennes, associant une consommation de vin rouge une prise

importante de graisses satures (Ghedira, 2005; Maleev et Kunti, 2007). Prs de 4000

flavonodes ont t dcrits (Medi-ariet al, 2004)

II-3-2-2 / Structure :

Les flavonodes ont tous la mme structure chimique de base, ils possdent un squelette

carbon de quinze atomes de carbones constitu de deux cycles aromatiques (A) et (B) qui

sont relis entre eux par une chane en C3 en formant ainsi l'htrocycle (C) (W- Erdman et

al, 2007). Gnralement, la structure des flavonodes est reprsente selon le systme C6-C3-

C6 (Emerenciano et al, 2007) en formant une structure de type diphnyle propane dont des

groupements hydroxyles, oxygnes, mthyles, ou des sucres peuvent tre attachs sur les

noyaux de cette molcule (Narayana, 2001; Maleev et Kunti, 2007)

17


26/130


II-3-2-3 / Classification :

Tableau IV : Principales classes des flavonodes (Narayana et al,2001; W- Erdman et al,2007)

Classes Structures chimiques R3' R4' R5' Exemples

Flavones H OH H Apignine

OH OH H Lutoline

OH OCH3 H Diosmtine

Flavonols H OH H Kaempfrol

OH OH H Querctine

OH OH OH Myrectine

Flavanols OH OH H Catchine

Flavanones H OH H Naringnine

OH OH H Eriodictyol

Anthocyanidines H OH H Pelargonidine

OH OH H Cyanidine

OH OH OH Delphnidine

Isoflavones R5 R7 R4'

OH OH OH Genisteine

H O-Glu OH Daidezine

O

IIO

OH

OH

R3'

R4'

R5'

O

IIO

OH

OH

R3'

R4'

R5'

OH

OOH

OH

R3'

R4'

R5'

OH

OOH

OH

R3'

R4'

R5'

IIO

OOH

OH

R3'

R4'

R5'

+

OH

O

IIO

OH

R4'R5

R7

18


27/130


II-3-2-4 / Localisation:

Les flavonodes sont impliqus dans de nombreuses interactions des plantes avec les

conditions biotiques et abiotiques de leur environnement, ces substances sont accumules

dans diffrentes parties cellulaires et tissulaires de la plante durant l'organognse et sous

l'influence de plusieurs facteurs stimulants (Hutzler et al, 1998)

Sur le plan cellulaire, les flavonodes sont synthtiss dans les chloroplastes puis migrent et

se dissolvent dans les vacuoles (Piquemal, 2008), la rpartition de ces composs montre des

accumulations trs localises, gnralement en relation avec une fonction physiologique ou

avec linteraction de la plante avec son environnement. Ainsi, les flavonodes qui ont une

localisation pidermique ont un rle d'cran vis--vis des rayonnements solaires, tandis que

ceux qui sont impliqus dans les mcanismes de dfense ont plutt une localisation sous

pidermique (Boudet, 2000)

II-3-2-5 / Distribution :

Les flavonodes sont prsents dans toutes les parties des vgtaux suprieurs : racines,

tiges, feuilles, fruits, graines, bois, pollens (Verhoeyen et al, 2002), ils peuvent aussi tre

rencontrs dans certains boissons et chez certains fourrages (ex: trfle) (Urquiaga et

Leighton, 2000)

Certaines classes de flavonodes sont prsentes exclusivement chez certains vgtaux, on

trouvera par exemple, les flavanones dans les agrumes, les isoflavones dans le soja, les

anthocyanes et les flavonols ont eux une large distribution dans les fruits et les lgumes

tandis que les chalcones se retrouvent plus frquemment dans les ptales des fleurs, sont

considrs comme des pigments naturels au mme titre que les chlorophylles et les

carotnodes (Lahouel, 2005 ; Piquemal, 2008)

19


28/130


Le monde animal est trs concern par les flavonodes dont Brewington et al (1974), Lopez

et Lindsay (1993) in (Besle et al, 2004) ont isol respectivement quinze et seize composs

aromatiques partir du lait de vache avec respectivement 6 et 5 composs importants dus

principalement la consommation des plantes par les herbivores.

On trouve aussi la chrysine, la querctine, de la galangine dans les propolis ; scrtion des

bourgeons de nombreux arbres (le bouleau, le sapin, le saule) rcolts par les abeilles, ces

insectes les fabriquent en modifiant la propolis par leurs enzymes salivaires. Les abeilles

mettent en uvre les proprits antifongiques et antibactriennes des polyphnols pour

aseptiser leurs ruches (Lahouel, 2005). Le tableau V reprsente la distribution des principaux

flavonodes dans certains aliments :

Tableau V : Distribution alimentaire des principales classes de flavonodes (W- Erdman et

al, 2007)

Flavonodes Exemples Aliments Caractristiques

Flavonols Querctine

Kaempfrol

Oignon, poireau,

brocolis, pommes,

chou fris, vin

rouge, th.

Le groupe le plus abondant

des composs phnoliques.

Flavones Lutoline

Apignine

Persil, cleri. Le groupe le plus abondant

des composs phnoliques, lesflavones se diffrent des

flavonols seulement par le

manque d'un OH libre en C3,

ce qui affecte ainsi leur

absorption aux UV, mobilit

hromatographique et les

ractions de coloration

O

IIO

OH

OH

R3'

R4'

R5'

OH

O

IIO

OH

OH

R3'

R4'

R5'

20


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Flavanones Naringnine

Eriodictyol

Fruits du genre

Citrus.

Sont caractriss par

l'absence de la double liaison

C2-C3, le

flavanone le plus abondant

est la naringnine, isole

pour la premire fois partir

des corces de citrus.

Isoflavones Genisteine

Daidzeine

Graines de soja et

produits qui en

drivent.

Caractriss par leur

variabilit structurale dont

l'attachement du cycle B se

fait en C3. Ils sont prsents

dans les plantes sous forme

libre ou glycosyle.

Flavan3-ols CatchineEpicatchine

Epigallocatc

-hine

Vin rouge, th

noire, th vert,

cacao, chocolat.

Flavan3ols ainsi que flavan3,

4diols sont tout les deux

impliqus dans la

biosynthse de

proanthocyanidines (tanins

condenss) par des

condensations enzymatiques

et chimiquesAnthocyanidines Cyanidine

Delphnidine

Raisins, vin rouge,

certaines varits de

crales.

Reprsentent le groupe le

plus important des

substances colores, ces

pigments hydrosolubles

contribuent la coloration

des angiospermes.

