The improvement of lipase’ function by application...

The improvement of lipase’ function by application of the bioimprinting method

Takeru Shigemura1, Ken Yamashita

1, Kaoru Nakamura

2, Shin-ichi Ueji

1*

(Graduate School of Human Development and Environment1, Graduate School of Human

Development and Environment ‘science shop researcher’2, Kobe University)

3-11Tsurukabuto,Nada, Kobe, 657-8501,[email protected]

We wish report a new bioimprinting method to greatly improve the enantioselectivity of lipase-catalyzed

hydrolysis of racemic butyl 2-(6-methoxy-2-napthyl) propanoate in aqueous buffer solution, and then the memory

of bioimprinting of lipase remained even in aqueous system.

( R、S ) CH3

O

CH3

COOBu CH

Bioimprinted lipase

in phosphate buffer

37 ℃ CH3

O

CH3

COOH CH

S -preference

新規固定化リパーゼの開発と光学活性イソオオキサゾリン誘導体の合成

(岡山大院自然) 酒井貴志，○田中恭子，是永敏伸，依馬正

エナンチオマーの選択的な合成には化学的手法の他に, 微生物や酵素などを利用した生体触媒法があ

る. 生体触媒の中でも加水分解酵素リパーゼは高い不斉認識能と幅広い基質特異性のため, 扱い易い有

用な生体触媒である. しかし, 酵素は変性し易く, 基質によっては反応が遅い等, いくつかの問題点も

ある. 当研究室では, リパーゼの性能を向上させるために, リパーゼの種々の固定化方法を開発中であ

り, 反応の高速化と高度なリサイクル利用を実現すべく, 現在研究をおこなっている.1)

今回我々は, イオン液体性架橋剤をカオリナイト性セラミッ

クス担体である Toyonite 200 に担持し, 有機―無機ハイブリッド

担体を調製した. それを酵素固定化担体として用い, 新規固定

化リパーゼ触媒を開発した. さらに, 触媒性能を評価するため

に, 有用な血小板凝集阻害剤 Roxifiban の合成中間体であるイソ

オキサゾリン誘導体 1 の速度論的光学分割 (KR: kinetic

resolution) を行った. その結果, 従来の固定化リパーゼ (lipase

PS-CII) よりも反応速度が向上した. また, イオン液体性架橋剤

のカウンターアニオンは PF6 が, より高活性であった. KR だけでなく, 動的速度論的光学分割 (DKR:

dynamic kinetic resolution) へと展開させるための検討についても併せて報告する.

References

1) a) Sakai, T.; Hayashi, K.; Korenaga, T.; Ema, T. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2003, 76, 1441‒1446.

b) Sakai, T. Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 2749−2756.

c) Sakai, T.; Wang, K.; Ema, T. Tetrahedron 2008, 64, 2178−2183.

entry lipase solvent t (h)% eeb

conv.

(%)bE TTN/h

(R)-2 (S)-1

1 PS-CII dioxane 48 95.7 26.2 21 58 56

2 PS-CII THF 44 98.5 13.6 12 148 23

3 PS-CII THPc 48 96.6 37.5 28 82 48

4 T2-PF6 dioxane 24 94.7 83.5 47 97 162

5 T2-PF6 THF 24 97.3 33.2 25 101 88

6 T2-PF6 THPc 24 97.0 80.1 45 163 156

7 T2-BF4 dioxane 44 93.8 97.0 51 133 95

8 T2-BF4 THF 48 95.9 59.3 38 88 66

9 T2-BF4 THPc 48 90.0 27.4 23 25 40

a Conditions: protein (0.8 mg), substrate (0.20 mmol), H2O (0.4 mL), solvent (4 mL).b Determined by HPLC. c Tetrahydropyrane.

表. 固定化リパーゼを用いるイソオキサゾリンエステルの光学分割a

NCN O

O

O NCN O

OH

O

(R)-2

lipase, H2O(S)-1 +

1

solvent, 30 °C

Si

O

O

O (CH2)3 N N n-BuToyonite200

X

X = PF6 (T2-PF6)X = BF4 (T2-BF4)

lipasePS

図. 新規固定化リパーゼ

P23

Development of �ovel Immobilized Lipase and Application to Synthesis of Optically

Active Isooxazoline Derivatives

*Takashi Sakai, Kyoko Tanaka, Toshinobu Korenaga, Tadashi Ema

Guraduate School of Natural Science and Technology, Okayama University

Tsushima-naka, Okayama 700-8530, Japan. E-mail: [email protected]

We developed novel immobilized lipase having ionic liquid moiety as a bridge, which showed

higher catalytic activity in kinetic resolution of isooxazoline ester than the previously reported

immobilized lipase.

Si

O

O

O (CH2)3 N N n-BuToyonite200

X

X = PF6 (T2-PF6)

X = BF4 (T2-BF4)

lipasePS

Fig. Novel immobilized lipase

極低周波電磁場による磁性リパーゼの機能改変極低周波電磁場による磁性リパーゼの機能改変極低周波電磁場による磁性リパーゼの機能改変極低周波電磁場による磁性リパーゼの機能改変

(神戸大院人間発達環境) ○奥由佳里、濱田武、江原靖人、上地眞一

極低周波電磁場（ELF-EMF）を用いて、磁性リパーゼの機能改変を試みた。

極低周波電磁場は一般に、その周波数領域が 300Hz 以下のものを指し、近年、極低周波電磁場

が健康に与える影響について人々の関心が高まっている。極低周波電磁場の研究の一つとして酵素

反応に関するものも存在し、極低周波電磁場が酵素反応に影響を与えるという報告もある。極低周

波電磁場を酵素反応に用いると、周波数や電磁場強度といった様々な条件から多様な機能改変が期

待でき、またその条件変更は機械操作であるため、非常に簡便である。

私達は新たな酵素機能改変手法として、極低周波電磁場を利用し、その効果を増幅させるために

磁性粒子であるマグネタイトを用いて磁性リパーゼを調製し、極低周波電磁場における酵素反応に

用いた。磁性リパーゼは、Candida rugosa lipase をマグネタイトに共有結合法によって固定化する

ことで得られた 1。磁性リパーゼの酵素機能における極低周波電磁場の効果は 2-(4 エチルフェノキ

シ)プロピオン酸ブチルの加水分解反応により調べた。

Et O CH

CH3

COOBu37 ºC

pH 7 phosphate buffer

Et O CH

CH3

COOH

Scheme 1. Magnetic enzyme-catalyzed hydrolysis and esterification.

Magnetic enzyme

ELF-EMF

その結果、2-(4 エチルフェノキシ)プロピオン酸ブチルの加水分解反応において、対応する R 体

のプロピオン酸が優先的に生成し、周波数 50Hz の極低周波電磁場によって磁性リパーゼの酵素活

性とエナンチオ選択性は上昇した。電磁場強度 200G の時、酵素活性は 1.4 倍上昇し、エナンチオ

選択性は 1.2 倍上昇した。電磁場強度 296G の時、酵素活性は 1.8 倍上昇し、エナンチオ選択性は

1.1 倍上昇した。

Table1. 極低周波電磁場における磁性リパーゼの加水分解反応の結果

電磁場強度 Conv.% e.e.% E Value

磁性リパーゼ 8.4 44 2.8

磁性リパーゼ磁性リパーゼ磁性リパーゼ磁性リパーゼ 50Hz50Hz50Hz50Hz 磁場磁場磁場磁場 200G200G200G200G 11.511.511.511.5 54.454.454.454.4 3.83.83.83.8

磁性リパーゼ 7.1 48.4 3.2

磁性リパーゼ磁性リパーゼ磁性リパーゼ磁性リパーゼ 50Hz50Hz50Hz50Hz 磁場磁場磁場磁場 296G296G296G296G 13131313 55.455.455.455.4 4444

1) Shyh-Yu Shaw, et al., Enzyme and Microbial Techn

P24

Improvement of magnetic lipase function

by Extremely Low Frequency Electromagnetic Field

Yukari Oku, Takeshi Hamada, Yasuhito Ebara, Shin-ichi Ueji*

(Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University)

3-11Tsurukabuto,Nada,Kobe,657-8501,Japan.E-mail:[email protected]

Extremely Low Frequency Electromagnetic Field（ELF-EMF）improves magnetic lipase activity and

enantioselectivity for the hydrolysis of butyl 2-(4-substituted phenoxy) propanoates.

