Intérêt de l'acide hyaluronique en parodontologie: revue ...
Thème · Chapitre IV : Matériels et méthodes ... V.1.5.2 Méthode de la réduction de fer (FRAP)...
Transcript of Thème · Chapitre IV : Matériels et méthodes ... V.1.5.2 Méthode de la réduction de fer (FRAP)...
UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences Biologique
Mémoire
MASTER ACADEMIQUE
Domaine : Science de la Nature et de la Vie
Filière : Biologie
Spécialité : Biotechnologie végétale
Présente par : BOUTALBI SAFA
Thème
Soutenu publiquement
Le : 08/06/2014
Devant le jury :
Présidente Mme. BAYOUCEFZ. M.A.A U.K.M. Ouargla
Promotrice Mme. OULD ELHADJ-KHELIL A. Pr U.K.M. Ouargla
CO-Promoteur Mr. SEGGAI A. M.A. A U.KI.M Ouargla
Examinatrice Mme. ANNOU G. M.A.A U.K.M Ouargla
Examinatrice Mlle. SALHI N M.C.A U.K.M Ouargla
Année universitaire : 2013/2014
Criblage chimique et l'activité biologique de spiruline (Arthrospira platensis).
Avant propos
Avant tout, je remercie ALLAH, sans Lui ce manuscrit n'aurait pu exister.
Je tiens particulièrement à remercier mon encadreur Mme OULD EL HADJ
KHELIL AMINTA Professeur de l'université d'Ouargla, pour ses conseils, ses commentaires
et sa bienveillance. Qu’elle soit assurée de ma profonde gratitude pour m’avoir guidée et
aidée tout au long de la réalisation de ce mémoire.
Je remercié les plus vifs vont également à ma Co-promoteur Mr SEGGAI.ALI
M.A.A à l'Université de Ouargla pour leur aide et orientation les conseils qu’elle m’a
prodigués, sa grande expérience en production de spiruline
J’exprime ma gratitude particulièrement Mr BELGUIDOUM Mahdi, Doctorant en
chimie appliquée spécialité phytochimie pour leur disponibilité durant la réalisation de ce
travail. Je vous remercie pour vos discussions scientifiques et techniques enrichissantes que
vous m’avez apporté au jour le jour, qui ont fortement contribué au bon déroulement de ce
mémoire et m’ont permis d’acquérir des nouvelles connaissances à l’échelle du laboratoire
J’exprime mes vifs remerciements à Mme BAYOUCEF ZAHIA Maitre conférence
A, de l'université de Ouargla d’avoir de m’avoir fait l’honneur de présider ce jury.
Je remercie vivement Melle SALHI NESRIN Maitre de conférence A à l’université
de Ouargla qui m’a fait l’honneur qui m’a fait le plaisir d’examiner ce modeste travail.
Je remercie sincèrement Mme ANNOU GHANIA Maitre assistante classe A à
l’université de Ouargla qui m’a fait l’honneur qui m’a fait le plaisir d’examiner ce modeste
travail.
Merci également à Mr HIRI fournisseur de la souche de Spiruline « Arthrospira
platensis » à Tamanrasset J’adresse également mes profonds remerciements à Mme ALOUI
Nabiha, Technicienne de laboratoire VPRS (valorisation et promotions et ressources
sahariennes) de la faculté de mathématique et science de la matière qui m'a permis d'effectuer
ce travail dans de bonnes conditions.
Je tiens à remercier Mr HADJADJ Professeur de l’université d'Ouargla Pour
m’avoir accueilli au sein de son laboratoire (VPRS).
A ceux qui mon donné la vie
" Papa et Mama "
Et à mon frère et mes sœurs
Ceux qui la rendent plus intéressante...
A toute ma famille et mes ami(e)s
Mon petit univers
Safa
SOMMAIRE
Remerciement
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des photos
Liste des abréviations
Introduction
Chapitre I : Généralité sur l'arthrospira platensis
I.1 Description de spiruline 3
I.2 Biologie et écologie
3I.2.1 Caractère morphologique 3
I.2.2 Taxonomie et systématique 3
I.2.3 Habitat et répartition géographique 4
I.3 Composition chimique de la spiruline 4
I.3.1 Protéines 4
I.3.2 Vitamines 5
I.3.3 Acides nucléiques 5
I.3.4 Lipides 5
I.3.5 Glucides 6
I.3.6 Composition en sels minéraux et oligo-éléments 6
I.3.7 Phycocyanine 6
I.4 Intérêt de la spiruline dans différents domaines 7
I.4.1 Santé 7
I.4.2 Cosmétique 7
I.4.3 Agroalimentaire 7
Chapitre II: les métabolites sécondaires
II.1 Métabolites secondaires 8
II .1.1 Composés phénoliques 8
II.1 .2 Principales classes des composés phénoliques 8
II.1.2.1 Flavonoïdes 9
II.1.2.2tanins 10
II.1.3 Composés terpéniques 10
II.1.4 Alcaloïdes 10
Chapitre III: les activités biologiques
III. 1 antioxydant
III.1. 2 Les antioxydants endogènes
III.1. 3 Les antioxydants exogènes
III.2 Agents antimicrobienne
III.2.1 Bactéries
III.2.2 Infections bactériennes
III.3 Généralités sur les champignons
11
11
11
12
13
13
13
Chapitre IV : Matériels et méthodes
IV.1 Matériel biologique 13
IV.2 méthodes d’extraction pour Screening chimique 13
IV.2.1.1 Détection des poly phénols 15
IV.3 Méthode d'extraction pour les activités biologiques 16
IV.4 Analyse quantitative des composés phénoliques 19
IV.4.1 Dosage des phénols totaux 19
IV.4.1.1 Courbe d’étalonnage 19
IV.4.2 Dosage de flavonoïdes 20
IV.4.2.1 Courbe d’étalonnage 21
IV.4.3 Dosage des tannins condensés 21
IV.5 Evaluation du pouvoir antioxydant 22
IV.5.1 Le pouvoir réducteur des composés phénoliques (Reducing Power Assay) 22
IV.5.1.1 Courbe d'étalonnage 23
IV.5.2 Piégeage du radical libre DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil) 23
IV.6 Analyses chromatographiques 24
IV.6.1 Analyse par chromatographie sur couche mince 24
IV.6.1.1 chromatographie sur couche mince de L’extrait aqueux brute et MeOH brut 25
IV.6.1.2 chromatographie sur couche mince CCM L'extrait chloroformique 25
IV.6. 2 Analyse par chromatographie sur papier CP monodimensionnelle 25
IV.6.2.1 CP monodimensionnelle 26
IV.6.2.2C.P bidimensionnelle 27
IV.7Activité antimicrobienne 28
IV.7.1Souches testées 28
IV.7.2Ensemencement 29
IV.8Activité antifongique 31
IV.8.1 Préparation des différentes concentrations 31
IV.8.2 Essai d’activité antifongique 32
Chapitre V: Résultats et discussion
V.1 Résultats 34
V.1.1 criblage chimique 34
V.1.2 Teneur des extraits en polyphénols 35
V.1.3 Teneur en flavonoïdes 36
V.1.4 Teneur en tanins 38
V.1.5 Activité antioxydant 39
V.1.5.1 Piégeage du radical libre DPPH (2.2-diphényl-1-picrylhydrazyl) 39
V.1.5.2 Méthode de la réduction de fer (FRAP) 43
V.1.6 Analyse chromatographique 46
V.1.6.1 Analyse par chromatographie sur couche mince CCM 46
V.1.6.2 Analyse par chromatographie sur papier CP monodimensionnelle 48.
V.1.6.3 chromatographie sur papier C.P bidimensionnelle 51
V.1.7 Activité antimicrobienne 52
V.1.8 Activité antifongique 54
V.2 Dissucusion 56
Conclusion 58
Liste des figures
Figure Page
Figure 01: Extraction méthanolique à partir de poudre de spiruline 14
Figure 02: Extraction aqueuse à partir de poudre de spiruline 14
Figure 03 : Protocole d'extraction des différentes phases 19
Figure 04 : structure de l'acide gallique 20
Figure 05 : structure de quercétine 20
Figure 06 : Réaction d’un antioxydant avec le radical DPPH 25
Figure 07: Illustration de prise de dépôt sur C.P de la monodimensionnelle 27
Figure08:Illustration de prise de dépôt sur C.P de la bidimensionnelle 28
Figure 09: Protocole expérimentale de l’essai d’activité antibactérienne des extraits de
spiruline
30
Figure 10: Protocole expérimentale de l’essai d’activité antifongique des extraits de
Spiruline
32
Figure 11:courbe d'étalonnage des polyphénols. 34
Figure 12: teneur en polyphénols totaux (mg/g de poids sec de la spiruline) 35
Figure 13: courbe d'étalonnage de Quercétine 36
Figure 14: teneur en flavonoïde des extraits de spiruline 36
Figure 15: courbe d'étalonnage de vanilline 36
Figure 16: teneur en tanins des extraits de spiruline 37
Figure 17: Comparaison des teneurs en polyphénols et flavonoïdes et tanins 38
Figure 18 : Pourcentage d’inhibition en fonction des différentes concentrations de
L’acide ascorbique
39
Figure 19 : Pourcentage d'inhibition de BHA 39
Figure 20 : Pourcentage d'inhibition de BHT 39
Figure 21: Pourcentage d’inhibition de radical libre DPPH en fonction des
concentrations des extraits BuOH, brut MeOH, AcET, brut Aqx. .
40
Figure 22 : IC50 de l'acide ascorbique, , les extraits de spiruline 41
Figure 23 : courbes représentants le pouvoir réductrice des extraits de spiruline 42
Figure 24: pouvoir réductrice de l'acide ascorbique 43
Figure 25 : Moyennes des diamètres des zones d'inhibition des extraits de spiruline
relatives aux différentes souches bactériennes
52
Figure 26 : Effet d'inhibition de la croissance mycélienne (mm) de Fusaruim
oxysporum par les extraits de spiruline
53
Liste des tableaux
Tableau01 classification des composés phénoliques 09
Tbaleau02 Liste des principaux radicaux libres. 10
Tableau 03 les souches bactériennes 30
Tableau 04 les résultats des screening chimique de spiruline. 34
Tableau 05 Les valeurs d’AEAC des différents extraits étudiés. 44
Tableau 06 fluorescence et Rf des taches sur CCM des extraits. 47
Tableau 07 Les résultats du CP monodimensionnelle. 50
Tableau 08 résultats de CP 2D de l'extrait butanolique et acétate. 52
Liste des abréviations
AcOEt acétate d'éthyle.
AEAC Ascorbique acide équivalent antioxydant capacité.
BHA Butyl hydroxyanizole.
BHT Butylhydroxytoluène.
BuOH butanol.
C concentration
CCM chromatographie sur couche mince
CHCl3 chloroforme.
CuSo4 sulfate de cuivre.
CP chromatographie sur papier WATHMANE
D nombre de dilution
DPPH 1 ,1-diphényle-2-picrylhydrazyl.
EQ Quercétine équivalent
EV Vanilline équivalent
FeCl3 Chlorure de fer.
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power.
g/l gramme par litre.
g gramme
GAE acide gallique équivalent
GN gélose nutritive
H2O2 Le peroxyde d’hydrogène
H2SO4 Acide sulferique
H3PMo12O40 Acide phosphomolybdique
H3PW12O40 Acide phosphotungstique
HCL Acide Chlorhydrique.
I% pourcentage d’inhibition.
IC50 concentration inhibitrice IC50.
K3Fe(CN) 6 Ferricyanure de potassium.
l litre
m Masse
M Molaire
mg/g milligramme par gramme.
mg/ml milligramme par millilitre.
Mg2+
Magnésium.
min Minute
ml millilitre.
NaOH hydroxyde de sodium.
NH4OH hydroxyde d'ammonium.
nm nanomètre.
O2 Oxygène moléculaire
O2·- Le radical superoxyde
OH Le radical Hydroxyle
PDA gélose dextrosée à la pomme de terre
R rendement.
ROO• Le radical Peroxyle
ROOH Hydroperoxydes organiques
TCA Acide trichlorure acétique.
UV Ultra-violet.
VC vitamine C ou acide ascorbique
λ longueur d’onde.
μl microlitre.
φ phase.
% pourcentage 0C Dégrée
Introduction
INTRODUCTION
1
INTRODUCTION
Le groupe des cyanobactéries, anciennement appelées algues bleues, compte parmi
l'unedes plus anciennes formes de vie sur Terre et constitue l'essentiel des bactéries
photosynthétique avec production d'oxygène. Parmi elle existe le genre Spirulina ou
Arthrospira,des cyanobactéries filamenteuses dont fait partie une bactérie particulièrement
intéressantedénommée Spirulina platensis (ou Arthrospira platensis) plus connue sous le nom
de algueSpiruline. Cettecyanobactérie semble actuellement l'une des meilleurs solutions pour
la production simple d'uncomplément alimentaire de haute qualité [15].
Elle consommée depuis des siècles par certains peuples primitifs d'Afrique et
d'Amérique,et connue par les scientifiques depuis plusieurs décennies pour sa richesse
nutritionnelle, elle faitl'objet d'une redécouverte depuis quelques années[1].Outre des
propriétés nutritionnelles avérées, la spiruline connait aujourd'hui un regaind'intérêt de la part
de la communauté scientifique internationale du fait de sa possible utilisationcomme source
de produits à vertus thérapeutiques.[12].
En effet, le potentiel de cette micro-alguesemble être important et ceci principalement
grâce a son principal pigment, la phycocyanine,donnant a cet organisme sa couleur bleu-vert
caractéristique. Certaines études ont en autres misen évidence des activités sur le système
immunitaire, le cancer, le SIDA mais aussi des effets dansla lutte contre le vieillissement
cellulaire, des propriétés hepatoprotectrices, et anti-inflammatoires.[14].
