Teoria y Tecnicas de Comunicacion Aplicadas a La Conciliacion
TESIS: TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR APLICADAS AL ...
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UNIVfílSIDAO NACmNAL A~rnNOMA Ot MtXl'CO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN
TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR APLICADAS AL DIAGNOSTICO DE ALGUNAS
HEMOGLOBINOPA1'1AS ( REVISION BIBLIOGRAFJCA)
T E s s QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO
PRESENTA
RICARDO ANTONIO GARCIA MERLO
DIRECTOR: Q F.I. GILDA FLORES ROSALES
CUAUTITLAN IZCALLI, MEX. --------'! TESIS COR FALLA DE OIU~
1988
UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis
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V
INDICE
Pág.
I. INTRODUCCION OBJETIVO •••••••••••••••••••.••••••••••••••.••• •
II. HEMOGLOBINA: ESTRUCTURA, FUNCIONES Y MUTACIONES. A. ESTRUCTURA DE LA HEMOGLOBINA HUMANA NORMAL.. 4 B. FUNCIONES DE LA HEMOGLOBINA: RELACION ES-
TRUCTURA-FUNCION e C. VARIACIONES NORMALES DE LA HEMOGLOBINA 1 l D. ORGANIZACION Y ESTRUCTURA DE LOS GENES DE
LAS GLOBINAS HUMANAS ••••••••••········••••• 15 E. TALASEMIAS Y HEMOGLOBINOPATIAS . . . • • • • • . . . • • 19
l. Las Talasemias .. .. .. •• .. . • .... ... ••• ••• 20.
2. Las Hemoglobinopatias ........ , • • • • • • • • • 43
Ill. TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR .........•••••• , • 61 A. OBTENCION DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO ••••• 64 B. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION .......•.••••.. 67 C. ELECTROFORESIS DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION
DEL ADN • . • . . • . . . . • . . . • . . . • • . . . . . . . . . • . • • • . . 72 D. IDENTJFJCACION DE SECUENCIAS GENICAS PARTI-
CULARES •.......••••..•.••.....•.••....•••.. l. Transferencia Southern
2. Hibridación con Sondas Genicas Molecula-
78 78
res .. • • .... • • • .... • ... • • • • .. • .... • .. • .. 80
vi
P&g.
IV. DIAGNOSTICO DE HEMOGLOBINOPATIAS Y TALASEMIAS MI. DIANTE TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR •••••••••• 95 A. DETECCION INDIRECTA DE LOS DEFECTOS MOLECU-
LARES DE LOS GENES DE LAS GLOBINAS •••.•••.• 96 B. DETECCION DIRECTA DE LOS DEFECTOS MOLECULA-
RES EN LOS GENES DE LAS GLOBINAS ...•.•••.•• 128 l. Mutaciones Puntuales que Afectan Sitios
de Restricci6n Conocidos • • • • • • • • • • • • • • • 128 2. Uso de Sondas Oligomericas Alelo-Especi-
ficas en Hibridaciones Diferenciales • • • ~147
3. Migraci6n Diferencial en Geles de Poli-
acrilamida • • .. . . . . . . . . . . . • . . . . • • . • • • • • . • 166
v. COMENTARIOS Y PERSPECTIVAS 175
VI. CONCLUSIONES
VII. BIBLIOGRAFIA 182
I. INTRO.DUCC.ION
OBJETIVO
L.a .hemoglobina ha feniilo·~ un ··pápet hist6rico en la
química, la biOlogía y ia :medÚina;· Fue la primer proteína
en .sei':'.'cÍ'istaliza_d_a y en· ser· a:~.oci~cda a una funci6n fisiol6-
gica ~spedfica, La morfología: cr.i.staUna de las hemoglobi
nas de difererites anim~les ap~~t6 la primera evidencia de
la." eSpeciffcidad de especie en estructuras protéicas; estuvo
entre ·_las primeras proteínas cuyo peso molecular se determin6
, cO~.rectamen te, fue la primer proteína eucariota en ser sin te
tizadá en un .sistema in-vitro libre de células, este experi-
mento demostr6 que el aparato para la síntesis protéica en
~eucariotes es similar al ·de Escherichia coli. El ARN mensaje
ro _globinico fué el primer mensajero eucariote en ser aislado
y secuenciado (1).
El descubrimiento de Ingram de que la anemia falci
forme es causada por la sustitución de un solo aminoácido,
de entre un total de 287, a la mitad de la molécula de la
hemoglobina demostr6 por primera vez que una mutación puntual
en un gen estructural puede provocar la sustitución de un
aminoácido en la proteína codificada por ese gene. Este des-
cubrimiento llevó a la fusión de
genética molecular
molecular ( 2).
la extensión
la genética médica con la
de la patología a nivel
La Hemoglobina es un acarreador respiratorio dual,
transporta oxígeno de los pulmones a los tejidos y facilita
el transporte, en sentido inverso, del bi6xido de carbono.
Realiza esta doble funci6n mediante cambios reversibles de
uu estructura. La forma arterial de la Hemoglobina tiene
una gran afinidad por el oxigeno; en la forma venosa esta
afinidad se invierte (1).
Los físicos gustan de probar los nuevos métodos expe
rimentales o nuevas teorías en el sistema más sencillo posi-
2
ble, el átómo .:·de. hÚrÓgerio •. ·La Hemogl.obina ha sido. llamada
"el átomo ·de .. li'idro.ge~Ó·, .. d.e la. biología" .:puesto que .. ha servido
par~ la apUC:aci6n d~Cnue~os:); sofisticados ~étC)dosde inves
tigaclÍ>~· (la cinétfca .de nano~~gundo~ y ia res'onÍincia magnética
nlic.1e·ar· 0-: e·n·'· su,.''.mom'8rito· _f./.?'~-~~ ~-~·c1e'fit.·eu;-e-nt.¡{;_~-:--l~s t~~nicas _de
;;;;:;.,,;~;!;:!!i!f };¡\/,:};¿{i\~~~~;~\~~~1:~~f:¡,;¡¡ de . este f en6meno· ha ofrecido ya'' re's~l Údoiíi'en :1,;:, 1:.,rapia de las h~moglobinopatias (3),
Las Hemoglobinas huma·nas· ~~an·~~m~i·~-s~ · s~n~ ai permitir la observacibn de los efectos "de una gran diver~·idad d~- errores ge-nét_ic~s sobre la estructura y -funci6n de uná
p~o~e,tna su relación con laS manifestacione·s clín_~cas.