OOH

OH

R3'

R4'

R5'

IIO

O

IIO

OH

R4'R5

R7

OOH

OH

R3'

R4'

R5'

OH

OOH

OH

R3'

R4'

R5'

+

OH

21


30/130


II-3-2-6 / Proprits des flavonodes :

A / Proprits antiradicalaires :

Les flavonodes sont capables de piger les radicaux libres en formant des radicaux

flavoxyles moins ractifs, cette capacit peut tre explique par leur proprit de donation

d'un atome d'hydrogne partir de leur groupement hydroxyle selon la raction reprsente

ci-dessous :

FLOH + R > FLO + RH (raction de pigeage)

Cette raction de pigeage donne une molcule stable (RH) et un radical flavoxyle (FLO)

ce dernier va subir un changement de structure par rsonance ; redistribution des lectrons

impaires sur le noyau aromatique pour donner des molcules de faible ractivit par rapport

aux R; en outre les radicaux flavoxyles peuvent interagir entre eux pour former des

composs non ractifs.

FLO + R > FLO-R (raction de couplage radical-radical)

FLO + FLO > FLO-OFL (raction de couplage radical-radical)

(Ami et al, 2003)

Figure 6 :Pigeage des espces ractives drives de loxygne (R) par les flavonodes et laformation d'une structure stable (Tiqwari, 2001)

OH

OH OH

O

O

O

R RH

R

RH

22


31/130

Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques

La proprit antiradicalaire des flavonodes est troitement lie leur structure, en

particulier au phnomne de rsonance lectronique stabilisant exerc par les noyaux

aromatiques, cette activit ncessite :

Structure ortho-dihydroxyphnolique du cycle B (3',4' dihydroxystructure), cette

structure est importante pour l'activit antiradicalaire des flavonodes possdant un

htrocycle satur.

La double liaison C2-C3 conjugue avec la fonction 4 oxo qui est responsable de la

dlocalisation des lectrons, en amliorant ainsi la capacit antiradicalaire.

Les groupements hydroxyles libres en C3 et C5 (Ami et al, 2003)

A titre d'exemple ; la querctine et la myrictine rpondent tous ces critres ncessaires

pour avoir une activit antiradicalaire efficace et importante (Middleton et al, 2000)

Figure 7 : Critres structuraux essentiels pour avoir une bonne activit antiradicalaire des

flavonodes (Amiet al, 2003)

O

OHOH

OH

OOH

OH

OH

A

B

C

2

3

45

6

7 8

2'

3' 4'

5'

6'

23


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B / Proprits chlatrices des ions mtalliques :

Les ions mtalliques sont ncessaires pour le fonctionnement des processus biochimiques et

physiologiques cellulaires, mais dans certains cas et lorsque leur mcanisme d'action n'est pas

bien contrl ces mmes ions peuvent tre l'origine d'une peroxydation lipidique, un stress

oxydatif, ou une blessure des tissus, titre d'exemple Cu+ est un stimulateur de la

peroxydation des LDL (Tiqwari, 2001).

Grce leur structure chimique spcifique, les flavonodes peuvent facilement chlater les

ions mtalliques en crant des composs complexes inactifs (Maleev et Kunti, 2007)

La chlation des ions mtalliques ncessite trois sites principaux :

Site situ entre le groupe 3' OH et le groupe 4' OH du cycle B

Site situ entre le groupe 3OH et 4 C=O de lhtrocycle C

Site situ entre le groupe 5OH du cycle A et le groupe 4C=O de lhtrocycle C

Figure 8 :Principaux sites impliqus dans la chlation des ions mtalliques (Me+) (Tiqwari,

2001)

O

O

OH

OH

OH

O

HMe+n

Me+n

Me+n

1

2

3

45

6

7

8 1'

2'

3'4'

5'6'A

B

C

24


33/130


C / Proprits antibactriennes :

La thrapeutique des infections bactriennes se base principalement sur lusage des

antibiotiques. La prescription grande chelle et parfois inapproprie de ces agents a entran

la slection de souches multirsistantes do limportance dorienter les recherches vers la

dcouverte de nouvelles voies qui constituent une source dinspiration de nouveaux

mdicaments base des plantes, sous forme de mtabolites secondaires dont les composs

phnoliques, sont toujours utiliss dans lindustrie alimentaire et cosmtique et comme agents

antimicrobiens en mdecine populaire.

Les polyphnols notamment les flavonodes et les tannins sont reconnus par leur toxicit

vis- -vis des microorganismes. Le mcanisme de toxicit peut tre li l'inhibition des

enzymes hydrolytiques (les protases et les carbohydrolases) ou d'autres interactions pour

inactiver les adhesines microbiens, les protines de transport et d'enveloppe cellulaire

(Cowan, 1999)

D / Proprits anticancreuses :

Le cancer se prsente habituellement comme une tumeur forme d'une masse cellulaire qui

est l'aboutissement d'une srie de transformation pouvant se drouler pendant plusieurs

annes, donc la cancrognse est un processus complexe multi-squentiel menant une cellule

de l'tat sain un tat prcancreux et finalement un stade prcoce de cancer (Pincemail et

al, 1999)

Depuis longtemps, on associe le cancer et le type d'alimentation, de nombreux chercheurs

ont tudi le rle des nutriments dans le dveloppement des cancers. Plus rcemment des

recherches exprimentales suggrent que les flavonodes sont parmi les substances

susceptibles de retarder voire d'empcher l'apparition de certains cancers, tout en rduisant

d'une manire spcifique les risques d'en avoir chez les sujets humains (Decloitre, 1993 ;

Hertog, 1996)

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Des tudes montrent que certains flavonodes particulirement ; lutoline, querctine,

kaempfrol, apignine, taxifoline inhibent d'une faon marque la lipogense des cellules

cancreuses, d'autres flavonodes sont plutt capables d'induire l'apoptose.

Certains flavanols (pigallocatchine-3-gallate) reprsentent des effets cytotoxiques sur les

cellules cancreuses de prostate, ces effets sont corrls avec leur capacit inhiber les

enzymes cls lipogniques i.e. FAS (Fatty Acid Synthase) (Brusselmans et al, 2005).

Les travaux raliss par Mahmoud et al(2000) in (Depeint et al, 2002) montraient que la

curcumine permet de prvenir la formation des tumeurs spontanes induites gntiquement,

ce mme flavonode rduit l'apparition des tumeurs de la peau induites chimiquement. La

querctine et la rutine sont les deux flavonodes les plus conseills pour prvenir l'apparition

du cancer de l'appareil gastro-intestinal tandis que l'apignine avec la querctine ont la

capacit inhiber la phase de mtastase. Toute fois Caltagirone et al(2000) in (Depeint et

al, 2002) signalaient que linhibition des diffrents stades de dveloppement de cancer est

plutt assure par tous les flavonodes.