De multiples études, certes dispersées, portent sur la recherche de
nouveauxconstituants naturels tels que les composés phénoliques, les huiles essentielles qui
ont desintérêts multiples mis en faveur de l’industrie agroalimentaire (additifs, colorants,
arômes,agents de conservation) et pharmaceutique, malheureusement l’exploitation et la
valorisationde ces ressources naturelles reste très limitée et très artisanale [20].
Toutefois, l’évaluation des propriétés thérapeutiques antioxydantes etantimicrobiennes
demeure une tâche très intéressante et utile en particulier,pour cela notre travail s’intéresse de
l'étude de chimique et l'activité biologique d'une cyanobactérie possède des caractéristiques
communes entre le monde végétal
Notre travail sera donc réparti en cinq chapitres, initié par une recherche
bibliographique où nousapportons dans le premier chapitre l'espèce sélectionnée: Arthrospira
INTRODUCTION
2
platensis. Dans leDeuxième chapitre nous avons développé un abrégé sur les substances
actives: composés phénoliques et terpènes et les alcaloïdes. Le troisième chapitre a pour objet
de définir les divers qctivit2s biologiques.
La partie pratique est subdivisée en deux chapitresprésente lesméthodes et les
techniques utilisées pour la réalisation de ce travail. Enfin le cinquième chapitre discute les
résultats obtenus dans cette étude.
Chapitre I
Généralité sur l’Arthrospira platensis
Chapitre I Généralités sur les l’Arthrospira platensis
3
Chapitre I : Généralité sur l'Arthrospira platensis
I.1 Description de spiruline
Arthrospira platensis, appelée communément spiruline est une cyanobactérie qui est
exploitée, aussi bien en lacs naturel qu'en bassins industriels, dans divers régions du monde
[1]. Elle est consommée depuis les temps reculés par diverses populations du monde (Tchad,
Mexique, Inde) [2]. La spiruline se présente sous formes de filaments constitués des
cellules juxtaposées. La reproduction de la spiruline, asexuées, se fait par division des
filaments [3]. Elle est considérée comme une source alimentaire de haute qualité nutritive [4].
I.2 Biologie et écologie
I.2.1 Caractère morphologique
La spiruline a une longueur moyenne de 250µm quand elle possède 7 spires .Elle est
composée de filaments mobiles (de 10 à 12 µm de diamètre) non ramifiés et enroulés en
spirales [2].La spiruline donc dotée du pouvoir photosynthétique, c'est-à-dire qu'elle produit
de la matière organique à partir du gaz carbonique et de l'énergie solaire qu'elle convertit en
énergie chimique utilisée pour réaliser la synthèse d'un grand nombre des métabolites [5].
C'est une procaryote vrai Elle est de type GRAM négative. Malgré son système
énergétique photosynthétique [2].
I.2.2 Taxonomie et systématique
La classification de la spiruline et la suivant [5] :
Règne: Monéra
Classe: Cyanophyceae
Ordre: Nostocales
Famille: Oscillatoriceae
Genre: Arthrospira
Espèce: Arthrospira platensis.
Chapitre I Généralités sur les l’Arthrospira platensis
4
Photo 01: aspect microscopique de l'Arthrospira platensis [2].
I.2.3 Habitat et répartition géographique
La spiruline se développe préférentiellement dans des eaux chaudes, alcalines et riches en
nutriments azotés et phosphorés. Plus communément, elle s’observe dans les eaux saumâtres,
ainsi que dans les lacs salins des régions tropicales et semi-tropicales [6].
Le caractère thermophile et les besoins importants en lumière limitent l'aire de répartition
de cette micro algue une bande intertropicale située environ entre 35° de latitude Nord et 35°
de latitude Sud [7]. Sa forte plasticité écologique permet de la retrouver à l’état naturel à la
fois dans les lacs alcalins en Afrique (Tchad, Ethiopie, Tunisie), en Amérique latine
(Mexique, Pérou), et en Asie du Sud (Inde, Sri Lanka, Thaïlande) [8].
I.3 Composition chimique de la spiruline platensis
La spiruline est utilisée, en alimentation humaine, compte tenu de ses teneurs en
protéines, vitamines, minéraux et acides gras non saturés. C'est l'ensemble de tous ses
nombreux facteurs nutritifs qui en fait un aliment si précieux. La composition chimique des
spirulines est variable selon les conditions de culture. Les caractéristiques les plus
intéressantes restent toujours présentes [9].
I.3.1 Protéines
Selon les souches et les conditions de culture, la quantité en protéines d'Arthrospira
platensis varie de 55 à 70 % du poids sec. La spiruline contient la plupart des acides amines et
notamment tous les acides aminés essentiels constituant prés de 60% du poids total des
protéines [3]. La spiruline est caractérisée par un très fort taux de protéines pouvant atteindre
jusqu’à 70 % du poids sec de l’algue.
Chapitre I Généralités sur les l’Arthrospira platensis
5
C’est l’aliment le plus riche en protéines connu à ce jour puisqu’elle en contient deux
fois plus que le soja et trois plus que la viande ou le poisson [9].
I.3.2 Vitamines
La spiruline est très riche en vitamines du groupe B, notamment en vitamine B12
puisqu’elle en contient 4 fois plus que le foie de veau. D’autre part, elle se distingue par sa
richesse en β-carotène (jusqu’à 80 % des caroténoïdes totaux). La vitamine E est retrouvée à
des taux comparables aux germes de blé [10].
Il existe treize vitamines, 4 liposolubles (A, D, E, K) et 9 hydrosolubles (B1, B2, B5, B6,
B12, C, PP). La spiruline contient de nombreuses d'entres elles et spécialement des vitamines
B dans des proportions optimales [11]. Les vitamines constituent le principal facteur implique
dans les propriétés biologiques des spirulines. Les vitamines identifiées en majorité chez
Spirulina platensis sont (pour 100g de biomasse) : la vitamine C (42,0-195,3 mg), la vitamine
B3 (0,6-5,3 mg), la vitamine B1 (0,8-15,4 mg), la vitamine B2 (0,2-0,9 mg), la vitamine B6
(0,3-4,0 mg), la vitamine B9 (0,2-0,6 mg) et la vitamine B12 (0,3-0,8 mg) [12]. Les trois
vitamines liposolubles trouvées chez la spiruline sont le β-carotène, précurseur de la vitamine
A, la vitamine E et la vitamine [7].
I.3.3 Acides nucléiques
Les acides nucléiques totaux représentent 4,2 à 6 % du poids sec de l’algue, et ce
faible taux exclut tout risque d’excès d’acide urique chez les consommateurs réguliers de
spiruline à la dose journalière recommandée à titre de complément alimentaire [13].
I.3.4 Lipides
En règle générale, après hydrolyse, la spiruline renferme principalement des acides gras
poly insaturés essentiels à 18 atomes de carbones, notamment de la série oméga-6 (ω6). C’est
en effet une des meilleures sources d’acide gamma-linolénique (18:3ω6) après le lait humain
et certaines huiles végétales onéreuses [2]. D’autres acides gras essentiels comme l’acide
linoléique (18:2ω6) sont retrouvés dans la spiruline ainsi qu’un fort pourcentage d’acide
palmitique (acide gras saturé) permettant de préférer certaines souches à d’autres [11].
Chapitre I Généralités sur les l’Arthrospira platensis
6
Cette richesse lui donne un intérêt biologique particulier puisque que cet acide gras est un
précurseur des prostaglandines, molécules ayant une activité anti-inflammatoire et
immunostimulante au sein de l’organisme [6].
I.3.5 Glucides
Les glucides représentent 15 à 25 % du poids sec de l’algue. Les sucres simples et les
polyols ne sont présents qu’en très faible quantité. Les glucides assimilables sont représentés
par du rhamnosanne et du glucosanne aminés, respectivement environ 2 % et 10 %. On note
aussi la présence de glycogène (0,5 %) [4].
I.3.6 Composition en sels minéraux et oligo-éléments
La richesse de la spiruline en fer, dont la biodisponibilité est deux à trois fois supérieure à
celle de la viande, se révèle très intéressante pour améliorer les anémies ferriprives liées aux
malnutritions protéino-énergétiques [5].Calcium et phosphore sont présents à des taux
comparables à ceux retrouvés dans le lait et dans des proportions qui excluent tout risque de
décalcification par apport excessif de phosphore. La spiruline est aussi une bonne source de
magnésium biodisponibles chez l’Homme [3].Le potassium est richement représenté dans la
spiruline, atout intéressant dans les pays industrialisés où le rapport sodium/potassium est
souvent trop élevé [10].
I.3.7 Phycocyanine
Les cyanobactéries possèdent une large variété de composants colores incluant les
Caroténoïdes, les chlorophylles et les phycobiliprotéines.ces derniers, dont fait partie la
phycocyanine, sont des chromoprotéines constitues d'une partie protéique et d'un pigment.
Leur agrégation en complexe macromoléculaire forme le phycobilisome. Les phycobilisomes
sont attachés en matrices régulières à la surface externe de la membrane du thylacoide, siège
de la photosynthèse [14].
I.4 Intérêt de la spiruline dans différents domaines
I.4.1 Santé
Dans les pays développés, et depuis peu dans quelques régions d’Afrique, la Spiruline
est consommée comme complément alimentaire « bénéfique à la santé ». Longtemps
recommandée comme complément en cas de carences en acides gras essentiels, elle répond
actuellement en Europe à la législation sur les compléments alimentaires et sa
Chapitre I Généralités sur les l’Arthrospira platensis
7
commercialisation pour la santé est indépendante de l’obtention de preuves d’efficacité, non
réclamées pour les compléments alimentaires [15].
I.4.2 Cosmétique
Elle est utilisée dans les masques cryogéniques et crèmes anti-âge, par son action sur
le renouvellement cellulaire et la tonicité des tissus. Elle est aussi utilisée en synergie avec
d’autres algues, comme agent cicatrisant et antiseptique [13].
I.4.3 Agroalimentaire
En alimentation humaine elle est utilisée comme colorant naturel dans les chewing
gums, produits laitiers, boissons non alcoolisées comme la menthe. La phycocyanine est un
des rares pigments naturels de couleur bleue. Elle apparaît également dans une gamme de
produits algaux mélangée à du sel, des tagliatelles. En Suisse et au Japon, il existe depuis
longtemps du pain à la spiruline [15].
Chapitre II
Les métabolites sécondaires
Chapitre II Les métabolites secondaires
8
Chapitre II: les métabolites sécondaires
II.1 Métabolites sécondaires
Les métabolites secondaires sont des produits à structure chimique souvent complexe,
on recense plusieurs milliers de métabolites (au moins 30000 structures caractérisées) et sont
classées selon leur appartenance chimique [16].
Parmi ces substances on trouve les composés phénoliques, les flavonoïdes, les tanins,
les saponosides, les huiles essentielles et les alcaloïdes qui ont des intérêts multiples mis à
profit dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique [17].
Les cyanobactéries produisent une grande variété de métabolites qui peuvent être des
peptides de faibles poids moléculaires, des alcaloïdes, des terpénoides, des polysaccharides et
des lipopolysaccharides.La, des polyphénols. La plupart de ces métabolites sont accumulés
dans la biomasse cyanobactérienne [1].
II .1.1 Composés phénoliques
Ce sont des dérivés non azotés dont le ou les cycles aromatiques sont issus de deux
grandes voies métaboliques : la voie du shikimates et celle de l’acétate [18]. Les composants
phénoliques sont des molécules biologiquement actives, ils sont largement utilisés en vertus
thérapeutique comme vasoconstricteurs, anti-inflammatoires, inhibiteurs enzymatiques,
antioxydants et anti radicalaires, antimicrobiens [17].
II.1 .2 Principales classes des composés phénoliques
Les composés phénoliques sont classés selon le nombre d’atome de carbone dans le
squelette de base, ces structures peuvent être sous forme libres ou liées à l’ester ou hétérosides
Ils existent également sous forme de polymères naturels (tanins) [18]. Les différentes classes
de ces composés phénoliques sont classées dans le tableau 01
Chapitre II Les métabolites secondaires
9
Tableau 01: classification des composés phénoliques [19]
Nombre de
carbones
Squelette Classification Structure de base
7 C6-C1 Acides phénols
8 C6-C2 acétophénones
8 C6-C2 Acide phénylacétique
9 C6-C3 Acides hydroxycinamiques
9 C6-C3 Coumarines
10 C6-C4 Naphthoquinones
13 C6-C1-C6 Xanthones
14
C6-C2-C6
Stilbènes
15 C6-C3-C6 Flavonoïdes
II.1. 2.1 Flavonoïdes
Les flavonoïdes possèdent un squelette de base à 15 atomes de carbone constitués de
deux cycles phényles, les cycles A et B, reliés par une chaine à trois carbones (structure en
C6-C3-C6). La chaine en C3 entre les cycles A et B est communément cyclisé pour former le
cycle C [20]. Les flavonoïdes sont capables d'exercer en plus des propriétés antioxydantes,
des propriétés anti-inflammatoires, antiallergiques et antiulcérogènes. Certains flavonoïdes
ont également démontré un potentiel d'agent vasodilatateur .Ils ont été surnommés les «
modificateurs naturels des réponses biologiques» [17].
II.1.2.2 Tanins
Les tanins sont une famille complexe de principes actifs. Ils ont la capacité de former
des complexes avec des macromolécules (les protéines, glucide …) et des liaisons entre les
fibres de collagènes, d'où leur viennent la plupart de leurs propriétés. Leur structure chimique
est particulièrement variable, mais comporte toujours une partie polyphénolique ; il existe
Chapitre II Les métabolites secondaires
10
deux catégories de tanins, d'origine biosynthétiques différente les tanins hydrolysables et les
tanins condensés [21].
