MINISTERUL EDUCAŢIEI UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA MEDICINĂ ȘI FARMACIE

ȘCOALA DOCTORALĂ ȘTIINȚE BIOMEDICALE

Domeniul de doctorat: BIOLOGIE

Florina MIERE (GROZA)

TEZĂ DE DOCTORAT

Conducător ştiinţific:

Prof. univ.dr. Simona Ioana VICAȘ

ORADEA

2021

2

MINISTERUL EDUCAŢIEI UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA MEDICINĂ ȘI FARMACIE

ȘCOALA DOCTORALĂ ȘTIINȚE BIOMEDICALE

Domeniul de doctorat: BIOLOGIE

Florina MIERE (GROZA)

TEZĂ DE DOCTORAT

STUDII CU PRIVIRE LA INCLUDEREA EXTRACTULUI DE STELLARIA MEDIA (L.)

VILL. ÎN DIFERITE SISTEME DE LIVRARE ȘI EVALUAREA IN VITRO A

POTENȚIALULUI DE ELIBERARE ÎN DIFERITE LICHIDE SIMULATE

Conducător ştiinţific:

Prof. univ.dr. Simona Ioana VICAȘ

ORADEA

2021

3

Cuprins

Listă abrevieri ........................................................................................................................................ 7

PARTEA I - STUDIU DE LITERATURĂ ....................................................................................... 12

CAPITOLUL I ..................................................................................................................................... 13

Matrici polimerice utilizate pentru înglobarea extractelor vegetale .............................................. 13

1.1 Introducere............................................................................................................................. 13

1.2 Clasificarea, formularea și caracterizarea hidrogelurilor ................................................. 14

1.3 Polimeri naturali. Derivați de polizaharide: Alginatul de sodiu ....................................... 15

1.4 Utilizari terapeutice ............................................................................................................... 17

1.5 Concluzii ................................................................................................................................. 19

CAPITOLUL II ................................................................................................................................... 20

Sisteme lipidice de includere a extractelor vegetale – Lipozomi ..................................................... 20

2.1 Introducere............................................................................................................................. 20

2.2 Avantajele și dezavantajele sistemelor lipidice de transport ............................................. 22

2.3 Proprietățile fizico-chimice ale lipozomilor ........................................................................ 23

2.4 Metode de formulare a sistemelor lipozomale .................................................................... 26

2.5 Caracterizarea lipozomilor sau a nanoparticulelor lipidice .............................................. 28

2.6 Stabilitatea veziculelor lipidice ............................................................................................. 31

2.7 Aplicații terapeutice pentru lipozomi sau pentru nanoparticulele lipidice ...................... 33

2.8 Concluzii ................................................................................................................................. 37

CAPITOLUL III ................................................................................................................................. 39

Compuși biologici activi prezenți în extractele vegetale .................................................................. 39

3.1 Introducere............................................................................................................................. 39

3.2 Compușii fenolici ................................................................................................................... 39

3.3 Compușii de tip saponozidic ................................................................................................. 43

3.4 Utilizarea plantei Stellaria media (L.) Vill. în tratamentul diferitelor afecțiuni .............. 44

3.5 Concluzii ................................................................................................................................. 46

PARTEA II - CONTRIBUŢII ORIGINALE .................................................................................... 47

CAPITOLUL IV .................................................................................................................................. 48

Descrierea morfologică a plantei Stellaria media (L.) Vill. .............................................................. 48

4.1. Introducere............................................................................................................................ 48

4.2. Obiective și plan experimental ............................................................................................ 49

4.3. Material și metode ................................................................................................................ 50

4.4. Rezultate și discuții ............................................................................................................... 51

4.5. Concluzii ................................................................................................................................ 55

CAPITOLUL V ................................................................................................................................... 56

4

Caracterizarea extractului de Stellaria media (L.) Vill. din punct de vedere al compușilor

bioactivi de tipul fenolilor, al capacității antioxidante și al activității antimicrobiene ................. 56

5.1 Introducere............................................................................................................................. 56

5.2. Obiective și plan experimental ............................................................................................ 60

5.3. Materiale și metode .............................................................................................................. 60

5.3.1. Materialul vegetal și determinarea conținutului în apă a plantei Stellaria media (L.)

Vill. ................................................................................................................................................ 60

5.3.2. Obținerea extractului hidroalcoolic din planta Stellaria media (L.) Vill. ..................... 61

5.3.3 Caracterizarea extractului din punct de vedere al compușilor bioactivi, a capacității

antioxidante și activității antimicrobiene .................................................................................. 63

5.3.3.1. Aparatura și condițiile cromatografice pentru analiza fenolilor din extractul

de Stellaria media (L.) Vill .......................................................................................................... 63

5.3.3.2 Determinarea spectrofotometrică a conținutului total de fenoli prin metoda Folin-

Ciocâlteu ....................................................................................................................................... 64

5.3.3.3 Determinarea conținutului total de flavonoide ............................................................. 67

5.3.3.4 Metoda DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl method) .............................................. 68

5.3.2.5 Metoda TEAC (Trolox Equivalents Antioxidant Capacity) ........................................ 69

5.3.3.6 Metoda FRAP (Ferric reducing ability of plasma) ....................................................... 70

5.3.3.7 Metoda CUPRAC (Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity) ............................... 72

5.3.3.8 Activitatea antimicrobiană a extractului din planta Stellaria media (L.) Vill. prin

metoda difuziei ............................................................................................................................. 73

5.4. Rezultate și discuții ............................................................................................................... 75

5.4.1. Conținutul în apă din planta Stellaria media (L.) Vill. ................................................... 75

5.4.2 Identificarea calitativă prin HPLC a compușilor fenolici din Stellaria media (L.) Vill.76

5.4.3. Conținutul în compuși bioactivi (fenoli și flavonoide totale) din extractul de Stellaria

media (L.) Vill. ............................................................................................................................. 77

5.4.4. Capacitatea antioxidantă a extractului de Stellaria media (L.)Vill. .............................. 78

5.4.5 Rezultate activitatea antimicrobiană a extractului obținut din planta Stellaria media

(L.) Vill. ........................................................................................................................................ 79

5.5. Concluzii ................................................................................................................................ 82

5.6 Diseminarea rezultatelor....................................................................................................... 84

CAPITOLUL VI .................................................................................................................................. 85

Aplicarea in vitro a extractului SMO obținut din planta Stellaria media (L.) Vill. pe culturi

celulare de tipul NHDF-Normal Human Dermal Fibroblasts ......................................................... 85

6.1. Introducere............................................................................................................................ 85

6.2. Obiective și plan experimental ............................................................................................ 86

6.3. Materiale și metode .............................................................................................................. 87

6.4. Rezultate și discuții ............................................................................................................. 101

5

6.5 Concluzii ............................................................................................................................... 151

CAPITOLUL VII .............................................................................................................................. 152

Includerea extractului din planta Stellaria media (L.) Vill. în structuri polimerice de tipul

alginatului de sodiu prin 3 metode diferite și testarea in vitro a eliberării acestuia în fluide

simulate .............................................................................................................................................. 152

7.1 Introducere........................................................................................................................... 152

7.2 Obiective și plan experimental ........................................................................................... 153

7.3 Materiale și metode ............................................................................................................. 154

7.3.1 Formularea microcapsulelor din alginat de sodiu cu extract din Stellaria media (L.)

Vill. inclus ................................................................................................................................... 154

7.3.1.1 Metoda I de obținere a microcapsulelor de alginat de sodiu cu extract SMO inclus.

..................................................................................................................................................... 155

7.3.1.2 Metoda II de obținere a microcapsulelor de alginat de sodiu cu extract SMO inclus.

..................................................................................................................................................... 156

7.3.1.3 Metoda III de obținere a microcapsulelor de alginat de sodiu cu extract SMO inclus.

..................................................................................................................................................... 157

7.3.2 Caracterizarea microcapsulelor de alginat de sodiu prin metode optice diferite ....... 158

7.3.2.1 Microscopia electronică de scanare (SEM) ................................................................. 158

7.3.2.2 Microscopia prin scanare cu CanonCanoScan 9000F ................................................ 158

7.3.3 Determinarea eficienței de includere (EI%) .................................................................. 158

7.3.4 Determinarea in vitro a eliberării extractului SMO din microcapsulele de alginat de

sodiu în fluidele gastric și intestinal simulate .......................................................................... 159

7.3.5 Interpretarea statistică a rezultatelor obținute pentru testarea in vitro a eliberării

extractului din microcapsulele de alginat de sodiu în fluide simulate .................................. 159

7.4 Rezultate și discuții .............................................................................................................. 160

7.4.1 Rezultate microscopie SEM și scanare cu aparatul Canon CanoScan 9000F ............ 161

7.4.2 Rezultatele eficienței de includere (EI%) ....................................................................... 165

7.4.3 Interpretarea statistică a rezultatelor obținute prin testarea eliberării in vitro a

extractului SMO din microcapsule de alginat de sodiu ......................................................... 165

7.5 Concluzii ............................................................................................................................... 170

7.6 Diseminarea rezultatelor..................................................................................................... 170

CAPITOLUL VIII ............................................................................................................................. 171

Includerea extractului de Stellaria media (L.) Vill. în lipozomi..................................................... 171

8.1 Introducere........................................................................................................................... 171

8.2 Obiective și plan experimental ........................................................................................... 172

8.3 Materiale și metode ............................................................................................................. 173

8.3.1 Prepararea lipozomilor .................................................................................................... 174

S-au preparat două tipuri de lipozomi utilizând fosfolipide diferite: ................................... 174

6

8.3.1.1 Prepararea lipozomilor de tip PC și PS ....................................................................... 174

8.3.1.2 Prepararea lipozomilor de tip PCE și PSE ................................................................. 176

8.3.3 Caracterizarea lipozomilor obținuți ............................................................................... 176