Desde un punto de vista biolbgico, la acumulaci6n del gen
falciforme en regiones endémicas de malaria es una de las
m-&-s. ··-c-OriVincentes ilustraciones de la evolución por selccci6n
naturál (4);.
Como resultado de ser un modelo biol6gico de los
---más7'-estudiados _es ~_Ógico, como se mencion6 en párrafos ante
riores, que la vanguardia de la -Señét-ica molecular, la ingen;_~
ría genética, dirija sus esfuerzos al conocimiento de la He
moglobina, de sus patologías, el diagn6stico de estas y su
prevención y/o tratamiento.
Aún cuando las hemoglobinopatías no son un proble-ma
de salud camón en México (4), se decidi6 hacer una recopila
ci6n y revisibn sobre el uso de las técnicas de genética mole
cular en el diagnóstico de las hemoblobinopatl.as por los si
guientes motivos (sin establecer una jcrarqula):
I I. HEMOGLOBINA; ESTRUCTURA, - l'UNCIONES Y MUTACIONES
4
- : ;)': - • ~-- - : .. - > • '-.. '. -
A. ESTRUCTURA DE LA HEM§GLO~INA ÍIUMANA)ÓRMAL - .; :::· '.
_L_a~fh~.i.osic>~1n;;';;';J_\k __ e;¡_I_ªÜ_·-_~:_L_P_t::_¡:~~---~--g',~_:_·-~-~: __ -_:_:_·-.·::_h ___ v_--_-:._:_: ___ -__ :_:: los• vertebradosÍ, 0tó~d~ub1i0és_.; brados. y én;1os -. iadi~~les :d~ ,.1S'~na~•cpi;;nt~~ legumi-
-::,::·: :.:.·;< =_--__ '.:_._-~-~---~_>. _::'_;· __ :;_-_( :~: ,,. --~ -
:.i< - ~ -~~'--.-~}.'. > • hé~~gl~~i~a es una - metaloprotélna giobuÍ;,,X:
peso molecular ele 64 5_00 d~ltones, formada por c~a"tio c'..ae:rias.
pólipeptidicas ile globina y cuatr-o moHctilas pirrotiÚs, .\íue c~n;tÚ~y~n "1 Ham;,,do'Grupo llemo ( 6).
~-. La·s· cuatro cadenas polipept!dicas, pueden ser dos
alf_a-"-like (alfa y zeta) y. dos beta-like (epsilon, gama, delta
y ti~_ta)·1 · d0 ta·i ma~era que el tetramero de globina puede ser
repres.intadri por la f6rmula alfa-like2 - beta-like 2 • En el
hombre las relaciones entre las cadenas alfa y beta-likc de
peri-den del estado de desarrollo del individuo (embrionario,
,fetal o adulto) (3). Los sitios activos de la hemoglobina
·son los· cuatro grupos Hemo, El papel de estos grupos es el
transportar oxigeno, y· es la funcibn de la cadena protéica
que· le rodea el brindarle un ambiente adecuado para hacerlo.
Este ambiente debe ser hidrofÓbico y se logra gracias a que
los aminoacidos que rodean al grupo llcmo son neutros (7).
Como protcina, ln hemoglobina es diferente a otras
muchas debido a que no sufre grandes cambios coníormacionales.
Los cambios que se suceden durante la oxigenación y la desoxi
genaci6n estan confinados a la relación que mantiene una cadena
con respecto a la otra, quedando las cadenas individuales
intactas, manteniendo as! constantemente el ambiente hidrof6-
bico alrededor del grupo hemo (7).
5
1. El Monómero de Gfobina
El m;c:>"ºln,er~ .. ·. d~· ·globina es una larga secuencia de
amin-oá.cidos, ~~-~·o :.·¡;a18I-es· .·Y ·polares, - de los cuales el 75% se
encue~trá·n<·· en•> una .conf;rmaci6n- ·de alfa helice (figura 1),
L8: .. ca~~-n~: .. --:~~··<~·.bbi·~. ~cÚ>:re :.~¡.·~is~':' d~~do 1ugar a ocho segmentos
helicoidales u~id'o.s mediante esquinas no. helicoidales (7). '->.~~- ·--_::_-. ··:,,·~~ ',• ': - .::
-L~ e~-truc·tura t·erci·a~ia de ia cadena esta determinada
principalme.nté pór la. posici6n en la hélice de los aminolicidos
pa'larés· Y-.·: no'' políires; Así es que debido a la periodicidad
de. la_,tiÜice _ (3,6 aaiinolicidos en cada vuelta completa). la
cera interna dj la hélice es ~o polar (hidrof6bica) y la super-
ficie es polar (hidrofilica). Los aminoácidos internos no
polares son de vii:al importancia para la estructura y funci6n
dP la ·cadena¡ s-us -c-adenas laterales hidrof6bicas se unen,
ya sea un·a con .otra, con arilinoácidos de hélices adyacentes
o Con el grupo hem. Los aminoácidos polares externos permiten
la solubilidad en el agua de las cadenas (8),
2. El· Grupo Hemo
. El g~-·~p·o;:·.-.;heiDO e~_ u.~-~-.-PO~fir_ina. que contiene un átomo
de· hierro; ·La P.orfirin.a o· protóporfirina III comprende ella
misma:_.~ ,4 anillÓS. p~r.ro·¡-, con extremos nitrogenados, unidos
por PUf':!'.Ot·e·s .:mete.no . c.:..:cff-} .·y. oé:ho cadenas laterales; metil,
vinil -- ¿ áci_do p~opi_~."_ic_o~ El átomo .de hierro se sit6a en el :·ce.ni:.ro.:.-de . la· porfirina·,-, Íija'do a los cuatro nitrogenos
de los n6cleos pirrol quedandole dos vaiencias libres (Fe 2+)
(B) (Figura 2).