Les tanins ont un très grand pouvoir antibactérien, antiviral, anti-inflammatoire et une
activité antimutagène. Les tanins sont utilisées dans les cas de rhume, de maux de gorge, les
problèmes de sécrétions trop importantes, les infections internes ou externes, blessures,
coupures et brûlures [17].
II.1.3 Composés terpéniques
Les terpènes et les stéroïdes ont un point commun essentiel, peuvent être considérés
comme formes semblables d’un nombre entier d’unités penta carbonées ramifiées dérivées de
2-méthylbutadiene.Selon le nombre d’unités isopréniques qui les constituent, on distingue :
les terpènes proprement dit mono terpènes en C10, les sesquiterpènes en C15, les di terpènes
en C20, les tritepènes (C30) (exemple : les stéroïdes), les tétra terpènes (C40) (exemple : les
caroténoïdes) et les poly terpènes (~4 000) [16].
II.1.4 Alcaloïdes
Les alcaloïdes sont des molécules d'origine naturelle. On les trouve principalement
chez les végétaux, mais aussi chez les animaux et chez certains micro-organismes. Leur
structure chimique de base est un hétérocycle azoté sauf pour quelques substances dans
lesquelles l'azote est extra cyclique [17].
Les alcaloïdes forment un groupe hétérogène du point de vue de leur structure, de
leurs propriétés et de leurs effets biologiques. Ils agissent directement sur le système nerveux
avec des effets sur la conscience et la motricité. L’action sur le système nerveux peut aller
jusqu’à une action antispasmodique, et mydriatique, anesthésique locale ou analgésique et
narcotique [18].
Chapitre III
Les activités biologiques
Chapitre III Les activités biologiques
11
Chapitre III: les activités biologiques
III. 1 antioxydant
Les antioxydants apparaissent aujourd’hui comme les clés de la longévité et nos alliés
pour lutter contre les maladies modernes. Ce sont des éléments protecteurs qui agissent
comme capteurs de radicaux libres (tableau 02).
Ces derniers sont produit quotidiennement par l’organisme ; ce sont des composés très
réactifs comportant un électron célibataire et nécessaire à des mécanismes vitaux [22] ils
deviennent cependant nocifs quand ils sont en excès et induisent certains dommages au
niveau de la structure des protéines, des lipides [23], des acides nucléiques en entrainant un
stress oxydant qui contribue aux processus de vieillissement cellulaire accéléré et au
développement de pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers,
l’artériosclérose[22].
Des systèmes de défense permettent de prévenir la formation radicalaire ou de limiter
les lésions d'oxydation résultantes. Ces systèmes peuvent être endogènes ou exogènes,
d'origine nutritionnelle [24].
Tableau 02: Liste des principaux radicaux libres.
Radical Formule
Anion superoxyde ●-O2
Peroxyde d’hydrogène H2O2
Hydroxyle OH
Peroxyle ROO●
Hydroperoxydes ROOH
Alcoxyles RO●
Oxygène singulet 1/2O2
Oxyde nitrique NO●
III.1. 2 Les antioxydants endogènes
Ce sont des enzymes ou protéines antioxydantes (Superoxyde dismutase, Catalase et
Glutathion peroxydase) élaborés par notre organisme avec l’aide de certains minéraux. Elles
sont présentes en permanence dans l’organisme mais leur quantité diminue avec l’âge [25].
Chapitre III Les activités biologiques
12
III.1. 3 Les antioxydants exogènes
Les antioxydants exogènes sont présents dans l’alimentation tels que les vitamines A, C, E
et les polyphénols en particulier les flavonoïdes, ainsi que les cofacteurs des enzymes
impliquées dans les systèmes anti-oxydants endogènes comme le sélénium, le zinc et le
manganèse. De nombreuses molécules issues de notre alimentation : vitamines, nutriments,
composés naturels,…etc. sont considérés comme des antioxydants [20].Notons à titre
d’exemples, les plus:
La vitamine E : Le principal anti-oxydant nutritionnel est la vitamine E
(essentiellement l’ K-tocophérol), liposoluble, puissant anti-oxydant mais qui peut
avoir des effets délétères à très forte dose [26]
L’ascorbate ou vitamine C : est l’antioxydant hydrosoluble majeur, réagit
rapidement avec l’anion superoxyde et l’oxygène singulet, ou encore avec le peroxyde
d’hydrogène. Elle est indispensable par sa capacité à réduire d’autres antioxydants
oxydés comme la vitamine E ou les caroténoïdes [23].
Les caroténoïdes : sont des pigments végétaux lipophiles formant une famille de plus
de 600 molécules notamment le lycopène et le 2-carotène, précurseurs de la vitamine
A. Ils sont présents dans les carottes, les fruits rouge et jaunes, les légumes verts et les
tomates [24].
Les flavonoïdes: Ce sont des substances naturelles présentes dans tout le règne
végétal. Les flavonoïdes peuvent agir de différentes façons dans les processus de
régulation du stress oxydant : par capture directe des espèces réactives de l’oxygène,
par chélation de métaux de transition comme le fer le cuivre ou par inhibition de
l’activité de certaines enzymes responsables de la production des espèces réactives de
l’oxygène comme la xanthine oxydase [17].
Les tanins: Les tanins sont des donneurs de protons aux radicaux libres lipidiques
produits au cours de la peroxydation. Des radicaux tanniques plus stables sont alors
formés, ce qui a pour conséquence de stopper la réaction en chaîne de l’auto oxydation
des lipides [21].
Les coumarines: Ils sont capables de piéger les radicaux hydroxyles, superoxydes et
peroxyles, importants dans la prévention de la peroxydation des lipides membranaires
et ils ont une activité antiperoxydante [17].
Chapitre III Les activités biologiques
13
Le sélénium: IL neutralise les métaux toxiques en particulier le plomb et le mercure.
IL aurait aussi une action préventive sur certains cancers [24].
III.2 Agents antimicrobienne
L’action antibactérienne ou antifongique va dépendre du microorganisme lui-même,
de l’agent antimicrobien et de l’environnement où se situe l’action. On parle d’un effet
bactériostatique lorsque la substance antibactérienne empêche la multiplication des bactéries
et d’un effet bactéricide lorsqu’elle détruit totalement la bactérie [25].
Les antibiotiques sont des substances d’origines naturelles, hémi-synthétiques ou
synthétiques capables d’inhiber la croissance ou d’entraîner la mort des bactéries. Ils ont une
activité sélective et spécifique liée à un mécanisme d’action précis. Ce sont les principales
armes médicamenteuses les plus efficaces utilisées contre les infections bactériennes.
Cependant, la prescription à grande échelle et parfois inappropriée de ces agents a entraîné la
création des souches multi-résistantes [26].
III.2.1 Bactéries
Une bactérie, ou bacteria, est un organisme vivant caractérisé par une absence de
noyau et d'organite. Les bactéries les plus grosses mesurent plus de 2 μm et les plus petites
mesurent 0,2 μm. Les bactéries présentent de nombreuses formes : sphériques (coques),
allongées ou en bâtonnets (bacilles), des formes plus ou moins spiralées. Les bactéries sont
ubiquitaires et sont présentes dans tous les types de biotopes rencontrés sur terre. Les
bactéries représentent une grande partie de la biomasse du monde [27].
III.2.2 Infections bactériennes
Une infection bactérienne désigne la pénétration et/ou la multiplication d’un agent
pathogène (bactérie) dans un organisme hôte. Elle entraîne une diminution des défenses du
sujet et un accroissement de la virulence des germes [28].
III.3 Généralités sur les champignons
Les champignons, ou mycètes, sont des végétaux eucaryotes dits thallophytes. Les
cellules sont groupées en un ensemble plus ou moins structuré appelé thalle porteur d’organes
reproducteurs qui permettent de distinguer les champignons filamenteux des levures. Ils sont
non chlorophylliens et peuvent se multiplier par reproduction sexuée ou asexuée. On peut les
cultiver à l’abri de la lumière mais il faudra leur fournir une source de carbone [29].
Chapitre IV
Matériel et méthodes
Chapitre IV Matériels et méthodes
14
Chapitre IV : Matériels et méthodes
IV.1 Matériel biologique
Le matériel biologique utilisé dans ce travail est l'algue bleu-vert : Arthrospira
platensis, la Spiruline fournie par les bassins de culture de Mr HIRI producteur de la spiruline
au Tamanrasset. La spiruline a été cultivée dans un milieu de culture enrichi par les éléments
minéraux nécessaire à la croissance, elle est récoltée, triée et séchée à l’air libre, à l’ombre et
à température ambiante en 1 Mai 2014.
IV.2 méthode d’extraction pour Screening chimique
La phytochimie qualitative basé sur des réactions colorées ou de précipitation par des
réactifs chimiques spécifiques réalisées sur les extraits reconstitués à partir de la poudre
lyophilisée de chaque échantillon pour une première estimation des données préliminaires sur
les constituants des extraits. Les groupes phytochimiques sont nombreux, mais on peut citer
les principaux : les alcaloïdes, les polyphénols (flavonoïdes, anthocyanes, tanins), les
saponosides, les stéroïdes, les coumarines, les terpènes [20].
La méthodologie adoptée pour l'extraction des principaux métabolites de la spiruline
est représentée dans la figure 01 et 02
Chapitre IV Matériels et méthodes
15
Figure 01: Extraction méthanolique à partir de poudre de spiruline.
Figure 02: Extraction aqueuse à partir de poudre de spiruline.
Macération pendant 24 h
Poudre de spiruline
Filtration
Extraction avec MeOH/eau
(9 :1 )
Filtrat
Extrait brut
méthanoïques
Résidu de la
spiruline
Poudre de spiruline
Macération pendant 24 h
Filtration
Extrait brut
aqueux Résidu de la
spiruline
1g de poudre avec 20
ml de l'eau distillée
Chapitre IV Matériels et méthodes
16
IV.2.1.1 Détection des polyphénols
a.1Test des tanins
Les tanins sont mis en évidence à partir de 1 ml de l'extrait placé dans un tube en
présence de quelques gouttes de FeCl3.
Après agitation de l'extrait, la couleur vire au bleu noir en présence de tanins galliques et
au brun verdâtre en présence de tanins catéchiques [30].
a.2 Test des coumarines
Les coumarines sont révélées à partir de 2 ml d'extrait placé dans un tube est ajouté à 3
ml de NaOH (10%), après agitation de l'extrait, la formation d'une couleur jaune indique la
présence de coumarines [31].
a.3 Test des anthocyanes
Les anthocyanes sont détectés en plaçant 5m d'extrait dans un tube auquel en ajoute 15
ml d'H2HSO4 à (10%) (Milieu acide), après agitation, le mélange est ajouté à 5ml NH4OH à
(10%) (Milieu basique). La présence d'anthocyanes est affirmée par une coloration bleu-
violacée en milieu basique [32].
a.4 Test des flavonoïdes
Un mélange de quelques gouttes de mg2+
et de gouttes d'HCL concentré, placé dans un
tube, est ajouté à 2ml d'extrait .l'apparition de la coloration rose, orange ou rouge indique la
présence des flavonoïdes [30].
a.4.1 Test de H2SO4: 1ml de l'extrait est ajouté quelque gouttes de H2SO4 concentré
.l'apparition de la coloration orange indique la présence [31].
a.5 Test des anthraquinones
Pour la détection des anthraquinones, 10ml d'extrait sont ajoutés à 5ml de NH4OH à
(10%). Après agitation quelque minute, l'apparition d'un anneau rouge indique la présence
d'anthraquinones [33].
Chapitre IV Matériels et méthodes
17
a.6 Test des saponosides
Pour la détection des saponosides ,10ml d'extrait placé dans un tube à essais sont
agités pendant 15 secondes puis déposées durant 15 min. Une hauteur de mousse
persistante, supérieure à 1 cm indique la présence de saponosides [34].
b. Tests des terpènes
b.1Test des stérols et tri terpènes
Les stéroïdes sont relevés après addition de 5ml d'anhydride acétique à 5ml d'extrait à
chaud. Le mélange est ajouté à 0.5 ml d'acide sulfurique concentré .Après l'agitation
l'apparition, à l'interphase, d'un anneau pourpre ou violet, virant au bleu puis vert, indique une
réaction positive [34].
c. Test des alcaloïdes
Les alcaloïdes ont été caractérisés à partir des réactifs de Mayer ou Wagner .10ml
d'extrait sont évaporés jusqu'à l'obtention d'un volume de 0.2ml, sur lequel 1.5ml de HCL à
(2%) sont ajoutés .Après agitation de la solution acide ,1 a 2 gouttes de réactifs Mayer ou
Wagner sont ajouté .L'apparition d'un précipité blanc jaunâtre ou brun indique la présence
d'alcaloïdes [31].
IV.2.1.2 Métabolites primaires
d. Test de protéine
2 ml de l'extrait aqueux est ajouté 5 a 6 gouttes NaOH a 5%, après agitation on ajouté 5 a 7
gouttes de CuSo4.l'apparition de couleur violet indique la présence de protéine [33].
E. Test de sucre réducteur
2 ml de l'extrait aqueux ,2ml de solution Fehling (A+B) placé dans un tube porté à
ébullition .l'apparition de précipité rouge indique la présence [34].
IV.2.3 Méthode d'extraction pour les activités biologiques
Après séchage dans un endroit sec et aéré, à l’abri de la lumière du soleil, l’algue est
broyée entièrement. On a effectué 3 macérations :
Chapitre IV Matériels et méthodes
18
Première macération : 10 g de la matière végétale est macérée dans l’eau, cette
opération est répétée trois fois avec renouvellement du l’eau chaque 24 heure. Deuxième
macération : 10 g de la matière végétale est macérée dans un mélange hydro alcoolique
(Méthanol / eau ; 70/ 30 ; V / V), cette opération est répétée trois fois avec renouvellement du
l’eau chaque 24 heure.Troisième macération : 30g de la matière végétale obtenue est mise à
macération dans un mélange hydro alcoolique (Méthanol / eau ; 70/ 30 ; V / V). Cette
macération est répétée 3 fois avec renouvellement du solvant chaque 24 heure. Après
filtration et concentration sous vide, l’extrait méthanolique (sec)est dilué (récupéré) avec de
l’eau distillée à raison de 50 ml pour 30g de matière sèche, on laisse la solution en repos une
nuit puis on filtre. Après filtration, la solution a subi des extractions successives de type
liquide-liquide en utilisant des solvants de polarité croissante en commençant par le
chloroforme puis l’acétate d’éthyle et enfin avec le n-butanol.Chaque extraction est répétée
trois fois sauf avec l’acétate d’éthyle.