Table.1 Effects of ELF-EMF on magnetic lipase-catalyzed hydrolysis

ELF-EMF intensity Conv.% e.e.% E Value

magnetic lipase 8.4 44 2.8

magnetic lipasemagnetic lipasemagnetic lipasemagnetic lipase 50Hz ELF50Hz ELF50Hz ELF50Hz ELF----EMFEMFEMFEMF 200G200G200G200G 11.511.511.511.5 54.454.454.454.4 3.83.83.83.8

magnetic lipase 7.1 48.4 3.2

magnetic lipasemagnetic lipasemagnetic lipasemagnetic lipase 50Hz ELF50Hz ELF50Hz ELF50Hz ELF----EMFEMFEMFEMF 296G296G296G296G 13131313 55.455.455.455.4 4444

Substrate

：：：：ketone

LSADH

NADHNAD+

OH

2-propanol acetone

E. coli cell

Product:optically

pure alcohol

O

NAD+

LSADH

Fig.2 LSADH 類縁酵素遺伝子のメタゲノムからの取得と評価

メタゲノムを用いた酸化還元酵素遺伝子ライブラリーの構築とその評価

(富山県大・工・生工)

○礒谷健太郎, 石母田剛, 加藤真輝, 牧野祥嗣，伊藤伸哉

【目的】Leifsonia sp. S749 由来のアルコール脱水素酵素(LSADH)１）を用いて、各種ケトン、α‐ケトエ

ステル、β‐ケトエステルよりキラルアルコールの生産を行い、その生産性、鏡像体過剰率、絶対配置

を調べる。また、土壌 DNA から PCR を用いて LSADH 類縁酵素遺伝子を探索し、取得した遺伝子によ

る発現酵素を用いて各種基質に対する活性を LSADH と

比較評価し、その有用性を検討する。

【方法・結果】LSADH の有する 2-propanol による補酵素

再生系反応を用いて(Fig. 1)、各種基質の LSADH による変

換を行い、生産性、鏡像体過剰率、絶対配置を調べた結

果、高い生産性と高い光学純度で多くの光学活性アルコ

ールを得ることができた。

さらに、LSADH 及びその orthologs の配列情報を基にプラ

イマーを作成し、土壌から抽出したメタゲノムに対して

PCR を行った。増幅した DNA を pUC 系ベクターである

pHAR1２）にライゲーションし、発現とシーケンス解析を

常法により行った(Fig. 2)。その結果、約 30 株の相同遺伝

子が得られた。また、発現した酵素を評価し、LSADH が

不活性なケトン類に反応することを見出した。

References

1) K. Inoue et al. (2005) Tetrahedron: Asymmetry, 16:2539-2549

2) Y. Makino et al. (2007) Appl Microbiol Biotechnol, 77:833-843

メタゲノムの分離 PCRによるLSADH類縁酵素遺伝子の増幅と遺伝子解析

増幅遺伝子

LSADH遺伝子を含む発現ベクターの作製

・ライブラリー評価・各種ケトンの不斉還元反応への応用

SD

6xHis

pUC118系系系系

Fig.1 2-propanol による補酵素再生系

P25

Library construction of oxidoreductase gene from metagenome and its evaluation

Kentaro Isotani, Tsuyoshi Ishimoda, Masaki Kato, Yoshihide Makino, *Nobuya Itoh

Department of Biotechnology, Faculty of Engineering, Toyama Prefectural University

5180 Kurokawa, Imizu, Toyama 939-0398, Japan. E-mail: [email protected]

We have constructed a gene library of

oxidoreductase including Leifsonia

alcohol dehydrogenase (LSADH) from

metagenome and evaluated the

expressed enzymes. It was found that

they are useful to asymmetric

bioreduction of ketones (Fig. 1).

Fig. 1 Scheme to obtain LSADH analogous genes from

metagenome and their evaluation.

SD

6xHis

pUC118

Separation of metagenome

Amplified gene

Amplification of LSADH analogous genes by PCR and gene analysis

Construction of expression vector possessing LSADH analogous genes

・Library evaluation・Application of enzyme library

to asymmetric reduction

植物培養細胞によるフラバノン類の物質変換植物培養細胞によるフラバノン類の物質変換植物培養細胞によるフラバノン類の物質変換植物培養細胞によるフラバノン類の物質変換

（1岡山理大院，2大分大・医，3サニーヘルス株式会社）

○山本涼平 1，下田恵 2，葛城寿史 3，濱田博喜 1

１．近年，グリーンケミストリーの観点から，微生物や酵素などの生体触媒を利用した有機合成が

注目されている．その一環として当研究室では，すぐれた生理活性を有する化合物のさらなる高機

能化を目的として，植物培養細胞による外来物質の物質変換を行っている．その結果，これまでに

植物培養細胞が水酸化能力や配糖化能力を有している事が分かった 1-3)．今回はフラバノンの一種

である 4’-ヒドロキシフラバノン(1)および 7-ヒドロキシフラバノン(2)を用いて物質変換を行い，

植物培養細胞による配糖化反応と水酸化反応を見出した．さらに，これらが同時に存在する場合，

植物培養細胞は一方を優位的に配糖化する事を見出したので報告する．

２．変換及び抽出方法は前報の同様である１）．

以下に 1および 2 の変換物の構造式を示す．

Fig. 1 タバコ植物培養細胞による 1 と 2 の変換

以上より，植物培養細胞はフラバノン類のフェノール性水酸基を選択的に配糖化する事が分かった．

さらに７位における水酸化反応を見出した．

1) K.Shimoda, H.Hamada et al., Phytochemistry, 70, 207-210 (2009)


3) K.Shimoda, H.Hamada et al., Chemistry Letters, 36, 1292-1293 (2007)

flavanone 7-O-β-D-glucoside

OOOO

OOOO

HHHHOOOO OOOO

OOOO

OOOOOOOO

OOOOHHHH

HHHHOOOOHHHHOOOO

OOOOHHHH

plant cultured cells

OOOO

OOOO

OOOOHHHH

HHHHOOOO


OOOO

OOOO

OOOOHHHH

A C

B1

2

3

45

6

7

8 1'

2'

3'

4'

5'

6'

OOOO

OOOO

OOOOOOOO

OOOOHHHH

HHHHOOOO

HHHHOOOO

OOOOHHHH

flavanone 2’-O-β-D-glucoside

2’ ,7-dihydroxy flavanone

1111

2222

P26

Biotransformation of flavanones using plant cultured cells

Ryohei Yamamoto*, Kei Shimoda, Hisasi Katsuragi, Hiroki Hamada

Department of Life Science, Okayama University of Science

1-1 Ridai-cho Kita-ku Okayama 700-0005, Japan, E-mail: [email protected]

Plant cultured cells glycosylate regioselectively the hydroxyl group of flavanons; 4’-hydroxy flavanone(1) and

7-hydroxy flavanone(2).

Fig.1 Biotransformation of flavanones using plant cultured cells

OOOO

OOOO

OOOOHHHH

HHHHOOOO


OOOO

OOOO

OOOOHHHH

A C

B1

2

3

45

6

7

8 1'

2'

3'

4'

5'

6'

OOOO

OOOO

OOOOOOOO

OOOOHHHH

HHHHOOOO

HHHHOOOO

OOOOHHHH

2’ ,7-dihydroxy flavanone

flavanone 2’-O-β-D-glucoside

flavanone 7-O-β-D-glucoside

OOOO

OOOO

HHHHOOOO OOOO

OOOO

OOOOOOOO

OOOOHHHH

HHHHOOOO

HHHHOOOO

OOOOHHHH


1111

2222

CGTaseCGTaseCGTaseCGTase((((糖転移酵素糖転移酵素糖転移酵素糖転移酵素

（１岡山理大院

○大広あずさ

1. 我々は酵素の持つ特異的物質変換能力の触媒機能を活用した高機能性化合物の合成を目的と

して，外来基質の物質変換を行っている．今回は，

チン多糖配糖体の調製を行った

2. アルブチン多糖配糖体の酵素合成

アルブチン 0.1mmol(27.2mg)

CGTase(600units/ml)0.5 ml

55℃で湯浴しながら撹拌し，

で湯浴し，酵素を失活させ生成した．

示す．図 2 に反応物の HPLC

3. CGTase（糖転移酵素）を活用し，

調製に成功した．また，生成物のアルブチン単糖配糖体とアルブチン

様なチロシナーゼ阻害活性がみられた．

アルブチン

アルブチン

多糖配糖体

OH

HO

HOOH

O

OHArbutin

図

図

55555555

P27 糖転移酵素糖転移酵素糖転移酵素糖転移酵素))))を活用したアルブチン多糖配糖体の調製を活用したアルブチン多糖配糖体の調製を活用したアルブチン多糖配糖体の調製を活用したアルブチン多糖配糖体の調製