8.3.4 Determinarea PDI (polydispersity index) și a potențialului Zeta ................................ 177

8.3.5 Determinarea eficienței de includere (EI%) a extractului SMO în cele două tipuri de

lipozomi ...................................................................................................................................... 177

8.4 Rezultate și discuții .............................................................................................................. 178

8.4.1 Caracterizarea lipozomilor prin microscopie optică ..................................................... 178

8.4.2 Determinarea dimensiunii lipozomilor și potențialului Zeta prin analiză DLS.......... 180

8.4.3 Eficiența de includere a extractului SMO în lipozomi .................................................. 183

8.5 Concluzii ............................................................................................................................... 183

8.6 Diseminarea rezultatelor..................................................................................................... 184

CONCLUZII GENERALE .............................................................................................................. 185

ORIGINALITATEA TEZEI ............................................................................................................ 187

PERSPECTIVE DE VIITOR ........................................................................................................... 188

BIBLIOGRAFIE: .............................................................................................................................. 189

7

Listă abrevieri

AFM- Microscopia cu forță atomic;

AGE- Acid galic echivalent;

ANOVA- Analysis OF Variance;

CAZ- Ceftazidină;

CIP- Ciprofloxacină;

CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute;

CTRL- Control pozitiv cu alantoină 50 µg/ml;

CTRL0- Control negativ;

CUPRAC- Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity;

Cx,y,z..- Concentrația de extract aplicată;

DLPC- Diluaril-fosfatidilcolină;

DLS- Dynamic light scattering;

DMPC- Dimiristoil-fosfatidilcolină;

DNR- Danorubicină;

DO- Doxorubicină;

DPPC- Dipalmitoil-fosfatidilcolină;

DPPH- 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl;

DSPC- Distearoil-fosfatidilcolină;

DXR- Doxorubicină;

EDTA- Acid etilen-diamino-tetra-acetic;

EI%- Eficiența de includere;

EUCAST- European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing;

F- Nitrofurantoin;

FOX- Oxacilină;

FRAP- Ferric reducing ability of plasma;

GN- Gentamicină;

GSH- Glutation;

GSSH- Glutation oxidat;

GUV- Vezicule gigant unilamelare;

HCA- Hierarchical Cluster Analysis;

HPLC- Cromatografie de lichide de înaltă performanță;

I - Fluid intestinal simulat;

IL- Interleukine;

8

Lp- O mărime cantitativă denumită norma Lp;

LUV-Vezicule mari unlamelare;

M1- Metoda 1 de formulare a microcapsulelor de alginat de sodiu cu extract inclus;

M2- Metoda 2 de formulare a microcapsulelor de alginat de sodiu cu extract inclus;

M3- Metoda 3 de formulare a microcapsulelor de alginat de sodiu cu extract inclus;

MANOVA– Multivariate Analysis OF Variance;

MLV- Vezicule multilamelare;

NHDF- Fibroblaste dermale umane normale;

NTU- Unitate de turbiditate nefelometrică;

P- Penicilină;

PC- Lipozomi cu Fosfatidilcolină;

PCA – Principle Component Analysis;

PCE- Lipozomi cu fosfatidilcolină și extract inclus;

PDI- Polydispersity index;

PG – Fosfatidilglicerol;

PS- Lipozomi cu fosfatidilserină;

PSE- Lipozomi cu fosfatidilserină și extract inclus;

QE- Quercetină echivalent;

S- Fluid gastric simulat;

SD- Deviația standard;

SEM- Microscopie electronică de scanare;

SMO- Planta/ Extract din planta Stellaria media (L.) Vill recoltată din zona Oradea;

SMV- Planta/Extract din planta Stellaria media (L.) Vill recoltată din zona Vadu Crișului;

SRO- Specii reactive de oxigen;

SUV- Vezicule mici unilamelare;

T0, 12, ...- Timpul la momentul 0, 12, etc...exprimat în ore;

Tc – Temperatură de tranziție;

TE- Trolox echivalent;

TEAC- Trolox Equivalents Antioxidant Capacity;

TEM- Microscopie electronică de transmisie;

9

Introducere

Remediile din chimicale nu vor avea niciodată întâietate în comparaţie cu produsele

naturii, cu celula vie a plantei, cu efectul final al razelor soarelui, mama întregii vieţi.-

Thomas Edison.

Pronind de la acest citat se poate afirma că încă din cele mai vechi timpuri s-a

cunoscut importanța utilizării remediilor din plante. Remediile din chimicale sunt utilizate în

îmbunătățirea stării de sănătate a pacienților cu anumite patologii însă produsele naturii nu

pot fi ignorate.

Compoziția chimică bogată în substanțe de interes terapeutic se regăsește aproape în

fiecare plantă existentă în lumea înconjurătoare însă pentru scoaterea în lumină a acestora este

necesară dedicarea pentru descoperire și studiu.

Această lucrare pune în prim plan planta Stellaria media (L.) Vill. plantă ce a stârnit

interes încă din anul 1825, inițial fiind numită Alsine media de către botanistul Linn.

Conform istoriei plantei în acelși an botanistul Velluso a schimbat numele plantei din

Alsine media în Stellaria media, urmând ca acest nume să fie modificat din nou în anul 1952

de către cercetătorul Mayer sub forma Stellaria media (L.) Vill., fiind adăugate numele

botaniștilor care au studiat această plantă.

Pe lângă interesul major asupra compoziției chimice și a efectelor terapeutice a

plantei Stellaria media (L.) Vill. teza descrie și testează două modalități de includere

extractului de Stellaria media (L.) Vill. bogat în compuși bioactivi de tipul fenolilor și

flavonoidelor.

În teza de doctorat, obiectivul principal a fost de a obține două forme de includere a

extractului din Stellaria media (L.) Vill. diferite din punct de vedere al compoziției. Astfel s-

au utilizat polimeri naturali de tipul alginatului de sodiu și vezicule lipidice (lipozomi)

utilizând fosfolipide diferite (fosfatidilcolina și fosfatidilserina).

Totodată după înglobarea în microcapsulele de alginat a extractului s-au realizat

studii cu privire la eficiența de includere dar și eliberarea in vitro în fluide simulate gastrice și

intestinale. În schimb în cazul includerii extractului în lipozomi, s-au urmarit aspectele cu

privire la dimensiunea, forma și eficiența de includere.

Avantajele includerii extractului în microcapsule polimerice sau în lipozomi sunt

multiple printre care se enumeră: eliberarea controlată, protejarea extractului de factori interni

ai organismului și de factori externi (de mediu), compatibilitate majoră cu organismul, efect

prompt, biodisponibilitate crescută, posibilitate de reducere a dozei terapeutice, etc.

10

Un alt obiectiv al tezei de doctorat a fost caracterizarea extractului de Stellaria media

(L.) Vill. din punct de vedere al conținutului total de fenoli și flavonoide, al capacitatății

antioxidante și al activității antimicrobiene.

Structura tezei

Teza de doctorat intitulată Studii cu privire la includerea extractului de Stellaria

media (L.) Vill. în diferite sisteme de livrare și evaluarea in vitro a potențialului de

eliberare în diferite lichide simulate este alcătuită din două părți: Partea I, care cuprinde date

din literatura recente cu privire la tema abordată și Partea II care conține contribuțiile

originale.

Partea I a tezei de doctorat este structurată în 3 capitole:

Capitolul I cuprinde date din literature de specialitate cu privire la matricele

polimerice naturale, punându-se accent pe caracterizarea și utilizarea acestora în vederea

obținerii unor microcapsule pe bază de alginat de sodiu. De asemenea în cadrul acestui capitol

sunt evidențiate utilizările terapeutice ale microcapsulelor formate din alginat de sodiu în care

s-au inclus diferite extracte sau substanțe active.

Capitolul II cuprinde informații referitoare la obținerea lipozomilor, avantajele,

dezavantajele acestora, precum și utilizările lor în terapie.

Capitolul III prezintă principalii compuși fitochimici care sunt prezenți în planta

Stellaria media (L.) Vill. dar și aspecte legate de utilizările terapeutice ale acestei plante.

Partea a II-a a lucrării este alcătuită din cinci capitole care cuprind rezultate

experimentale originale. Partea experimentală a tezei s-a efectuat în Laboratorul de Biochimie

și Research Laboratory of the Physicochemical Properties and Bioactive Characteristics of

Foodstuff (https://eeris.eu/ERIF-2000-000N-0444) din cadrul Facultății de Protecția Mediului

și în Cells Cultures Laboratory (http://eeris.eu/ERIF-2000-000X-0592) din cadrul

Universității din Oradea.

Primul capitol al contribuțiilor originale cuprinde informații referitoare la încadrarea

sistematică a plantei colectată din două zone diferite (Oradea și Vadu Crișului), structura

morfologică a plantei Stellaria media (L.) Vill. aceasta fiind descrisă în urma analizelor

macroscopice și microscopice.

Următorul capitol descrie metoda de obținere a extractului de Stellaria media (L.)

Vill. și prezintă rezultatele obținute în urma caracterizării acestuia cu privire la conținutul în

fenoli totali (determinat prin metoda Folin-Ciocâlteu), de flavonoide totale și a capacității

antioxidante determinate prin patru metode cu principii diferite (DPPH, FRAP, TEAC,

CUPRAC). De asemenea a fost investigată și capacitatea antimicrobiană a extractului de

11

Stellaria media (L.) Vill. asupra unei bacterii gram pozitive (Staphyilococus aureus) și a unei

bacterii gram negative (Escherichia coli).

În capitolul următor au fost prezentate rezultatele obținute în cazul testării extractul

de Stellaria media (L.)Vill. pe NHDF-fibroblaste dermale umane cu scopul de a urmări viteza

de migrare a celulelor într-un interval de timp bine determinat în vederea acoperirii

”zgârieturii” simulate prin efectuarea testului ”scratch”.