Les trois phases organiques ainsi obtenues (faiblement polaire : chloroforme,
moyennement polaire : acétate d’éthyle et polaire : n-butanol) sont concentrées à sec sous
pression réduite, pesées, puis les extraits acétate d’éthyle et n-butanol sont repris avec du
méthanol par contre l’extrait chloroformique est repris avec du chloroforme enfin tous sont
laissés à l’air libre pour évaporation [35].
Chapitre IV Matériels et méthodes
19
Figure 03:Protocole d'extraction des différentes phases.
Matière végétale
M= 30 g
Extrait
hydroalcoolique
Phase aqueuse
Phase aqueuse Phase organique
Phase aqueuse
Extrait
chloroformique
Extraitacétate
d'éthyle
Phase organique
Phase aqueuse
Phase organique
Extrait butanolique
Macération dans un mélange
MeOH/H2O (7 :3), Répétée 3× 24h.
-Concentration à sec
-Dilution avec 50 ml d’eau distillée,
repos une nuit
-Extraction par le chloroforme 3×
- Décantation
-Concentration de l'extrait de
chloroforme
-Extraction par acétate d’éthyle x1
-Décantation
Concentration-
-Extraction Par le n-butanol(x3)
-Décantation
-Concentration
Chapitre IV Matériels et méthodes
20
IV.4 Analyse quantitative des composés phénoliques
L'analyse quantitative des composés phénoliques permet d’avoir une estimation sur la
teneur en phénols totaux de l’échantillon .Le dosage des phénols totaux a été effectué par une
méthode adaptée de Singleton et Rossi en utilisant le réactif de Folin-Siocalteu[36], tandis que
les flavonoïdes ont été quantifiés par le dosage direct par le trichlorure d’aluminium d’après
une méthode adaptée de Lamaiosn et Carnat, ainsi que les tannins ont été estimés par une
méthode colorimétrique en utilisent le vanilline[37].
IV.4.1 Dosage des phénols totaux
Le dosage des polyphénols totaux en utilisant le réactif de Folin. Le réactif est formé
d’acide phosphomolybdique H3PMo12O4 et d’acide phosphotungstique H3PW12O40qui est
réduits par l’oxydation des phénols en oxydes bleus de tungstène W8O23 et de molybdène
Mo8O3.Les phénols sont estimés par une spectroscopie UV dont l’acide gallique est utilisé
comme un standard à une longueur d’onde λ =760 nm [20].
Figure 04 : structure de l'acide gallique
IV.4.1.1 Courbe d’étalonnage
Un standard de calibration a été préparé en utilisant des solutions d’acide gallique des
différentes concentrations de 0.03 jusqu'à 0.3 g/l'on prend 100μl de la solution diluée, elle est
ensuite oxydée par le réactif de Folin-Ciocalteu (dilué 10 fois) laissé 5 minutes et puis
neutralisée avec 2 ml de carbonate de sodium 20%puis les solutions ont été secouées
immédiatement et sont maintenues dans l’obscurité pendant 30 minutes à température
Chapitre IV Matériels et méthodes
21
ambiante [38]. L’absorbance de chaque solution a été déterminée à 760 nm. L’analyse
quantitative des phénols totaux des extraits phénoliques a été réalisée par la même procédure.
Les concentrations des polyphénols a été déterminé par la formule suivante :
C : concentration de polyphénols en mg/g.
A : l’absorbance à λ = 760 nm.
K : tangente de l’acide gallique. (nm*ml/mg)
D : nombre de dilution.
V : volume de récupération de l’extrait. (ml).
P : le poids initial de la plante.
IV.4.2 Dosage de flavonoïdes
Le chlorure d’aluminium (AlCl3) forme un complexe très stable avec les groupements
Hydroxydes OH des phénols. Ce complexe jaune absorbe la lumière visible à une longueur
d’onde 415 nm. Les phénols sont estimés par une spectroscopie UV, dont la Quercétine est
utilisé comme un standard à une longueur d’onde λ =415 nm [39].
Figure 05 : structure de quercétine
𝑪 =𝑨 × 𝑫 × 𝑽
𝑲 × 𝑷
Chapitre IV Matériels et méthodes
22
IV.4.2.1 Courbe d’étalonnage
Un standard de calibration a été préparé en utilisant des solutions de Quercétine de
différentes concentrations de 0.03 jusqu'à 0.3 g/l.1ml de la solution diluée est mis à réagir
avec1 ml de chlorure d'aluminium 10%, puis laissé 10 minutes dans l’obscurité .L’absorbance
de chaque solution a été déterminée à 415 nm. En utilisant les valeurs des absorbances
obtenues pour les différentes solutions de Quercétine [35].
L’analyse quantitative des flavonoïdes totaux des extraits a été réalisée en adaptant la
même procédure utilisée pour l’établissement de la courbe d’étalonnage, en remplaçant
l’acide gallique par des délutions des extraits jusqu'à une appropriée concentration. La teneur
en flavonoïdes totaux de chaque extrait a été calculée et exprimé en équivalent Quercétine en
milligramme par 1g de la matière végétale (mg/g) [36]. Par la formule suivante :
𝑪 =𝑨 × 𝑫 × 𝑽
𝑲 × 𝑷
C : concentration de flavonoïdes en mg/g d’ES
A : l’absorbance à λ = 415 nm.
K : tangente de Quercétine. (nm*ml/mg).
D : nombre de dilution.
V : volume de récupération de l’extrait. (ml)
P : le poids initial de la plante.
IV.4.3 Dosage des tannins condensés
Les quantités des tannins condensés sont estimées en utilisant la méthode à vanilline
en milieu acide (Julkunen-Titto, 1985). Un volume de 400μl de l’extrait brut est ajouté à 3
ml de la solution vanilline/éthanol (4 %, m/v) puis mélangé à l’aide d’un vortex. Ensuite, 1.5
ml de l’acide chlorhydrique concentré (HCl) est additionné et laissé réagir à la température
ambiante pendant 15 min. L'absorbance à 500 nm est mesurée contre un blanc. La
concentration des tannins est estimée en milligramme (mg) équivalents de vanilline par
gramme (g) du poids de l’extrait sec (EV)/g) à partir de la courbe d’étalonnage [37].
Chapitre IV Matériels et méthodes
23
La teneur en tanins totaux de chaque extrait a été calculée et exprimé en équivalent
vanilline en milligramme par 1g de la matière biologique (mg/g). Par la formule suivante:
C : concentration de tanins en mg/g d’ES .
A : l’absorbance à λ = 500 nm.
K : tangente de Quercitine. (nm*ml/mg).
D : nombre de dilution.
V : volume de récupération de l’extrait. (ml)
P : le poids d’initial de la plante.
IV.5Evaluation du pouvoir antioxydant
Des nombreuses méthodes sont utilisées pour l’évaluation de l'activité antioxydant des
composés phénoliques des extraits. La plupart de ces méthodes sont basées sur la coloration
ou la décoloration d’un réactif dans le milieu réactionnel. Dans notre étude nous avons utilisé
deux tests chimiques à savoir : le test ferric Reducing / Antioxydant Power Assay qui mesure
le pouvoir de réduction des ions de fer et le test du DPPH qui mesure le pouvoir d’inhibition
des radicaux libres [35].
IV.5.1 Le pouvoir réducteur des composés phénoliques (Reducing Power Assay)
Ce test est considéré comme un test direct et rapide dont est utilisé pour mesurer le
pouvoir des antioxydants non enzymatiques, et utilisée pour déterminer l’activité
antioxydante des extraits étudiés dans un milieu neutre. Il est basé sur la réduction des ions
[Fe (CN) 6]3-
à des ions de [Fe (CN) 6]4-
qui donnent dans la présence des ions Fe3+ une
coloration bleu clair, dont l'absorbance à une longueur d’onde λ= 700 nm. L’activité
antioxydante est mesuré avec un nouveau terme appelé AEAC : qui présente l’activité
antioxydante en équivalant de l’acide ascorbique des extraits étudiés (Ascorbic Acid
Equivalent Antioxydant Capacity).L’évolution de l’activité antioxydante de nos extraits est
comparée par rapport à l’acide ascorbique (vitamine C) et cela en traçant une courbe
d’étalonnage de ce dernier [38].
𝑪 =𝑨 × 𝑫 × 𝑽
𝑲 × 𝑷
Chapitre IV Matériels et méthodes
24
IV.5.1.1 Courbe d'étalonnage
Les solutions d’acide ascorbique (vitamine C) sont préparé de concentration allant de
0.01 jusqu'à 0.1 g/l. 1 ml de chaque solution introduite dans des tubes à essai, puis on l’ajoute
2.5 ml d’une solution K3Fe(CN) 6 (1%), 2.5 ml de solution tampon phosphaté. Les solutions
ont secouées immédiatement, puis ils sont maintenus dans un bain marie pendant 30 minutes
à une température de 50 °C. Ensuite, en suite on a ajoute 2.5 ml de l’acide trichloracétique
(TCA 10%). On prend de chaque tube 2.5 ml et on introduit dans un autre tube à essai et on
ajoute 2.5 ml de l’eau distillé, 0.5 ml de solution deFeCl3 (0.1 %).L’absorbance de chaque
solution a été déterminée à 700 nm contre un blanc. Les lectures de la densité optique à700
nm, des solutions ainsi préparées ont permis de tracer la courbe d'étalonnage de l’acide
ascorbique (Vitamine C) [39].
IV.5.2 Piégeage du radical libre DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil)
Le DPPH c'est une méthode est basée sur la mesure de la capacité des antioxydants à
piéger le radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH). Ce dernier est réduit à la forme
d’hydrazine (non radical) en acceptant un atome d’hydrogène. L’effet de chaque extrait sur le
DPPH est mesuré par la procédure décrite par Sanchez-Moreno et al (1998).Un volume de 1
ml de différentes concentrations de chaque extrait exprimées en g/l est ajouté à 1 ml de la
solution méthanolique du DPPH (0.025 mg/ml) fraîchement préparée. L’absorbance à 517 nm
est mesurée [40].
Figure 06: Réaction d’un antioxydant avec le radical DPPH [41].
Chapitre IV Matériels et méthodes
25
Calcule des pourcentages d’inhibitions
Nous calculons ainsi les pourcentages d’inhibition par la formule suivante :
I (%) : pouvoir d’inhibition en %.
A0: absorbance de la solution de DPPH en absence de l’extrait
A1: absorbance de la solution de DPPH en présence de l’extrait.
Calcule des IC50
IC50 est la concentration de l’échantillon testé nécessaire pour réduire 50 % de radical
DPPH, Les IC50 sont calculées graphiquement par les régressions linéaires des graphes tracés
; pourcentages d’inhibition en fonction de différentes concentrations des fractions testées et
les standards [20].
IV.6Analyses chromatographiques
IV.6.1Analyse par chromatographie sur couche mince
L’étude préliminaire de ces extraits est, classiquement, dominée par une analyse en
CCM et la chromatographie sur papier. L’étude des chromatogrammes peut se faire : soit
Directement: chalcones et aurones sont habituellement directement visibles sur les
chromatogrammes. En présence de vapeurs d’ammoniac les taches passent à l’orange et au
rouge .Soit Par un examen en lumière ultraviolette avant et après pulvérisation de trichlorures
d’aluminium, avant et après exposition aux vapeurs d’ammoniac: la nature et les changements
des fluorescences observées donnent des renseignements utiles sur le type de flavonoïde
présent [35].
IV.6.1.1 Chromatographie sur couche mince de L’extrait aqueux brute et MeOH brute
Pour obtenir un meilleur système chromatographique des deux extraits, on a choisi
comme phase stationnaire le gel de silice. Pour la phase mobile on a effectué plusieurs tests
pour choisir le meilleur éluant :
𝑰 % = 𝟏 −𝑨𝟏
𝑨𝟎 × 𝟏𝟎𝟎
Chapitre IV Matériels et méthodes
26
Chloroforme / méthanol/acide acétique (1:2:1), (1 :1:1 ).
Méthanol / chloroforme / acétate d’éthyle (0.5:1:1.5)
Chloroforme / acetone/methanol (1:1.5:0.5), (4:1).
Chloroforme / methanol (1:2)
IV.6.1.2 chromatographie sur couche mince (CCM) de l'extrait chloroformique
Pour obtenir un meilleur système chromatographique puisque l’extrait est apolaire, la
phase stationnaire donc ne sera que le gel de silice .Pour la phase mobile, on a testé beaucoup
de systèmes pour choisir le meilleur éluant :
Chloroforme /MeOH (10:1) (20:1).
Dichlorométhane/MeOH (10:1).
Chloroforme/MeOH (5:1) (30:1).
Chloroforme /acétone (10:1).
Chloroforme/acide acétique (20:1).
IV.6. 2 Analyse par chromatographie sur papier (CP) monodimensionnelle
La technique de chromatographie sur papier occupe jusqu'à maintenant une position
dominante dans le domaine de l’analyse et la séparation des flavonoïdes. La CP est
convenable pour la séparation des mélanges complexes de tous les types flavonoïdes. Elle est
aussi utilisée pour isoler les petites ainsi que les grandes quantités de flavonoïdes et nécessite
des équipements et des matériels de faible coût.