L'activit anticancreuse des flavonodes est assure par l'intervention de plusieurs

mcanismes :

pigeage des radicaux libres

Inhibition du mtabolisme d'acide arachidonique

Formation d'un complexe inactif avec le carcinogne (Hertog, 1996)

Prvention de l'activation des mtabolites carcinognes

Inhibition de la prolifration des cellules cancreuses

Arrt du cycle cellulaire des cellules cancreuses

Induction de l'apoptose

Inhibition des processus d'angiognse (Ren et al, 2003)

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E / Proprits anti inflammatoires :

Une inflammation par dfinition est une raction de dfense immunitaire strotype du

corps une agression (infection, brlure, allergie) qui se manifeste par une rougeur, un

gonflement, une sensation de chaleur, une douleur qui semble pulser (Wikipdia, 2008).

Au cours de l'inflammation, des produits bactriens dclenchent la production d'une grande

quantit d'oxyde nitrique (NO) dans les macrophages et d'autres cellules sous l'action d'oxyde

nitrique synthase inducteur (iNOS) (Hmlinen et al, 2007), bien que la libration de (NO)

est trs importante pour maintenir la dilatation des vaisseaux sanguins (vasodilatation) mais

des fortes concentrations peuvent conduire aux dommages oxydatifs (Nijveldt et al, 2001),

car une fois que le NO est form il se peut qu'il va ragir avec l'anion superoxyde conduisant

la formation de peroxynitrite qui provoque l'endommagement des macromolcules

cellulaires. Cependant une production en excs de NO durant une inflammation chronique

rsulte au dveloppement du cancer (Tsai, 2004)

De nombreuses tudes semblent indiquer que les flavonodes possdent des proprits anti

inflammatoires et qu'ils sont capables de moduler le fonctionnement du systme immunitaire

par inhibition de l'activit des enzymes qui peuvent tre responsables des inflammations, ils

peuvent aussi moduler l'adhsion des monocytes durant l'inflammation athrosclrosique en

inhibant l'expression des mdiateurs inflammatoires (Gonzlez-Gallego et al, 2007) d'autres

flavonodes sont capables d'inhiber l'histamine (Kim et al, 2004).

Les flavones et les flavonols sous forme glycosyle ou libre comme la querctine,

kaempfrol, myrectine ont une activit inhibitrice de COX (Cyclooxygnase) (Tapas et al,

2008)

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F / Proprits antivirales :

La stratgie de recherche d'un compos antiviral consiste mesurer la rduction de

l'infection virale des cellules en culture, une substance peut agir diffrents niveaux du cycle

viral :

au niveau de l'adsorption du virus sur la cellule hte

au niveau de la pntration du virus dans la cellule hte

au niveau la de rplication du virus et la synthse des protines virales

au niveau de l'assemblage et de la sortie du virus hors de la cellule hte

L'activit antivirale des flavonodes contre HIV peut tre lie directement par leurs effets

sur les enzymes responsables de son rplication (HIV-1 reverse transcriptase ou HIV-1

integrase) par railleurs d'autres flavonodes montraient une activit antivirale contre le virus

d'influenza, HIV-1, HIV-2 (Bylka et al, 2004). Querctine, apignine, catchine et

hesperdine sont parmi les flavonodes caractriss par leurs proprits antivirales contre onze

types de virus. Les flavonodes aglycones pourvus dun groupement hydroxyle libre en C3 ont

montr une bonne activit antivirale, les flavanes sont gnralement plus efficaces que les

flavones et les flavanones contre HIV-1 et HIV-2 (Tapas et al, 2008)

G / Proprits antiallergiques :

Ces effets antiallergiques sont attribus l'influence des flavonodes sur la production de

lhistamine. En effet, les flavonodes inhibent les enzymes, telles que l'AMP cyclique

phosphodiesterase et ATPase Ca+ dpendante, responsables de la libration de l'histamine

partir des monocytes et des basophiles. Par exemple, l'ATPase Ca+ dpendante dgrade

l'ATP produisant ainsi de l'nergie afin de faciliter l'absorption du calcium par les membranes

cellulaires, ce qui favorise la libration de l'histamine stocke dans les vsicules. En inactivant

cette enzyme, la querctine a montr un potentiel d'action suprieur celui du cromoglycate

de sodium utilis comme mdicament en empchant la libration de l'histamine et d'autres

substances endognes qui causent l'asthme (Marfak, 2003)

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H / Les flavonodes sont des produits nutraceutiques :

Le terme nutraceutique a t intervenu en 1979 par Steph De Felice (Lin et Weng, 2006), il

s'agit d'une appellation commerciale labore par les industriels qui rsulte de la contraction

de "Nutrition" et de "Pharmaceutique" (Bietrix, 2004). Les nutraceutiques sont des

composs qui n'ont pas une valeur calorique mais qui ont un rle fondamental pour ce qui

concerne la prvention de certaines pathologies (Teissedre et al, 2007)

Le rle nutraceutique des polyphnols s'inscrit dans le cadre de ce que l'on appelle lanouvelle pharmacie qui consiste faire un traitement prventif et non curatif, il vaut mieux

que le mdicament soit dj prsent dans l'organisme prt la dfense apport sous forme des

aliments fonctionnels capables de procurer des bienfaits physiologiques dmontrs ou de

rduire les risques des maladies chroniques, en plus de remplir leurs fonctions nutritionnelles

de base dont la consommation des fruits et des lgumes riches en composs bioactifs peut

tre une stratgie de prvention raliste contre de nombreuses maladies majeures. Les produits

nutraceutiques fondamentaux des plantes sont les composs phnoliques, particulirement les

flavonodes en raison de leurs proprits bnfiques sur la sant humaine.

I / Biodisponibilit des flavonodes :

Les effets sant des polyphnols dpendent essentiellement de leur biodisponibilit ; cette

dernire qui signifie la part d'un nutriment prsent dans un aliment qui est effectivement

assimile par l'organisme (Wikipdia, 2008)

Selon Wiseman (1999) la biodisponibilit absolue (%) correspond la proportion des

molcules qui entrent dans la circulation sanguine sous leur forme intacte aprs leur

consommation en passant travers la paroi intestinale et le foie.

29


38/130


a / Absorption: tous les flavonodes l'exception de catchine (flavanol) sont prsents dans

les plantes sous forme glycosyle (lis aux sucres par des liaisons osidiques) seuls les

aglycones peuvent tre absorbs par l'intestin grle, tandis que les glycosides sont hydrolyss

tout d'abord en aglycones par l'intermdiaire de la microflore colique qui dispose des enzymes

capables de cliver les liaisons osidiques (Wiseman, 1999 ; Urquiaga et Leighton, 2000 ;

Ming, 2007), cette mme flore microbienne mtabolise au mme temps les aglycones librs.