El grupo hemo se sitúa en un repliegue de la estructu
ra terciaria de cada monomero ·de globina llamada "bolsa del
hemo 11, y se fija en su sitio, por una parte, por las uniones
Figura 1. Representnc1on d1agramat1ca de la co~ f1guracion tercia.ria de la globina de los mnmif~ roa •• Se muestra la posic1on dal grupo hamo (en. negro)dentro de la bolsa del hemo. (7)
6
_¡¡
Figura 2. La molecula del hemo. AP acido pr,g pionico; M = metil¡ V = vinil. (8)
Cadena de globina
Aproxinl!l cion por ':<~::z=:z:=J::Z:::Wiil~--las cadenas cido J'.lrol'.lionicas del homo
Figura :;.. Las uniones hemo-globina. (8)
7
8
. -·-
que inté.~éambian las cadenas 'laterales del .écido propi6nico
del hem y.·.la globina; por otra, el hierro qu.e dispone de dos
vBlencias./libres fija una de ellas difecfamente sobre un re
siduo ·histidina llamado ."proximal" y .. la''otra act6a poi: la
cara opuesta a la molécula del hemo fijando una molécula de
ox~gé_no y, gracias a· su acci6n asegura· -·üna_ aproximaci6n suple
ménúiria sobre otro residuo de hist"i.dina llamado "distal"
d~·la globina (8), (figura 3),
3, El Tetramero
El i:etramero de hemoglobina (Rb A pór ejemplo) puede
ser considerado como un par de cadenas alfa acom~dadas simétri
camente sobre un par sim~trico de cadenas beta,· pero diagram6ti
c6mente puede representarse como se muestra en la figura 4.
--Existen dos regiones de contacto entre cftdenas diferentes,
c6no~ldas como region~s de contacto alfa 1-beta1 (o alfa 2-beta2 )
y el contacto alía 1-beta2 (alfa2 -beta1). El contacto alfa1 -
beta 1 es grande y firme (formado por el contacto entre 35
aminoácidos) y estabiliza a las cadenas en dimeros de alfa
beta (7).
El ot~o contacto,· el-a~fa 1 -beta2 (formado por contac
to entre 19,. am'inoácid_os)_, .. ,-es _ei contacto funcional¡ es a tra
vés de el que· se sucede el ·cambio estructural de la molécula
dti~antc· los procesos de oxigenaci6n-desoxigenaci6n (7).
B. FUNÍ:ÍONES DE LA HEMOGLOBINA: RELACION ESTRUCTURA-FUNCION
Siendo la hemoglobina el pigmento respiratorio de
los globulos rojos, asegura varias funciones:
La funci6n principal es el transporte reversible
de oxigeno desde los pulmones hasta los tejidos. Cada molé-
Figura 4. Representacion diagramatica de las relaciones entre las cadenas alfa y beta del tetramero de hemoglobina •• El contacto alfa 1-beta1 (alra2 -beta2) es el contacto estabilizante: el contacto alra1- beta2 (alra2-beta1) es el contacto al tra-ves del cual las cadenas beta se deslizan durante la o:dgenacion y dcsoxigonacion. (?)
9
10
cu la de· hemoglobina fija una molééula de oxígeno. (02 )· sobre
eí" .hi cr.ro .... de cada grupo hemo, Const~ tuy~ndO ia· -'<iXi.h_·~.moglob-in.a. La molécula humana de· henioglobina e~hibe otras tres: pro.pieda~ deS·· q·üe f~vOrecen a su fu'nción pl-inc.ipal: prin!ero ··:~ª- .-~-ñ·terac·cióñ hcmO-:hemo o efe e to cooperativo, s~g·u-~do·:<t · la:·/Jl.átiiiiiad· para l.igar.· iones H+ (efecto Bohr) y
de'.!iga~ fosfatos orgánicos (2, 3-DPG) (7,
. Ya se mencionó que el agua debe ser manten.ida fuerá
'de -Ya ffÓlsa del hemo para que este pueda funcionar.. La expli
·éac{óñ -i{·e·s-tO· puede verse al examinar la -reacc.ión hemo-oxígeno.
En ->Sü e_St8do reducido el átomo de hierro tieñe dos cargas
(+)y ~n electr6n desapareado (e-). En la oxigenac16n, el
o:d.g~no_ ~otra a la bolsa del hemo y comparte este electrón.
La ·unión qúímica entre el oxigeno y el átomo de hierro es
un enlace i6nico dHil y se rompe facilmente al disminuir
:la conceritraci6n de oxígeno en los tejidos:
.• Fe+:'°-(2) + o2 ~ Fe+++-(e)-02
(reversible)
.Cuando el oxígeno se libera, el electrón es devuelto
al átomo de h~_~r~~-1 z:egresando este a su estado ferroso
(Fe++:(~)-). Sin embargo, si el agua (H20) ganara acceso al
hemo,, desplazaría al oxígeno, reaccionaría con el Fe++ y acep
taría al electr6n del átomo ferroso, oxidandolo irreversible
mente a su estado férrico (metahemoblogina):
2. Interacción Hemo-Hemo
Cuando un grupo hemo adquiere una molécula de oxígeno
11
sufre un cambio en su conformaci6n de tal manera que se alteran
las relaciones entre las cadenas. Este movimiento se reduce
a _un ·désplazamiento de las cadenas beta sobre las uniones
ál~aJ:~beta2,. Durante la oxigenaci6n la molécula se 11 abre11
y :en-.-1a desoxigenaci6n se ~'cierra'~. Este cambio en la confor
maC.i6n ·~u~enta la capacidad de los otros hemo para ligar oxí
geno.- El_ P_roceso in.verso se observa cuando la molécula cede
al ~~Íg~~~. Este. fen6men6 se llama interacci6n hemo-hcmo
(!).