Une partie de chaque extrait doit être déposée sur un morceau de papier
chromatographique Whatman et séparée mono ou bi dimensionnellement avec du B.A.W et
de l’acide acétique. Cette procédure est inestimable en tant que moyen de déterminer la
complicité du mélange glycoside. Plus tard, pour être séparer a une large échelle sur un épais
papier chromatographique Whatman N° 3 une dimension. Chromatographie de partage sur un
épais papier filtre (Whatman N° 3) est l’un des moyens convenables de séparer et isoler les
flavonoïdes glycosides [42].
IV.6.2.1 CP monodimensionnelle
On a travaillé sur chromatographie papier (C.P) descendante avec le papier WHATMAN
Chapitre IV Matériels et méthodes
27
N° 3 monodimensionnelle avec les solvants :
Phase organique : B.A.W : n-Butanol / acide acétique /water, phase supérieur (4:1:5)
Phase aqueuse : Acide acétique 20%.
La Préparation du papier sur les dimensions du papier Whatman sont 18×21 cm, mesure 1
cm et on plie le papier dans le haut de papier en dans la bas on met les quatre dépôts : extrait
acétate d’éthyle, extraits n-butanol ; extrait aqueux, extrait MeOH l’aide d’une pipette
capillaire [43].comme les représente la figure:
1.5 cm
Figure 07:Illustration de prise de dépôt sur C.P de la monodimensionnelle
IV.6.2.2C.P bidimensionnelle
Pour avoir une idée plus claire on est passé à l’analyse chromatographique
bidimensionnelle toujours avec le système CP D1 :B.A.W, D2 : acide acétique 15%.
Les flavonoïdes glycosides sont aisément distingués dans le chromatogramme 2D des
autres phénols par leurs couleurs de réaction : généralement marron sombre dans la lumière
Les extraits de spiruline
Chapitre IV Matériels et méthodes
28
UV, il se change au jaune brillant avec les vapeurs d’ammoniaque, et par leurs positions
respectives.
On a travaillé sur du papier Whatman N°3 de dimension 18×21 cm. Le dépôt de
l'échantillon se fait comme pour la mono dimension mais on laisse 7 cm à partir du bord de la
deuxième dimension [35].comme le montre la figure
Figure: Illustration de prise de dépôt sur CP de la bidimensionnelle
Figure 08 : Illustration de prise de dépôt sur C.P de la bidimensionnelle.
IV.7Activité antimicrobienne
IV.7.1Souches testées
Les souches utilisées dans les tests font parties de microorganismes, qui sont des
pathogènes et des contaminants. Les microorganismes.
D1 : B
AW
D2: acide acétique 15%
Chapitre IV Matériels et méthodes
29
Tableau 03 : Les souches bactériennes .
Etat frais Souche Gram
Bacille
Bâtonnet
Escherichia coli ATCC 25922
Négatif
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Klebsilla pneumonieATTCC700603
Cocci Enterococcus faecalis ATCC 29212
Positif
IV.7.2Ensemencement
15 ml de la gélose nutritive est coulé dans des boîtes de Pétri. Après le
refroidissement et solidification du milieu de culture sur la paillasse, 300μl de suspension
bactérienne à tester sont étalés en surface de gélose pour chaque boîte puis on laisse sur la
paillasse pendant 30 minute .Dans des conditions aseptiques et à l’aide d’une pince stérile, les
disques imbibés par les extrait de la spiruline , extrait butanolique; extrait acétate d'éthyle,
extrait aqueux , extrait MeOH brut. Sont déposés sur le gélose (4disques/boite) et pour le
témoin on a mite des disque imbibés par l'eau distillé (1disques/boite). Les boîtes sont ensuite
fermées et incubée à température de 37°C pendant 24 heures [44].
Chapitre IV Matériels et méthodes
30
milieu GN stéril
E.coli P.aeruginosa Entr.feacalis KL.pneumonie
Après 24 heures d'incubation
10 ml d'eau physiologique dans chaque tube
+colonies de +colonies de +colonies de
15 ml de GN +300μl15 ml de GN +300μl 15 ml de GN +300μl 15 ml de GN +300μl
Sup.E.coli sup P.aerugénosa sup
sup
Préparation de pré cultures
Préparation des suspensions bactériennes
Etalement
Dépôt des disques imbibés par
les extraits de la spiruline
Incubation à 37°C pendant 24
heures
+colonies de
Chapitre IV Matériels et méthodes
31
Figure 09: Protocole expérimentale de l’essai d’activité antibactérienne des extraits de
spiruline.
IV.8Activité antifongique
Pour la réalisation de l’activité antifongique on a adopté la méthode de contact direct.
IV.8.1 Préparation des différentes concentrations
Pour préparer les différentes concentrations on prélave 5mlde chaque des extrait de la
spiruline et ajuster a 50 ml par PDA puis on agite pendant 5 minute pour homogènes le
milieu de PDA avec les extraites [45].
IV.8.2 Essai d’activité antifongique
15 ml de mélange (PDA +les extraits de la spiruline) a été coulé dans des boites de
Pétri, Après le refroidissement et la solidification de cette mélange sur la paillasse des disques
mycélien de diamètre de 5mm de diamètre issue de la marge d’une culture âgée de Fusarium
sporotrichioides ont été prélevée avec un emporte-pièce et inoculé au centre de chaque boite
(1disque/boite). Chaque concentration est répéter trois fois. Les boites sont incubées dans
d’obscurité à température de 20 ± 2oC ; Le témoin est réalisé dans les mêmes conditions sans
extraites des plantes et les mesures sont prélavées après 72 h d’incubation [45].
Chapitre IV Matériels et méthodes
32
ⱷ BuOH ⱷ AcOH ⱷ MeOH ⱷ Aqx sans extrait
ⱷ BuOH ⱷ AcOH ⱷ MeOH ⱷ Aqx Témoin
ⱷ BuOH ⱷ AcOH ⱷ MeOH ⱷ Aqx
Figure 10: Protocole expérimentale de l’essai d’activité antifongique des extraits de spiruline.
PDA
Agitation et la mise dans des boites pétris
Dépôt des disques mycéliens de Fusarium
sporotrichioides
Incubation a 20°C (72heure)
Témoin
Chapitre V
Résultat et dissucusion
Chapitre V Résultats et discussion
33
Chapitre V: Résultats et discussion
V.1 Résultats
V.1.1 criblage chimique
Une investigation phytochimiques préliminaire a été entreprise et a permis de mettre
en évidence divers métabolites secondaires. Le tableau 04 regroupe les résultats des tests
chimiques réalisés sur la spiruline.
Tableau 04: les résultats des screening chimique de spiruline.
Extraits
Métabolites secondaires Extrait aqueux Extrait méthanolique
++ ++ Tanins hydrolysable
Polyphénols
- - Anthraquinones
+ ++ Flavonoïdes
- - Anthocyanes
- - Coumarines
+++ +++ Saponosides
++ +++ Stéroïdes Terpènes
+++ +++ Alcaloïdes
Les métabolites primaires
- - Sucre réducteur
- +++ Protéines
- - Amidon
-
++
Les composes volatiles
- : Test négatif ++: Test positif
+: Test faiblement positif +++: Test fortement positif
Chapitre V Résultats et discussion
34
Les résultats de criblage chimique sont obtenus à partir de poudre épuisés par l’eau, et
le méthanol. La recherche, des anthraquinones, des composés réducteurs, des amidons, des
anthocyanosides, des anthracenosides sont montrée négative mais celle de flavonoïdes, des
tanins et des huiles volatiles et des alcaloïdes a été positive.
Il est à signaler que les saponosides, les stérols et stéroïdes et protéines sont présents
en forte quantité dans la spiruline. D’autre part, les coumarines sont des classes de familles
chimiques totalement absentes dans la spiruline.
La présence des principaux métabolites secondaires chez la spiruline suggère d'une
activité photosynthétique et énergétique, comparable à celle des plantes.
Le criblage réalisée a permis de constater la présence des cinq grands groupes
chimiques, les tanins, les flavonoïdes, les stérols et stéroïdes, les huiles volatiles et les
saponosides, alcaloïdes alors que les coumarines ne semblent présentes. Cependant
V.Anbarasan et al. 2011ont rapporté la présence des mêmes classes de familles chimiques
retrouvées au niveau la spiruline.
V.1.2 Teneur des extraits en polyphénols
Les quantités des polyphénols correspondantes ont été rapportées en mg équivalent
acide gallique par g du poids sec, sont déterminées par une équation de type : y = a x.
Figure 11: courbe d'étalonnage d'acide gallique .
Suivant la (figure 16) ci-dessus donne la teneur en polyphénols de chaque extrait de
spiruline. L'extrait méthanolique représente la teneur la plus élevée en polyphénols suivi
R² = 0.995
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,1 0,2 0,3 0,4
concentartion de l'acide gallique g/l
abso
rban
ce à
ג =7
60
nm
Chapitre V Résultats et discussion
35
l'extrait aqueux et butanolique et en faible teneur en polyphénols l'extrait chloroformique et
l'extrait acétate d'éthyle.
Figure 12: teneur en polyphénols totaux (mg/g de poids sec de la spiruline) des extraits de
spiruline.
Pour les cinq extraits de la spiruline nous avons remarqué une variabilité en polyphénols
totaux (figue 16).la teneur le plus élevée est constaté dans l'extrait brute méthanolique (1.25
mg EAG/g ES) par rapport de l'extrait brute aqueux (0.79mg EAG/g ES), une faible teneur de
polyphénols est constaté dans l'extrait acétate d'éthyle et l’extrait chloroformique .
V.1.3 Teneur en flavonoïdes
Des dosages spectrophotométriques ont été effectués à partir des extraits de la
spiruline afin de déterminer la teneur totale des flavonoïdes. Une courbe d'étalonnage a été
réalisée avec Quercétine à une longueur d'onde 420 nm.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
CHCl3 AcOET BuOH Aqx MeOH
con
cen
trat
ion
mg
GA
E/g
Chapitre V Résultats et discussion
36
Figure 13: courbe d'étalonnage de Quercétine.
D'après l'histogramme illustré par la figure 18, on a enregistré la teneur la plus élevée
en flavonoïdes dans l'extrait BuOH (1.72 mg EQ/g) et l'extrait MeOH (1.33mg EQ/g) et en
teneur plus moins0.79mg EQ/g enregistre dans l'extrait aqueux en faible teneur en flavonoïdes
enregistré chez l'extrait CHCl3 (0.03mg EQ/g).
Figure 14 : teneur en flavonoïde (mg/g de poids sec de la spiruline) des extraits de spiruline.
R² = 0.998
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01
Concentration du quercitine g/l
ab
sorb
an
ceàג
=415
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
CHCl3 AcOET Aqx MeOH BuOH
CHCl3
AcOET
Aqx
MeOH
BuOHcon
cen
trat
ion
mg
EQ/g
Chapitre V Résultats et discussion
37
V.1.4 Teneur en tanins
Une courbe d’étalonnage est réalisée en utilisant de la Vanilline comme contrôle
positif. Les résultats sont exprimés en milligramme (mg) équivalent de la vanilline par
gramme de la matière sèche (mg EV/g).
Figure15 : courbe d'étalonnage de vanilline.
Figure 16: teneur en tanins (mg/g de poids sec de la spiruline) des extraits de spiruline.
Comme le montre l’histogramme dans la figure 22 les concentrations des tanins sont
classées comme suit : extrait BuOH qui sont de l’ordre de (0.07 mg EV/g) et extrait MeOH
(0.03mgEV/g) dont nous avons remarqué que la teneur enregistrée dans l'extrait BuOH est la
plus importante.et absente total dans les autres extraits.
R² = 0.997
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 0,05 0,1 0,15
concentartion du Vaniline g/l
ab
sorb
an
ceàג
=500n
m
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
Teneur en tanins Extrait BuOH
Teneur en tanins Extrait MeOH
con
cen
tart
ion
en m
gE V
/g
Chapitre V Résultats et discussion
38
V.1.5 Activité antioxydant
V.1.5.1 Piégeage du radical libre DPPH (2.2-diphényl-1-picrylhydrazyl)
Dans notre travail nous avons étudié l’activité antioxydante des différents extraits de
la spiruline étudiée afin de préjuger et localiser la fraction la plus active. Les valeurs obtenues
ont permis de tracer des courbes ayant une allure exponentielle avec présence d’une phase
stationnaire qui signifie la réduction presque totale du DPPH· en sa forme non radicalaire. A
partir de ces courbes nous pouvons déterminer les pourcentages d’inhibition obtenus en
fonction des concentrations utilisées ainsi la valeur d’IC50 de chaque extrait.
Figure 18: Pourcentage d’inhibition en fonction des différentes concentrations de L’acide
ascorbique.
R² = 0.996
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 0,01 0,02 0,03pou
rcen
tage
d'i
nh
ibit
ion
%
concentration M
R² = 0.99
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0,05 0,1
concentration mg/ml
po
urc
enta
ge
d'i
nh
ibit
ion
%
R² = 0.990
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0,02 0,04
concentration mg/ml
po
urc
enta
ge
d'i
nh
ibit
ion
%
Figure 20: Pourcentage d'inhibition de BHT Figure19: Pourcentage d'inhibition de BHA
Chapitre V Résultats et discussion
39
Figure21: Pourcentage d’inhibition de radical libre DPPH en fonction des concentrations des
extraits BuOH, brut MeOH, AcOET, brut Aqx.
La phase butanolique de spiruline a montré une activité très élevée de piégeage du
radical DPPH● par rapport à les autres extraits. Elle est même supérieure à celui de BHT.