Capitolul VII cuprinde rezultatele obținute cu privire la includerea extractului din

Stellaria media (L.) Vill. în matrice polimerică de tipul alginatului de sodiu în prezența

soluției de clorură de calciu (4%) prin trei metode diferite.

Sunt comparate trei metode de includere în matricea de alginat din punct de vedere al

eficienței de includere, al aspectului microscopic și al eliberării in vitro în lichide simulate.

Capitolul VIII descrie un alt tip de sistem de includere a extractului din Stellaria

media (L.) Vill., veziculele lipidice numite lipozomi. Obținerea lipozomilor care au inclus

extractul de Stellaria media (L.) Vill. s-a realizat prin metoda hidratării filmului lipidic

utilizând diferite fosfolipide.

În acest capitol s-a evidențiat care formulare a lipozomilor este mai avantajoasă

acestea fiind comparate din punct de vedere al dimensiunii, formei, eficienței de includere și a

încărcării electrice de suprafață (potențial Zeta).

Teza de doctorat se încheie prin prezentarea celor mai importante concluzii rezultate

în urma studiilor realizate și a perspectivelor de viitor.

12

PARTEA I - STUDIU DE LITERATURĂ

13

CAPITOLUL I

Matrici polimerice utilizate pentru înglobarea extractelor vegetale

1.1 Introducere

În ultimii ani se poate observa o crestere majoră a interesului față de compușii

biologici naturali precum polimerii naturali. Acest lucru se poate demonstra printr-o simplă

căutare pe site-uri precum Pubmed utilizand cuvinte cheie precum naural, polimer sau

matrice polimerică (Dintcheva și colab., 2020).

Conform căutarilor recente numai în anul 2019 s-au publicat peste 1400 articole ce

au ca temă compușii naturali de tipul polimerilor, implicațiile lor în diferite domenii sau

utilizarea lor pentru îmbunătățirea stării de sănătate în diferite patologii (Dintcheva și colab.,

2020).

Polimerii naturali au ca avantaj principal compatibilitatea perfectă cu organismul

uman (Catoria și colab., 2019). Având acest important avantaj polimerii de diferite tipuri se

pot utiliza în patologii și în domenii diferite precum: biologie, medicină, farmacie, agricultură,

tehnologie alimentară. Datorită compatibilității majore cu organismul uman aceste materiale

polimerice se mai pot numi și biomateriale.

Biomaterialele pot fi definite ca fiind orice substanță sau combinație de substanțe

sintetice sau naturale și care pot fi utilizate pe o durată bine determinată de timp având scopul

de a trata, vindeca sau de a înlocui anumite părți ale organismului uman (Catoria și colab.,

2019).

De asemenea, biomaterialele mai pot fi definite ca substanțe care au capacitatea de a

reacționa cu țesutul organismului uman sau cu sistemele biologice îmbunătațind astfel starea

de sănătate a organismului (Catoria și colab., 2019).

Se pot aminti următorii polimeri naturali utilizati până în prezent: chitosanul,

alginatul, celuloza, amidonul, gelatina, colagenul, fibrina, etc. Aceștia pot fi utilizati ca

sisteme de vehiculare a substanțelor medicamentoase sau a extractelor vegetale care conțin

compuși de interes terapeutic (Catoria și colab., 2019, Vieira și colab., 2017).

În funcție de structura acestor biomateriale acestea pot fi numite și retele 3D sau

hidrogeluri tridimensionale datorită formării de geluri în contact cu apa.

Structura de gel se formează numai în contact cu apa și se poate obține atât din

polimeri naturali cât și din polimeri sintetici sau pot exista rețele tridimensionale prin

înglobarea moleculelor de apă de către amestecuri de polimeri naturali și sintetici, acestia din

14

urmă fiind mai utilizați deoarece polimerii naturali sunt mai greu de controlat dar și cu

proprietăți mecanice mai limitate (Ching și colab., 2017).

Hidrogelurile se formează datorită abilității de a reține molecule de apă în rețeaua

tridimensională ce se datorează caracterului hidrofil al acesteia.

Aceste sisteme reticulare pot fi atât naturale cât și sintetice în funcție de polimerul

utilizat și prezintă proprietăți precum: similitudinea cu tesuturile moi ale organismului,

capacitatea de a îngloba în rețeaua tridimensională molecule de natură hidrofilă precum

diferite extracte sau substanțe medicamentoase (Dhamecha și colab., 2019).

Din aceste considerente indiferent de natura polimerilor utilizați există o foarte mare

deschidere spre această categorie de structuri pentru posibilitatea de utilizare în scop medical

(Francis și colab., 2018).

1.2 Clasificarea, formularea și caracterizarea hidrogelurilor

Pentru formularea hidrogelului se utilizeaza polimeri naturali sau sitetici sau se

combina cele două categorii și se pun în contact cu apa. Practic are loc așa-numitul fenomen

de tranziție de la faza solidă a polimerilor la faza de gel. Această fază se numeste tranziție

solid-gel și momentul acestei faze se poate calcula pentru fiecare hidogel prin studii reologice.

Pentru formarea hidrogelului din diferite tipuri de polimeri se pot utiliza două

metode: formularea prin metode chimice și formularea prin metode fizice.

Prin metodele de reticulare chimice se pot înțelege: reacții enzimatice,

termogelificare, reticulare prin radiații, etc.

Prim metodele de reticulare fizice se înțelege: utilizarea unor ioni pozitivi care să

reacționeze cu polimerul și să ducă la auto-reticulare (cum ar fi cazul alginatului în contact cu

Ca2+, Zn2+) sau utilizarea influenței temperaturii asupra procesului de formare a gelului

(scaderea drastică a temperaturii sau creșterea acesteia (Ching și colab., 2017).

În funcție de metodele utilizate pentru gelificare se poate obține gel cu

caracteristicile dorite în funcție de apilcabilitatea ulterioară a acestuia.

Caracterizarea hidrogelurilor poate fi făcută în funcție de mai mulți factori printre

care se pot aminti: gradul de hidratare a rețelei polimerului, proprietăți mecanice, dimensiune

dar și gradul de rezistența și de degradare a acestuia (Sathaye și colab., 2015).

Din punct de vedere mecanic hidrogelurile sunt caracterizate de elasticitate și

rezistență la întindere. De asemenea pe lânga elasticitate acestea se caracterizează și printr-o

vâscozitate caracteristică fiecărui hidrogel în parte dar care predomină mai slab fața de

proprietațile elastice.

15

Așadar hidrogelurile sunt caracterizate de proprietăți vâscozo-elastice a căror

intensitate este dată de factori precum gradul de hidratare și densitatea sistemului reticulat

format. Se consideră astfel că cu cât mai puternic este gelul format, cu atât cantitatea de apă

inclusă în reticol este mai mică (Ketan și colab., 2013).

Comportamentul gelului format din polimeri prin contact cu apa este influențat

puternic și de factori externi precum: pH, temperatură, calitatea solvenților utilizați. Din acest

motiv este de importanță majoră să se cunoască influența acestor factori asupra

comportamentului gelului, degradării lui sau modificării volumului acestuia (Hudalla și

colab., 2008).

Așa cum s-a menționat mai sus pentru obținerea acestor hidrogeluri sau a rețelelor

tridimensionale se utilizează diferite tipuri de polimeri.

Clasificarea materialelor polimerice

Matricele polimerice pot fi clasificate în funcție de proveniență în matrice polimerice

naturale (cele de interes major în ceea ce priveste utilizarea lor pentru obținerea de forme cu

cedare controlată) și matrice polimerice sintetice (Vieira și colab., 2017).

Matricele polimerice naturale pot avea proveniență diferită conform Fig. 1.1, acestea

pot fi derivate din proteine sau derivate din polizaharide. Din matricele polimerice sintetice

fac parte compuși precum: poliamide, poliesteramidă, polianhidridă, etc. (Vieira și colab.,

2017).

Figura 1.1. Clasificarea matricelor polimerice biodegradabile naturale.

1.3 Polimeri naturali. Derivați de polizaharide: Alginatul de sodiu

Alginatul de sodiu este un polimer natural care se obține prin extracție din algele

brune din familia Phaeophyta. Acest polimer este alcătuit din acid alginic, săruri și o

16

polizaharidă hidrofilă, anionică. Proporția compușilor existenți în compoziția alginatului

depinde foarte mult de condițiile de creștere a algelor din care este extras (Azevedo și colab.,

2014).

Alginatul de sodiu este un biopolimer liniar alcătuit din doi acizi uronici: acidul 1, 4-

β-D manuronic (M) și acidul α-L guluronic (G). Acești derivați de acizi uronici influențând

rigiditatea și elasticitatea polimerului. Astfel se consideră a fi cel mai rigid polimerul care

conține două molecule G consecutive, rigiditatea scăzând atunci când există două molecule M

consecutive (Azevedo și colab., 2014).

Alginatul de sodiu se caracterizează prin rigiditate scăzută deci elasticitate mare

atunci când moleculele de acizi uronici M și G se găsesc consecutive și leagate prin legături

chimice diecuatoriale și legături chimice diaxiale sub forma unei panglici (Fig. 1.2) (Daemi și

colab., 2012).

Figura 1.2. Structura chimică tridimensională a polimerului alginat.

Alginatul de sodiu este polimerul care se utilizează frecvent pentru obținerea unui gel

deoarece acesta are capacitatea de a îngloba substanțe medicamentoase și extracte vegetale de

diferite tipuri. Avantajul major al acestui polimer este acela că reacționează în funcție de pH

(Azhar și colab., 2014).