3.
c· •• \ .•.• :cLB ·~anfidad de OXÍgeno que la hemoglobioa puede ligar
a Cu~lq~.~er _ _..'"concentraci6n de o2 es conocida como afinidad
por· .el .o.xigeno .(exprezada como P50 - la p0 2 requerida para
saYurar 81 so% la mo°lécula).
·El pH y la presencia de fosfátos orgánicos influen
cian a esta propiedad (7).
4. Transporte de Bioxido de Carbono
Otra funci6n de la hemoglobina es el transporte del
C02 desde los tejidos a los pulmones. Solamente una parte
del co2 (alrededor del 40%) es transportada en esta forma.
La hemoglobina fija al bioxido de carbono no sobre el átomo
de hierro como hace con el oxigeno, sino sobre los grupos
aminados laterales de la globina, para constituir la carboxi
hemoglobina (8).
C. VARIACIONES NORMALES DE LA HEMOGLOBINA
edades.
La hemoglobina humana no es la misma a todas las
Las diferentes hemoglobinas que se presentan ·en las
12
"ªriadas etapas del desarrollo del !ndi.viduo se forman por
las -dist:inl:áS comb.i'nacion~s entre cadena·s monomerica~ de glo
bina. Las. cadenas m0nomeric8s p~eden ser alfa-like (alfa
y ietii)". de 141 aminoácidos .de largo º'' beta-like (epsilon,
gama, delta o beta) con 146" aminoác.ido·s (3).
La configuraci6n - tridim~~sional de las cadenas alfa,
zeta, epsilon'1 ·, ga.ma, delta y. be.ta es la µiisáu~ .. (figura 1).
Las diferencias entre ellos reside en la secuencia y. número -
de aminoácidos :que. las .forman (3).
En lá tabla· ·1 se indican los diferentes tipos de
hemoglobinas ·que se presentan durante el desarrollo del indi
viduo sano: En los tres primeros meses de la gestaci6n humana,
los islotes sanguineos del saco vitelino sintetizan las llama
das hemoglobinas embrionarias, que asocian cadenas embriona
rias (zeta y epsilon), fetales (gama) y del adulto (alfa),
según la edad del embri6n: Gower 1 (zeta 2-epsilon 2 ), Gower
2 (alfa 2-eps!lon 2 ) y, Hb Portland (zeta 2-gamma2); esta última
es hallada en trazas normalmente en el cordon umbilical.
Subsecuentemente el hígado fetal y la médula ósea se activan,
siendo este Último el principal órgano eritropoyetico en la
vida adulta (figura 5 ), La principal hemoglobina durante
la vida fetal es la hemoglobina fetal HbF (alfn2
-gama2), cuya
afinidad por el oxígeno es más fuerte que la de la HbA. Alre
dedor del nacimiento ocurre el más interesante de los cambios
en el desarrollo del individuo: el cambio de HbF a llbA (alfu,
beta2). Otro tipo de hemoglobina del adulto es la HbA2
(alfa;
delta2), la cual aparece al mismo tiempo, pero permanece como
componente minoritario (1-3.5%) durante la vida adulta (tabla
11). Poco se sabe sobre los factores que disparan el cambio
de la llbF a la adulta; se ha observado que la desaparición
de las cadenas zeta y epsilon ocurre paralelamente, sugiriendo
un cambio coordinado de la expresi6n de los genes embrionarios
(zeta y epsilon) a los fetales (alfa y gama), junto con el
Heoes de Gestacion
Saco Vitelino
Higa do
Medula osea
Figura 5. Representacion esquematica de la actividad de los diferentes genes globinicoa (parte superior) y ~e loa diferentes organoa hematopo -yeticos (parte inferior) durante la gestacion, _ niñez tempr~na y vida aC.ulta. (9)
13
14
TABLA I. Las He:noglobinas Humanas (9)
Tipo de hemoglobina Composicion Presente en de
Cadenas
Hb t. «L (!li_ Vida adulta(95''); trazas en la vida fetal
Hb F O(~".% Vida fetal (:pre do-·. minan temen te); en
vida adulta( 1-2'~)
F.b A2 «%, ~z. Vida adulta ( 1 -2"i)
Gower-1 ~ '-.e ~12 semanas
Gower-2 o<i'-& <12 semanas
Portland ·~ "(L <12 semanas
TABLA II. liemoglobinas del Adu1 to Sano (9)
Hemo15lobint1 A (At&t>z) .......................... .. 97-99. %
Hemoglobina A2 (.C1Í¡) .... : .. ·· ............... ~ •.. 1- 3.5%
Hemoglobina F (O(.z ll'¡) .............. ;., ......... .. indicios
1.5
cambio · eriÚopoictico · del·' saco :.vitelino al hfg'!do fetal.
La persistenciá de pequeñas canticl.ad~; d\.. H(PorÚ.iiid •durante
la .vida fetai ;e asemeja a ia>pe.rsistencúi de :~i;Ciu€ñas. canti
dades de HbF d~~a~te. l..i vida adul·t~· (9>:} ~} .. L . · '¡-'
;La;s •.. d~·fere.nte: h~:ogl~b{~~.:ik~f~~~~~i~P'~~d~k iij~~ifi_. .. :.:.:. ~.e< 7.·~·~~-.~1.·)v:e"~···.ª. ºt.·:.ml~<ldo;~ •.• ;ü,~/~·¿9~:ein~!e~~&~.:_;Jfa~ J¿á~tica
'·; .. :.·· - - -"·:o,-:· ·~.~~{:_ 'o."i;,~;~~~· ~:.~~~-~-- ;·~'.;_,}_·_,~:::- C," :~~:,-,-. !-=-' -.-¿;/ -· - '' ''--,,"!;".:--J ;:•:.''· -·,-;;e'':'- ··:s.':; ·::,:~ -~ -=~-==
-:::::'~;ik~{~;~i"~~k~~Niif~~lI~l~¡;-~l:á;~:F::::: • E1 estudio de la re~istenci; a la de~nat~r~Hza~16~ ·.
alcali[Iª• q~e·.:permite dosificar laHbF, m~·y. resi .. tente a pH
alcalinÓs (7. ·s).