A une concentration de 0.035 mg/ml le pourcentage d’inhibition de la fraction
butanolique est de 60% La réduction du DPPH● est dépassé l'IC50à partir de cette
concentration. En comparant avec l'extrait aqueux, le pourcentage d’inhibition est de 30% à
une concentration de 0.035 mg/ml. Concernant la fraction méthanolique et acétate d'éthyle le
pourcentage d’inhibition est de l’ordre de 40 %et de 35 % respectivement à une concentration
de 0.035 mg/ml. Ces deux fractions on a donné des activités plus faibles à celle de l’acide
ascorbique.
R² = 0.993
0102030405060708090
0 0,05 0,1
concentration de l'extrait brut Aqx de spirulinemg/ml
po
urc
enta
ge
d'i
nh
ibit
ion
%
R² = 0.991
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
concentration de l'extrait AcOET despiruline mg/ml
pou
rcen
tage
d'i
nh
ibit
ion
%
R² = 0.989
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 0,02 0,04 0,06
concentration de l'extraitbrut MeOH de spiruline mg/ml
pou
rcen
tage
d'i
nh
ibit
ion
%
R² = 0.992
0
10
20
30
40
50
60
70
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
concentartion de l'extrait BuOH despiruline mg/ml
po
urc
enta
ge
d'i
nh
ibit
ion
%
Chapitre V Résultats et discussion
40
Les valeurs des IC50 trouvées pour tous les extraits testés sont représentées dans le
tableau et dans la figure sous forme d’histogramme.
Figure 22: IC50 de l'acide ascorbique, les extraits de spiruline
Le figure 22 rapporte les résultats du pouvoir antioxydant des extraits de spiruline par
la méthode de piégeage du radical libre DPPH.D’une manière générale, tous les extraits testés
méthanolique, aqueux, acétatique et butanolique ont provoqué une diminution plus ou moins
importante de l’absorbance à 517nm selon leurs concentrations. L’extrait butanolique
présente un pourcentage d’inhibition comparable à celui de l’extrait aqueux, et les deux
extraits sont supérieurs que le BHT, et nettement inferieure à celle acide ascorbique et le
BHA. La fraction méthanolique c'est la plus faible pouvoir anti radicalaire comparable à
l'autre extrait. Ces résultats montrent que nos extraits possèdent une puissante activité à céder
le proton pour neutraliser le radical DPPH.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Extrait
BuOH
Extrait
AcOH
Extrait
Aqx
Extrait
MeOH
Acide
ascorbique
IC5
0m
g/m
l
Chapitre V Résultats et discussion
41
V.1.5.2 Méthode de la réduction de fer (FRAP)
Les différents extraits sont traités de la même façon que ceux des solutions standards de
l’acide ascorbique (V.C). Nous avons tracé les courbes représentants la variation du pouvoir
réducteur exprimée en absorbance en fonction de l’inverse du nombre dilution
Figure 23: courbes représentants le pouvoir réductrice des extraits de spiruline.
R² = 0.996
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,2 0,4 0,6
abso
rban
ce à
ג =
70
0 n
m
1/dilution
extrait AcOETR² = 0.93
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0 0,5 1
abso
rban
ce à
ג =
70
0 n
m
1/dilution
extraitCHcl3
R² = 0.991
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 0,05 0,1 0,15
abso
rban
ce à
ג =
70
0 n
m
1/dilution
extraitAqx
R² = 0.979
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 0,05 0,1 0,15
abso
rban
ce à
ג =
70
0 n
m
1/dilution
extrait BuOH
R² = 0.997
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 0,02 0,04 0,06abso
rban
ce à
ג =
700
nm
extrait MeOH
1/ dilution
Chapitre V Résultats et discussion
42
Figure 25: la pouvoir réductrice de BHA
Figure 26: pouvoir réductrice de l'acide ascorbique.
Tableau 05: Les valeurs d’AEAC des différents extraits étudiés.
extrait BuOH MeOH Aqx AcOET CHcl3 BHA BHT
AEAC 2.94 8.76 1.07 1.07 0.07 0.56 0.75
R² = 0.991
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 0,5 1 1,5
abso
rban
ce à
ג =
70
0 n
m
1/ dillution
R² = 0.987
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,5 1 1,5
abso
rban
ce à
ג =
70
0 n
m
1/ dillution
R² = 0.997
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 0,2 0,4 0,6
abso
rban
ce à
=7
00
nm
1/ dilution
Figure 24 : pouvoir réductrice de BHT
Chapitre V Résultats et discussion
43
Les résultats obtenus dans les figures 23, 24, 25,26 montrent que la capacité à réduire
le fer pour l’extrait méthanolique brut elle est plus élevée par rapport les autres extraits. On
observées de densités optique qui dépasse 0.5 à une concentration 0.05 mg/ml, elle supérieur,
mais elle est nettement inférieur de l'acide ascorbique.
L'extrait chloroformique présenté une très faible activité avec des valeurs observées
de densités optiques (DO) qui ne dépassent pas le 0.1 à une concentration de 0.9 mg/ml, mais
elle est nettement inférieure à celle de l’acide ascorbique qui présente une DO de 0.1mg/ml à
la concentration 0.5 mg/ml seulement et le BHA qui présente une DO de 0.1 mg/ml à la
concentration 0.1 mg/ml.
La fraction butanolique représente moyennement élevé pour réduire le fer pour la
fraction méthanolique densité optique maximale de 0.49 à la concentration 0.13 mg/ml mais
cette capacité est nettement supérieure à celle de BHT et nettement inférieur que l'acide
ascorbique et BHA.
Selon le tableau 05 tous les extraits de spiruline possèdent un pouvoir réducteur
important, on remarque que l'extrait méthanolique brut possède la plus forte activité de
réduction de fer suivie par l'extrait butanolique puis l'acétate et l'extrait aqueux brut.
L'extrait méthanolique montre un meilleur pouvoir réducteur que le BHA et le BHT
de fois 15 et 6 respectivement.
Pour l'extrait butanolique les résultats effectués une bonne activité réducteur 5 fois
plus que le BHA et 3 fois par rapport le BHT par contre l'extrait aqueux montre une pouvoir
plus au moins que l'extrait méthanolique brute et extrait butanolique mais une fois plus que le
BHA et BHT.
La capacité à réduire le fer pour L'extrait chloroformique enregistre plus faible
pouvoir par rapport les autre extraits mais importante le BHA et BHT.
La méthode FRAP a révélé que l’extrait MeOH possède un pouvoir réducteur plus fort
que celui du les autres solvants. Classes de polyphénols contenues dans l'extrait.
D'après synthèse bibliographique et les résultats obtenus, on peut dire que les
flavonoïdes de classe : mon-glycosides et di-o-glycosides sont les plus concentré dans l'extrait
MeOH, et ils sont très efficaces en tant qu'antioxydant [33].
Chapitre V Résultats et discussion
44
V.1.6Analyse chromatographique
V.1.6.1 Analyse par chromatographie sur couche mince CCM
Nous avons soumis nos extraits méthanolique et aqueux et chloroformique à une
analyse sur chromatographique sur couche mince, dans 7 systèmes a donné une bonne
séparation des molécules dans le système S7 pour l'extrait méthanolique et aqueux (Méthanol/
chloroforme / acétate d’éthyle 0.5:1:1.5). Pour l'extrait chloroformique le S1 a donné une
bonne séparation (Chloroforme /MeOH 10:1).
Photo 02 : Plaque CCM de l'extrait chloroformique sous UV.
Photo 03: Plaque CCM de l'extrait MeOH brut et Aqx brut sous UV à 356 =ג nm.
MeOH
Aqueuse
Chapitre V Résultats et discussion
45
Dans notre étude, nous avons réalisé une chromatographie sur couche mince pour les
fractions aqueuse et méthanolique et chloroformique sur une plaque de gel de silice en
utilisant différents systèmes. Pour l'extrait CHCL3 le système (CHCL3/MeOH) ;(10:1)
(donne une bonne séparation, et pour l'extrait MeOH et Aqx le système
CHCL3/MeOH/AcOH) (1:0.5:2.5).
Par le biais de ces systèmes, nous avons pu mettre en évidence : trois composés pour
l'extrait chloroformique, trois composés pour aqueux et neuf composé pour l'extrait
méthanolique brute. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 06:
Tableau 06: fluorescence et Rf des taches sur CCM des extraits.
Extrait Nombre de
taches
Valeurs de RF Couleur des
taches
CHCl3 03
0.95
0.71
0.32
Rouge
Violet
Rouge
MeOH
Brut
09 0.88
0.8
0.7
0.64
0.55
0.47
0.43
0.3
Rouge
Marron
Rose
Rouge
Violet
Bleu
Jaune
Vert
Aqx 02 0.76
0.43
Bleu
Violet
V.1.6.2 Analyse par chromatographie sur papier CP monodimensionnelle
La phase organique B.A.W a pris 10 heures pour atteindre le front de solvant par
contre l’acide acétique 20% a pris 5 heures, les chromatogrammes.
Chapitre V Résultats et discussion
46
Photo 04: CP ascendante monodimensionnelle, solvant acide acétique20% sous UV.
Photo 05: CP ascendante monodimensionnelle, solvant acide acétique20% après UV.
Figure 07: Chromatogramme CP ascendante monodimensionnelle, solvant BAW sous UV.
Chapitre V Résultats et discussion
47
Photo 07: Chromatogramme CP ascendante monodimensionnelle, solvant BAW après UV.
D’après les chromatogrammes C.P 1D, il est montre une variabilité des taches et des
couleurs pour les extraits selon les deux systèmes BAW et acide acétique à 20% les résultats
obtenues montre qui il y des différences entre les extraits. Les résultats de CP à 1D ont été
démontrés dans le tableau 07 ci-dessous:
Tableau 07: Les résultats du CP monodimensionnelle.
Extrait Système de
solvant
Nombre de
tache
Valeurs de
Rf
Couleurs de taches
BuOH BAW
3 0.82
0.75
0.62
Bleu
Vert
Jaune
Acide
acétique
5 0.72
0.56
0.48
0.36
0.25
3 Bleu
Jaune
vert
AcOEt BAW
3 0.84
0.76
0.64
Bleu
Vert
Jaune
Acide
acétique
3 0.73
0.50
0.36
2 Bleu
Jaune
Chapitre V Résultats et discussion
48
MeOH
Brut
BAW
3 0.77
0.61
0.46
Bleu
Jaune
Vert
Acide
acétique
4 0.70
0.46
0.32
0.21
3 bleu
Jaune
Aqx
Brut
BAW
Acide
acétique
1
0.82
Bleu
2 0.53
0.31
Vert
Jaune
Par le biais de ce système, nous avons pu mettre en évidence : cinq taches dans le
système d'acide acétique, et 3 taches dans le system BAW pour la fraction butanolique, et on a
constaté trois taches pour la fraction d'acétate d'éthyle dans les deux systèmes, et un tache
pour l'extrait aqueux dans le système BAW et deux taches dans le système acide acétique.
. Dans la phase méthanolique on a constaté trois taches dans le système BAW et
quatre taches dans l'autre système phase acétate d'éthyle. Les couleurs des taches pour tous les
extraits et variable entre le bleu et le jaune, et le vert avec une différence de valeur RF
(tableau 06). D'après ces résultats on observées quel le système d'acide acétique le meilleurs
que le système BAW pour la séparation. Les différences des valeurs de Rf sont dues à la
polarité des composés vis-à-vis du système d solvants d’élution et la phase stationnaire.
V.1.6.3 chromatographie sur papier C.P bidimensionnelle
Les conditions opératoires sont :
Pour la première dimension : BAW.
Pour la deuxième dimension: AcOEt 20 %.
Révélateur: UV 254/365 nm.
Chapitre V Résultats et discussion
49
Photo 08: CP bidimensionnelle Extrait BuOH solvant acide acétique /BAW.
Photo 09 : CP bidimensionnelle Extrait AcOEt solvant acide acétique /BAW.
Les papiers obtenus présentent une bonne migration ; par conséquent une bonne
séparation qui permet l’analyse qualitative des composés flavoniques. Les taches sont bien
distinctes et montrent une richesse considérable de l’extrait analysé en substances
flavoniques. Les échantillons sont riches en flavones en premier lieu qui correspondent aux
tâches violettes, jaunes et bleues. Les résultats sont présentés dans le tableau12 ci –dessous :
Chapitre V Résultats et discussion
50
Tableau08 : résultats de CP 2D de l'extrait butanolique et acétate.
Selon le tableau 08Par le biais de ce système, nous avons pu mettre en évidence : cinq taches
pour la fraction butanolique, et aussi pour la fraction acétate d'éthyle avec des couleurs
variée entre le bleu, jaune, vert, violet.
Les différences de longueur des taches sont dues à la polarité des composés. Ont démontré
que les deux extrait riche en composés flavoniques, particulièrement le flavone qui présenté
par couleur bleu.
V.1.7 Activité antimicrobienne
Les résultats de l'évaluation antimicrobienne des extraits sont repris ci-dessous figure
sont inclus les valeurs en (mm) zones ou diamètres d'inhibitions, représentant la grandeur du
halo formé par les microorganismes inhibés par l'activité antimicrobienne.
Extrait Couleur de taches Nombre de taches Suggestion des classes de
flavonoïdes Markham;1982
BuOH 2 Bleu
Vert
Jaune
Violet
5 Flavone
chalcone
Flavonol
Flavone
AcOEt Violet
Vert
Bleu
Bleu foncé
Jaune
5 Flavone
chalcone
Flavone
Flavone
Flavonol
Chapitre V Résultats et discussion
51
Figure 25: Moyennes des diamètres des zones d'inhibition des extraits de spiruline relatives
aux différentes souches bactériennes.
La figure montre que l'extrait butanolique a manifesté une activité modérée contre les
bactéries. En revanche l'extrait aqueux a présenté une bonne activité vis-à-vis pseudomonas
aeuroginosa et E.coli, nous remarquons les autres extraits aucune une zone d'inhibition
contres ses souches. Notre résultat montre que l'extrait aqueux possède une activité plus
élevée que les autres.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
ATCC2592 ATCC ATCC29212 ATCC700603
Extrait BuOH
Extrait Aqx
Extrait AcOH
Extrait MeOH
Photo 10 : Effet des extraits de spiruline
sur Pseudomonas aeruginosa.