La pH acid alginatul prezintă rezistență iar la pH alcalin permite pătrunderea

moleculelor hidrofile în rețea. Astfel alginatul se poate utiliza pentru vehicularea și eliberarea

controlată a substanțelor incluse. Un bun exemplu reprezintă eliberarea controlată la nivel

intestinal (pH alcalin) și evitarea pierderii substanțelor de interes în mediul gastric (pH acid)

(Azhar și colab., 2014, Dhamecha și colab., 2019).

In vitro s-a demonstrat că microcapsulele de alginat de sodiu sunt stabile în mediul

gastric (pH acid) și eliberarează controlat substanța inclusă în intestin (pH alcalin). Pentru

creșterea stabilității microcapsulelor de alginat de sodiu se pot efectua etape de învelire a

17

acestora cu sarcini opuse (cu chitosan) sau cu alți polimeri de tipul carragenului sau gelatinei

(Wu și colab., 2014).

Învelirea microcapsulelor determină creșterea stabilității acestora față de factorii de

mediu externi pe durata depozitării dar îmbunătățesc și timpul de înjumătățire a substanțelor

incluse în microcapsulele administrate pe cale orală, astfel numărul administrărilor scade (Wu

și colab., 2013). Prezentând o multitudine de avantaje alginatul de sodiu se utilizează frecvent

pentru formularea microcapsulelor care se pot utiliza în diferite patologii în funcție de

substanța inclusă.

1.4 Utilizari terapeutice

Alginatul de sodiu este un material polimeric biocompatibil, biodegradabil, inert și

poate fi utilizat cu usurintă pentru formularea microcapsulelor care să înglobeze substanțe

medicamentoase de interes terapeutic. Mai mult decât atât alginatul de sodiu este ușor de

manipulat, ieftin și permite formularea microcapsulelor prin metode rapide și ușoare (Sosnik

și colab., 2014). Astfel alginatul este polimerul cel mai utilizat în vehicularea substanțelor de

interes cu scopul eliberării controlate a acestora (Sosnik și colab., 2014).

Substanțe medicamentoase incluse: nistatinul este una dintre substanțele

medicamentoase incluse cu success în matrici polimerice. S-au realizat studii in vivo care

demonstrează cresterea eficienței nistatinului împotriva Candida albicans localizată la nivelul

mucoasei bucale. Datorită înglobării nistatinului în matricea de alginat de sodiu s-a observat

creșterea contactului dintre mucoasa bucală și substanța medicamentoasă crescând timpul de

retenție în cavitatea bucală și totodată s-a evitat pasajul hepatic deoarece nistatinul nu a

pătruns sistemic (Martin și colab., 2015).

Izoniazida, substanță antituberculoasă a fost inclusă în microcapsule de alginat de

sodiu. Rezultatele obținute au fost foarte bune reușindu-se scăderea dozei de izoniazidă

deoarece trimpul de înjumătățire a crescut. Astfel s-a scăzut efectul hepatotoxic al acesteia

scăzând numărul de administrări. Eliberarea substanței a fost făcută controlat în procent de

peste 70% la nivel intestinal. Acest lucru a fost posibil datorită comportamentului diferit al

alginatului în funcție de pH (Rastogi și colab., 2007).

Antiinflamatoarele nestoroidiene au fost incluse în matrice polimerice. Pentru

această clasă medicamentoasă s-au obținut îmbunătățiri în ceea ce privește protecția mucoasei

gastrice față de ibuprofen. Astfel fiind incluse în matrice polimerică de alginat de sodiu

substanțele antiinflamatoare nu mai intră în contact direct cu mucoasa gastrică și efectul lor

secundar, de distrugere a mucoasei gastrice este mult diminuat (Negpal și colab., 2012).

18

De asemenea în microcapsule polimerice s-au mai inclus polifenoli, uleiuri esențiale

pentru eliberare controlată și protecțiea principiilor active. Printre substanțe medicamentoase

sintetice incluse în microcapsule polimerice se mai pot aminiti: doxorubicina (în terapia

cancerului), cafeina, rifampicina, aciclovir, celecoxib, metformin pentru toate acestea

demonstrandu-se a fi benefică includerea deoarece a avut loc creșterea biodisponibilității și

scăderea reacțiilor adverse (Chen și colab., 2018, Zhang și colab., 2016, Md și colab., 2011,

Maestrelli și colab., 2017).

Înglobarea celulelor și eliberarea controlată a acestora: până în prezent există

studii în literatura de specialitate prin care s-a evidențiat posibilitatea de înglobare sau aplicare

în/pe matrici polimerice a celulelor izolate, vii de diferite tipuri (Etter și colab., 2018).

Astfel s-a cercetat posibilitatea de înglobare a celulelor mezenchimale umane și

testarea in vitro a influenței acestora în angiogeneză și reparare a mușchilului miocardic (Yu

și colab., 2010). S-a urmărit includerea în matrice polimerice a celulelor stem sau a celulelor

osoase. Astfel prin înglobarea osteoblastelor s-a evidențiat in vitro o creștere a calcifierii și

mineralizării osoase (Grellier și colab., 2009, Qi și colab., 2016).

Celulele insulelor pancreatice au fost izolate și incluse într-un sistem polimeric care a

fost testat pentru capacitatea de funcționare precum un pancreas artificial, tratament benefic

pentru bolnavii de diabet. Practic s-a demonstrat că administrarea acestor celule incluse în

sisteme polimerice de alginat de calciu sau bariu sunt mai puțin respinse de către organism

(nefiind recunoscute ca elemente străine) (Qi și colab., 2012).

S-au încapsulat inclusiv gene primordiale germinale obținute din celule stem care s-

au testat pe șoareci cu scopul evidențierii evoluției embrionale, tratament revoluționar ce ar

putea fi utilizat împotriva infertilității (Mansouri și colab., 2017).

Includerea celulelor izolate de diferite tipuri este o metodă revoluționară de

menținere a vieții celulei deoarece matricea polimerică ii permite schimbul de oxigen și de

nutrienți cu mediul. Polimerii au avantajul major de a menține cultura celulară viabilă pe

termen lung acționând precum un scut împotriva factorilor de stres (Mansouri și colab.,

2017).

Înglobarea proteinelor de diferite tipuri: fracțiunile proteice de diferite tipuri au

fost printre primele incluse în matricile polimerice. Acestea reacționează cu organismul cel

mai bine atunci când sunt incluse în matrici polimerice față de alte biomateriale (Dimitrov și

colab., 2012).

Astfel până în prezent au fost descrise sisteme formate din matrici polimerice și

factori de creștere a celulelor osoase cu scopul calcifierii și remineralizării fracturilor osoase,

19

albumină serică și factori de creștere a fibroblastelor cu scopul îmbunătățirii răspunsului

organismului după transplantul de piele și acceptarea grefelor de piele (Dimitrov și colab.,

2012 , Liu și colab., 2017).

S-a inclus acid hialuronic pentru îmbunătățirea răspunsului organismului față de

diferite tipuri de implanturi. Aceste sisteme polimerice s-au utilizat de asemenea pentru

creștre tisulară, regenerare nervoasă sau pentru reușita absorției în organism a moleculelor

care ca atare nu permit acest lucru datorită punctului izoelectric mare (lizolima și

chimotripsina) (Zhai și colab., 2015). Din categoria enzimelor incluse în matrice polimerice

se poate aminti peroxidaza (Wang și colab., 2003).

Înglobarea probioticelor: probioticele au un rol foarte important pentru menținerea

sănătății organismului dar mai ales a tractului gastro-intestinal. Aceste microorganisme

benefice însă sunt foarte sensibile la pH-ul mediului gastric și intestinal dar și la acțiunea

sărurilor biliare și pancreatice astfel că de cele mai multe ori administrarea ca atare a acestora

este ineficientă (Ma și colab., 2012).

Prin înglobarea tulpinilor bacteriene, a probioticelor în matrice polimerice de tipul

alginatului s-a reușit eliminarea inconvenientelor amintite deoarece alginatul de sodiu

protejează tulpina bacteriană de acțiunea acidului gastric și eliberează conținutul la nivel

intestinal unde are loc și colonizarea și popularea intestinală. Eficacitatea înglobării acestor

tulpini bacteriene crește atunci când se utilizează amestecuri de polimeri, cel mai des fiind

utilizat amestecul alginat-chitosan (Chen și colab., 2018).

1.5 Concluzii

În concluzie matricele polimerice sunt materiale avantajoase care pot fi utilizate pe o

scară largă din punct de vedere terapeutic. Sunt ușor de manipulat astfel că formularea

microcapsulelor este facilă. Înglobarea diferiților compuși (substanțe medicamentoase,

extracte, uleiuri, proteine, agenti antivirali, bacterii) are ca rezultat îmbunătățirea

biodisponibilității acestora dar și protecția lor față de factori de mediu externi sau interni.

Astfel utilizarea microcapsulelor polimerice permite obținerea unor tratamente inovative și de

succes în domeniul medical și farmaceutic.

20

CAPITOLUL II

Sisteme lipidice de includere a extractelor vegetale – Lipozomi

2.1 Introducere

Lipozomii au fost realizați pentru prima dată în 1961 de către Alec D. Bangham

existând și în prezent o provocare continuă pentru domeniile industriale și de cercetare cu

privire la noi metode de obținere și de extindere a ariei lor de aplicare. În special se dorește

utilizarea lor ca transportori avansați și instrumente de administrare a medicamentelor

dorindu-se vizarea unor țesuturi sau organe specifice (organe țintă) (Kale și colab., 2010,

Yogita și colab., 2014).

În același timp, studiul lipozomilor atrage atenția și în cazul studiilor de optimizare,

deoarece se cunoaște că aceste sisteme de transport au capacitatea de a prelungi timpul de

înjumătățire în circulația sângelui a substanței medicamentoase transportate (Sun și colab.,

2020), obținându-se astfel o scădere a numarului de administrări și creșterea confortului

pacientului pe durata tratamentului.