岡山理大院，２岡山県立大，３サニーヘルス株式会社）

○大広あずさ１，中島伸佳２，葛城寿史３，濱田博喜 1

の持つ特異的物質変換能力の触媒機能を活用した高機能性化合物の合成を目的と

して，外来基質の物質変換を行っている．今回は，CGTase（糖転移酵素）を活用した

調製を行ったので報告する．

アルブチン多糖配糖体の酵素合成

mg)に 0.1M クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液

0.5 ml，α-シクロデキストリン 0.5mmol (486 mg)を加えた．この溶液を

℃で湯浴しながら撹拌し，1 時間反応させ，多糖配糖体を合成した．多糖配糖体反応液を

で湯浴し，酵素を失活させ生成した．CGTase によるアルブチンの多糖配糖体の反応を

HPLC を示す．

（糖転移酵素）を活用し，アルブチンをアルブチン単糖配糖体とアルブチン

．また，生成物のアルブチン単糖配糖体とアルブチン 2 糖体

がみられた．

TOF/MSTOF/MSTOF/MSTOF/MS

� MW =434MW =434MW =434MW =434

ESIESIESIESI----/MS /MS /MS /MS m m m m ////zzzz 433[433[433[433[ M M M M ---- H ] H ] H ] H ] ----

� MW=596MW=596MW=596MW=596

ESIESIESIESI----/MS /MS /MS /MS m m m m ////zzzz 595 [ M 595 [ M 595 [ M 595 [ M ---- H ] H ] H ] H ] ----

CGTase

OH

O

HOOH

O

OH

HO

HOOH

OH

O

HOO

OH

O

HOOH

OH

HO

HOOH

図 1.CGTase によるアルブチンの反応

図 2.アルブチン多糖配糖体の生成

55555555℃，℃，℃，℃，pH 5.4pH 5.4pH 5.4pH 5.4

を活用したアルブチン多糖配糖体の調製を活用したアルブチン多糖配糖体の調製を活用したアルブチン多糖配糖体の調製を活用したアルブチン多糖配糖体の調製

サニーヘルス株式会社）

の持つ特異的物質変換能力の触媒機能を活用した高機能性化合物の合成を目的と

（糖転移酵素）を活用したアルブ

クエン酸ナトリウム緩衝液( pH5.4)3.5ml と，

を加えた．この溶液を

時間反応させ，多糖配糖体を合成した．多糖配糖体反応液を 80℃

によるアルブチンの多糖配糖体の反応を図 1 に

アルブチンをアルブチン単糖配糖体とアルブチン 2 糖体の

糖体はアルブチンと同

OH

OHO

OH

Enzymatic synthesis of arbutin oligosaccharides using CGTase

*Azusa Oohiro, Nobuyosi Nakazima, Hisasi Katuragi, Hiroki Hamada,

Department of life science , Okayama University of Science

1-1 Ridai-cho kita-ku Okayama 700-0005 , Japan. E-mail: [email protected]

We synthesized the mono- and di- glucoside of arbutin using CGTase.

OH

HO

HOOH

O

OH

CGTase

OH

O

HOOH

O

OH

OH

HO

HOOH

OH

O

HOOH

O

OH

OH

O

HOOH

OH

HO

HOOH

Arbutin

Fig.1 synthesis of glucosides of arbutin using CGTase

55555555℃，℃，℃，℃，pH 5.4pH 5.4pH 5.4pH 5.4

クルクミンの水溶化クルクミンの水溶化クルクミンの水溶化クルクミンの水溶化に関する研究に関する研究に関する研究に関する研究


○小原隆博 1，下田恵 2，葛城寿史 3，濱田博喜 1

4. クルクミンはショウガ科植物ウコンの根茎に含まれる黄色色素成分で，肝機能の向上，抗腫瘍

作用，抗炎症作用，抗酸化作用などの認められている．しかし，クルクミン(1111)は水溶性が低

く使用範囲が制限される．そこで，クルクミンの水溶化向上を目的として、化学合成や植物培

養細胞を用いて配糖化を行い１)，クルクミンモノグルコサイド(3333)とクルクミン多糖配糖体を調

製したので，本講演で報告する．

5. 植物変換及び合成の変換物の構造を示す．

1) 植物変換

2) 化学合成

3) 酵素合成

図 1. 植物培養細胞，化学合成及び酵素合成によるクルクミンの変換

以上の結果より次のことが明らかになった．

1) 植物培養細胞はクルクミンモノグルコシドを生成することがわかった．

2) CGTase による酵素合成でクルクミン多糖配糖体の合成に成功した．

1) Kei Shimoda, Hiroki Hamada et al.,Tetrahedron Letters , 48484848, pp.4029-4032（2007）

O O

OCH3

OH

H3CO

HO1

O O

OCH3

OH

H3CO

OO

OH

HO

HO

OH CurucminCurucminCurucminCurucmin----ββββ----DDDD----glucoside glucoside glucoside glucoside


O OOCH3

OH

H3CO

OO

OAc

AcOAcO

OOOOAAAAccccO O

OCH3

OH

H3CO

OO

OH

HOHO

OH

TAGB , Ag2CO3 , MS-4A

1

2Acetone ( Dry ), 9 hr

32 hr

K2CO3 , CH3OH

2

n=1～5

O O

OCH3

OH

H3CO

OO

O

OH

HOHO

OOH

OH

HOHOCGTase

1

n

P28

The study of The study of The study of The study of solubilitysolubilitysolubilitysolubility concernig curcuminconcernig curcuminconcernig curcuminconcernig curcumin

Ohara Takahiro*, Kei Shimoda, Hisashi Katsuragi ,Hiroki Hamada


1-1 Ridai-Cho Kita-Ku Okayama 700-0005, Japan, Email:[email protected]

We synthesized curcumin-O-β-D-glucoside and oligoglcoside using the living cells.

O O

OCH3

OH

H3CO

HO1


O O

OCH3

OH

H3CO

OO

OH

HO

HO

OH

O O

OCH3

OH

H3CO

OO

O

OH

HOHO

OOH

OH

HOHOCGTase

1

n

植物培養細胞によるカテキン類の鏡像体選択的配糖化植物培養細胞によるカテキン類の鏡像体選択的配糖化植物培養細胞によるカテキン類の鏡像体選択的配糖化植物培養細胞によるカテキン類の鏡像体選択的配糖化

（1岡山理大院，2岡山県立大，3大分大・医，4サニーヘルス株式会社）

○木村江利子 1，中島伸佳 2，下田恵 3，葛城寿史 4，濱田博喜 1

1. 茶に含まれるカテキン類(渋み成分)は，現在までに抗酸化作用，発ガン抑制作用，抗菌作用，

消臭作用などの生理機能が数多く解明されており注目を集めている．しかしながら，カテキ

ン類は光酸化に対する色沢安定性が非常に悪いことから，商品化への利用範囲に制限がある．

このような理由から，本研究室では，植物培養細胞の持つ配糖化反応を利用してカテキン類

を配糖化し，水溶性の増大と光安定性の向上を目的として研究を行っている 1)．今回の研究

では(+)-カテキン，(-)-エピカテキンとそれぞれの鏡像異性体である(-)-カテキン，(+)-エ

ピカテキンを用いて物質変換研究を行ったので報告する．

2. 培養及び抽出方法は前報と同様に行った 1)．

以下に今回使用した一部の基質の構造と主変換物の構造式を示す．

図 1．植物培養細胞を用いた(+)-カテキンと(-)-カテキンの変換

3. ツキヌキユーカリ植物培養細胞は (+)-および(-)-カテキンを識別して，2R-(+)体の 3’位を

配糖化し，2S-(-)体の 7位を配糖化することが分かった．また一方，(-)-および(+)-エピカ

テキンを識別して，2R-(-)体の 3’位と 7 位を配糖化し，2S-(+)体の 7位を配糖化すること

が分かった．

この結果から，ユーカリ植物培養細胞は 2Rと 2S の B 環の立体の違いを識別し，鏡像体選

択的配糖化反応を生起することが明らかになった．

1）K.Shimoda, H.Hamada et al., Chemistry Letters, 36363636, 1292-1293 (2007)

(-)-catechin-7-O-β-D-glucoside

(+)-catechi (+)-catechin-3’-O-β-D-glucoside

(-)-catechin

O

OH

OH

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

OH

OO

OH

HOHO

OH

E.perriniana

1

3

45

6

7

8 1'

2'

3'

4'

5'

6'

ツキヌキユーカリ植物培養細胞

2S

O

OH

OH

OH

OH

HOO

OH

OH

O

OH

HOE.perriniana

OHO OH

OH

OH

1

345

6

7

8 1'

2'3'

4'

5'

6'

ツキヌキユーカリ植物培養細胞

2R

P29

EnantioEnantioEnantioEnantioselective biotransformation of catechinselective biotransformation of catechinselective biotransformation of catechinselective biotransformation of catechinssss usingusingusingusing plant cultured cellsplant cultured cellsplant cultured cellsplant cultured cells

Eriko Kimura*, Nobuyoshi Nakajima, Kei Shimoda, Hisashi Katsuragi, Hiroki

Hamada


1-1 Ridai-Cho Kita-Ku Okayama 700-0005, Japan, E-mail:[email protected]

Plant cultured cells discriminate the enantiomer of catechins and enantioselectively

glycosylate the hydroxyl group of catechins.