Se puede tambiln estudiar la rcpartici6n de la
HbF en los globulos rojos por medio de una tlcnica inmunoquimi
ca con la ayuda de anticuerpos antiHbF (9).
D. ORGANIZACION Y ESTRUCTURA DE LOS GENES DE LAS GLOBINAS
HUMANAS.
l. Organizaci6n
Los - genes de las globinas humanas se presentan en
familias multigénicas; los genes alfa-like se localizan en
el br.azo corto del cromosoma 16, entre 16p12 y 16pter (10),
los genes beta-like ocupan una regi6n, de aproximadamente
70 Kb 1 en el tercio distal del brazo corto del cromosoma 11
(11). Hay dos genes alfa y 2 gama, totalmente funcionales
en cada cromosoma 16, reflejando su duplicación durante la
evolución y la accibn subsecuente de eventos genicos modifi-
+ -- HbA HbF HbS ---- - h'b A2 y Hb C
Figura : .Micracion electroforetica do diferen
tes hemoglobinas (8)
16
17
¡·.sdores (figura ~). La tan -cercana relación entre los genes
delta y beta habl.a de una duplicaci6n genice, pero mutaciones
posteriores en la regi6n reguladora del gen delta han hecho
a este gen funcionalmente insignificante. Así pues, existen
solo dos genes beta funcionales por célula diploide. Tanto
la familia alfa como la beta incluyen pseudogenes. Estos
son el resultado de la evoluci6n y, representan a genes previa
mente funcionales que debido a mutaciones secuenciales se
han inactivado, (10, 11).
2. Estructura
Un gen prototipico de globina incluye tres secuencias
codificantes (exones} separadas por dos secuencias interven
tivas no codifican tes (intrones) (12). Justamente antes de
las ··secuencias codificantes para el ARNm, en las fronteras
exon-intron 1 y al final de las secuencias codi[icantes para
el ARNm, se localizan secuencias conservadas importantes para
el funcionamiento genico. Los promotores pora los genes glo
binicos incluyen secuencias en el extremo S' que son esenciales
para la fijaci6n de la ARN polimerasa y para una transcripción
confiable y eficiente (13). Las diferencias en el arreglo
de las secuencias conservadas en las regiones promotores entre
los diferentes genes globinicos pueden ser la clave para su
expresi6n selectiva durante el desarrollo (9). Las sencucncias
en los límites exon-intron son cruciales para la remoción
_confiab_le de los intrones en el ARN transcrito y lü suLsccucn
te re-uni6n de las secuencias codificantes para la formación
de una molbcula funcional de ARNm (14), La transcripción
parece continuar más allá de la posición que, en el ADN 1 corres
ponde al extremo 3' de la región codificante; secuencias con
servadas halladas en esta posici6n pueden ester involucradas
en la terminación de la transcripción del ARNm y en la adición
de adenosines para formar la cola de poliA (15). La cola
18
~ '('$y< cl.o<l
..iChúS 0cC like 5' • QQCll!I , 1 -' Cromosoma 16
Genes f.. lrne 5' (. '1~'}- r!> .r ~ 3' Cromosoma 11 • •• e • • 1 1 1 !.o lo !;o 1 o 10 20 60 Kilo bases
Figura 7. Mapa de las familias de las elobinas humanas.
La familia alfa-lI\<e contiene tres eenes funcionales, zeta,
alfa2 , y alfa1 , y do5 seudocenes, psi-alfa y psi-zeta. Talos
seudogenes tienen homologia de secuencia con los genes funci.2 nales pero son defectuosos en algunos componentes esencialos
pera la oxpresion, y por tanto, no pueden expresar a
dueto globinico. La familia beta-like incluye a los
tes genes funcionales opsilon, AgaM, ªeama, delta y
.su pro
sieuien beta y
un seudogon, psi-beta. Los genes zeta y epsilon son expresa
dos durante lQs tres primeros meses de la gestacion, origi -
nando la horr.oglobina Gower 1 (zeta2 -epsilon2 ). Los geneo du
plicados alfa y eama, son expresados desdo otapas tempranas _
do la gestacion ya que es posibls> hallar H1; Gower 2 (alfa2 -
epsilon2 ), Hb PortlAnd ( zeta2-gama2 ) y Hb F (alraz-gama2 ) on
la sa:igre retal durante el aegunJo tri:.1ostre. El gon beta _
tambien se activa temprano en la gestacion, sin embargo el cambio importante on la sintesis de las globinas, de la cada
na gama a la beta, ocurre en el periodo peri na tal, cuando la
Hb A (alra2-beta2) se convierte en la hemoglobina mayoritaria. (180).
19
de poliA puede ser '0
ilÍlp~;tant~ 'pa~a el ~ransporte del ARNm
del n6cleo al ~\~oplasmi y en l~ ~stabHidad del ARNm en este
6ltiino meilio.;(9) ."/:fa ::· E. T~LA~~MI¡~ . Y k~MOGLO!II~~:P~T~As
", .~-' - · -·'-' ··- ···::_ - ,. ; .: -L-a~·'.:~~-u~-~-~i~;~.e-~-:-~n- 'fas· :·10Cus :de las ·globinas han con-
tribuido ;co~~ide~ableinenl:e a la morbilidad y mortalidad huma
na. Ademil.s, la· postulada superioridad del heterocigoto porta
d0r ':~e B_fgunaS- de estas mutaciones en la lucha contra algunas
hemoparas~~osis, ha permitido la persistencia de estos alelos
en algu~as poblaciones. Al nivel protéico, tales mutaciones
han sido detectables por más de 30 años, a través de técnicas
rutinarias de electroforesis de la hemoglobina y del mapeo
polipeptídico. - Un gran número de variantes hemoglobinicas
han sido descritos y catalogadas brindando importantes elemen
tos de conocimiento sobre el funcionamiento de la hemoglobina
(42).