Des quantits considrables de catchines polymriques connus sous le nom de

proanthcyanidines sont prsents dans lalimentation, des tudes montrent que les formes

dimres et trimres de catchine sont susceptibles d'tre absorbs tandis que les polymres de

degr de polymrisation lev ne peuvent pas tre absorbs par la paroi intestinale qu'aprs

leurs dgradation (Hollman, 2001)

b / Mtabolisme: deux compartiments considrablement importants pour le mtabolisme des

composs phnoliques :

les tissus (foie et les reins) : ou des enzymes de biotransformation agissent

directement sur les flavonodes aglycones ainsi que sur des mtabolites coliques

absorbs, ces enzymes sont principalement localiss au niveau du foie, des reins, ainsi

quau niveau de lintestin grle.

Colon : o la microflore colique dgrade les flavonodes aglycones librs (aprs

hydrolyse des glycosides) par ouverture de leur htrocycle aux diffrents endroits

selon le type de flavonode concern :

Les flavonols : sont dgrads en acides phnylacetiques et acides

phnylpropioniques

Les flavanols : produisent les valerolactones (noyau benznique avec une chane

latrale de cinq atomes de carbones) et des acides phnylpropioniques

Les flavones et les flavanones : produisent des acides phnylpropioniques

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Ces acides sont encore mtaboliss aux drivs des acides benzoques, les groupements

hydroxyles des mtabolites gnrs subissent une conjugaison par acide glucuronique,

sulfate, ou par glycine (Hollman, 2001). L'limination des mtabolites de polyphnols se

fait par deux voies essentielles d'excrtion ; soit par voie biliaire (Manach, 1998) ou par

voie urinaire.

Figure 9 : Principaux compartiments impliqus dans le mtabolisme des flavonodes

(Hollman, 2001)

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G / Autres proprits des flavonodes :

Protection des plantes contre les radiations UV

Sont impliqus dans les processus de dfense de la plante contre les infections

bactriennes et virales

Agissent comme des pigments ou des co-pigments

Modulation de la distribution d'auxine

Fonctionnent comme des signaux molculaires de reconnaissance entre les bactries

symbiotiques et les lgumineuses afin de faciliter la fixation de lazote molculaire

Rgulation de l'longation des tiges

Interviennent dans la maturit des fruits

Sont l'origine des gots amers et astringents afin de repousser les animaux

herbivores (Park et Cha, 2003 ; Subsamanian et al,2007 ; Yang et al, 2008)

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Matriel et mthodes


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Chapitre I

Etude phytochimique


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Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique

I-1 / Matriel vgtal :

Le matriel vgtal est constitu des parties ariennes de Thymus vulgaris etRosmarinus

officinalis. Les feuilles du thym ont t cueillies en mai 2008 de la rgion dAin Smara tandis

que Les feuilles et les sommits fleuries du romarin ont t rcoltes en mois de mars 2008

de luniversit de Constantine. Aprs schage une temprature ambiante et labri de la

lumire solaire, afin de prserver au maximum lintgrit des molcules, le matriel vgtal

de chacune des deux espces est broy grossirement dans un moulin lectrique.

I-2 / Extraction des flavonodes :

Suivant le protocole dextraction dcrit par (Merghem et al, 1995), le matriel vgtal

broy (100 g) est soumis une extraction par macration dans le mlange thanol / eau

(30/70 : v/v) pendant 72 heures avec renouvellement de solvant chaque 24 heures et

agitation de temps en temps. Les macras sont runis puis ils sont filtrs sur un papier

filtre. Les filtrats sont vapors presque sec au moyen dun vaporateur rotatif. Le rsidusec est repris dans 100 ml deau distille bouillante (lintrt de lutilisation de leau distille

bouillante cest pour assurer la rcupration des composs rests accols la paroi du ballon

dvaporation), aprs une dcantation de toute une nuit on rcupre la phase limpide qui va

subir des affrontements par des solvants de polarit croissante :

Affrontement par ther de ptrole

Affrontement par actate dthyle

Affrontement par MEC (mthyle thyle ctone)

33


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Ces affrontements se font dans des ampoules dcanter, la phase aqueuse et le solvant

sont agits nergiquement puis laisss au repos pendant 30 minutes, la phase aqueuse (quiest au fond de lampoule) et la phase charge de molcules spcifiques sont rcupres

sparment. Les diffrentes phases rcupres (actate dthyle, MEC, phase eau rsiduelle)

sont vapores sec puis reprises par 10 ml du mthanol, les extraits obtenus sont ensuite

stocks une temprature ambiante jusqu' leur utilisation.

Figure 10 :Protocole d'extraction des flavonodes (Merghem et al, 1995)

34


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I-3 / La chromatographie analytique sur couche mince :

I-3-1 / Principe :

Le principe de la chromatographie repose sur lentrainement dun chantillon dissous par

une phase mobile travers une phase stationnaire (Wikipdia, 2008)

I-3-2 / Mode opratoire :

a / Prparation de la phase stationnaire :La chromatographie sur couche mince a

t ralise sur des plaques pr-tales de gel de silice et sur des plaques de

polyamide (DC6), quant ces dernires sont prpares en mlangeant 10 g de poudre

de polyamide dans 50 ml dthanol, aprs talement du gel sur des plaques en verre et

schage, la phase stationnaire sera prte lutilisation.

b / Prparation de la phase mobile : La phase mobile est constitue par un mlange

de solvants organiques. Pour cela, diffrents systmes solvants ont t essays pour

dfinir ceux qui donnent les meilleures sparations.

Tableau VI: Les diffrents systmes solvants utiliss pour la CCM de gel de polyamide

CCM sur gel de polyamideSystmes solvants Proportions Rfrences

Systmes

essays

Tol/MEC/EtOH (2/1/1) (v/v/v) Mehibel, 2006Tol/MEC/EtOH/EP (2/1/1/1) (v/v/v/v) Mehibel, 2006

MeOH/H2O/A actique (18/1/1) (v/v/v) Kaabouche, 2007

MeOH/H2O/A actique (95/5/5) (v/v/v) Bhat et al, 2004

Tol/MeOH/EtOH (4/3/3) (v/v/v) Aurangzeb et al, 2005

Systmes

choisis

Tol/MeOH/EtOH (4/3/3) (v/v/v) Aurangzeb et al, 2005

MeOH/H2O/A actique (95/5/5) (v/v/v) Bhat et al, 2004

35


46/130


Tableau VII: Les diffrents systmes solvants utiliss pour la CCM de gel de silice

Les systmes solvants choisis sont utiliss comme des luants des phases stationnaires (silice

et DC6), leurs vapeurs doivent saturer latmosphre de la cuve ceci impose dutiliser une cuve

bien ferme.