(+)-catechin-3’-O-β-D-glucoside (+)-catechi

O

OH

OH

OH

OH

HO

2RO

OH

OH

O

OH

HO

OHO OH

OH

OH

E.perriniana

1

345

6

7

8 1'

2'3'

4'

5'

6'

(-)-catechin (-)-catechin-7-O-β-D-glucoside

O

OH

OH

OH

OH

HO

2S

O

OH

OH

OH

OH

OO

OH

HOHO

OH

E.perriniana

1

3

45

6

7

8 1'

2'

3'

4'

5'

6'

Fig.1 Biotransformation of (+)-catechin and (-)-catechin by plant cultured cells

植物培養細胞によるフラボノールの配糖化植物培養細胞によるフラボノールの配糖化植物培養細胞によるフラボノールの配糖化植物培養細胞によるフラボノールの配糖化


○近藤舞 1，下田恵 2，葛城寿史 3，濱田博喜 1

1．フラボノールは植物の二次代謝産物として植物界に広く分布しているフラボノイドの一種であ

り，抗酸化作用や抗がん作用，抗炎症作用など種々の生理活性を有していることが報告されている．

当研究室ではこれまでに植物培養細胞の特異的物質変換機能を見出しており，植物培養細胞の配糖

化反応によって化合物の水溶性や安定性が増大することを見出した 1-2)．本研究では優れた生理活

性物質であるフラボノールのさらなる高機能化を目的としてクエルセチン(1111)とモリン(2222)の物質変

換研究を行ったのでその結果を報告する．

2．変換および抽出方法は前報と同様の方法で行った 1)．以下に今回用いた 1111 および 2222 の変換結果

を示す．

以上の結果より，植物培養細胞は 1111 および 2222 のフェノール性水酸基を基質特異的かつ位置選択的に

配糖化することが分かった．



O

OH

OH

OH

HO

O

OH

2

3

45

6

78

9

10

2'3'

4'

5'

6'1'

O

OH

HO OH

OH

HO

O

O

O

OH

O

HO

OHO

OH

OH

OH

HO

OH

O

O

OH

O

HO

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

OO

O

O

OH

HOHO

OHOH

OH

OH

HO

1111

2222

quercetinquercetinquercetinquercetin----3333----OOOO----ββββ----DDDD----glucosideglucosideglucosideglucoside

morinmorinmorinmorin----3333----OOOO----ββββ----DDDD----glucosideglucosideglucosideglucoside

morinmorinmorinmorin----7777----OOOO----ββββ----DDDD----glucosideglucosideglucosideglucoside

図 1．植物培養細胞による 1111 および 2222 の変換

PPPPlant cultured lant cultured lant cultured lant cultured

PPPPlant cultured lant cultured lant cultured lant cultured

P30

Biotransformation of flavonols using plant cultured cellsBiotransformation of flavonols using plant cultured cellsBiotransformation of flavonols using plant cultured cellsBiotransformation of flavonols using plant cultured cells

Mai Kondo*, Kei Shimoda, Hisashi Katsuragi, Hiroki Hamada


1-1 Ridai-Cho Kita-Ku Okayama 700-0005, Japan, Email:[email protected]

Plant cultured cells glycosylated the hydroxyl group of quercetin and morin

regioselectively.

Fig.1 Biotransformation of quercetin and morin using plant cultured cells

O

OH

OH

OH

HO

O

OH

2

3

45

6

78

9

10

2'3'

4'

5'

6'1' O

O

OH

O

HO

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

PPPPlant cultured cellslant cultured cellslant cultured cellslant cultured cells

quercetinquercetinquercetinquercetin----3333----OOOO----ββββ----DDDD----glucosideglucosideglucosideglucoside

O

OH

HO OH

OH

HO

O

O

O

OH

O

HO

OHO

OH

OH

OH

HO

OH

OO

O

O

OH

HOHO

OHOH

OH

OH

HO

PPPPlant cultured cellslant cultured cellslant cultured cellslant cultured cells

quercetinquercetinquercetinquercetin

morinmorinmorinmorin----3333----OOOO----ββββ----DDDD----glucosideglucosideglucosideglucoside morinmorinmorinmorin----7777----OOOO----ββββ----DDDD----glucosideglucosideglucosideglucoside morinmorinmorinmorin

ジアホラーゼ及びラッカーゼによる NAD+再生とその応用

(富山県立大学) ○黒川純司伊藤伸哉

リポアミド脱水素酵素は 2-オキソ酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体を構成する成分の一つであり、ジヒ

ドロリポイル化したタンパク質や dihydrolipoamide を酸化し、その際 NAD+から NADH を生成する。また

ジアホラーゼ活性を有し、色素の還元や 1,4-ベンゾキノン類や 9,10-フェナントレンキノンなどキノン

類をメディエーターとして NADH を NAD+に変換する事ができる。我々は NAD+依存アルコール脱水素酵素

を使用したアルコールからのアルデヒド及びケトン生産に必須となる補酵素再生系の構築を目的に

Microbacterium luteolum よりリポアミド脱水素酵素遺伝子(mlulpd)のクローニング及びその翻訳産物

の特性決定を行った。MluLPD は 102kDa からなるホモ 2 量体で一補欠分子族として FAD を有する。また

リポアミド脱水素酵素に特徴的なドメイン構造を保存しており、Frankia sp.、Mycobacterium

vanbaalenii、Rhodococcus sp.の LPD に対してそれぞれ 78.2、76.6、73.5% の相同性を示した。大腸菌

で発現させた組換え MluLPD は NADH に対する高い親和性と強いジアホラーゼ活性を示した。これらの酵

素特性は NAD+の再生に適している。そこでメディエーターとして 2,5-dimethoxy-1,4-benzoquinone

(DMBQ)を用いて NAD+の再生系を構築した。メディエーターは MluLPD による還元を受けヒドロキシキノ

ンと NAD+を生成する。ヒドロキシキノンは Trametes 属由来ラッカーゼによる酸化を受けベンゾキノン

に再生する。この補酵素再生系と Leifsonia sp. S749 由来アルコール脱水素酵素（LSADH）1)を用いて

2-オクタノールから 2-オクタノンへの変換を試みた。

結果、dl-オクタノールの約半量を３時間の反応で 2-オクタノンに酸化することができた。LSADH は

広範囲の pH 域で様々な 2級アルコールを酸化する酵素である。また厳密な立体選択性を持ち R体のみ

を酸化する。よって反応液中には S体が残り、アルコールの光学分割が可能である。2)

Fig.1 Schematic reaction process for production of ketones/aldehydes from alcohols by coupled

enzymatic redox reactions.

1)K. Inoue et al., Appl. Environ. Microbiol., 71, 3633-3641(2005).

2)J. Kurokawa et al., J. Biosci. Biotechnol., in press.

O2

Autooxidationor Laccase

Diaphorase NAD+-dependent dehydrogenases

NAD+

NADHH2O/H2O2

quinone

hydroxyquinone

R1

R2

OH

R1

R2

O

O2

Autooxidationor Laccase

Diaphorase NAD+-dependent dehydrogenases

NAD+

NADHH2O/H2O2

quinone

hydroxyquinone

R1

R2

OH

R1

R2

O

P31

Enzymatic regeneration system of �AD+ from �ADH using artificial electron acceptors by a coupled

reaction with dihydrolipoamide dehydrogenase and laccase.

