[TOXin vitro] David Ramos Investigador CERETOX dramos@pcb.ub.cat

Jornada: The in vitro choice 29 de Noviembre de 2013

Parc Científic de Barcelona

REALIDAD

ACERCAMIENTO

IN SILICO

IN VITRO

IN VIVO

Perdida de información

HUMANOS

¿El modelo ideal?

¿Por qué In vitro?

1 Forma parte del avance tecnológico

2 Throughput (screening molecular)

3 Tiempo (días, semanas vs años)

4 Coste (- maquinaria + persona )

5 Menor gasto de molécula (µg vs g)

6 Moral/Ética (Refinamiento, reemplazo, reducción)

7 Obligaciones legales (pharma vs cosmética)

VALIDAN TÉCNICAS IN VITRO

Técnicas validadas

Toxicidad sistémica

Genotoxicidad

Reprotoxicidad

Carcinogénesis

Tolerancia local

OECD

ICCVAM

ECVAM

FDA

Toxicidad sistémica

Ensayo 3 Rs Mecanismo Endpoint Normativa

ACUTE SYSTEM TOXICITY

3T3 NRU - Acute oral Toxicity - Fixed Dose Procedure

Reducción, refinamiento Vibilidad celular Neutral red

uptake/IC50 ICCVAM

Normal human epidermal keratinocyte NHK - Acute oral Toxicity - Fixed Dose Procedure

Reducción, refinamiento Vibilidad celular Neutral red

uptake/IC50 ICCVAM

MTT Assay - Acute oral Toxicity Reducción, refinamiento Vibilidad celular MTT uptake/IC50 ECVAM 17

3T3 NRU Phototoxicity Test - Fototoxicidad

Reducción, refinamiento

Exposicion UVA - viabilidad

Neutral Red Uptake OECD 432

IC50

000 010 020 030 040 050 060 070 080 090 100

000 001 001 002 002 003 Ce

ll N

umbe

r (%

Via

ble)

Log Concentration (µM)

Compound 4

IC50 (µM) [LB, UB]

Compound 4 88.79 [76.12, 102.26]

Neutral red

MTT

Genotoxicidad

Ensayo 3 Rs Mecanismo Endpoint Normativa

GENOTOXICITY

Ames Test - Bacterial Reverse Mutation Test Reducción Mutagenicidad en

S. typhymurium Colonias revertintes

vs espontáneas. OECD 471

In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test Reducción Alternaciones

cromosómicas

Translocaciones y perdidas de cromosomas

OECD 473

In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test Reducción Mutagenicidad en

TK cell

Colonias mutantes en medio selectivo

vs colonias en medio no selectivo

OECD 476

MNT in vitro - In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test Reducción Alteración nuclear

post-mitosis MN generados en

celulas binculeadas OECD 487

DNA Single Strand Damage - Comet Assay Refinamiento Daño en el DNA,

electroforesis Tamaño cola Comet ASTM E2186

OTRAS

GENOTOXICITY

Ensayo 3 Rs Normativa In Vitro Sister Chromatid Exchange Assay in Mammalian Cells Reducción OECD 479

Saccharomyces cerevisiae, Gene Mutation Assay Reducción OECD 480

Saccharomyces cerevisiae, Mitotic Recombination Assay Reducción OECD 481

DNA Damage and Repair, Unscheduled DNA Synthesis in Mammalian Cells in vitro Reducción OECD 482

Escherichia coli, Reverse Assay Reducción OECD 472

Genotoxicidad

MN In vitro Ames Test Comet Assay Aberraciones cromosómicas

Ensayo 3 Rs Mecanismos Endpoint Directive

REPROTOX

EST Embryonic Stem Cell Test Reemplazo parcial Citotoxicidad

3T3/D3 + Gota pendiente D3

IC50 3T3, IC50 D3, ID50 ECVAM 113

MM Micromass Embryotoxicity Assay Refinamiento

Extremidades embriones +

citotoxicidad 5 dias + Alcian blue

IC50 para la inhibición y citotoxicidad

ECVAM 114

WEC Whole rat Embryo Embryotoxicity Test Refinamiento

Cultivo de embriones expuestos

IC50 ICMAX for malformations;

ICNOEC for Total Morphlogical score

ECVAM 123

FET Refinamiento Exposición embrión zebrafish

Alteraciones morfologicas embrion OECD 236

Toxicidad en la reproducción

EST Cultivo ES-D3 Día 0 Día 3-5 Día 10

MM Extracción miembros Tinción NR Tinción Alcian Blue

Test Method 3 Rs Mecanismo Endpoint Directive

CARCINOGÉNESIS CTA – Balb/c 3T3 Cell Transformation Assay Reemplazo

CFE citotoxicity + ½ Fase testado como inductor o

promotor

Focos Tipo III transformantes

OECD Draft 31 ECVAM

Recomendation

Carcinogénesis

CFE Citotoxicity Dia 46 estudio: contaje de focos Focos tipo III

Tolerancia local

Ensayo 3 Rs Mecanismo Endpoint OECD

SKIN CORROSION

In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Episkin, Epiderm)

Reemplazo Exposición producto sobre RHE Viabilidad por MTT OECD 431

CORROSITEX - In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion

Reemplazo Membrana sintética

Tiempo necesario para corroer membrana OECD 435

SKIN IRRITATION RHE Model Test (Episkin, Epiderm) Reemplazo Exposición producto

sobre RHE Viabilidad por MTT OECD 439

DERMAL PENETRATION

TESTING Skin absorption Refinamiento

Cámara Franz con fluido donador y

receptor % molécula recuperada OECD 428

HEMOLISIS Red Blood cell test Reemplazo Exposición de la

sustancia en eritrocitos aislados

Hemolisis 50% ECVAM 99

SENSIBILIZACIÓN LLNA /BrdU Refinamiento

Exposición en ratón, extracción nódulos

linfáticos

Cantidad de timidina tritiada recogida

OECD 429/442

hCLAT Reemplazo Exposición a células THP1

Detección de receptores CD86-54 Draft

Tolerancia local

Ensayo 3 Rs Mecanismo Endpoint Directiva

EYE IRRITATION

BCOP - Bovine Cornea Opacity Test Reemplazo parcial Exposición a corneas bovinas

Opacidad de la cornea TG 437

ICE - Isolated chicken eye test Reemplazo parcial Exposición a corneas

Opacidad y fluorescencia e hinchazón

TG 438

HET-CAM - Hen's egg test - chorio-allantoic membrane Reemplazo parcial

Huevos fertilizados post-10d

Hemorragia, lisis de los vasos, coagulación

ECVAM 047

Un futuro prometedor

Tenemos un mayor conocimiento de los mecanismos moleculares Estamos más cerca de sustituir el uso de animales Debemos avanzar hacia modelos que nos acerquen a la realidad Los ensayos in vitro representarán en un futuro próximo una parte muy importante en el desarrollo de un nuevo producto y en la fase regulatoria.

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