c / Le dpt: le dpt se fait avec des tubes capillaires en verre usage unique dune

faon perpendiculaire et linairement. Chaque phase doit tre dpose en solution

dilue dans le mthanol, on peut effectuer plusieurs dpts successifs du mme analyte

en mme endroit, cette pratique permet de concentrer lanalyte (Sine, 2003)

d / Dveloppement des plaques: chaque plaque est dpose en position verticale ou

lgrement incline dans la cuve pralablement sature par les vapeurs du systme

solvant appropri, lchantillon tudier sera plus ou moins entrain par la

progression par capillarit de la phase mobile vers le haut de la plaque (Sine, 2003)

e / Rvlation : si les constituants sont colors, ils seront directement visible sur la

plaque, sinon la rvlation peut se faire soit aux UV ou bien par des mthodes

chimiques :

CCM sur gel de silice

Systmes solvants Proportions Rfrences

Systmes

essays

Actate dthyle /acide

formique/acide

actique/H2O

(100/11/11/27)

(v/v/v/v)

Male et al, 1998

Actate

dthyle/MeOH/H2O

(100/13.5/10)

(v/v/v)

Male et al, 1998

Systmes

choisis

Actate

dthyle/MeOH/H2O

(100/13.5/10)

(v/v/v)

Male et al, 1998

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*Rvlation aux UV: qui permet de mettre en vidence sous forme des taches des substances

qui absorbent les UV entre 254 nm et 365 nm.

*Rvlation par des mthodes chimiques: ces mthodes consistent mettre en contacte de

la plaque un ractif plus ou moins spcifique qui donne un produit color par raction

chimique avec les substances rvler (Latifou, 2005)

f / Identification des flavonodes: le comportement dune molcule particulire dans

un systme donn est exprim par sa fluorescence sous UV et par son Rf (le rapportde la distance parcourue par cette molcule sur celle parcourue par la phase mobile

cest dire le front du solvant) qui est compris entre 0 et 1.

*Structure -Rf

La distance de migration des substances dpend essentiellement de leur polarit :

Les polyhydroxyflavones ont des faibles valeurs de Rf (0,00-0,25)

Les oligohydroxy et les oligomthoxyflavones ont des valeurs de Rf comprises entre

(0,3-0,5)

Les flavanones, les flavonols, mthoxyflavones ont les valeurs les plus leves de Rf

(0,5-0,75) (Bandyukova et Shinkarenko, 1973)

Tableau VIII :La relation entre le Rf et la structure des flavonodes (Bandyukova etShinkarenko, 1973)

Structure flavonique Rf

Augmentation des (OH) Diminution du Rf

Mthylation des groupements (OH) Augmentation des valeurs de Rf

Actylation Augmentation des valeurs de Rf

Glycosylation Diminution des valeurs de Rf due principalement de

lintroduction de nouveaux groupements (OH)

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*Structure-fluorescence :

Lexamen en lumire ultraviolette est la mthode la plus utilise pour la dtermination de la

structure des flavonodes, le tableau 9 rsume la relation qui peut exister entre la structure

dun compos et sa fluorescence sous UV.

Tableau IX :La relation entre la fluorescence et la structure des flavonodes (Lahouel, 2005)

Spot color Types de flavonodes

Noir Flavonols 5, 6, 7, tri OH libres

Flavonols 5, 7, 8, tri OH librs

Brun noir 3-OH absent ou 3-OH substitu

Violet Flavones 5-OH et 4 OH

Flavones 3-OR et 5 OH ,4-OH

Flavones 6 ou 8 OH

Chalcones

Dihydroflavonols

Isoflavones

Flavanones

Bleu claire (fluorescent) Flavones sans 5-OH libre

Flavonols sans 5-OH libre avec 3 OH

substitu

Jaune terne

Jaune

Fluorescence orange

Flavonols 3- OH libre avec ou sans 5-OH

libre

Jaune vert brillant 5 OH libre ou 5 OH substitu

Jaune fluorescent Flavonols avec 3OH libres

Aurones

Chalcone

flavanones

Jaune ple dihydroflavonols

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I-4 / Mise en vidence des flavonodes :

Afin de mettre en vidence la prsence des flavonodes dans nos extraits, un test simple et

rapide au AlCl3 a t ralis (Latifou, 2005) pour ce test nous avons prpar une solution

thanolique de chlorure d'aluminium (1%) en dissolvant 1g d'AlCl3dans 100 ml d'thanol, la

solution est ensuite stocke 4c puis pulvrise sur le chromatogramme de gel de silice, ce

dernier qui a t dvelopp au pralable dans le systme solvant (actate

d'thyle/mthanol/eau) (100/13,5/10). Aprs schage le chromatogramme sera directement

observ dans le visible.

I-5 / Dosage des composs phnoliques :

Le contenu des composs phnoliques de nos extraits est estim par la mthode de Folin

ciocalteu (Adesegun et al,2007)

1ml d'extrait de l'chantillon 5ml du ractif de Folin ciocalteu (dilu dix fois)

4ml d'une solution de bicarbonate de sodium (0.7M)

Agiter vigoureusement

Incuber pendant 2h une temprature ambiante

Lire l'absorbance 765 nm, le total des composs phnoliques est dtermin selon

l'quation suivante T=C.V/M

T : Reprsente le total des composs phnoliques (mg EAT / g dextrait sec de la plante)

C : Concentration dextrait thanolique quivalente lacide tannique, obtenue partir de la

courbe d'talonnage (mg/ml)

V : le volume d'extrait thanolique (ml)

M : poids sec d'extrait thanolique de la plante (g)

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I-6 / Dosage des flavonodes:

Les flavonodes contenus dans les extraits thanoliques du thym et du romarin sont estims

par la mthode d'AlCl3(Ayoola et al, 2008)

1ml d'une solution thanolique d'AlCl3 (2%) est rajout 1ml de l'extrait de la plante.

Aprs 30 minutes d'incubation une temprature ambiante, l'absorbance du mlange

est lue 420 nm, la querctine est utilise comme un standard, la quantit desflavonodes est estime en mg EQ/g d'extrait sec de la plante.

I-7 / Techniques chromatographiques de sparation des flavonodes :

I-7-1 / La chromatographie sur colonne :

La chromatographie sur colonne est une mthode de sparation des constituants dun

mlange par migration dans un dispositif constitu de deux phases :

La phase stationnaire : cest le support solide, qui est la colonne de polyamide

(DC6), elle est monte dans le moins polaire des solvants utiliss qui est le tolune

dans notre cas.

La phase mobile: reprsente le solvant dlution utilis qui est en gnrale unmlange de deux solvants, lun polaire et lautre apolaire.