De asemenea există mulți factori care înca trebuie studiați cum ar fi evitarea

solvenților nocivi folosiți pentru preparare, deoarece până în prezent se utilizează de cele mai

multe ori substanțe organice nocive pentru organismul uman (Silva și colab., 2019).

Denumite inițial sferule acestea s-au obținut pentru prima dată dintr-un amestec de

lecitină și colesterol dispersate în apă prin agitare sau sonicare manuală, acestea au prezentat o

structură lamelară așa cum s-a evidențiat prin microscopie electronică (Skupin-Marugalska și

colab., 2018). În prezent se utilizează însă instrumente nano-tehnologice, astfel că

dimensiunea veziculelor lipidice obținute poate fi de tip nanometric, numindu-se astfel și

nanoparticule sau nanolipozomi în funcție de dimensiunea măsurată (Skupin-Marugalska și

colab., 2018).

Aceste sferule (lipozomi sau nanolipozomi) sunt de natură lipidică deoarece sunt

formulate în esență dintr-o emulsie de apă în ulei (A / U) sau ulei în apă (U / A) (Riaz și

colab., 1996, Mozafari și colab., 2005).

Din punct de vedere morfologic lipozomii sunt vezicule artificiale mici (chiar nano-

scalate) prezentând unul sau mai multe straturi capabile să încorporeze o varietate de compuși

lipofili și hidrofili și să-i elibereze la țintă într-un moment potrivit (Juliano și colab., 1975,

Hunt și colab., 1979).

21

În mod tradițional, principalele componente ale lipozomilor sunt fosfolipidele.

Acestea se caracterizează printr-o compoziție specifică care a fost descrisă astfel: un cap

hidrofil compus din trei componente moleculare: colină, un grup de fosfați și glicerol și două

cozi reprezentate de un lanț lung care conține acizi grași esențiali, cu proprietăți hidrofobe.

Principalele proprietăți ale unui astfel de complex sunt: auto-asamblarea și auto-

etanșarea în medii apoase având loc astfel înfășurarea spontană a compușilor bioactivi (Fig.

2.1) (Maherani și colab., 2011).

Figura 2.1. Reprezentarea schematică a lipozomilor unilamelari și a pozițiilor

substanțelor încărcate (1-6). Imagine adaptată după (Maherani și colab., 2011).

Până în prezent s-au dezvoltat o varietate de metode de formulare a lipozomilor

având ca scop principal obținerea de diferite formule sau tipuri lipozomale. Au fost produse

vezicule unilamelare (UV) și multilamelare (MLV) (Huang și colab., 1969, Harashima și

colab., 1994, Riaz și colab., 1996, Mozafari și colab., 2005).

În funcție de metoda folosită în procesul de formulare caracteristicile lipozomilor

precum dimensiunea și sarcina electrică de suprafață diferă. Prin urmare metoda de obținere a

lipozomilor utilizată v-a influența stabilitatea, dimensiunea și eficiența de includere a

veziculelor formulate.

Potențialul Zeta acționează ca o barieră energetică repulsivă controlând stabilitatea

dispersiei prin opunerea apropierii particulelor (Harashima și colab., 1994, Wagner și colab.,

22

2011, Akbarzadeh și colab., 2013). Cunoașterea potențialului Zeta fiind deci utilă în controlul

agregării, fuziunii și precipitării nanolipozomilor (Dua și colab., 2012).

Scopul acestui capitol este acela de a revizui pe scurt metodele de obținere a

lipozomilor, avantajele și dezavantajele acestora, precum și metodele de caracterizare la nivel

de laborator. Acest capitol prezintă diferiți compuși activi terapeutici încapsulați în sisteme

lipozomale de transport care vizează organele sau țesutul țintă (Miere (Groza) și colab.,

2020).

2.2 Avantajele și dezavantajele sistemelor lipidice de transport

Interesul pentru utilizarea lipozomilor în diferite patologii este extrem de mare.

Avantajele și dezavantajele acestor structuri pot fi identificate în Tabelul 2.1.

Tabelul 2.1

Avantajele și dezavantajele utilizării lipozomilor ca agenți de vehiculare a substanței active

încapsulate (Hârjău și colab., 2003, Ijeoma și colab., 1999, Bozutto și colab., 2015)

Avantajele utiluzării lipozomilor Dezavantajele utilizării lipozomilor

Sunt biologic inerţi şi biodegradabili În cazul în care suportul sau matricea se

rup sau se dezagregă prea repede, există

riscul apariţiei unor efecte toxice, ca

urmare a eliberării unei doze mari de

medicament odată

Nu prezintă riscul unei toxicităţi,

antigenitaţi sau pirogenitaţi deoarece

fosfolipidele sunt constituenţi naturali ai

membranelor celulare

Imposibilitatea întreruperii bruşte a

tratamentului în cazul manifestării

reacţiilor adverse sau în cazul unor

accidente terapeutice

Pot fi preparaţi în diferite dimensiuni,

compoziţii, cu diferite sarcini superficiale în

funcţie de cerinţele formulării

Apariţia riscului de acumulare, dacă

viteza de eliminare a substanţei

medicamentoase este lentă

Pot încapsula o varietate mare de substanţe

medicamentoase hidrofile şi lipofile

O absorbţie scăzută poate întârzia

apariţia acţiunii terapeutice a substanţei

medicamentoase

Protejează substanţele medicamentoase de

acţiunea nefavorabilă a enzimelor

Perioada de eliberare a substanţei

medicamentoase este reprezentată de

timpul cat medicamentul se găseşte la

nivelul tractului gastrointestinal

23

Atingerea rapidă şi menţinerea pe o

perioadă suficientă de timp a nivelelor

plasmatice ale substanţei active

-

Scurtarea frecvenţei administrării

medicamentului pe parcursul unei zile

-

Scăderea fluctuațiilor nivelelor terapeutice

din plasmă

-

Reducerea cantităţii de substanţă activă

utilizată

-

Eliberarea substanţei active la nivelul

organului ţintă, fapt care conduce la

scăderea frecvenţei şi intensităţii reacţiilor

adverse şi în plus la utilizarea unor doze mai

mici

-

Așadar urmărind Tabelul 2.1 se poate afirma că avantajele acestor sisteme de

transport sunt mai numeroase și mai importante față de dezavantajele prezentate (raportul

risc/beneficiu al utilizării lipozomilor este favorabil) ceea ce permite utilizarea acestor sisteme

de transport în domenii precum medicină, farmacie, biologie și tehnologie.

2.3 Proprietățile fizico-chimice ale lipozomilor

Pentru a obține lipozomi de dimensiuni nanometrice este foarte important să se

cunoască proprietățile fizice și chimice ale tuturor componentelor care intră în structura

acestora.

Astfel accentul se pune pe cunoașterea compoziției chimice a substanțelor utilizate și

a temperaturii de tranziție a acestora (Tc) (Guerrero și colab., 2005).

1. Compoziția chimică a lipozomilor

Compoziția lipozomilor poate cuprinde următoarele elemente:

• fosfolipide: reprezintă componentele structurale majore ale

membranelor biologice,

• aditivi în straturile duble de fosfolipide,

• colesterol,

• activatori enzimatici,

• inhibitori enzimatici,

24

• compuși pentru stabilizarea lipozomilor,

• agenți antioxidanți,

• agenți de chelare.

Există două tipuri de fosfolipide și produsele lor corespunzătoare de hidroliză:

fosfodigliceride și sfingolipide.

Fosfolipidele sunt formate din glicerol, doi acizi grași legați în pozițiile l sau 2 de

glicerol, o grupare fosfat în poziția 3 și o grupă polară (Tabelul 2.2) (Trotta și colab., 2003,

Maherani și colab., 2012).

Tabelul 2.2

Reprezentarea structurilor chimice a fosfolipidelor

Cele mai frecvent utilizate fosfolipide sunt fosfatidilcolinele (PC-uri) cunoscute și

sub denumirea de lecitine. Aceste molecule amfipatice sunt greu solubile în apă. În mediu

apos se aliniază spontan în straturi duble sub formă de structuri lamelare pentru a reduce

interacțiunile nefavorabile dintre faza apoasă și lanțurile lungi de acizi grași (Maherani și

colab., 2012).

Abrev. Nume Structură chimică

PC Fosfatidilcolină

DLPC Diluaril-

fosfatidilcolină

DMPC Dimiristoil-

fosfatidilcolină

DPPC Dipalmitoil-

fosfatidilcolină

DSPC Distearoil-

fosfatidilcolină

25

Lecitina din surse naturale este de fapt un amestec de fosfatidilcoline, fiecare cu

lanțuri de hidrocarburi de diferite dimensiuni și grade diferite de nesaturare. Lecitina vegetală

are un nivel ridicat de polinesaturare în timp ce lecitina din sursele animale conține un grad

mai mare de lanțuri complet saturate (Severino și colab., 2015).

Singingolipidele: un grup versatil de lipide care sunt alcătuite din sfinx (porți

alchilate cu lanț lung) și un acid gras care sunt legate de o grupă amidă. Acestea sunt prezente

în structura celulelor eucariote cu diferite roluri precum: activarea sau inhibarea protein-

kinazelor, transducția semnalului sau reglarea transportului ionic. Cel mai important rol este

acela de a fi implicat în apoptoza celulară.

În ceea ce privește utilizarea lor, ele pot fi utilizate pentru a formula lipozomi sau

pentru a fi încorporate în lipozomi. Sfingolipidele sunt cel mai adesea incluse în lipozomi,

având un efect puternic anticancerigen, sfingolipidul inclus și transportat la celulele tumorale

dictând apoptoza celulară (Kester și colab., 2015).

În compoziția membranei lipozomale sunt adăugați de asemenea diferiți compuși

cum ar fi sfingomielina care are rolul de a crește stabilitatea imunoliposominei în vivo și

cardiolipina lipidică antigenică folosită în aplicații imunologice.