Las mutaciones en los genes glob!nicos se han clasi
ficado tradicionalmente en: 1 1 hemoglobinopatias o mutaciones
cualitativas, que se definen como hemoglobinas anormales con
uno o más cambios estructurales, usualmente un cambio Único
en un aminoácido de una de las cadenas globinicas 1 que se sinte
tiza a un nivel normal o casi· normal. Algunas de estas muta
_ciones son 11 silenciosas 111 es decil· que no se afecta ni la
funci6n de la proteína alterada ni el fenotipo del portador.
Otras, como la hemoglobina S falciforme, debido a sus importan
tes alteraciones fisicoquímicas 1 son la causa de serios feno
tipos patológicos. 2 1 los síndromes talasemicos o mutaciones
cuantitativas, agrupa a mutaciones que no afectan la estruc
tura de ·la globina sino que resultan en una disminución de
la biosíntcsis de cadenas globinicas específicas. Esta senci
lla clasificación de las mutaciones en los genes globí.nicos
20
es violada por o~ras mutacionesi que han sido llamadas hemoglo
binopatias ~alasemicas, que producen tanto una alteraci6n
de la e~tructur~ g~obinica como una disminuci6n en su síntesis
(9).
1. Las TalBsemias
Las talasemias son anemias hipocroJ!licas-microciticas
que:"_, se __ Car~c-terizan_ por un desbalance en la síntesis de una
o mh de las cadenas globl.nicas de la hemoglobina (7, 8).
Las talasemias se clasifican de acuerdo a la cadena cuya sín
tesis esta disminuida: alfa-, beta-, delta-beta-, delta-,
gama -delta-beta-talasemias. Además, existe un grup"' de
desordenes, no bien definido caracterizado por la pcr~istencia
de hemoglobina fetal en el adulto (persistencia hereditaria
de hemoglobina fetal o PllllF), y que son el resultado de una
forma extremadamente suave de talasemia en la cual la produc
ci6n defectuosa de cadena beta o delta-beta es compensada
en gran parte por la síntesis persistente de cadenas gama
( 39).
La síntesis desbalanceada de cadenas glob{nicas resul
ta no solo en una hemoglobinizaci6n defectuosa del hematíe
sino tambi"én el'! h~mÓlisis provocada por la precipitación in-
tracelular de inC.-lllsioil_e_s ___ formadas---por -la_ -cadeñ_a_ -sintetizada_
en relativo exceso. Así pués, la anemia se debe a una éom
binaci6n de hiposl.ntesis hemoglobl.nica y de· liem6lisis intra
medular y esplénica (39).
El estudio de familias afect.adao por talasemias ha
indicado que estas mutaciones se heredan como alelos de los
genes globinicos-. O .sea·, qué las mutaciones talasémicas afec
tan al gen de globina mismo o a una porci6n de ADN muy cercana
(ligada) al mismo, Las talasemias son mutaciones que actúan
en cis. Una mutaci6n en cis afecta solo al gen del cromosOma
en el- cual S!-Jciide- la mu_tación¡ una mutaci6n que actúa en tra·~·s influye ·la ~xpresi6n de ambos genes de un locus cromosoma!.
Esto~- ·h~chos explican el comportamiento recesivo de los sin-:.:
dromes talasémicos mayores, que requieren de "doble dósistt'
de la mutaci6n para conferir un fenotipo patol6gico grave
(9).
El desbalance en la síntesis de las cadenas de globina
a nivel protéico puede ser el resultado de mutaciones a dife
-rentes __ ni-Veles. Por ejemplo, las mutaciones pueden afectar
la- estructura del gen, la transcripci6n del gen, la maduración
del ARNm ::o la traductibilidad del ARNm maduro. De hecho,
actualmente ~e han descrito mutaciones a casi todos los nive
les. Los sindromes talasémicos son heterogeneos al nivel
molecular, hecho no sorprendente en vista de la complejidad
estructural y funcional de los genes globÍnicos (180).
Naturaleza de las Alfa-Talasemias
Por muchos años las alfa-talasemias representaron
a un confuso grupo de desordenes caracterizados por mostrar
un vasto rasgo de manifestaciones clf.nicas, así como la exis
tencia de muchos y variados pedigris familiares. Sin embargo
con el advenimiento de las técnicas de genética molecular
ha sido posible el estudio directo de los genotipos y con ello
la complej:t dad de los fenotipos se tornó en un problema desen
traña ble.
Antes de describir las diferentes formas de alfa
talasemias es necesario revisar su nomenclatura (tabla 111):
Un indivi.duo con sus cuatro genes alfa intactos se denota
alfa, alfa/alfa, alfa. Un individuo con un gen alfa inacti
vado o reducido en sus [unciones se ha designado como alfa-
22
.TABLA III. Las Alfa Talasemias (42)
Designacion
Sano
Tal 2 ó portador cilencioso
Tal 1 o rasgo talase,,,ico alfa
Manifestaciones clinicas
Ninguna
Asintomatico
Asintomatico a anemia muy ligera
Enfermedad de la HbH Anemia
Hidroposia fetal o Muerte e n-utero anasarca fetoplacentaria . del teto
Numero de genes alfa afectados y representacion
2 --.*« o -0(. /-ti(
3 --/--<.