Aprs dissolution des phases actate dthyle et MEC de Thymus vulgaris dans le

mthanol, le mlange est additionn une quantit de polyamide (DC6), vapor sec ce qui

conduit lobtention dune poudre solide qui est introduite dlicatement dans la colonne puis

fractionne avec le gradient (tolune/mthanol) de polarit croissante, llution doit tre

poursuite jusquau mthanol pur. A chaque fois des fractions de 25 ml sont prleves.

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Les fractions collectes sont soumises au contrle chromatographique sur couche mince, puis

rvles aux UV (254 et 365 nm) ce qui en permet de rassembler les fractions prsentant dessimilitudes.

I-7-2 / La chromatographie sur papier :

La chromatographie prparative sur papier Wathman n 3 est une mthode de sparation

dont le principe repose sur les phnomnes de partage. La phase mobile est le plus souvent un

solvant organique et leau, la phase stationnaire est constitue par leau elle-mme absorbe

par la cellulose du papier ou lie chimiquement elle. Dans cette technique, une quantit

importante des deux phases mlanges de MEC et actate dthyle de Rosmarinus officinalis

est dpose sur le bord dune bande de papier de chromatographie, cet chantillon est absorb

par le papier ; ce qui signifie que les molcules interagissent avec ce dernier et quelles auront

tendance rester au mme endroit. Le papier est ensuite tremp dans le systme solvant

(acide actique/eau) (50/50 : v/v) plac dans une cuve bien ferme, pendant que lluant

descend le long du papier par capillarit, il rencontre lchantillon qui commence descendre

avec celui-ci. Les diffrentes substances de lchantillon migrent diffrentes vitesses selon

quelles interagissent plus ou moins fortement avec le papier. La chromatographie sur papier

demande un certain temps, gnralement plusieurs heures, une fois que cest fini, c'est--dire

quand le solvant est arriv en bas du papier ce dernier est retir de la cuve, on laisse vaporer

le solvant. Aprs dveloppement des chromatogrammes, les bandes correspondent aux

composs sont dlimites sous UV, dcoupes et lues dans le mthanol.

I-8 / La spectrophotomtrie:

I-8-1 / Dfinition :

La spectrophotomtrie est une mthode analytique quantitative qui consiste mesurer

labsorbance ou la densit optique dune structure chimique donne en solution, plus cette

espce est concentre plus elle absorbe la lumire dans les limites de proportionnalit

nonces par la loi de Beer Lambert (Wikipdia, 2008)

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I-8-2 / Principe :

Le principe repose sur labsorption de la lumire par les espces chimiques, lappareilcomporte une source de lumire blanche, un systme dispersif permettant de slectionner

la longueur donde de la radiation et un systme dtecteur permettant la mesure de

lintensit lumineuse de la radiation monochromatique traversant la solution. Le

spectrophotomtre effectue une comparaison entre les intensits lumineuses incidentes et

transmises et permet par lintermdiaire dun circuit lectronique dafficher labsorbance

A= .l.c

Pour valider la loi de Beer-Lambert il faut travailler en lumire monochromatique, les

solutions utilises doivent tre dilues, homognes, et le solut ne doit pas donner de

ractions sous leffet de la lumire incidente.

I-8-3 / Spectres UV-Visible des flavonodes :

Les flavonodes peuvent tre considrs comme des pigments qui absorbent trs

fortement les radiations UV, par consquent la spectroscopie UV-Vis reste l'outil principal

pour l'analyse structurale des flavonodes. Les flavones et flavonols sont caractriss en

majorit par deux bandes dabsorption majeures dans la rgion UV-Visible.

Les flavones et les flavonols hautement oxygns ont tendance d'absorbance vers les

longueurs d'ondes les plus longues en entrainant un dplacement du spectre vers linfrarouge. La mthylation ou la glycosylation des groupements hydroxyles des flavonodes

rsulte gnralement d'un dplacement hypsochromique de la bande I.

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Tableau X :Principales caractristiques des spectres UV-Visible des flavonodes (Markham,

1982)

Bande II Bande I Types de flavonodes

250-280

250-280

250-280

245-275

275-295

230-270

(Faible intensit)

230-270

270-280

310-350

330-360

350-385

310-330

(paulement pic 320)

300-330

Epaulement

340-390

380-430

465-560

Flavones

Flavonols substitus en C3

Flavonols

Isoflavones

Isoflavones (5-desoxy-6,7-

dioxygns)

Flavanones et

dihydroflavonols

Chalcones

Aurones

Anthocyanes

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I-8-4 / Etude spectrale des flavonodes :

Aprs la collection des extraits flavoniques suite lutilisation des techniqueschromatographiques de sparation (chromatographie sur colonne pour Thymus vulgaris

et chromatographie sur papier pour Rosmarinus officinalis) les composs isols sont

analyss par mesure de leur spectre dabsorption UV-Vis dans le mthanol, ainsi que leur

dplacement bathochromique, hypsochromique, hyperchromique suite laddition des

ractifs spcifiques (Andr et al, 1976 ; Van Den Broucke et al, 1982 ; Voirin , 1983 ;

Dordevi et al, 2000)

Premire srie :

Deuxime srie :

Troisime srie :

Figure 11 :Protocole d'tude spectrale des flavonodes en prsence des diffrents ractifs

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Tableau XI :Principales caractristiques spectrales UV-Visible des flavonodes en prsence

des diffrents ractifs (Markham, 1982)

Ractifs Dplacements en nmBande I Bande II

Interprtations

MeOH 310-350 250-280330-360 250-280350-380 250-280

FlavonesFlavonols (3-OH substitu)

Flavonols (3-OH libre)NaOH +45 65 BI avec stabilit

dintensit

+50 60 avec diminutiondintensit

Faible dplacement avecdiminution dintensit

Absence de pic entre 320-335

Apparition dun pic entre BIet BII

Transformation de BI en uneinflexion

4OH

3,4-di OH

4 OMe

7-OR

7-OH

5-OH

AlCl3+MeOH +20 45+60 5-OH3-OHAlCl3+HCl / AlCl3 -30 45

-10

-20

3,4 di OH

3 ,4-OH,OMe

3,4,5-tri OH

AlCl3+HCl /MeOH +35 55

+17 20

5-OH

5-OH

NaOAc / MeOH +20 80

Dplacement trs faible

Diminution dintensit avec letemps

Spectre se dcompose avec letemps

7-OH

7-OR

6,7 ; 7,8 ou 3 ,4-di-OH

5, 6,7 ; 5, 7,8 ou 3,3,4-triOH

NaOAc +H3BO

3/ MeOH +12 36

+5 10

3,4-di OH

6,7 ou 7,8 di OH

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Chapitre II

Etude des activits biologiques


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Matriel et mthodes ChapitreII Etude des activits biologiques

II-1 / Activit antiradicalaire des flavonodes :