Photo11: Effet des extraits de spiruline sur
Enterococcus faecalis.
Chapitre V Résultats et discussion
52
Photo12:Effet des extraits de spiruline sur
Escherichia coli.
Photo13: Effet des extraits de spiruline sur
Klebsilla pneumonie.
V.1.8 Activité antifongique
Les résultats de l'activité antifongique de nos extraits exploités dans l à figure26 :
Figure 26: Effet des extraits de spiruline sur le Fusarium oxysporum
Le plus grand diamètre de croissance mycélienne a été enregistré en absence des
extraits aqueux des plantes étudie (témoin) avec un diamètre de croissance de 80 mm. Le
diamètre de croissance mycélienne est inversement proportionnel aux extraits de spiruline
dans le milieu de culture.la plus grande zone a été montre dans l'extrait brute méthanolique
témoin positif
extrait MeOH
extrait Aqx extrait BuOH
extrait AcET
80
24,720
16
0
tau
x d
'inh
ibit
ion
en m
m
Chapitre V Résultats et discussion
53
(27.7 mm), et on a enregistrée (0 mm) chez l'extrait acétate d'éthyle la plus efficace. On
constate que la spiruline possède une bonne activité antifongique.
Photo 14: Effet de l'extrait AcOEt sur le
Fusarium oxysporum
Photo 15: Effet de l'extrait MeOH brut sur le
Fusarium oxysporum.
Photo16: Effet de l'extrait Aqx sur le Fusarium
oxysporum.
Photo 17: Effet de l'extrait BuOH sur le
Fusarium oxysporum.
Chapitre V Résultats et discussion
54
V.2 Dissucusion
Le Criblage chimique des extraits de spiruline est une étape préliminaire et d’une
grande importance, puisqu’elle révèle la présence des constituants connus par leur activités
physiologiques et possédant des vertus médicinales. [38]. Les recherches effectuées sur les
différents extraits révèlent la présence d’importants métabolites secondaires comme les
flavonoïdes, les stéroïde et les tannins, les composés volatils, ainsi les alcaloïdes ont
caractérisés les deux extraits de l'Arthrospira platensis. De point de vue biologique, selon
L.trabelsi et al., 2010, cette micro algue referme de principes potentiellement actifs
rencontrés comparable à celle des plantes. Ce sont des précurseurs de drogues très utiles en
thérapie clinique.
L'analyse quantitative a révélé des taux notables et variables en polyphénols et
flavonoïdes et tanins. Dans l'extrait méthanolique brut, qui montré taux les plus élevés de
polyphénols (1.25mgGAE/g). Les flavonoïdes se concentrent principalement dans l'extrait
butanolique (1.72 mg EQ/g). Par contre on a enregistrée une faible teneur en tanins dans les
différents extraits. Selon Mohamdi, 2013 L’Acétate d’éthyle, butanol et le méthanol, et
chloroforme sont utilisés pour le fractionnement de la charge en métabolites secondaires,
principalement celle de nature phénolique. Les résultats du dosage prouvent que l’essentiel de
ces métabolites se sont retrouvés dans les fractions organiques avec des proportions
différentes d’un échantillon à un autre. Cette distribution dépend de la nature des substances
phénoliques contenues dans chaque extrait, de leur solubilité et de la polarité de chaque
solvant.
La variabilité des teneurs en polyphénols, tanins, flavonoïdes chez ces espèces
végétales est les microorganismes photosynthétique est du probablement à la composition
phénoliques des extraits [46], aux facteurs génotypiques [47], les conditions biotiques
(espèce, organe et l’étape physiologique) et abiotiques (facteurs édaphiques) [48], la
composition du milieu de culture [3].
Diverses études ont déterminé expérimentalement les capacités des extraits naturelles
à piéger les radicaux libres [39]. Jusqu’à présent, il n’y a pas une méthode simple et
universelle par laquelle l’activité antioxydante est évaluée qualitativement et quantitativement
[3].Pour cette raison, nous avons combiné deux techniques complémentaires. Ce pendant, la
présence de ces substances indique que nos extraits et fractions sont dotés d’une activité
Chapitre V Résultats et discussion
55
antioxydante. Les meilleurs antioxydants naturels sont les fractions butanolique les piégeurs
les plus efficaces du radical libre DPPH notre étude possédant les valeurs IC50 les plus basses:
la fraction butanolique 0.031mg/ml et fraction aqueuse 0.042mg/ml ont montré un bon
pouvoir de neutralisation du radical DPPH. Dans la méthode de FRAP les valeurs d’AEAC
obtenus dans ce test montrent que les extraits méthanolique butanolique de l'Arthrospira
possèdent de très fortes capacités réductrices (8.72 mg/ml) bien quelles sont supérieur à celle
du BHT.
Les résultats de l’analyse chromatographique ont permis de mettre en évidence la
présence de flavonoïdes dans les extraits des composés mais en différents par la
concentration en flavonoïdes (Intensité des taches).selon Montoro et al;, l’essai
d’identification des composés flavoniques par la chromatographie sur couche mince et sur
papier nous permis de conclure que les composés phénoliques identifiés dans les différents
extraits sont responsable de l’activité antioxydante et renforcent la capacité de ces extraits à
céder un proton pour réduire le DPPH et de libérer un électron pour réduire le fer .
L’activité antibactérienne des métabolites extracellulaires a été identifiée chez d’autres
cyanobactéries (Nostoc commune). Ce travail montre que cette activité est également présente
chez Arthrospira platensis. Elle serait cependant modérée en comparaison aux antibiotiques
usuels, tels que la kanamycine. Toutefois, il faut rappeler que ces métabolites sont efficaces
dans des traitements locaux d’infections épidermiques (oedème et eczéma), dans les
utilisations traditionnelles par les peuplades du Ghanem au lac Tchad [49].
Selon L.trabelsi et al. 2010 Il est important de constater, à ce niveau, l’action
sélective de ces métabolites en fonction de la nature membranaire de la bactérie cible. En
effet, sur les six souches étudiées l’activité antibactérienne n’est observée que sur les bactéries
Gram positives alors qu’elle est totalement absente chez les bactéries Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli et qui sont Gram négatives.
Les résultats obtenus dans notre le présent travail montrent que les souches qu'on
étudiées sont sensibles aux l'extrait aqueux par une zone de diamètre maximal 21 mm et la
zone minimal 15 mm des la spiruline, et aussi par une zone d'inhibition modère dans l'extrait
butanolique, la plus faible activité antibactérien enregistré dans l'extrait méthanolique et
l'acétate d'éthyle par une zone d'inhibition maximal 5 mm et 9 mm respectivement.
Chapitre V Résultats et discussion
56
Cette différence serait due au fait que la sensibilité d'un microorganisme à une extrait
dépend non seulement de l'extrait, mais aussi du microorganisme lui-même et de
l'environnement ou se situe l'action [25].
D'après les résultats Mala et al.; 2009 Sur l'activité antibactérienne des différents
extraits de spiruline , l'extrait aqueux de spiruline montre a maximum de zone de diamètre 18
mm vis-à-vis Klebsiella pneumoniae, et la zone la plus minimal 10 mm vis-à-vis Proteus
vulgaris.tous les microorganismes a été testé sont résistée dans l'extrait méthanolique.
Les effets antifongiques des extraits spiruline peuvent être attribués aux différentes
substances phytochimiques on constate une bonne activité antifongiques chez tous les extraits
de spiruline particulièrement l'extrait acétate d'éthyle qui montre aucune zone de croissance
considère, c'est l'extrait la plus efficace, une croissance mycélien faible dans l'extrait
butanolique 16 mm , 24.7 dans l'extrait méthanolique, et 20 mm dans l'extrait aqueux
indiquent que notre micro algue elle possède une activité antifongique important.
Les composants des extraits tels que les terpènes affectent non seulement la
perméabilité mais aussi d'autres fonctions dans les membranes cellulaires. Ces composés
peuvent traverser les membranes cellulaires, pénètrent ainsi à l'intérieur de la cellule et
interagissent avec des sites critiques intracellulaires tels que les enzymes et les protéines, ce
qui conduit à la mort cellulaire [51].
Les flavonoïdes sont également responsables de l’inhibition des microbes résistants
aux antibiotiques. Ils sont responsables des processus de balayage ou chélateurs et peuvent
également perturber les membranes microbiennes. Par ailleurs, les alcaloïdes renferment un
effet détoxifiant et possèdent une très bonne activité antifongique [52].
Conclusion
Conclusion
57
Conclusion
La présente étude a porté sur le criblage chimique et l'activité biologique de
l'Arthrospira platensis. Elle a permis de mettre en évidence à travers un screening chimique la
présence des tanins, des flavonoïdes, des stérols et tri terpènes, des huiles volatiles, des
saponines et des alcaloïdes.
La première étape était la préparation de différents extraits de spiruline, notons les
deux extraits bruts aqueux et méthanolique aussi que trois extraits résultants de l’extraction
liquide-liquide avec différents solvants de polarités croissantes (chloroforme, acétate d’éthyle
et n-butanol).
Les extractions des différents métabolites sécondaires les plus abondant dans notre
cyanobactérie nous a permis de calculer le rendement de chaque extrait notamment l'extrait
aqueux brut, dont le rendement le plus remarquable est celui des les autres extraits (24,4 %).
Les résultats des dosages des phénols totaux, tanins, flavonoïdes des différents
extraits de spiruline : méthanolique brut, et aqueux brut, butanol et l'extrait d'acétate d'éthyle,
et extrait chloroformique a révélé des teneurs considérable en polyphénols pour l'extrait
méthanolique brut (1.25 EAG/mg de MS), ce extrait présent de teneur en tanins (0.03 EV/mg
de MS ),et en flavonoïdes(1.33 EQ/mg de MS), l'extrait butanolique présente de teneur en
polyphénols assez faible (0.18 EAG/mg de MS) par contre une teneur la plus élevée marqué
en flavonoïdes (1.72EQ/mg de MS) .
l'extrait aqueux brut présente une teneur en polyphénols et flavonoïde appréciable (
0.79 EAG/MG mg) de MS et( 0.5 EQ/mg) de MS respectivement.les plus faible teneur de
flavonoïde , tanins ,polyphénols représente dans les deux extraits chloroformique et acétate
d'éthyle avec des teneurs ne dépassent 0.01 mg de MS .
Nous avons constaté pour l’activité antioxydante par la méthode FRAP, que tous les
extraits de spiruline étudiée ont la capacité de réduire le fer qui augmente en fonction de la
concentration. Comme nous avons remarqué que l’extrait méthanolique brut présente une
capacité intéressante pour réduire le fer par rapport aux autres extraits, mais cette capacité est
à celle de l’acide ascorbique et BHA mais plus élevée para rapport BHT.
Conclusion
58
Cependant, pour le piégeage du radical libre DPPH● et en comparant les IC50 des
différents extraits par rapport à celle de l’acide ascorbique, BHT et BHA nous avons
remarqué une activité antioxydante très importante de la fraction butanolique (IC50 = 0,03
mg/ml) qui est supérieur à la capacité du piégeage du radical DPPH● de BHT (IC50 = 0,06
mg/ml).
Le pouvoir antibactérien, par le diamètre des zones d'inhibition obtenues au contact
les extraits, a manifesté une activité modérée contre ces bactéries. En revanche l'extrait
aqueux a présenté une bonne activité vis-à-vis les quatre bactéries étudiées.
Le pouvoir antifongiques vis-à-vis Fusarium oxysporum les extraits manifeste une
bonne activité contre ce champignon, nous remarquons que l'extrait acétate d'éthyle montre
une l'activité la plus élevée que les autres extraits.
En outre, l’analyse qualitative des flavonoïdes des deux fractions acétates d’éthyle et
1-butanol des trois parties de la plante par chromatographie sur papier grâce au système
d’élution choisi a révélé la présence des différents composés flavoniques.
En utilisant les méthodes chromatographiques : CCM gel de silice on a pu séparer les
constituants de chaque extrait en comparant le nombre, la couleur et le Rf des spots grâce au
système d’élution choisi.
Selon les résultats obtenus dans cette étude, nous pouvons déduire que l'Arthrospira
platensis et riche en Phénols Totaux et en Flavonoïdes. Les extraits donnent une bonne
activité antioxydante, anti radicalaire, antibactérienne et antifongique.
Notre perspective d’avenir est d’étudier chaque extrait séparément puis isoler, purifier
et identifier les différents composés qui existent et tester leurs activités antioxydantes et
biologiques.
Référence bibliographique
Références bibliographiques
Référence bibliographique
[1]TRABELSI. L, BENOUADAH., BASSA.H., 2010activités biologiques des métabolites
excrètent par les cyanobactéries filamenteuse arthrospira platensis, journal pharmacognosie.
[2] VICENETE.N., 2008.Spiruline et développement in international symposium 'spirulina
and development' pages 07.
[3]JEAN –PAUL .J., 2006, Manuel de culture artisanale pour la production de spiruline
pages 06.
[4]OULD BELAHCENT, et al. 2013 Culture et production de spirulina platensis dans les
eaux usées domestiques, Larhyss Journal.
[5] J.FLAQUET, J.P Hurni., 2006, spiruline aspects nutritionnelle, Antenna technologie,
Genève.pages 03.
[6] CHARPY.l, LANGLADE .M.J et ALLIOD.R., 2008 « La Spiruline peut-elle être un
atout pour la santé et Le développement en Afrique», institut de Recherche le développement,
Marseille, page10.
[7] TABUTIN .I, GOUESIN.P.Y., 2002, livret pédagogique: la spiruline contre la
malnutrition, page 11-13.
[8] GERSHWIN M.E., BELAY A., 2007 - Spirulina in human nutrition and health. CRC
Press.
