Teststrategi og metodevalg for diagnostikk av autoimmune ... for immunologi og... · Teststrategi...
Transcript of Teststrategi og metodevalg for diagnostikk av autoimmune ... for immunologi og... · Teststrategi...
Teststrategi og metodevalg ved
OUS for diagnostikk av
autoimmune leversykdommer
Randi Karlsen
Fagbioingeniør
Seksjon for medisinsk immunologi
Oslo Universitetssykehus
Ullevål sykehus
April 2016
Innhold
• Test repertoar
• Test strategi
• Metoder
• Guidelines
Analysepakker
Test repertoar ved OUS• ANA-IIF (kjerneantistoff og cytoplasmaantistoff)
• SMA (antistoff mot glattmuskel)
• AMA (antistoff mot mitokondrier)
• LKM (antistoff mot liver/kidney mikrosomalt)
• LC-1 (antistoff mot levercytosol)
• SLA/LP (antistoff mot soluble liver antigen/ liver pancreas protein)
• ANCA-IIF (P-ANCA)
• IgG, IgA og IgM
• ALD-Blot: a-M2, a-3E(BPO), a-LC1, a-LKM1, a-SLA/LP, a-PML, a-Sp100, a-gp210,
TEST-STRATEGI
LEVER DIAGNOSTIKK
LKS
ANA
IgG, A, M
Hep-2 PH50
CTD OG A-M2
KJERNE OG
CYTO-
PLASMATISK
MØNSTER OG
STYRKE
LKS-IIF
MØNSTER EV.
TITRERING
AKTIN-
ELISA
ALD-
BLOT
IMMUN-
GLOBULINER -
NEFELOMETRI
2. LINJE ANALYSE: ALD-BLOT
Metoder• Indirekte immunfluorescens
Vevssnitt av gnager lever, nyre og mage
Hep-2
Transfekterte celler
• Elisa
FEIA
• Immunoblot
Line immunoassay, dot blot
Indirekte immunfluorescens
LKS-slides• Tre sammensatte organer fra mus
• Kan teste på flere antistoffer samtidig
SMA, AMA, LKM, LC-1, GPC og ANA
• Screening fortynning 1/40
• Titrering av positive 1/80, 1/256 og 1/1280
• IgG spesifikt konjugat
• Må ha fluorescensmikroskop og kompetanse
• Kan automatiseres, billig og effektiv.
Negativ nyre, mage
Antistoff mot glatt muskel (SMA)Kan påvises hos ca. 80 % av pasientene med AIH (autoimmun hepatitt) type 1. Deles i undertyper basert dels på reaksjonsmønster i vevssnitt, dels på antigenkarakterisering. Den viktigste undertypen har et såkalt VGT-mønster, som viser at det foreligger antistoff mot F-aktin Mønsteret sees hos ca. 80% av pasienter med AIH. Mønsteret har en sensitivitet på ca. 80% og en spesifisitet på over 90 % for AIH-type1. Andre varianter av anti-glattmuskulatur er nokså uspesifikke og trolig av beskjeden diagnostisk verdi.Analysen har liten verdi av måling for sykdomsaktivitet eller prognose.
Ulike mønstre:
V (vessel): Fluorescens i cytoplasma til muskelcellene i Muscularis Mucosa, muskelceller i kar og muskelfibre mellom parietalcellene.
VG (Vessel + glomeruli): Som over, men også markant farging i glomeruli (mesangialt).
VGT (Vessel + glomeruli + tubuli): Som over, men også nålelignende farging peritubulært i nyrebarken samt i ytterkant av parietalceller.
V-mønster er lite spesifikk for AIH
VGT-mønster er svært spesifikk for AIH og assosieres med anti-F-aktin
Titer 80 eller høyere er viktig for diagnose score
Titer 40 kan bety noe.
SMA på mage, nyre
VGT mønster på nyre og mage
Antistoff mot mitokondrier (AMA)Har vært delt i 10 eller flere undertyper basert vesentlig på reaksjonsmønster i vevssnitt, i noen grad på antigenkarakterisering.
Diagnostisk betydning av de fleste av disse subspesifisitetene er usikker. Den diagnostisk mest interessante varianten er (M2), som finnes hos 90–95 % av pasientene med primær biliær cholangitt (PBC), og som kan opptre mange år før klinisk sykdom utvikles Det er ukjent hvor mange av pasientene med mitokondrieantistoff, men uten leversykdom, som senere vil utvikle PBC.
Mitokondrieantistoff kan også sees hos noen pasienter med autoimmun hepatitt (gjerne lave titer), hepatitt C og systemisk sklerose, samt mer sporadisk ved en del andre tilstander.Analysen har ingen verdi mht. måling av sykdomsaktivitet eller vurdering av prognose hos pasienter med etablert PBC.M2-reaktiviteten omfatter E2 -subenhetene i tre enzymkomplekser:
Pyruvate dehydrogenase complex E2 (PDC- E2)
2-oxo-glutarate dehydrogenase complex E2 (OGDC-E2)
Branched chain 2-oxo-acid dehydrogenase complex E2 (BCOADC-E2)
Mønster
• Kornet fluorescens i nær alle nyretubuli i margen(distale tubuli).
Kornet fluorescens i proksimale tubuli i barken P1>P2>P3.
• Kornet fluorescens i cytoplasma av parietalceller og hovedceller i
magen. Oppklaring av den sekretoriske kanal og skarp
celleavgrensning er karakteristisk. Kornet farging i leverparenchymet.