Colesterolul este introdus în membrana lipozomală și datorită nucleului rigid de

sterol dar și pentru că realizează o ambalare strânsă a stratului lipidic și îmbunătățește

rigiditatea și hidrofobia membranei. Raportul folosit de fosfolipide: colesterolul trebuie să fie

de 1: 1 sau 1: 2 (Mozafari și colab., 2005). Fosfatidilcolina în prezența colesterolului crește

permeabilitatea lipozomală și poate crește fuziunea lipozomilor cu celulele (Zaka-Ud-Din și

colab., 1974).

Searilamina, dietilfosfatul și acidul fosfatidic sunt utilizate pentru stabilizarea

lipozomilor. Adăugarea de compuși ionici conferă lipozomilor o încărcare negativă sau

pozitivă, ceea ce determină o repulsie electrostatică între diferitele straturi (Tabatt și colab.,

2004). Acest lucru duce la o creștere a spațiilor interlamelare cu o putere mai mare de

includere pentru substanțele solubile în apă.

α-tocoferolul, și butilhidroxitoluenul sunt antioxidanți folosiți pentru stabilizarea

lipozomilor care conțin lipide polinesaturate (Khamkar și colab., 2011).

EDTA (acid etilen-diamino-tetra-acetic) este utilizat ca agent de chelare pentru ioni

metalici care contaminează lipozomii și pot induce oxidarea catalitică.

Clorura de sodiu menține izotonicitatea iar agenții antifungici și antimicrobieni

îmbunătățesc stabilitatea microbiologică a preparatelor lipozomale (Rasti și colab., 2012).

26

2. Temperatura de tranziție (Tc)

Temperatura de tranziție este definită ca fiind temperatura necesară pentru a induce o

schimbare a stării fizice a lipidelor din faza de gel, unde lanțurile hidrocarbonate sunt extinse

și strâns legate, la faza de lichid-cristalin, în care lanțurile hidrocarbonate sunt orientate

aleatoriu. Există mai mulți factori care influențează direct Tc inclusiv lungimea lanțului de

hidrocarburi, gradul de nesaturare, sarcina electrică.

S-a observat că Tc crește atunci când lungimea lanțului hidrocarburilor este mai mare

deoarece interacțiunile Van der Waals devin mai puternice, necesitând mai multă energie

pentru a dezorganiza ansamblul stratului de membrană. Dacă este introdusă o legătură dublă

în grupa acil energia grupului nesaturat este mai mare și astfel este necesară o temperatură

mai mică decât Tc pentru a produce organizarea suprafeței lipozomale (Colas și colab., 2007).

La temperatura de tranziție cele două faze de tranziție ale lipozomilor coexistă în

proporții egale. La temperaturi mai scăzute față de Tc faza de gel este atinsă și la temperaturi

mai mari față de Tc se produce o dezorganizare a fazei fluide (Colas și colab., 2007).

Tc influențează anumite proprietăți ale lipozomilor precum permeabilitatea,

agregarea, legarea de proteine și fuziunea lipozomilor. Tranziția de fază este utilizată pentru a

induce fuziunea lipozomilor și eliberarea substanței active. Substanțele încapsulate pot fi

eliberate în țesutul țintă prin modularea temperaturii țesutului cu diferite surse de energie,

precum radiații infraroșii, microunde, laser. Tc este considerat a fi influențat de natura

fosfolipidelor, de lungimea lanțului acil, de sarcina electrică, de gradul de saturație a lipidelor

și de natura grupărilor existente.

Cu cât este mai scurtă lungimea lanțului acil cu atât Tc este mai mică.

Tc este considerat a fi cu 10 ° C mai mare decât temperatura de topire a

fosfolipidelor utilizate. Se numește temperatura de tranziție, deoarece la această temperatură

crește permeabilitatea membranelor fosfolipide ale lipozomilor (Mozafari și colab., 2008).

Spre exemplu a fost demonstrat că eliberarea substanțelor incluse în lipozomi cum ar fi

doxorubicina este influențată de Tc (Seher și colab., 2007, Gabizon și colab., 1993).

2.4 Metode de formulare a sistemelor lipozomale

În literatura de specialitate există o varietate de metode care pot fi utilizate pentru a

formula lipozomi sau nanoparticule lipidice (Park și colab., 2002). Acestea pot fi clasificate în

moduri diferite dar în funcție de tipul de lipozomi formulați există următoarele metode (Fig

2.2).

27

Figura 2.2. Clasificarea metodelor de formulare a diferitelor tipuri și dimensiuni a

lipozomilor.

Metodele cele mai importante și utilizate cel mai frecvent sunt: tehnica sonicării,

metoda de extrudare și microfluidizarea. Toate aceste metode sunt aplicate după formularea

emulsiei primare și au rolul de a micșora lipozomii la dimensiuni nanometrice rezultând

nanolipozomi sau nanoparticule (Mastropietro și colab., 2011).

Formarea emulsiei primare este realizată prin metoda hidratatării filmului lipidic.

Amestecul lipidic conține fosfolipide (una sau mai multe) care sunt omogenizate cu agenți

emulgatori diferiți (de exemplu colesterolul) ulterior fiind solubilizate în solvenți organici

(metanol, etanol, chloroform, diclormetan). Ulterior amestecul este supus îndepărtării

solvenților organici cu ajutorul rotavaporului. După îndepărtarea solventului organic pe pereții

balonului cu fundul rotund se formează filmul lipidic care ulterior se hidratează cu soluții

apoase (apă distilată, soluții tampon fosfat, soluții tampon HEPES). Se recomandă ca

hidratarea să fie făcută cu ajutorul soluțiilor tampon deoarece acestea conferă sarcină electrică

pe suprafața lipozomilor formați la contactul celor două faze. Această formulare generală are

28

ca rezultat lipozomii, vezicule mari și prin metodele descrise în Fig. 2.2 se realizează

micșorarea acestora, formând astfel nanolipozomii.

Practic, are loc o tranziție de la dimensiunea micrometrică a lipozomilor la

dimensiunea nanometrică, lipozomii de tip nano fiind considerați cei cu o dimensiune mai

mică de 100 nm Fig. 2.3. (Mozafari și colab., 2008, Botto și colab., 2017).

Figura 2.3. Etapele formulării emulsiei primare.

2.5 Caracterizarea lipozomilor sau a nanoparticulelor lipidice

Pentru a putea demonstra succesul formării lipozomilor urmând pașii descriși mai sus

este necesară o serie de analize care să demonstreze forma, dimensiunea, sarcina electrică

(potențial Zeta) a acestora (Bondi și colab., 2010).

Pentru vizualizarea formei lipozomilor se pot utiliza metode optice și electronice.

Pentru particule mai mari de 300 nm, se poate folosi microscopul optic dar pentru particule

mai mici de 100 nm sunt utilizate cel mai frecvent tehnicile de microscopie electronică (Bondi

și colab., 2010).

29

1. DLS (Dynamic light scattering): se utilizează pentru determinarea dimensiunii

veziculelor formate și pentru determinarea potențialului Zeta.

Prin injectarea probelor sub formă lichidă se obțin grafice care evidențiază

dimensiunea particulelor în suspensie.

Această analiză poate determina de asemenea sarcina electrică de suprafață a

lipozomilor (potențialul Zeta).

Potențialul Zeta este influențat de compoziția capului fosfolipidelor, de pH-ul

mediului sau de compoziția fazei apoase utilizate pentru hidratarea filmului lipidic.

Lipozomii pot fi încărcați cu sarcină negativă, pozitivă sau neutră. Natura și

densitatea sarcinii electrice de pe suprafață a membranei lipozomale influențează stabilitatea,

cinetica biodistribuției precum și absorbția lipozomilor de către celulele țintă (Abdul Ghafoor

Raja și colab., 2018).

Lipozomii neutri: au o tendință mai mică de a fi recunoscuți și apoi distruși de

celulele sistemului reticuloendotelial după administrarea sistemică. Principalul dezavantaj al

acestui tip de lipozomi este că are o tendință mai mare de a forma agregate (Gregoriadis și

colab., 2007).

Lipozomi negativi: formează suspensii stabile și au o capacitate de agregare

redusă. Cei care conțin fosfatidilserină (PS) sau fosfatidilglicerol (PG) au o rată de endocitoză

mai mare, deoarece suprafața negativă este recunoscută de receptorii macrofagilor

(Gregoriadis și colab., 2007).

Adăugarea de glicolipide, cum ar fi gangliozidele sau fosfatidilinositolul inhibă

absorbția lipozomilor de către macrofage și celulele sistemului reticuloendotelial, prelungind

timpul de circulație. O cantitate mică de lipide încărcate negativ stabilizează lipozomii neutri

împotriva mecanismului de agregare (Brgles și colab., 2008).

Lipozomi pozitivi: au o tendință ridicată de interacțiune cu proteinele serice și sunt

recunoscuți cu ușurință de macrofage cu clearance hepatic, splenic și pulmonar ridicat. Sunt

utilizate în terapia genică pentru administrarea ADN-ului intracelular (Brgles și colab., 2008).

2. Tehnici microscopice utilizate pentru caracterizarea formei veziculelor

lipidice

Tehnicile microscopice permit vizualizarea formei lipozomilor și a morfologiei

acestora. În ceea ce privește tipul de microscopie acestea poate fi de mai multe tipuri:

microscopie optică sau microscopie electronică (Bibi și colab., 2011).

30

În cele ce urmează acestea vor fi descrise deoarece fiecare tehnică microscopică are

atât avantaje cât și dezavantaje (Murphy și colab., 2012).