4 - - / - -
23
taláSeD\ia-/2 ·y,· se le denota como -,alfa/alfa, alfa: tal indi~
vi-duo_ preSenta un mínimo de alteraciones hematológic-as Y· se le llama "portador silencioso", su diagn6stico se infiere'·
pÓr. e.studios familiares y por una disminuci6n en la biosínte
si~ de. la cadena alfa. Por otro lado, la alfa-talasemia .1·
~- ···ur~sgo talasémico" involucra la pérdida funcional de dos
genes alfa y resulta en una anemia suave con alteraciones·
morfológicas de los hematies y una ligera disminución en los
niveles de hemoglobina. Tal individuo puede ser -,alfa/-,alfa,
que es la forma usualmente presente en los negros o. si los
dos genes alfa no funcionales se hallan en el mismo cromosoma,
-,-/alfa,alfa. Si tres de los cuatro genes alfa no son fun
cionales, la denotación es -.-/-, alfa: tales individuos pade
cen el mal de la HbH caracterizado por anemia cr6nica, esplcno
megalia y alteraciones morfo16gicas de las c~lulas rojas origi
nadas por inclusiones de HbH (tetrameros de globina beta).
La forma más severa de alfa-talasemia es aquella en la que
no existe~ genes alfa funcionales¡ esto origina infantes hi
drópicos que mueren en utero, o poco después del alumbramiento,
que presentan como único componente hcmoglobinico las
Hb Bart ( tetramero de la cadena gama) Hbl!. Debido a la
alta afinidad por el oxígeno que posee la Hb Bart, esta casi
no libera oxígeno a los tejidos provocando hipoxia, hidropismo
y muerte fetal (42).
Todavía a principios de la década de los 1970's se
pensaba que la deleci6n de los genes alfa era la única causa
lidad g6nica responsable de las alfa-talasemias (16), Estudios
de cinética de hibridaciones de ADNc de alfa-globina con
ADN de- pacientes alfa talascmicos indicaron que la deleción
de la mayoria (si no es que de todos) de los genes alfa se
presentaba en estos pacientes ( 17, 18). Sin embargo estudios
posteriores (19, 20) demostraron la existencia de genes "tala.
sémicos", esto es, genes que aún estando presentes en el genomio
. ,
celular .. , no dirigen fa :Sin tesis de· .. lá cadena, alh. · pilra · la. :
cual co'diHcan:·
·"·· ·;·- "':,_ .. ·--,·-: ._,·;." ..
El . ¡~v~nimi~nt~ 'de las técnicas de clonaci6n mole-
c~lar ,_ ,.~~~Úe·~~ .. ¡a~1;6n· d~1·:· .. _ADN y mapeo con enzimas de restric
ci6n ¡,·:ha --~tev-Sdo 'a una mejor comprensión de las bases molecula
-re~ ~~~los~r~~~reglos del ADN que desembocan en las alfa-tala
semias: El análisis de las secuencias de los dos genes al fa
·-globinicos y el estudio de las secuencias que los flanquean
han mostrado la existencia de segmentos altamente homologas,
- d~ptic6d0-s en tandcm, dentro de la familia olfa-like (familias
de secuencias repetitivas Alu Kpn) (180), La presencia
dé estas regiones altamente homólogas predispone a los genes
de esta familia a eventos rccombinantes. el malapareamiento,
durante la meiosis, entre dos bandas de ADN de un par de cro
mosomas homblogos puede originar la deleci6n de uno o varios
de los genes cercanos al evento (180).
En la figura 8 se muestran las deleciones descritas
para el locus alfa-like. Existen dos deleciones que resultan
en el haplotipo -,alfa/. La deleci6n -,alfa3 • 7¡, tambi6n
conocida como ''delecibn derecha'', parece haberse
por un entrecruzamiento desbalanceado entre genes
alfa2 malapareados. Esta deleci6n origina en el
-,al[a/ un gen alfa híbrido, siendo su extremo 3'
el S' alfa2 (180).
originado
alfal
cromosoma
alfal y
la otra a-tal-2 se denota como -,alfa4 •2¡ debido
a que se pierde un segmento de 4',2 ,Xb. Es conocida tambi~n
como la "delcci6n izquierda" .c,i8o').
As{ como uno de los_~rod~~to~ d~ estos entrecruzamien-
25
'¡; n: 'I"'- oc?. oci m rnmm m
- alfa-tal 2 - alfa3.7/ - alfa-tal 2 - alfa4.2./ - alfa -tal -Calra)5· 2/
alfa-tal ASU/
alfa-tal Med/
alfa -tal - (alfa) 20/
Figura 8. Delaciones en la Al fa TalaGemia. El locus de la
globina alfa y la seis delaciones conocidas se muestran. A-
quellas que dejan un ¡:;en alfa funcional originan el feno:t~po
de al fa-talasemia 2, mientras que aquellas que destruyen la funcion de ambos genes alfa originan la alfa-talasemia 1.
Las aroas oscuras representan di do, mientras quo las are"s tidumbre sobre el final de la
porcioes que se sabe so han peL
rayadas rep1·esontan la inceL
delecion en aquellas mutacio -
nes que aun no han sido.secuenciadas. En aquellas dolciones
en que se ha caracterizado la cantidad exacta de AD!I perdido
esto se muestra como un indice en el haplotipo. Por ejemplo --alfa3· 7/ representa un haplotipo en el que un gen alfa perm,!!.
nece funcional y se ha sufrido una delecion de :;. 7 kb. ASU
representa una delecion hallada en el Sureste de Asia, y Med
una descrita en el Hediterraneo. {18d)
26
tos desbalanc~ados· es un cromosoma con sol? un: gen: ,a~fa, ,_e~
de esperarse que se pr·<;;auzca, -·e·n e1 mismo.'" evénto .. ; un cromosoma : . . ·-:.
con 'tres geries alfa! ~st~s C:romosouias ya han ·.sido. _descritos
(21).