• OBS. Mulighet for prozone fenomen hvor det ikke er typisk farging i
nyren, men med prikker (relativt tett). Må titreres.
• Positiv test bekreftes med annen teknikk.
• Titer >40 regnes som spesifikk for PBC (primær biliær cholangitt)
• Ikke for monitorering. Flukterer ikke med sykdomsaktivitet.
AMA på nyre, mage og lever
AMA på Hep-2
LKM• Forkortelsen LKM står for liver, kidney mikrosomal autoantibodies.
• Anti-LKM1, 2 og 3 er rettet mot tre forskjellige enzymer i det
endoplasmatiske retikulum i leverparenkym og nyretubuli. LKM1 og 3
er vanskelig å skille mikroskopisk i nyre og lever fra gnager.
• LKM1 reagerer med cytokrom P450 2D6. Er markør for en
undergruppe AIH (type2), som er karakterisert ved negativ ANA,
forekommer hos yngre kvinner (ofte barn).
• Anti-LKM2 er rettet mot enzymet cytokrom P450 2C9. Medikament
indusert.
• Anti-LKM3 er rettet mot enzymet UTG1A (UDP-
glucuronosyltransferase 1A). Sees ved HepC, HepD og AIH.
Mønster
• Partiell farging i nyren. Relativt homogen farging innerst i barken, mer
variabelt utover i barken. Ingen farging i marg.
• Kraftig, relativt homogen farging av leverparenchym
• Vanskelig å se forskjell på LKM-1, 2 og 3
• Positiv test bekreftes med annen metode (LIA)
• LKM1 er assosiert med AIH type2
LKM-1 på nyre og lever
negativ på distale tubuli
LC-1
• Opptrer ofte sammen med anti-LKM1, og er da vanskelig å
påvise.
Nyremarg: Ingen fluorescens.
Nyrebark: Ingen fluorescens.
Magesekk: Ingen fluorescens.
Lever: Fluorescens i leverparenchymet med sentral-
lobulær avbleking
• Positiv test bekreftes i annen teknikk (LIA)
• Assosiert med AIH type 2
LC-1 på lever
ANA- indirekte
immunfluorescens• Ved AIH kan det være flere målantigener
Negativ på vanlige undergrupper
Kan være kromatin assosiert
• Substrat av gnager eller Hep-2
• Serumfortynning 1/40 er relevant
• Ved PBC
Centromer, nukleær membran, multiple nukleære dots
• Ved andre autoimmune tilstander og hos friske
Multiple nukleære dots og
punktert nukleær membran på
Hep-2
ANCA
• Atypisk p-ANCA
• P-ANNA: perifer antinukleær nøytrofil
antistoff (antigen i membranen)
• Ved PSC (primær skleroserende cholangitt)
og AIH
• a-Pr3 positiv hos IBD?
Anti-SLA/LP
• Sees ikke ved IIF-metodikk
• Elisa eller LIA
• AIH type 3 ?
• Oftest ingen andre autoantistoff
Oppfølgingstester
• Mitokondrieantistoff
FEIA: Phadia250
EliA brønn coatet med både nativt pyruvat dehydrogenase-kompleks fra mitokondrier og i tillegg det rekombinante M2-antigenet BCOADC-E2
LIA: Euroline blotmaster fra Euroimmun
Native M2 antigen
M2-3E (BPO): består av
E2-BCOADC, E2-PDH og E2-OGDC
Anti-glatt muskel positive
Anti-F-Aktin: Elisa-kit fra INOVA
Settes pt opp på alle SMA positive også
de med mønster V.
Finnes hos 52-85% med AIH eller
kronisk aktiv hepatitt og hos 22% av
pasienter med PBC, men også hos 3-
18% friske.
Line-immunoassay
ALD-blot fra Euroimmun• MA-M2= native M2 antigen
• M2-3E (BPO) :E2-(BCOADH), -(PDH) og -(OGDH)
• Sp100= speckled protein (100 kDa);
• PML= promyelocytic leukemia protein;
• gp210= glycoprotein (210 kDa);
• LKM-1= cytochrome P450 IID6;
• LC-1= formiminotransferase cyclodeaminase
• SLA/LP= UGA-suppressor-tRNA associated protein
• Mange antigener coated på en strips av
plast. Membran av nitrocellulose eller
nylon
• Detekterer mange antistoffer samtidig
• Fra manuell til helautomatisk prosess
• Fargeintensiteten leses av og graderes,
reflekterer antistoff aktiviteten
ALD-blot
Positiv kontroll
Ani-Sp100
Ting å tenke på
• Valg av metode
• Valg av teststrategi
• Kvalitetskontroller
• Ekstern kvalitetskontrollprogram
Guidelines• Diego Vergani et al. Liver autoimmune serologi; a
consensus statement from the committe of autoimmune serologi of the International Autoimmune Hepatitis group. Journal of Hepatology 41 (2004) 677-783
• Diagnostiske guidelines:
AIH(AASLD-guidelines): Manns, MP, Czaja, AJ, Gorham, JD, Krawitt, EL, Mieli-Vergani, G, Vergani, D, Vierling, JM. 2010. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatology 51: 2193–2213.
• PBC: (AASDL-guidelines): Lindor, KD, Gershwin, ME, Poupon, R, Kaplan, M, Bergasa, NV, Heathcote, EJ. 2009. Primary biliary cirrhosis. Hepatology 50: 291–308.
European Association for the Study of the Liver (EASL): J Hepatol 2009;51:237