Les radicaux libres peuvent tre considrs comme des lments trs importants pour la vie

de lorganisme suite limplication de leurs effets bnfiques, par exemple les radicaux

oxygniques exercent des actions critiques sur les signaux de traduction, et sur les gnes de

transcription, les cellules phagocytaires (macrophages) utilisent galement les espces

ractives drives de loxygne (ROS) pour combattre les agents infectieux (bactries et

virus). Cependant ces mmes radicaux peuvent causer des dgts oxydatifs cellulaires,

endommagement des tissus et mme la mort des cellules et le dveloppement des processuspathologiques (Fotsing Matene, 2005 ; Wang et al, 2008)

Les antioxydants naturels sont prsents dans lalimentation ; pour la plupart se sont des

composs phnoliques qui possdent au moins un noyau aromatique, contenant un ou

plusieurs substituants, en effet cette proprit antioxydante est en relation directe avec la

structure de ces molcules (Cosio et al,2006). Lactivit antioxydante des flavonodes peut

tre mesure par lutilisation dune mthode simple, rapide et facile mettre en uvre ; cestla mthode de DPPH, dont le DPPH est un radical libre, stable, qui possde une bande

dabsorbance 517 nm, employ pour valuer lactivit antioxydante des composs pures ou

de mlange complexe, la mthodologie est base sur la dcroissance de labsorbance dune

solution mthanolique de DPPH suite laddition de lantioxydant (Bernardi et al, 2007). On

utilise comme principes actifs les extraits flavoniques du thym et du romarin qui sont

respectivement en nombre de six et de trois, ces extraits sont vapors sec afin de connaitre

leurs poids sec puis repris dans le mthanol de telle sorte avoir des concentrations de 5mg/ml pour chacun.

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Lactivit antiradicalaire de ces extraits est mesure selon la mthode dcrite par (ES Safi

et al, 2007)

25l de lextrait tester

2.5ml dune solution mthanolique de DPPH (0.004%)

La densit optique DO est mesure par le spectrophotomtre SHIMADZU 517 nm,

aprs 30 minutes dincubation une temprature ambiante et lobscurit, la

dcroissance de labsorbance est convertie en pourcentage dactivit Scavenger selon

lquation suivante :

Activit Scavenger (%) = (A contrle A chant / A contrle) x 100

A contrle: Absorbance du contrle

A chant: Absorbance des flavonodes tests

II-2 / Evaluation de l'activit antibactrienne des flavonodes :

Le test de susceptibilit a t effectu selon la mthode de diffusion des disques dcrite par

(Dulger et Gonuz, 2004 ; Parekh et Chanda, 2007 ; Rota et al, 2008)

Le support microbien est compos dEscherichia coli, Staphylococcus aureus,Enterobacter spp qui ont t isoles de produits pathologiques provenant de laboratoire de

bactriologie de l'hpital universitaire de Constantine.

Repiquage des espces bactriennes : les diffrentes espces bactriennes ont t

repiques par la mthode des stries, puis incubes 37 C afin d'obtenir des colonies

isoles qui vont servir la prparation de linoculum.

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Prparation de l'inoculum : des colonies bien spares des espces bactriennes

concernes ont t prleves l'aide d'une anse de platine strile et homognisesdans 10 ml de bouillon nutritif puis portes lincubation pendant (18-24) heures

37C.

Prparation des disques: des disques de papier Wathman n1 de 6 mm de diamtre,

striles (strilisation 120C pendant 15 min par autoclavage), sont chargs de

l'extrait naturel tester, des disques imprgns de mthanol sont galement utiliss qui

vont servir de tmoin ngatif.

Prparation des milieux de culture : la glose de Muller Hinton strile prte

lusage a t coule dans des boites de ptrie striles de 90 mm de diamtre.

L'paisseur de la glose est de 2 mm rpartie uniformment dans les boites. Ces

dernires doivent tre sches 30 min une temprature ambiante du laboratoire avant

leur emploi.

Ensemencement : des boites de ptrie striles pralablement coules, sont

ensemences par talage l'aide d'un rteau strile, l'ensemencement s'effectue de telle

sorte assurer une distribution homogne des bactries.

A l'aide d'une pince strile, les disques de papier filtre contenant les produits tester

sont dposs la surface de la glose inocule au pralable.

L'activit antibactrienne est dtermine en terme de diamtre de la zone d'inhibition produite

autour des disques aprs 24 h d'incubation 37 C.

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Rsultats et discussion


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Chapitre I

Etude phytochimique


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Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique

I-1 / Extraction:

L'extraction des parties ariennes de Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis parmacration dans le mlange thanol / eau (30/70 : v/v) et la partition entre les diffrents

solvants nous ont permis d'obtenir les phases suivantes :

Phase ther de ptrole : obtenue aprs affrontement par l'ther de ptrole mais elle

est limine car elle ne contient que des matires grasses, des chlorophylles, et des

impurets.

Phase actate d'thyle: obtenue aprs affrontement par l'actate dthyle, ce dernier

qui permet d'extraire les flavonodes, en entrainant les aglycones, les mono-O-

glycosides et partiellement les di -O- glycosides (Benkiki, 2006)

Phase mthyle thyle ctone (MEC) : obtenue aprs affrontement par mthyle

thyle ctone.

Phase eau : c'est la phase rsiduelle. Le mlange des deux phases (phase actate

d'thyle et la phase MEC) sera consacr aux analyses chromatographiques de

sparation (CC et CP).

I-2 / Chromatographie analytique sur couche mince :

Pour avoir les empreintes flavoniques de nos extraits, et avoir une ide sur leurscompositions chimiques, une chromatographie analytique sur couche mince a t ralise en

utilisant deux systmes solvants moyennement polaires. Sous lumire UV 365 nm Les

diffrentes taches de produits qui se prsentent sur les chromatogrammes ont t dlimites.

Les couleurs des spots et leurs Rf observs sous UV suite une analyse par chromatographie

sur couche mince, nous ont permis de rvler la prsence des flavones et des flavonols.