Microscopia optică: folosește lumina vizibilă fiind o tehnică mai ușor de

manipulat dar nu oferă rezultate detaliate asupra lipozomilor studiați (Nallamothu și colab.,

2008). Aceast tip de microscopie nu permite vizualizarea stratului lipidic al lipozomilor însă

permite vizualizarea formei acestora. Prin urmare această tehnică este limitată dar pentru

completarea rezultatelor se pot utilize și alte tipuri de microscopii optice (polarizarea,

fluorescența sau microscopia confocală) (Bouvrais și colab., 2010).

Microscopia de polarizare este puțin mai avansată decât microscopia convențională,

permițând evaluarea ușoară a formei lipozomilor dar la fel ca microscopia clasică nu poate

oferi detalii despre stratul lipidic al lipozomilor la nanoscală. Acest tip de microscopie poate

oferi o imagine monocromă sau colorată cu o rezoluție bună dacă lipozomii au dimensiuni

micrometrice (Klymchenko și colab., 2009).

O tehnică mai avansată este microscopia cu fluorescență. Acest tip de microscopie

utilizează fluorocromuri care sunt capabile să emită lumină fluorescentă în urma excitării

luminii la o anumită lungime de undă (Ruozi și colab., 2007). Metoda este mult mai complexă

decât cea descrisă mai sus și permite o vedere mai detaliată a lipozomilor.

Prin această metodă pe lângă forma lipozomilor straturile lipidice ale membranei

lipozomale pot fi vizualizate folosind rodamina ca substanță fluorescentă. Cu toate acestea,

are și anumite dezavantaje, cum ar fi posibilitatea distrugerii membranei lipozomale prin

injectarea agenților de contrast (în cantități mai mari de 1%) sau decolorarea, albirea și

pierderea fluorescenței prin expunerea prelungită la lumina fluorescentă a substanței injectate.

Microscopia confocală este o versiune mai avansată a microscopiei fluorescente,

astfel încât poate fi utilizată pentru a obține imagini tridimensionale ale lipozomilor (Mertins

și colab., 2013).

Microscopia electronică: spre deosebire de microscopia optică, microscopia

electronică permite vizualizarea lipozomilor foarte mici, nanometrici. Microscopia electronică

folosește electroni pentru a obține o imagine proiectată. Această categorie de microscopie

include: microscopie electronică de scanare (SEM), microscopie electronică de transmisie

(TEM) (Henry și colab., 2005).

SEM folosește un fascicul de electroni care va avea ca rezultat o imagine lipozom

extinsă. Astfel imaginile obținute permit vizualizarea formei, morfologia și structura

lipozomilor fiind mai complexe față de imaginile oferite de cître alte tipuri de microscopii. Cu

31

toate acestea din cauza faptului că lipozomii sunt dificil de aplicat, se usucă pe suportul

microscopului și vidul creat este capabil să deformeze membrana lipozomală această metodă

este destul de rar folosită (Henry și colab., 2005).

TEM este cea mai frecventă metodă folosită pentru a caracteriza lipozomii de

dimensiuni nanometrice. Această metodă permite utilizarea emulsiei nanoparticulelor sub

formă lichidă și caracterizarea nanostructurilor cu o dimensiune de 1 nm (Adler și colab.,

1985).

În plus față de aceste tipuri de microscopie, optica și electronica pot fi de asemenea

utilizate pentru vizualizarea nanoparticulelor și microscopia cu forță atomică (AFM)

(Kuntsche și colab., 2011).

AFM are o rezoluție excepțională care furnizează imagini clare, tridimensionale, cu

referire la modificări ale membranei nanoparticulelor (atașarea de anticorpi de exemplu),

forma, morfologia și poate furniza de asemenea informații mecanice și chimice ale structurii

membranei (Sitterberg și colab., 2010).

Astfel ținând cont de aceste considerente alegerea corectă a tehnicii de vizualizare a

lipozomilor sau a nanoparticulelor lipidice este foarte importantă pentru a obține

caracterizarea formei și structurii acestora. De asemenea este important să se țină cont de

avantajele și dezavantajele fiecărei metode.

2.6 Stabilitatea veziculelor lipidice

Perioada de valabilitate a unui produs care conține lipide poate fi afectată dramatic

de speciile de lipide utilizate în formulare. De obicei cu cât legăturile duble pe care le conțin

lipidele în structura lor sunt mai multe cu atât acestea sunt mai ușor degradate prin oxidare.

Lipidele din surse biologice conțin cantități mari de acizi grași polinesaturați și au

stabilitate scăzută la oxidare spre deosebire de lipidele sintetice de obicei saturate (Tareq și

colab., 2012).

Lipidele saturate oferă cea mai mare stabilitate împotriva oxidării, dar au

dezavantajul unei temperaturi ridicate de tranziție care le face dificil de utilizat în formulări.

Altă problemă legată de stabilitate este degradarea hidrolitică. Hidroliza depinde de mulți

factori: pH, temperatură, tipul de tampon, rezistența ionică, lungimea lanțurilor de acizi grași,

starea de agregare și posibilitatea pătrunderii apei în membrană (Tareq și colab., 2012).

Printre metodele de stabilizare sunt cunoscute următoarele: adăugarea de antioxidanți

precum α-tocoferolul, adăugarea de carbohidrați care sunt intercalați în membrană și care au

capacitatea de a îndepărta apa din regiune, uscarea lipidelor (Tareq și colab., 2012, Seher și

32

colab., 2007). Pot apărea modificări în structura lipozomilor datorită apariției degradării

chimice (oxidare și hidroliză) dar și degradării fizice (agregare, fuziune, pierderea substanței

încorporate (Mitsuhiro și colab., 2015).

Prevenirea degradării chimice

Nivelul de oxidare poate fi redus dacă se iau măsuri de precauție, inclusiv utilizarea

lipidelor proaspăt purificate și a solvenților proaspăt distilați, evitând utilizarea unor procese

care necesită temperaturi ridicate.

De asemenea, se are în vedere executarea proceselor în absența oxigenului și

deoxigenarea soluțiilor apoase cu azot.

Depozitarea suspensiilor lipozomale trebuie să fie făcută într-o atmosferă inertă.

Este obligatoriu să se includă în membrana lipidică un compus antioxidant cum ar fi

α-tocoferolul, un chelator de fier pentru a preveni inițierea unei reacții radicale în lanț

(Mitsuhiro și colab., 2015).

Gradul de saturație al lipidelor utilizate este important, fiind de dorit să se folosească

lipide saturate în locul celor nesaturate susceptibile la degradare datorate oxidării.

pH-ul utilizat trebuie să fie aproape de neutru (Ming și colab., 2017).

Prevenirea degradării fizice

Prin degradare fizică în cazul lipozomilor se poate înțelege agregare, sedimentare,

fuziune care apar pe o perioadă lungă de timp (Ming și colab., 2017).

Agregarea și sedimentarea lipozomilor neutri apar din cauza interacțiunilor Van der

Waals și tind să crească în lipozomi mari unde există suprafețe membranoase mari care permit

contactul dintre ele. Pentru a evita acest fenomen o cantitate mică de încărcare negativă de

fosfatidilglicerol sau acid fosfatidic este introdusă în mediu (Chevalier și colab., 2013).

Reducerea conversiei lipozomilor mici în lipozomi mari datorită fuziunii se produce

prin adăugarea de urme de izomer 1,3-diacil-2-fosfatidilcolina. Fuziunea lipozomilor mici

poate fi prevenită dacă sunt depozitați la temperaturi mai scăzute ale Tc și dacă în structura

lor este inclus suficient colesterol (Lumsdon și colab., 2000).

Permeabilitatea membranei lipozomale depinde de compoziția membranei lipidice și

a solutului antrenat. Moleculele sau ionii polari mari vor fi mai ușor de captat decât compușii

lipofili ușori (Okada și colab., 2012).

Alte metode de creștere a rezistenței membranei sunt fixarea glutaraldehidei în

membrană, osmificarea, includerea polimerilor alchilici cum ar fi alcoolul polivinilic

33

esterificat cu acid stearic sau palmitic, includerea sfingomielinei sau a derivaților 2-

carbamoilfosfatidilcolinei (Liu si colab., 2012).

Cea mai bună soluție pentru menținerea stabilității lipozomului este transformarea

lipozomilor într-o formă solidă, anhidră, care scade posibilitatea degradării (Ming și colab.,

2017).

2.7 Aplicații terapeutice pentru lipozomi sau pentru nanoparticulele lipidice

De-a lungul timpului au fost abordate mai multe aspecte în ceea ce privește

includerea substanțelor sau amestecurilor de substanțe în aceste sisteme de transport. Au fost

încorporate medicamente precum: aciclovir, betametazonă, retinol, atorvastatină, insulină,

doxorubicină etc., precum și extracte de plante.

Până în prezent există numeroase studii care testează in vitro utilizarea lipozomilor

încarcați cu substanțe de interes. Lipozomii nu au activitate terapeutică independentă și sunt

folosiți doar ca vectori de transport ai substanței incluse prin urmare activitatea lor terapeutică

este dictată de substanța încorporată.

Astfel, există lipozomi care au fost testați in vitro pentru a evalua activitatea

terapeutică în multiple afecțiuni: terapie cardiacă, afecțiuni dermice, respiratorii, afecțiuni pe

mucoase, boli oftalmologice, în lupta împotriva obezității, în terapia diferitelor tipuri de

cancer, boli ale ficatului etc. (Mastropietro și colab., 2011).

Aplicații pentru afecțiunile pielii: utilizarea nanoparticulelor lipidice în

afecțiunile pielii este un subiect de interes major deoarece prin această metodă inovativă pot fi

aplicate pe piele diverse substanțe terapeutice care ca atare nu pot fi utilizate la nivelul

epidermei (Belquoi și colab., 2016). Nanoparticulele pot fi utilizate în domeniul

dermatologiei, fie în scop terapeutic, fie în scopuri cosmetice (bazele Nanobase® sau

Cutanova® de exemplu) (Desmet și colab., 2017).