Junji Kurokawa, *Nobuya Itoh

Department of Biotechnology, Faculty of Engineering, Toyama Prefectural University 5180 Kurokawa, Imizu,

Toyama 939-0398, Japan. E-mail: [email protected]

An NAD+-regenerating system with Microbacterium luteolum dihydrolipoamide dehydrogenase (MluLPD)

and laccase using 2,5-dimethoxy-1,4-benzoquinone as a hydrogen acceptor was demonstrated. Racemic 2-octanol

was converted to 2-octanone by Leifsonia alcohol dehydrogenase coupled to this NAD+-regenerating system.

ウマ肝臓アルコール脱水素酵素

―――基質および立体選択性

（東京理科大学大学院）竹村哲雄、○冨木藍、梅野伸彰、小川恭子、太田尚孝、（北里大学・理）

真崎康博、（東京大学・生物生産工学研究センター）野口治子、山根久和、野尻秀昭

ウマ肝臓アルコール脱水素酵素

状や環状のアルコールそして芳香族ケトンなどの

いえる。HLADH にはエタノールを基質とする

類があることが報告されている[1]

配置した構造をとる立体的にユニークな化合物である。トリプチセン誘導体は

利用が期待されている。2,6-bis(hydroxymethyl)triptycene

る酸化反応を行うと、収率約２０％、立体選択性約２０％

が得られた。市販の酵素は主として

ンなどの基質に対する反応性、望ましくは立体選択性が向上することを期待して、Ｓ型酵素

合成上の有用性を調べる。

S 型酵素を取得するために、初めに生のウマ肝臓から

Gateway Technology を利用して発現用ベクターに挿入し、

行った。さらに可溶性画分での発現量を増やすために、分子シャペロンを用いて発現を試みた。そ

の結果、異なる発現用ベクターを用いたいくつかの系において、

れらの系で発現させた S 型酵素をアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト

ーを行って精製し、精製標品を作製した。

現在、上記の方法で得られた酵素を用いて、トリプチセン誘導体をはじめとする様々な有機化合

物に対する活性を調べているところである。

[1] Doo-Hong Park and Bryce V. Plapp,

13296-13302, 1991.

1

P32 ウマ肝臓アルコール脱水素酵素によるトリプチセンの酸化還元

基質および立体選択性に及ぼすアイソザイムの影響―――


（東京大学・生物生産工学研究センター）野口治子、山根久和、野尻秀昭

ウマ肝臓アルコール脱水素酵素(HLADH)は古くから研究されている酵素であり、

芳香族ケトンなどの、様々な基質を変換する基質特異性の広い酵素と

にはエタノールを基質とする E 型酵素とステロイドを基質とする

[1]。トリプチセンは、三個のベンゼン環が三枚羽根の歯車のように

立体的にユニークな化合物である。トリプチセン誘導体は

bis(hydroxymethyl)triptycene（１１１１）を基質として、市販の

収率約２０％、立体選択性約２０％ee で酸化体 2,6-bis(formyl)triptycene

が得られた。市販の酵素は主としてＥ型酵素であると考えられる。そこで本研究では、

反応性、望ましくは立体選択性が向上することを期待して、Ｓ型酵素

型酵素を取得するために、初めに生のウマ肝臓から S 型酵素の DNA を抽出し、その遺伝子を

発現用ベクターに挿入し、大腸菌を形質転換し、発現条件の検討を


の結果、異なる発現用ベクターを用いたいくつかの系において、S 型酵素の発現が確認できた。そ

型酵素をアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト

ーを行って精製し、精製標品を作製した。


物に対する活性を調べているところである。

Plapp, Journal of Biological Chemistry, Vol. 266, No. 20, pp.

2

によるトリプチセンの酸化還元

の影響―――


（東京大学・生物生産工学研究センター）野口治子、山根久和、野尻秀昭

は古くから研究されている酵素であり、比較的大きな鎖

基質特異性の広い酵素と

型酵素とステロイドを基質とする S 型酵素の二種

トリプチセンは、三個のベンゼン環が三枚羽根の歯車のように

立体的にユニークな化合物である。トリプチセン誘導体は機能性材料としての

を基質として、市販の HLADH によ

bis(formyl)triptycene（２２２２）

型酵素であると考えられる。そこで本研究では、トリプチセ

反応性、望ましくは立体選択性が向上することを期待して、Ｓ型酵素の有機

を抽出し、その遺伝子を

大腸菌を形質転換し、発現条件の検討を


型酵素の発現が確認できた。そ

型酵素をアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ


Vol. 266, No. 20, pp.

Oxido-reduction of Triptycenes by Horse Liver Alcohol Dehydrogenase

―――――――― Effect of Isozymes on Substrate- and Stereo-selectivity ――――――――

Tetsuo Takemura1, *Ai Tomiki

1, Nobuaki Umeno

1, Kyoko Ogawa

1, Hisataka Ohta

1,

Yasuhiro Mazaki2, Haruko Noguchi

3, Hisakazu Yamane

3, Hideaki Nojiri

3

1Faculty of Science, Tokyo University of Science,

1-3, Kagurazaka, Shinjuku-ku, Tokyo, 162-8601, Japan.

E-mail: [email protected] 2School of Science, Kitasato University,

3Biotechnology Research Center, University of Tokyo

S-isozyme gene of Horse Liver Alcohol Dehydrogenase (HLADH) effective for oxido-reduction of

triptycenes was overexpressed in E.coli in the expectation of improving both substratespecificity

and hopefully stereoselectivity of the enzyme.

イチジクのイチジクのイチジクのイチジクの生産する生産する生産する生産するゴムゴムゴムゴムの生合成の生合成の生合成の生合成機構解析機構解析機構解析機構解析

○張雯、大谷典正

山形大学大学院理工学研究科

天然ゴムはゴムノキの樹液に含まれるシス-ポリイソプレン [(C5H8)n] を主成分とする物質であり、

生体内で生成したものである。樹液中では水溶液に有機成分が分散したラテックスとして存在する。

2000 種類以上の植物がゴムを生産する中で、収率の高さと優れた物性から航空機やトラックなど過酷な

条件下で使用される唯一の材料は Heveaゴムである。さらに、環境問題に関して天然ゴムは合成ゴムと

違い生分解性があるので、近年、天然ゴムは石油資源に頼らないエコ材料として注目を集めている。し

かし、Hevea ゴムには栽培地の限定や、全人口の７％に関わるアレルギー問題や、農作物の単一種依存

や、分岐構造が複雑などの問題点を持っている。

これらの問題点で、新しい代替ゴム資源が必要となる。それで、本実験では、Heveaゴムと同様にラ

テックス状でゴムを産出し、日本国内で育つことができるイチジクをゴム生産植物として注目し、分子

量調節機構を解明するため合成酵素及び分岐生成機構について遺伝子工学（ゴム合成酵素のクローニン

グ）および分子構造解析を目的にする。

山形大学校内で新鮮なイチジクを取り、枝及びラテックスからRNAを抽出、精製し、これを鋳型とし

て、cDNAへ逆転写した。その後、相同性検索より設計したプライマーを用いてDNA断片を得るためのPCR

を行った。増幅したDNA断片を切り出し、精製し、pGEM®-T Easy Vector に組み込み、JM109に形質転換

した。そして、ブルーホワイトセレクションとコロニーPCRによりスクリーニングし、目的コロニーか

らプラスミドを抽出した。DNAシークエンシングにより塩基配列を決定し、他の生物のゴム合成酵素と

相同性検索を行った。その後、一部分の塩基配列が明らかになっているところ、その配列から遺伝子特

異的なプライマーを作製し、PCRにより残りの3’もしくは5’末端側の未知配列を含むDNA断片を増幅する

3’-RACE及び 5’-RACEを行った。その中、 3’-RACEの結果は図１のように示した。 Hevea由来

cis-prenyltransferaseのアミノ酸配列と比較すると、相当高い相同性が見られたので、得られた断片

はイチジク由来cis-prenyltransferase（イチジクのゴム合成酵素）の一部分と推測した。

図１、イチジク（3’末端）とHevea由来cis-prenyltransferaseのアミノ酸配列の相同性比較

一方、イチジクゴムの分子構造について、イチジクからゴムを抽出し、ゴム分子量を測った。そして、

イチジクの各部分（実、葉、茎、幹）からラテックスを採集し、それぞれの粒径について検討した。続

いて、イチジクの各部分由来ラテックスのイソペンテニル二リン酸（IPP）取り込み活性測定実験を行

ったので、あわせて報告する。

P33

Biosynthesis mechanism of rubber from Fig tree

○ZHANG Wen and OHYA Norimasa,

Department of Biological and Material Chemistry, Faculty of Science,

Yamagata University, Yamagata 990-8560, Japan

Over 2,000 species of higher plants produce natural rubber. Now, virtually almost all the

commercial natural rubber is obtained from Hevea brasiliensis due to its high productivity of the plant

and excellent physical properties of Hevea rubber. However, Hevea rubber has some problems such

as an allergic problem, the single kind dependence of farm products and the complicated divergence

structure etc. An alternative rubber source is necessary. Therefore, this study is attempted to provide

new information on the structure of natural rubber from Fig tree which make rubber in latex like Hevea

rubber, and can be grown in Japan. To elucidate molecular weight adjustment mechanism, we have

been analyzing of the molecular structure and cloning of the cis-prenyltransferas of the Fig tree.