[9]CLEMENT G., 1975-Production et constituants caractéristiques des algues Spirulina
maxima etplatensis. Ann. Nutr. Aliment. 29(6), pages 477-487.
[10] SAUTIER C., TREMOLIERES J., 1975 - Valeurs alimentaires des algues spirulines
chez l’Homme. Ann.Nutr. Aliment. 29(6), pages 517-533.
[11] QUILLET M., 1975 - Recherche sur les substances glucidiques élaborées par les
spirulines. Ann. Nutr.Aliment. 29(6), pages 553-561.
[12] PASCAUD M., 1993 - The essential polyunsaturated fatty acids of Spirulina and our
immune response.
[13] BULL. Inst. Océano. Monaco, numéro spécial 12, pages 49-57.
[14] CHAUMONT D., 1995, Bases physiologiques et technologiques de la conception de
photobioréacteurs pour la culture contrôlée de microalgues. Application à l’étude de la
Références bibliographiques
plasticité métabolique de PhorphyridiumcruentumNaegliet Haematococcuspluvialis Flotow.
Thèse de doctorat, Faculté des Sciences et Techniques de Saint Jérôme, 245 pp.
[15]SGUERA.S., 2008, Spirulina platensis et ses constituants intérêts nutritionnelle et
activités thérapeutiques.
[16]JUDD W.S., CAMPBELL C.S., KELLOGG E.A., STEVENS P.F. ,2002.Botanique
systématique. Une perspective phylogénétique. 1ére Edition De Boeck Université.Paris, 383.
[17]BRUNETON J., 1993Pharmacognosie, phytochimie, plantes médicinales. Techniques
et Documentation. 2ème Ed.Lavoisier. Paris, 274-285.
[18]A. CROZIER, M. N. CLIFFORD, H. ASHIHARA .,2006, Plant
SecondaryMetabolites,Blackwell Publishing, Oxford UK.
[19]W. VERMERRIS, R. NICHOLSON., 2006, Phenolic compound biochemisry,
Springer,The Netherlands
[20] BOUGANDOURA N;2010 Pouvoir antioxydant et antimicrobien des extraitsd’espèces
végétales Saturejacalaminthasspnepta (nabta)et AjugaivaL. (chendgoura) de l’ouest
d’Algérie.mémoiremagister;université Tlemcen.
[22]Bartosz. G., 2003. Generation of reactive oxygen species in biological
systems.Comments on Toxicology, 9, 5-21.
[23]POURRUT B., 2008. Implication du stress oxydatif dans la toxicité du plomb sur une
plante modèle, Vicia faba.Thèse pour l’obtention du Diplôme de Doctorat à l Institut National
Polytechnique del’Université de Toulouse spécialité : Ecotoxicologues. France.
[24] FAVIER A., 2003. Le stress oxydant. Intérêt conceptuel et expérimental dans la
compréhension des mécanismesdes maladies et potentiel thérapeutique.L’actualité chimique,
11, 108-115.
[25] MEYER A. et DEIANA J., 1988. Cours de microbiologie générale. Doinéditeurs, paris.
p 201
[26]BILLING J. ET SHERMAN P.W., 1998. Antimicrobial function of spices. Quarterly
Review of Biology. 73: p.49
[27] FREDRICKSON. J, ZACHARA. J, BALKWILL. D., 2004. « Geomicrobiology of
high-level nuclear waste-contaminated vadose sediments at the Hanford site, Washington
state», dansAppl Environ Microbiol, vol. 70, no 7, p. 4230–41
Références bibliographiques
[28] KHIATI.M., 1998. Guide des maladies infectieuses et parasitaires.
[29] CHABASSE. D., BOUCHARA J. P., De GENTILE L., BRUN S., CIMON B., PENN
P., 2004. Les Dermatophytes. Laboratoire de parasitologie-mycologie du CHU d’Anger, 31
:143p
[30] VIJAYAKUMARI.B 2, SASIKALA.V 1, , RADHA.S.R 3TAMILNADU.,2013-
PRELIMINARY PHYTOCHEMICAL SCREENING OF THE VARIOUS EXTRACTS OF
ROTULA AQUATICA LOUR.India
[31] SELADJI.M ; BELMEKKI.N ; AZMANI.I ; BOUZIANI.I ; BENDIMERAD. N.,
2013- Phytochemical Screening of two Algerian medicinal plants, University of Tlemcen-
Algeria.
[32]SAVITHRAMMA.N, LINGARAO.M and SUHRULATHA.D 2011 Screening of
Medicinal Plants for Secondary MetabolitesUniversity Andhra Pradesh, India,
[33] SAMEJO.M.Q , SUMBUL.A , SHAH.S , MEMONA .S.B; CHUNDRIGAR.S.,2013
Phytochemical screening of TamarixdioicaRoxb. ex RochUniversity of Sindh, Jamshoro
76080, Pakistan
[35] BELGUIDOUM .M . 2012. Une approche phytochimique pour diffirencier deux
especes de genre zygophylum . Université d’ouargla
[36] HARBORNE.J.B., 1975, MABRY.T.J, MABRY.H, The Flavonoids, academic
press,New york.
[37] HUNG.P.V, MAEDA.T, MIYATAKE.K, MORITA.N.,2009, Total phenolic
compounds andantioxidant capacity of wheat graded flours by polishing method, Food
ResearchInternational, 42 185–190 .
[38] CHIA-CHI.C et al .,2002, estimation total flavonoid content in propolis by two
complementary colorimetric methods , journal of food and drug analysis , vol 10, no. 3, pages
178-182.
[39] MAAMRI.S., 2008, étude de Pistaciaatlantica de deux regions de sud Algérien: dosage
des lipids, dosage des polyphénols, essaysantileishmaniens, mémoire magister, Université De
Boumerdes.
Références bibliographiques
[40] ZOUARI.S, KETATAA.M, BOUDHRIOUAC.N, AMMARA.E, ALLIUM roseum
L.,2013, volatilecompounds profile and antioxydantactivity for chemotype discrimination –
Casestudy of the wild plant of Sfax (Tunisia), Industrial Crops and Products 41 172– 178
.[41] MOHAMMEDI .Z.,2012-Etude Phytochimique et Activités Biologiques de quelques
Plantes médicinales de la RégionNord et Sud-Ouest de l’Algérie .thése docotrat aboubeker
belkaid Tlemcen
[42] BERTHILLIER.A,la chromatographie et ses applications, DUNOD,PARIS 1972,p42-
67,p153-187
[43] CAO.J, ZHOU.S. 2012 -A simple and fast method for the simultaneous quantificationof
six flavonoids in Fructusaurantii by UPLC–PDA and confirmation by UPLC/ESI-Q-
TOFMS.journal of the Royal Society of Chemistry.
[44] HELLAL.Z., 2011. Des propriétés antibactériennes et antioxydants de certaines huiles
essentielles extraites des Citrus Application sur la sardine (Sardina Pilchardus). Magistère,
Université Mouloud Mammeri de Tizi-Ouzou. pp 1-78.
[45] GOUMNI. Z., 2013.etude de l'activité antimicrobienne de l'huile essentielle extrait de la
plante laurusnobilis .L mémoire master académique univ Ouargla.
[46] HAYOUNI, E., ABEDRABBA, M., BOUIX, M., HAMDI, M. (2007). The effects of
solvent and extraction method on the phenolic contents and biological activities in vitro of
Tunisian Quecus coccifera L. and Juniperus phoenicea L. fruit extracts, Food Chem. 105:
1126-1134.
[47] El- WAZIRY, A.M. (2007). Nutritive value assessment of ensiling or mixing Acacia
and Atriplex using in vitro gas production technique. Res. J. Agric. Biol. Sci. 3(6): 605-614.
[48] KSOURI, R., MEGDICHE, W., DEBEZ, A., FALLEH, H., GRIGNON, C.,
ABDELLY. C. (2007). Salinity effects on polyphenol content and antioxidant activities in
leaves of the halophyte Cakile maritima. Plant. Physiol Bioch, 45: 244-249.
[49] BROUERS M (2004) Traditional use of Spirulina (Arthrospira platensis) in Chad.
International Symposium: CSSD “Cyanobacteria for health, Science and Development”,
Embiez Island France.
Références bibliographiques
[50] LINUMA, M., TSUCHIYA, H., SATO, M., YOKOYAMA, J., OHYAMA, M.,
OHKAWA, Y., TANAKA. FUJIWARA, S. & FUJII, T., 1994. Flavanones with potent
antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Pharmacol
46(11), 892-895.
[51] KESSLER, M., UBEAUD, G. & JUNG, L., 2003. Anti-and prooxidant activity of rutin
and quercetin derivatives. J Pharm and Pharmacol 55, 131.
[52] ZEE-CHENG, R.K., 1997. Anticancer research on Loranthaceae plants. Drugs Future
22(5), 515-530.
Criblage chimique et l’activité biologique de spiruline (Arthrospira platensis )
Résumé L'étude présente travail porté sur un screening chimique de spiruline visant à identifier les différentes familles des composés chimiques contenus.
Cinq extraits ont été préparés à partir de la biomasse de cette micro algue, méthanolique, chloroformique, butanolique, acétate d'éthyle, et aqueux. Les resultats
de l’étude quantitative de spiruline par dosage de polyphénols, flavonoïdes, tanins ;montrent que l'extrait chloroformique et acétate d'éthyle sont les plus pauvres
en polyphénols et en flavonoïdes que les autres extraits.
L'évaluation de L'activité antioxydante des extraits par la méthode (FRAP) et celle du DPPH a montré que l'extrait butanolique manifeste un pouvoir
antioxydant plus grand que les autres extraits, et l'extrait méthanolique brute a montré un pouvoir réducteurleplus important. L'analyse par chromatographie
CCM, et CP pour les différents extraits de spiruline, a montré une bonne séparation des différents composes phénoliques
Les tests des activités antimicrobiennes sur quatre souches bactériennes (Klebsilla pneumonie, Escherichia coli, pseudo Klebsilla pneumonie,
Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Enterococcus faecalis ), et une souche fongique (Fusarium oxysporum). Montrent que l'extrait aqueux possède une
fort e activité antibactérienne avec des diamètres d’inhibition varient entre 15 a 20 mm en comparaison avec les autres extraits. L’activité antifongique del'extrait
acétate d'éthyleest plus forte que l'extrait butanolique, méthanolique, et aqueux.
Mots clés : Spiruline, screening chimique, pouvoir antioxydant, pouvoir antimicrobienne, pouvoir antifongique, CCM, CP.
Chemical screening and biological activiy of spirulina ( Arthrospira platensis)
Abstract:
The present study focused on spirulina chemical screening to identify different families of chemical compounds. Five extracts were prepared from the
biomass of this micro algae, methanol, chloroform, butanol, ethyl acetate, and aqueous. The quantitative study of spirulina per dosage of polyphenols, flavonoids,
tannins. The results show that the chloroform extract and the ethyl acetate are poorer in polyphenols and flavonoids other extracts.
Evaluation of the antioxidant activity of the extracts by the method (FRAP) and the DPPH showed that the butanol extract shows an antioxidant activity
larger than the other extracts. And crude methanol extract showed the largest reducing powerr. Analysis by TLC chromatography, and CP for the various extracts
of Spirulina showed good separation of various phenolic compounds.
The antimicrobial activity tests on four strains of bacteria (Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa , Entercoccus faecalis),
and a fungal strain (Fusariumoxysporum). Show that the aqueous extract has a strong antibacterial activity with inhibition diameters ranging from 15 to 20 mm in
comparison with the other extracts. The antifungal activity of the ethyl acetate extract is stronger than the butanol extract, methanol, and aqueous.
Keywords: Spirulina, chemical screening, antioxidant, antimicrobial power, antifungal potency, CCM, CP
(Arthrospira platensis )سبيرولينا الفحص الكيميائي و النشاط البيولوجي ل
:ملخص
حى إعذاد خست يسخخهصاث ي انكخهت انحت يسخخهص انثال، . ركزث ذ انذراست عه انفحص ي انكائ نسبزنا نخحذذ عائالث يخخهفت ي انزكباث انكائت
بج انخائح أ يسخخهص . انذراست انكت نهسبزنا ف اندزعاث ي يادة انبن فل، انفالفذ انعصف. انكهرفرو، بحال، االسخاث اإلثم، انسخخهص يائ
. انكهرفرو اسخاث اإلثم األكثز فقزا ف يادة انبنف ل انفالفذ انسخخهصاث األخز
أظزث انخائح أ انسخخهص اظز انبخان اظز قة )(DPPH) كذا حفخخ اندذر انر(FRAP)ا حقذز انشاط انضاد نألكسذة نهسخخهصاث بطزقخ إرخاع انحذذ
ي خذة فصم سبزنا ي يخخهفتنسخخهصاث CCM، CP انخحهم أظز. ارخاعت اكبز ي انسخخهصاث األخز كذا انسخخهص انثان اظز قذرة ف إرخاع انحذذ األكبز
. انخخهفت انفنت انزكباث
,Klebsilla pneumonie, Escherichia coli, pseudo Klebsilla pneumonie, Escherichia coliا انقذرة انضاد نهشاط انبكخز ألربعت بكخزا
Pseudomonas aeroginosa, Enterococcus faecalis ,. نهفطزاثدانشاط انضا كذ (fusaruim oxysporum ) بج أ انسخخهص انائ نذ شاط يضاد نهبكخزا قت يع
. يائ انثال، بحال، انشاط يضاد نهفطزاث نهسخخهص خالث اإلثم أق ي اسخخزاج. يهى بانقارت بانسخخهصاث أخز20-15بأقطار حخزاذ حثبظ
CCM, CP ,يضاد انشاط انفطز,يضاد انشاط انبكخز ,يضاد نالكسذة , انفحص انكائ , سبيرولينا:الكلمات المفتاحية