Utilizarea nanoparticulelor lipidice în terapiile dermatologice prezintă avantaje

majore: datorită structurii lor bogate în lipide, permit penetrarea profundă a dermului și

reținerea substanțelor terapeutice, astfel încât se folosește o cantitate mai mică de substanță,

iar efectul este mai intens. Aceste particule de dimensiuni nano vor menține pielea hidratată

datorită filmului ocluziv creat pe suprafața pielii (Muller și colab., 2010).

Nanoparticulele lipidice sunt utilizate pentru tratamentul alopeciei deoarece au

capacitatea de a pătrunde prin zonele foliculare datorită dimensiunii lor.

34

De asemenea, s-au efectuat cercetări cu privire la combinarea nanoemulsiilor cu

preparatele dermice hidratante, această idee fiind cea mai promițătoare la nivel cutanat și

folicular (Patzelt și colab., 2013).

Până în prezent au fost încorporate în nanoparticule lipidice pentru aplicații cutanate

vitamina A eficacitatea la nivelul pielii fiind de aproape 5 ori mai mare decât aplicarea

vitaminei ca atare. S-a demonstrat in vivo pe șoareci că nanoparticulele cu vitamina A au un

rol major în creșterea părului sau că pot fi utilizate în scopuri anti-îmbătrânire, fiind

încorporate în diverse creme (Jeon și colab., 2013).

Substanțele fotoprotectoare au fost de asemenea încorporate în nanostructuri și s-a

dovedit că au o eficiență crescută în această formă (Puglia și colab., 2012).

S-u încorporat și s-a demonstrat că Coenzima Q10 are o eficiență mult mai mare în

această formă (lipozomală) pentru protecția solară și ca activitate antioxidantă (Yoe și colab.,

2010). De asemenea, licopenul are un efect antioxidant și fotoprotector crescut dacă este

încorporat în nanoparticule conform Okonogi și colab., 2015.

Clasa flavonoidelor a fost de asemenea testată concluzionându-se că efectul

antiinflamator cutanat al quercetinei este crescut prin încorporarea în aceste sisteme

terapeutice (Bose și colab., 2013).

În unele articole, activitatea in vitro a extractului de Callendula officinalis a fost

evidențiată prin măsurarea gradului de vindecare a rănilor obținute artificial într-un timp de 48

de ore (Lide și colab., 2015).

Astfel, Lide și colab., 2015 au lucrat in vitro pe culturi de celule epiteliale pe care le-

au zgâriat cu o pipetă de 0,22 μm, apoi peste aceste răni au adăugat extractul de gălbenele ca

atare și extractul de gălbenele inclus în nanoparticulele lipidice.

Ulterior timp de 48 de ore s-a evaluat gradul de epitelizare. Celulele epiteliale la

care s-a adăugat extract de gălbenele au prezentat o reepitelializare a plăgii în procent de 20%

la concentrații de 5g / ml după 48 de ore. În cazul celulelor epiteliale cu extract de gălbenele

încorporat în nanoparticule lipidice autorii Lide și colab., 2015 observă o reepitelializare într-

un procent mai mare de 64,6% la concentrații de 5, 10, 20 μg / ml (Lide și colab., 2015).

Substanțele medicamentoase precum minoxidilul au fost de asemenea entrapate în

lipozomi pentru creșterea părului, fluocinolona acetat a fost încorporată în scopuri

antiinflamatorii, pentru tratamentul acneei, psoriazisului și ihtiozei a fost încorporată

tretinoină, pentru hiperpigmentarea s-a folosit hidrochinona, toate aceste substanțe având o

activitate crescută prin încorporarea în sisteme veziculare lipidice față de aplicarea substanței

ca atare (Wang și colab., 2017, Sousa și colab., 2017).

35

Sisteme transportoare de vaccin: în ultimii ani, tehnologia vaccinului a fost

studiată pe larg pentru includerea tulpinilor virale în lipozomi. Astfel ADN-ul, ARN-ul sau

diferite peptide virale pot fi incluse în lipozomi, ajungând la dimensiuni de până la 150 nm.

Acest lucru face posibilă administrarea intramusculară a vaccinului prin includerea în

lipozomi a protecției acestor compuși înglobați. Vaccinul este astfel mai eficient, lipozomul în

sine fiind un factor imun adjuvant (Watson și colab., 2012).

Afecțiuni cardiace: D. moldavica este o plantă care aparține familiei Lamiaceae

iar efectele farmacologice ale extractului acestei plante sunt multiple dar cel mai important

este efectul exercitat asupra miocardului acționând astfel în boli coronariene, ateroscleroză,

hipertensiune. Toate acțiunile se datorează conținutului bogat în flavonoide.

Includerea extractului în nanoparticule lipidice în acest caz s-a realizat datorită

faptului că biodisponibilitatea și solubilitatea ingredientelor active este mică dacă este

administrată într-o formă farmaceutică convențională. Rezultatele de eliberare in vitro a

principiilor active din nanoparticule fiind în procente de 96,23%, în timp ce eliberarea

substanțelor active formele convenționale a fost mai mică, 86,51% (Mei-e și colab., 2017).

Boala pulmonară: s-a demonstrat de asemenea atât in vivo cât și in vivo că

extractul de Yuxingcao încapsulat în nanoparticule solide are o biodisponibilitate pulmonară

mai mare și prin urmare un efect mai prompt în comparație cu administrarea extractului ca

atare. Administrarea prin nebulizare a nanoparticulelor lipidice solide încărcate cu extract de

Yuxingcao s-a demonstrat a avea efect bronhodilatator mai intens și mai de lungă durată față

de administratea inhalatorie ca atare a extractului și poate fi utilizat în diferite boli respiratorii

(Yun și colab., 2016).

Terapia cancerului: doxorubicina (DXR) este un agent activ antineoplastic

utilizat pentru tratarea multor tipuri de cancer și anume limfoame, leucemii și tumori solide.

Cu toate acestea administrarea acesteia determină depresia măduvei osoase, alopecie și

ulcerații orale. Includerea DXR în lipozomi scade toxicitatea substanței și menține sau chiar

crește efectul anticanceros. Clorhidratul de doxorubicină este primul produs lipozomal

autorizat din Statele Unite (Shaheen și colab., 2013).

S-au făcut cercetări pentru îmbunătățirea profilului de siguranță al antracilinelor

citotoxice, doxorubicinei (DXR) și daunorubicinei (DNR) împreună cu vincristina (VCR),

care sunt asociate cu reacții adverse cardiotoxice și gastrointestinale severe. Încorporarea în

sisteme terapeutice lipozomale a acestor substanțe a dus la reducerea cardiotoxicității și a

toxicității dermice (Shaheen și colab., 2013).

36

Cisplatina este o altă substanță anticanceră inclusă în lipozomi a cărei

biodisponibilitate este crescută datorită acestui fapt. Avantajul includerii substanțelor

anticanceroase în lipozomi este că substanțele sunt concentrate în tumoră cu un efect mai

prompt (Huwyler și colab., 2013, Jose del Jesus Valle și colab., 2016).

În lucrarea Jaboticaba (Plinia peruviana) extract nanoemulsions: development,

stability and in vitro antioxidant activity s-a demonstrat caracterul antioxidant al extractului

de Jaboticaba prin metoda DPPH și FRAP. Ambele metode au fost aplicate comparativ între

emulsia lipozomală care conține extractul Jaboticaba și extractul ca atare. Rezultatele obținute

au fost următoarele: atât în cazul metodei DPPH cât și în cazul metodei FRAP s-a arătat că

extractul încorporat în nanoparticulele au o activitate antioxidantă mai intensă, spre deosebire

de extractul folosit ca atare datorită protejării extractului în interiorul nanoparticulelor

(Mazzarino și colab., 2018).

Afecțiuni oftalmologice: Pentru inflamația zonei precorneale și segmentul

anterior al ochiului, corneea, au fost studiate diverse substanțe antiinflamatorii care au fost

incluse în sistemele lipozomale. Acestea includ: diclofenac, ibuprofen, flurbiprofen,

indometacină, triamcinolonă, toate având o biodisponibilitate mai bună și mai puține efecte

secundare față de substanțele administrate prin forme farmaceutice convenționale. În

glaucom, au fost studiate sistemele lipozomale cu timolol (Battaglia și colab., 2016).

Alte afecțiuni: S-a determinat in vitro activitatea neomicinei și a penicilinei incluse

în lipozomi demonstrandu-se că este eficientă substanța activă inclusă față de administrarea

acesteia sub o altă formă. Însă activitatea antibacteriană a cloramfenicolului, scade foarte mult

atunci când este încorporat în aceste vezicule (Kerami și colab., 2018).

Administrarea intravenoasă la șoareci a gentamicinei inclusă în sisteme

nanolipozomale a dus la modificarea distribuției substanței medicamentoase în țesuturi dar s-a

demonstrat că administrarea intramusculară duce la eliberare susținută la locul injectării cu

concentrație plasmatică prelungită (Vinícius Dias-Souza și colab., 2017).

Includerea rifabutinei în lipozomi duce la o creștere semnificativă a activității

împotriva infecțiilor cu Mycobacterium avium și Mycobacterium tuberculosis în comparație

cu rifabutina liberă. La fel se poate observa și pentru rifampicină (substanță chimioterapeutică

anti-tuberculoză) că activitatea crește dramatic prin încluderea în lipozomi (Griffith și colab.,

2018).

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Dias-Souza+MV&cauthor_id=29158706https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Griffith+DE&cauthor_id=30216086

37

Claritromicina inclusă este mai eficientă împotriva infecțiilor in vivo cu

Mycobacterium avium intracelular, iar terapia cu etambutol poate crește și mai mult

eficacitatea tratamentului (Onyeji și colab., 1994).

Tratamentul actual la paci