マイクロ波照射によって温度制御された微生物培養

（1九工大院・生命体工，2九工大院・情報工）

○栄田尚寿 1，白川泰裕 1，西依祐太 2，吉村武朗 2，大内将吉*1,2

マイクロ波照射によって，多くの有機化学反応について反応時間の大幅な短縮や収率の向上が達

成されてきた。我々は，種種の生体触媒反応にマイクロ波加熱を用い，その効果を明らかにしてき

た。この研究では，微生物にマイクロ波を照射し，微生物培養に与える影響を調べた。従来法の熱

源である恒温槽の代わりにマイクロ波加熱を用い，培養した微生物の増殖度と発現した蛋白質を従

来法と比べた。

培養には，Escherichia coli JM109 を用いた。マイクロ波装置として家庭用電子レンジ（700 W）

を用いた。その際，変圧器によりマイクロ波装置の出力を下げた。培養容器はガラス管を用い，LB

培地 70 ml で培養した。振盪するかわりにエアーポンプで空気を送りこみ，好気的条件の下で培養

した。培養温度は 37℃に設定し，12 時間培養した。

サンプリングを 1 時間ごとにおこない，菌体濃度を吸光度（OD600）によって測定し従来法と比較

した。マイクロ波培養と従来法の菌体濃度には違いは見られなかった。また，培養した大腸菌 JM109

株を超音波破砕し，遠心して得た上清を二次元プロファイリングし，発現蛋白質を比較した。その

結果，マイクロ波加熱を用いて培養した大腸菌では，従来法よりも多量に発現している蛋白質を確

認した。また，栄養価の少ない培地を用いた培養に対してもマイクロ波加熱を用い，マイクロ波の

影響を検討した。

エアーポンプ

サンプリング

チューブ

Fig. 1. マイクロ波培養装置

P34

Temperature Controlled Microbial Cultivation by Microwave Irradiation

Naohisa Sakaeda1, Yasuhiro Shirakawa

1, Yuta Nishiyori

2, Takeo Yoshimura

2, Shokichi Ohuchi＊

1,2

1Graduate School of Life Science and Systems Engineering, Kyushu Institute of Technology,

680-4, kawatsu, iidsuka, Fukuoka, Japan, E-mail: [email protected] 2Graduate School of Computer Science and Systems Engineering, Kyushu Institute of Technology

In this study, we investigated the influence of microorganism cultivation under microwave

irradiation.

加水分解酵素に対するマイクロ波照射の効果

（1 九工大院・生命体工，２九工大院・情報工）○鳥打祐太 1，木本征吾 1，松尾聡子 1，大内将吉*1,2

最近，生体触媒反応でもマイクロ波照射が反応促進や選択性の向上などの効果が明らかにされてきた。

マイクロ波の効果がどのような分子メカニズムを与えているかについては，様々な議論がなされている

状況にある。その一つとして沸点を超えて溶媒が温まるスーパーヒーティングである。また，温度に依

存せず反応が促進される効果があるとの考え方もある。たとえば，超高熱性酵素において活性化する温

度より低い条件でもマイクロ波照射により活性化した例があり，微視的に考えたときに測定温度は従来

法と変わらないが酵素表面の溶媒だけがバルクより高い温度となり反応促進するとの理由付けがなさ

れている。しかしながら，いずれもそれらを証明する直接的な実験結果が示されているわけではない。

この研究では，加水分解酵素であるリパーゼやアミラーゼによる生体触媒反応にマイクロ波を照射して，

その効果を検証し，マイクロ波照射の生体触媒反応への分子メカニズムの解明を目指した。

デンプン 0.1%溶液中(6 ml)に aspergillus oryzae 由来のα−アミラーゼ(60 µl)を加え，一定速度で攪拌し

ながら出力 13 W のマイクロ波を照射し，反応温度を 37˚C に制御して加水分解反応を進行させた。マイ

クロ波装置にはシングルモード(IDX グリーンモチーフ Ib)を用い，温度の誤差は±1˚C 以内であった。

デンプンが加水分解して得られる還元糖の量を DNS 試薬により定量することで，還元糖量の経時変化

を追った。さらに，基質濃度を変えて反応速度を調べた。

マイクロ波照射，およびウォーターバス加熱におけるアミラーゼによるデンプンの加水分解反応の経

時変化を Fig. 1 に示す。今回の反応では，同等の速度で加水分解反応が進み，マイクロ波照射による反

応促進効果は充分に確認できなかった。また，温度を変化させて反応初速度をプロットしたが，いずれ

の基質濃度においても反応速度の違いはみられなかった(Fig. 2)。これまでのリパーゼによる加水分解反

応では約 1.3 倍の反応促進効果が確認されていた。その実験で用いた基質の分子量は 200 程度であった

のに対し，今回基質として用いたデンプンの平均分子量は約 3000 であった。分子量が大きいほどマイ

クロ波の影響を受けにくくなるため，反応促進効果が得られなかったと考えられる。酵素（タンパク質）

の立体構造として，αへリックスのダイポールとマイクロ波照射の関連性が示唆されていることから，

これらの効果を考慮する必要がある。

0

0.5

1

1.5

2

0 20 40 60

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 0.05 0.1 0.15

Fig. 1. デンプンの加水分解反応の経時変化 Fig. 2. 各基質濃度における反応速度の比較

Reaciton time (min) Substrate concentration (mM)

Rea

ctio

n r

ate

(mM

/min

)

Co

nce

ntr

atio

n (

mM

)

● Conventional

■ Microwave

● Conventional

■ Microwave

P35

Effect of Microwave Irradiation for Hydorolytic Enzymes

Yuta Toriuchi1, Seigo Kimoto

1, Satoko Matsuo

1, and Shokichi Ohuchi*

1,2

1Graduate School of Life Science and Systems Engineering, Kyushu Institute of Technology,

680-4, kawatsu, iidsuka, Fukuoka, Japan, E-mail: [email protected] 2Graduate School of Computer Science and Systems Engineering, Kyushu Institute of

Technology

The effect of the microwave irradiation for enzymatic reaction was investigated to demonstrate the

molecular mechanism of the microwave effect.

酵素反応に及ぼすマイクロ波の効果

(長浜バイオ大学,村田製作所次世代技術研*)河合靖○中田康介,神波誠冶*,近藤孝志*

[[[[緒言緒言緒言緒言]]]]

医薬・農薬・香料分野には立体構造の違いにより生理活性が異なる光学異性体が存在するため、目的

の異性体のみを合成する方法が必要になる。その手段の一つとして、酵素反応による不斉合成がある。

しかし立体選択性や反応率が十分とは言えず、効率化の必要がある。

現在、酵素反応に対するマイクロ波の研究が進められているが、マイクロ波の立体選択性や反応率に

及ぼす影響はまだ明らかになっていない。そこで本研究では酵素反応中にマイクロ波を照射し、立体選

択性や反応率に及ぼす影響を研究し、マイクロ波の酵素反応への利用につなげることを目標にする。さ

らには不斉合成の効率化にもつなげることができると期待できる。

[[[[実験・結果実験・結果実験・結果実験・結果]]]]