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Tableau XII: Comportement chromatographique des phases actate d'thyle et MEC de

Thymus vulgarisetRosmarinus officinalis sur plaque de polyamide (DC6) dans le systme

solvant (tolune /mthanol/thanol) (4/3/3)

Thymus vulgaris Rosmarinus officinalis

La phase MEC La phase actated'thyle

La phase MEC La phase Actated'thyle

Spot colorsous UV 365nm

Rf Spot colorsous UV 365nm



Rf

Violet +++ 0.85 Brun marron 0.84 Violet+++ 0.84 / /

Violet 0.62 Violet 0.63 Violet++ 0.6 Brun noir 0.73

Brun 0.49 Brun marron 0.51 Brun 0.5 Violet 0.66

Blanc 0.40 Marron 0.43 Marron clair 0.42 Brun noir 0.54

Violet 0.32 Violet 0.35 Violet+ 0.33 Noir 0.44

Jaunefluorescent

0.27 Marron jaune 0.25 Jaunefluorescent

0.28 Violet 0.38

Marron 0.19 Violet 0.12 Marron 0.24 Marron 0.31

Violet 0.14 Jaune ple 0.02 Violet 0.16 Bleu clair 0.14

Marron 0.06 Dpt =jauneple

0.0 Violet sombre 0.08 Dpt=jauneple

0.0

Dpt=marronjaune

0.0 / / Marron jaune 0.02 / /

/ / / / Dpt=marron jaune

0.0 / /

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Tableau XIII :Comportement chromatographique des phases actate d'thyle et MEC de

Thymus vulgarisetRosmarinus officinalis sur plaque de polyamide (DC6) dans le systmesolvant (mthanol/eau/acide actique) (95/5/5)

Thymus vulgaris Rosmarinus officinalis



Spot color

sous UV 365nm

Rf Spot color

sous UV 365 nm

Rf Spot color

sous UV 365 nm

Rf Spot color

sous UV 365 nm

Rf

Violet+++ 0.73 Vert clair 0.71 Violet+++ 0.84 Jaune trsclair

0.75

Jaune trs clair 0.59 Violet 0.56 Jaunetrs clair

0.75 Gris 0.64

Marron 0.38 Gris 0.51 Violet 0.63 Violet 0.57

Jaunefluorescent+++

0.28 Violet 0.45 Marron 0.45 Brun noir 0.51

Bleu clairfluorescent

0.21 Vert jaune 0.34 Jaune+++ 0.32 gris 0.45

Marron+++ 0.13 Bleu clair 0.21 Bleu clair 0.24 Brun noir 0.36

Vert jaune 0.06 Marron 0.11 Marron 0.15 Bleu clair 0.21

Dpt=marron 0.0 Jaune 0.04 Marron+++ 0.06 Marron 0.08

/ / Dpt=jauneple

0.0 Dpt=marron

0.0 Dpt =jaune 0.0

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Figure 12: CCM analytique reprsentative des flavonodes de Thymus vulgaris et de

Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide DC6 dveloppe dans le systme solvant

(tolune/mthanol/thanol) (4/3/3)

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Figure 13: CCM analytique reprsentative des flavonodes de Thymus vulgaris et de

Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide DC6 dveloppe dans le systme solvant

(mthanol/eau/acide actique) (95/5/5)

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I-3 / Mise en vidence des flavonodes :

La pulvrisation du chromatogramme de gel de silice par une solution thanolique dAlCl3(1%), rvle lapparition des taches jaunes, cette coloration est due la formation d'un

complexe entre le chlorure d'aluminium et les atomes d'oxygne prsents sur les carbones des

flavonodes. Ces rsultats affirment lexistence des flavonodes dans les phases exprimant des

taches jaunes.

Figure 14 : Comportement chromatographique des phases actate d'thyle et MEC de

Thymus vulgaris et de Rosmarinus officinalis sur plaque de silice aprs pulvrisation par

une solution thanolique d'AlCl3(1%), dont les taches jaunes correspondent aux flavonodes.

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I-4 / Dosage des composs phnoliqueset des flavonodes:

Le contenu des composs phnoliques a t dtermin par la mthode de Folin ciocalteu. Le

romarin prsente 10,420,003 mg EAT/g dextrait sec de la plante, ces rsultats sont presque

conformes aux travaux de Muchuweti et al(2007), dont ils ont estim 10,83 mg EAG/g pour

lextrait sec du romarin sur lequel ils travaillaient. Le Thymus vulgarisprsente 9,07 0.002

mg EAT/g dextrait sec de la plante.

La quantit des composs phnoliques des extraits thanoliques des plantes tudiesdpend essentiellement : de leur origine (Ebrahimzadeh et al, 2008), la varit, la saison de

culture, la saison de rcolte, les conditions climatiques et environnementales, la localisation

gographique, les diffrentes maladies qui peuvent affecter la plante, la maturit de la plante

(Park et Cha, 2003) et la dure de conservation (zgven et al, 1998)

La teneur en flavonodes des extraits thanoliques en terme de la querctine quivalent

(EQ) est de 8,83 0.026 mg/g EQ pour lextrait sec du romarin, et de 8.56 0.001 mg/gEQ pour lextrait sec du thym.

Figure 15: Le contenu des composs phnoliques et contenu des flavonoides dans ThymusvulgarisetRosmarinus officinalis.

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I-5 / Les fractions obtenues par les techniques chromatographiques de

sparation :

I-5-1 / Les flavonodes isols de Thymus vulgarispar CC :

La technique de chromatographie sur colonne de polyamide est utilise pour isoler des

flavonodes du mlange des deux phases actate dthyle et MEC de Thymus vulgaris,dont on

a pu collecter 172 fractions de 25 ml, le contrle de ces fractions sur des plaques de

polyamide nous a permis de slectionner celles qui reprsentent un seul spot bien distingu

sous UV 365 nm .

Tableau XIV: Le mode d'obtention des diffrentes fractions isoles de Thymus vulgaris,

leurs fluorescences sous UV 365nm, leurs Rf sur des plaques de polyamide ou de silice ainsi

que les systmes solvants qui en sont utiliss pour le dveloppement des chromatogrammes.

Molcules Systmes

d'lution

(Tol/MeOH)pour la CC

Spot color

sous UV 365

nm

Rf Systmes solvants pour le

dveloppement des plaques

01 (50/50) Noir 0.68 Tol/MeOH/EtOH/EP (20/15/12.5/2.5)

02 (50/50) Violet 0.63 Tol/MeOH/EtOH/EP (20/15/12.5/2.5)

03 (50/50) Violet trs clair 0.63 Tol/MeOH/EtOH/Ether de ptrole

(20/15/12.5/2.5)04 (0/100)

(5/95)

Violet trs clair 0.36 Tol/MeOH/EtOH/EP (20/15/12.5/1)

05 (90/10) Brun 0.93 Actate d'thyle/MeOH/H2O/EP

(20/15/12.5/1.5) (plaque de silice)

06 (65/35)

(70/30)

Bleu violet 0.93 Tol/MeOH/EtOH/EP (20/15/12.5/2.5)

56


70/130


I-5-2 / Les flavonodes isols deRosmarinus officinalispar la CP :

Les flavonodes isols de Rosmarinus officinalis ont t obtenus par la technique de

chromatographie sur papier en utilisant comme luant le systme solvant (acide actique/eau)

(50/50 : v/v). Aprs le dveloppement des chromatogrammes, les bandes correspondant aux

composs sont dlimites sous UV 365 nm.

Tableau XV : Les diffrentes fractions obtenues de Rosmarinus officinalis, leurs

fluorescences so

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