極性な分子にマイクロ波を照射すると、誘電損失が起こり発熱する。このことから基質に極性な分子

を用いると、マイクロ波照射時と非照射時の立体選択性や反応率に差が生じ、この差からマイクロ波が

及ぼす影響を観測できると考えた。さらに極性の異なる基質をいくつか選択し比較することで、マイク

ロ波の影響がより顕著になると考えた。

基質には極性の異なるピリジルエタノール、1-フェニルエタノールを選択した(Scheme 1Scheme 1Scheme 1Scheme 1)。これらを

用いた理由は、極性が異なる、不斉炭素がある、構造が似ているという点が挙げられる。これらの理由

は基質に不斉炭素を持つ分子を用いて、ラセミ体の光学分割を行うことで立体選択性の議論をすること

ができるという点と、構造が大きく異なるとマイクロ波の影響が極性の違いによるものなのかがわから

ないという点が挙げられる。またこれらの基質の極性を log P で比較すると 3333、1111 の順に親水性が高くな

る。溶媒にはヘキサンを用いた。マイクロ波照射下では水などの極性溶媒を用いると、すぐに溶媒の温

度が上がり酵素が失活する可能性があるので、無極性溶媒を用いて温度上昇を防ぐためにヘキサンを用

いた。溶媒に有機溶媒を用いるため、脂肪を加水分解する酵素であり、疎水性の有機溶媒中でも活性が

あると知られているリパーゼを用いることにした。またリパーゼは有機溶媒中ではエステル交換反応を

することから、酢酸ビニルを用いてエステル交換反応を行うことにした。酢酸ビニルを用いた理由とし

ては、逆反応を防ぎ正確な反応率を求めるためである。

マイクロ波照射時と非照射時の立体選択性や反応率を比較すると基質の極性が大きくなるにつれ、立

体選択性が上がり、反応率が下がる傾向があることが分かった。基質の極性の大きさによってマイクロ

波の影響に差があることから、マイクロ波が基質に影響を及ぼしていることが示唆される。

1111,2222:R= 3333,4444:R=

SSSScheme 1cheme 1cheme 1cheme 1 2 級アルコールのアセチル化

N

1,31,31,31,3 2,42,42,42,4

CH3

OH

R O

O

hexane

lipase

R CH3

OH

R CH3

O CH3

O

P36

Effect of microwave irradiation on enzymatic reaction

Yasushi Kawai, *Kosuke Nakata, Seiji Kamba1, Takashi Kondo

1

Nagahama Institute of Bio-Science and Technology

Nagahama, Shiga 526-0829, Japan. 1Murata Manufacturing Company, Ltd. Research Center for Next Generation Technology

E-mail: [email protected]

Stereoselectivity of lipase-catalyzed optical resolution was improved under microwave irradiation

conditions, where the selectivity varied depending on the substrate polarity.

1111,2222:R= 3333,4444:R=

SSSScheme 1cheme 1cheme 1cheme 1 acetylation of secondary alcohol

N

1,31,31,31,3 2,42,42,42,4

CH3

OH

R O

O

hexane

lipase

R CH3

OH

R CH3

O CH3

O

Lipase-catalyzed acylation

n-C8H17

OO

O

O

O

CF3

n-C8H17 O

O

O

O

O

CF3

CF3

OH

1

(±)-1

Ar=

(±)-2

Lipase-catalyzed hydrolysis

LC

n

n

Ar

BnOn

CF3

OAcBnO

n CF3

OHBnO

n

High reaction rate,but moderate % ee

High % ee, but poor reaction rate

イオン液体溶媒を用いた光学活性トリフルオロメチルアルカノールの合成にイオン液体溶媒を用いた光学活性トリフルオロメチルアルカノールの合成にイオン液体溶媒を用いた光学活性トリフルオロメチルアルカノールの合成にイオン液体溶媒を用いた光学活性トリフルオロメチルアルカノールの合成に

おける緩衝液の添加効果おける緩衝液の添加効果おける緩衝液の添加効果おける緩衝液の添加効果

（香川大教育）高木由美子，○石原弘章，伊賀達哉，小川勤，

（鳥取大工）伊藤敏幸

1. トリフルオロメチル基を有する２量体型の液晶材料は反強誘電性液晶のキラルドーパントとし

て優れていることが楠本らによって報告されている。1)一般に良好な性質を有する液晶の設計では

分子の一部にある程度リジッドな骨格を導入するとよいと言われており、反強誘電性液晶の素材と

して有望な分子の中間に芳香族官能基を持つ新しいタイプの２量体型液晶材料へ変換可能なビス

トリフルオロメチルアルカンジオールの合成を検討した(Scheme 1)。

2．入手容易なアルカンジオールから 6step でラセミ体の 1,1,1-トリフルオロ７-ベンジロキシ-２-

ヘプタノール（1）を合成した。2,3）Candida anterctica リパーゼを用いてリン酸緩衝液(pH7.2)とアセ

トン（10:1）混合溶媒中で撹拌し、加水分解を行ったところ、E>200 という実用的に十分なエナン

チオ選択性で光学活性トリフルオロメチルアルカノールを得ることができた。さらに種々のイオン

液体を溶媒に用い，系内に緩衝液などを添加すると，効率よく光学分割が進行し目的の光学活性体

を効率よく獲ることができた。その詳細について述べる。

References

1） T. Kusumoto et al. Chem. Lett. 1995199519951995 , 719. 2） (a)T. Itoh et al., J. Org. Chem. 1996,1996,1996,1996, 61, 2332. (b)T. Itoh et al. Tetrahedron Lett. 1996199619961996, 37, 5001.

3) Y. Takagi et.al, Tetrahedron Asym: 2004200420042004, 15, 2591.

P37

The Additive Effect of a Phosphate Buffer as CoThe Additive Effect of a Phosphate Buffer as CoThe Additive Effect of a Phosphate Buffer as CoThe Additive Effect of a Phosphate Buffer as Co----solvent for the Efficient Kinetic Resolution of solvent for the Efficient Kinetic Resolution of solvent for the Efficient Kinetic Resolution of solvent for the Efficient Kinetic Resolution of

1,11,11,11,1,1,1,1,1----TrifluoroTrifluoroTrifluoroTrifluoro----2222----alkanol by Lipasealkanol by Lipasealkanol by Lipasealkanol by Lipase----catalyzed Reaction in an Ionic Liquid Solvent Systemcatalyzed Reaction in an Ionic Liquid Solvent Systemcatalyzed Reaction in an Ionic Liquid Solvent Systemcatalyzed Reaction in an Ionic Liquid Solvent System

Yumiko Takagi*, Hiroaki Ishihara, Tsutomu Ogawa, Toshiyuki Itoh

Department of Chemistry, Faculty of Education, Kagawa University

1-1 Saiwai-Cho, Takamatsu 760-8522, Japan. E-mail: [email protected]

Investigated enantioselectivity in the enzymatic kinetic resolution of trifluoromethylalkanol

employing immobilized lipase from Candida antarctica results from the use of the ionic liquids

[bmim][PF6] and [bmim][TFSA] as reaction medium.

Chirazyme L-2(50wt%)

(±)-2a

CF3

OAcBnO

CF3

OAc

(R)-2a

BnOIL, 35°C, 1.5 h

CF3(S)-1a

BnO

OH

(1)

希少糖を用いた生理活性糖誘導体の合成研究希少糖を用いた生理活性糖誘導体の合成研究希少糖を用いた生理活性糖誘導体の合成研究希少糖を用いた生理活性糖誘導体の合成研究

（香川大教育）○入江亜希子，高橋理絵，宇根山絵美，高木由美子

1. 希少糖は，天然にごくわずかしか存在しない糖の総称であり，その中の一つである D-アロース

は L-ラムノースイソメラーゼを利用し，D-プシコースより合成することが，D-アロースは，活性酸

素の生成の抑制効果や，抗ガン作用，植物細胞の増殖抑制作用など様々な生理活性があることがわ

かってきている。また，我々は以前にフェロセンを含む糖誘導体の合成に成功し，それらが，抗マ

ラリア剤になることを見出している。1）そこで，今回，リパーゼ酵素反応を活用し，Ｄ−アロース

を用いて，キラルビルディングブロックとして期待できる生理活性糖誘導体の合成を行うことを計

画した。

2. リパーゼに代表される酵素触媒反応は、糖誘導体の位置選択的アシル化あるいは脱アシル化を

効率よく行うことが知られている。例えば，D-グルコースを基質に用い，反応条件を適切に選択す

れば位置選択的に目的の化合物が得られることが知られている。2,3）そこで，Candida rugosaある

いは Pseudomonas cepacia 由来の酵素を用い，1,2,3,4,6-ペンタ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシ

ドあるいは 1,2,3,4,6-ペンタ-O-アセチル-α-D-アロピラノシドを用いてリパーゼ加水分解反応を

種々検討した。その詳細について述べる。

Reference

[1] Itoh, T. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000200020002000, 10, 1657-1659.

[2] F. Ganske, U. T. Bornscheuer, Org. Lett. 2005200520052005, 7, 3097–3098.

[3] G. Fernández-Lorente, et al., Tetrahedron, 2003200320032003, 59, 5705–5711.

[4] Gotor, V., et al, Eur. J. Org. Chem.. 2002002002007777, 2769-2778.

O

OHOH

HO

OH

OH

O

AcOAcO

AcO

OAc

OAcO

BnOBnO

BnO

OBn

R

R=SPh, F,

O

NH

CCl3

O

AcOAcO

AcO

OAc

OAc

Lipase

P38

ChemoChemoChemoChemo----enzymatic enzymatic enzymatic enzymatic Synthesis of ESynthesis of ESynthesis of ESynthesis of Efficientfficientfficientfficient Chiral Building Blocks Using DChiral Building Blocks Using DChiral Building Blocks Using DChiral Building Blocks Using D----AlloseAlloseAlloseAllose

Akiko Irie, Rie Takahashi, Emi Uneyama, Yumiko Takagi

Department of Chemistry, Faculty of Education, Kagawa University,

Kagawa 760-8522, Japan, E-mail: [email protected]

Enzyme-catalyzed reactions have been successfully utilized in selective deacylation or

acylation of sugars and hence have provided an effective method of manipulating

protecting-group strategies in carbohydrate synthesis. We described to novel synthesis of

D-allose derivatives for efficient chiral building blocks using lipase technology.

OAcO

OAc

OAcOAc

OAcLipase

Phosphate Buffer / 1,4-Dioxane

OAcO

AcO

OAcOAc

OH

OHO

AcO

OAcOAc

OAcO

AcO

AcO

OHOAc

OAc

A B C

30°C,

光学活性トリフルオロメチルアルカノールの合成研究光学活性トリフルオロメチルアルカノールの合成研究光学活性トリフルオロメチルアルカノールの合成研究光学活性トリフルオロメチルアルカノールの合成研究

（香川大教育）高木由美子，石原弘章，○伊賀達哉，小川勤

（鳥取大工）伊藤敏幸

1. 有機化合物中の水素原子の数個をフッ素原子に置換した化合物はしばしばユニークな生理活性

を有することから医薬・農薬の分野で幅広く活用されている。また，含フッ素エステル類は酵素阻

害剤などとして知られている。また，現在では，含フッ素エステルは溶液の粘度を低下させるのに

効果があることから，リチウム二次電池用電解溶媒などの機能性材料への応用が期待されるている。1）従ってこれらの化合物の効率的な合成法が求められている。

2．我々の研究室では液晶分子合成に活用すべく光学活性トリフルオロメチルアルコールの合成研

究を手がけてきた。2）1,1,1-トリフルオロ７-ベンジロキシ-２-ヘプタノール（1）の光学分割反応は、

酢酸エチルによる抽出を行う必要がある。アルコールの不斉アシル化の場合は，抽出は不要である

が，3 は求核性が低くアシル化速度が極めて遅く，加水分解反応でないと，反応が効率的に進行し

ない。そこで，この系にイオン液体を用いて研究を行うことにした。その結果，反応は良好な結果

で進行することがわかり，しかも，緩衝液は加水分解のためだけにごくわずかしか使用していない

ため，反応終了時には抽出操作が不要で通常の溶媒の乾燥の操作だけでよいことがわかった。そこ

で原料合成の効率化などからの簡便な合成法についてまで検討した。その詳細について述べる。

References

1) T. Fuchigami ”Organic Electrochemistry. 4th Ed. ” Ed. Lund. H.; Hammery O. Mercel Dekker, 2001.

2) Y. Takagi et.al, Tetrahedron Asym: 2004200420042004, 15, 2591.

CF3

OAcO

Lipase

Buffer pH7.2

Buffer or IL

CF3OOH

CF3OOAc

2 2 2

Chirazyme1.5h

Entry conv.% %ee of 3 E

1

2

3

36

30

44

57

59

58

296

427

258

Solvent

Buffer pH6.5

1 2 3

%ee of 2

99

99

99

40 53 >200099.9IL-4 + pH7.2(1.5eq)

+

Buffer pH5.8

29 39 6696[bmim][PF6]+ H2O(1.5eq)4

5

P39

Simple preparation of optically active fluorinated Simple preparation of optically active fluorinated Simple preparation of optically active fluorinated Simple preparation of optically active fluorinated alcoholalcoholalcoholalcohol using lipaseusing lipaseusing lipaseusing lipase catalyzed Reactioncatalyzed Reactioncatalyzed Reactioncatalyzed Reaction

Yumiko Takagi*, Hiroaki Ishihara, Tatsuya Iga, Tsutomu Ogawa, Toshiyuki Itoh

Department of Chemistry, Faculty of Education, Kagawa University

1-1 Saiwai-Cho, Takamatsu 760-8522, Japan. E-mail: [email protected]

Preparation of optically pure trifluoromethylalkanols through lipase-catalyzed hydrolysis of

corresponding acetates has been demonstrated. Using optically active bis(trifluormethyl)

-alkanediols as starting materials, synthesis of novel dimer type AFCLs has been progressed.

Mesorhizobium loti 由来ケトース 3-エピメラーゼ遺伝子のクローニングと発現

(香川大希少糖セ)○上地敬子，高田悟郎，吉原明秀，森本兼司，何森健

【目的】

ケトース 3-エピメラーゼは、ケトース間の可逆的異性化反応を触媒する酵素である。我々が発見

した Pseudomonas chichorii 由来の D-タガトース 3-エピメラーゼは、天然に存在する単糖の D-フ

ルクトースから希少糖 D-プシコースを生産するための最も重要な酵素となっている。本研究では、

ミヤコグサ（Lotus japonicus）の根に共生する根粒菌 Mesorhizobium loti の、ゲノム上に存在す

る 3 種類の異なったケトース 3-エピメラーゼと類似した遺伝子をクローニングし、組換え酵素を作

らせて、その機能を明らかにすることを目的とする。

【方法・結果】

１、オーセンティックの酵素の発現について

M. loti を培養後集菌し、適当な緩衝液を用いて微生物反応を行った。基質には D-タガトースと

L-リブロースを用い、経時的に HPLC で生産物を調べたところ、エピメラーゼの活性が確認できた。

また、発現解析では 3種類の遺伝子すべてが転写されていた。

２、ケトース 3-エピメラーゼ類似遺伝子のクローニングと組換え酵素の生産について

3 種類の遺伝子をそれぞれクローニングし塩基配列の決定を行った。次に、それぞれの遺伝子を

発現ベクターに組込み、大腸菌を形質転換させて大量発現させた。その結果、1 種類の遺伝子のみ

が活性発現し、組換え酵素が得られたので、酵素を精製し諸性質を検討した。

３、新規酵素 L-リブロース 3-エピメラーゼの精製と諸性質の検討

活性発現した酵素は L-リブロースと L-キシルロース間の炭素第 3 位のエピ化反応を最もよく触

媒することがわかり、本酵素は新規の L-リブロース 3-エピメラーゼであることがわかった。本酵

素の諸性質は、反応の最適温度は 60℃、温度安定性は 70℃以下、反応の最適ｐＨはｐＨ８．０、

ｐＨ安定性はｐＨ７－９であった。L-リブロースに対する Km は 103mM、Kcat は 4.7×104min-1、

Kcat/Km は 456mM-1min-1、D-タガトースに対する Km は 92mM、Kcat は 1.1×104min-1、Kcat/Km は

120mM-1min-1と、L-リブロースに対する触媒活性が最も高いことがわかった。

４、L-リブロースから L-キシルロースの生産

出発物質となる L-リブロースはリビトールの微生物酸化により調製した。30％の L-リブロース

を基質に用いて、固定化した L-リブロース 3-エピメラーゼとバッチ方式で反応させたところ、L-

リブロースの 60%が L-キシルロースに転換し平衡に達した。生産物を精製し、機器分析により生産

物が L-キシルロースであることを確認した。

P40

Cloning and expression of ketose-3-3epimerase gene from Mesorhizobium loti

*Keiko Uechi, Goro Takata, Akihide Yoshihara, Kenji Morimoto, Ken Izumori

Kagawa University Rare Sugar Research Center, 2393 Ikenobe, Miki, Kagawa, 7610795, Japan.

E-mail: [email protected]

We succeeded cloning and expression of a new ketose-3-epimerase gene from Mesorhizobium loti,

which enzyme showed highest enzyme activity and catalytic effciency against L-ribulose, and

finally identified as L-ribulose-3-epimease.

The improvement of lipase’ function by application...

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