La deleci6n i.iquierda· es ·com6~ entre·· i.ndividuos Orien
tales (22) y se prese~ta 'también. aunque con baja frecuencia.
en Saudi Ar~bia, pero no se le ha hallado ni eri el Mediterraneo
ni en América (23). ·La deleci6n derecha es vista distribuida
mundialment"e e·ntre todos los grupos raciales (Orientales,
Mediterraneos y Negros) (9). El cromosoma con un solo gen
alfa" es más común que el cromosoma con el gen al fa triplicado
(24). Los griegos chipriotas muestran la mayor frecuencia
de alfa-talasemia entre los individuos blancos y de cromosomas
con el gen alfa triplicado (25).
Las deleciones que llevan a la pérdida de ambos genes
alfa en un cromosoma {alfa-tal-1) pueden ser explicados por
mecanismos de ruptura-reunión de los cromosomas y dan lugar
al haplotipo -,-/ (25),
,Las deleciones de un solo gen alfa, que dan lugar
al haplotipo· -,alfa/, son comunes entre los Negros y los Medi
terraneos (26). Mientras que el cromosoma sin genes de alfa
globina es típico de individuos Asiáticos (26). El hallazgo
del haplotipo -,-/ en los Orientales explica la ocurrencia
de la íorma·más severa de alfatalasemia, hidropismo fetal o
.anasarca ~~t6-placentario, en este grupo. Este cuadro no
se presenta en los negros ya que su genotipo alfa-talasémico,
alfa,-/alfa,-, hace difícil la ocurrencia del homocigoto
-,-/-,- (27).
27
Reorregl~s en. los genes zeta.
-Debido a la alta homología entre las secuencias de
los .senes ze.ta y·· pseudo-zeta, no es sorprendente que se origi
nen en~recruzamientos desbalanceados entre ellos, dando por
resultado cromosomas con genes zeta 6nicos o triplicados.
Sin embargo no se ha definido aún si estos rearreglos tienen,
o no, un efecto fisiológico durante la vida embrionaria o
adulta (9).
Hemoglobinopatías alfa-talasémicas.
Las hemoglobinopatias alfa-talasémicas comprenden a un
grupo heterogéneo de mutaciones que originan ausencia o re-
. ducci6n en la- expresi6n de los genes alfa que estructuralmente
estan p_resentes (tabla IV). La herencia de tales mutaciones,
en combinaci6n con mutaciones del tipo alfa,-/ o -,-/, origina
una gran variedad de manifestaciones clínicas (42).
Mutaciones que alteran sitios de corte en el ARNmhn
Se conoce como ARNm heterogeneo nuclear (ARNmhn)
al transcrito de ARN que aún posee intrones y otros caracterís
ticas del ARNm inmaduro. Se ha descrito una deleci6n de cinco
nucleotidos que elimina completamente el sitio diana de corte
del primer intron del gen alfa2 y activa un sitio oculto de
corte dentro del primer cxon (28). Un aspecto interesante
de estas mutaciones es la apariencia de que existe cierta
"presión" que obliga a completar los cortes en el ARNmhn,
aunque sea incorrectamente, antes que dejarlo sin procesar.
Mutaciones en el codon de terminación.
El codon normal de terminaci6n de la traducci6n,
28
TABLA IV. Hemoglobinopatias Alfa Te.lasemicas (24)
-lecanisr.io t10lecular del Anorcmlidnd estructural
e!'ecto talase:;;ico en la globina
U.J Perdida del terminador (A) Cadena glooinica alargada
nor?:1al (1) Hb Constant Spring
«. ( 142) ter Gln
(2) Hb Icaria
oC. (142) ter Lis
(3) Hb Koya Dora
c(.(142) te~ Ser
(4) ºHb Seal Rock
et (142) ter Glu
(3) Inestabilidad de la (B) (1) Hb Quone; Zse
globina o hemoglobina e(. (125) Leu Pro
(C) ~:ecanis!:o desconocido (C) Supuesta inestabilidad
postraduccional
( 1) Hb Suan-Dok
o<. (109) Leu Arg
(2) Hb Petah Ti kv ah
e( (110) Ala Asp
29
tanto para la globina alfa como para la beta, es UAA; el ARNm
de · 1a globina alfa tiene 109 nucleotidos en su región 3' no
traducida. El reemplazo de un solo nucleotido en el termina
dor y con ello, el surgimiento de un codon que codifique pare
un aminoácido y no para la terminaci6n de la traducci6n, da
lugar e la síntesis de cadenas alfa. anomala.mente alargadas.
Como se muestra en la tabla IV, se han descrito varias situa
ciones diferentes en el cod6n de terminación del ARNm-alfa:
las hemoglobinas mutantes resultantes son diferentes solo
por el aminoácido en la posición del codon de terminaci6n.
La primera en ser descrita, que tomaremos como
ejemplo, fue la Hb Constanl Spring (HbCS). El ARNm-HbCS se
traduce hasta que se encuentra otro codon de terminación en
fase, resultando una globina con 31 aminoácidos en m6.s de
su extremo carboxilo
141). El fenotipo
terminal
talasémico
( 172 aminoácidos en lugar
de la HbCS aparentemente
de
se
debe a la inestabiliad del ARNm y no a una transcripción redu
cida del mismo ( 29).
Mutación en el sitio de poliAdenilaci6n.
La transcripción del ARNm aparentemente continúa
más allá de la posición en el ADN que corresponde al extremo
3' de la molécula de ARNm madura. Por ejemplo, la transcrip
ci6n primaria del gen de globina del ratón, continúa por 750
nucleotidos más allá de las sencucncias codificnntes del ADN.
La secuencia AAUAAA, presente en el ARNmhn, actúa como señol
de reconocimiento para que a 20 nucleotidos de ella (en dircc
ci6n 3 1) se realice un corte y se adicione la cola de poliAdc
nosinas (30).
Se ha descrito una mutaci6n en humanos que ocurre
en la señal de poliadenilaci6n del gen alfa2, alterando la
formo natural AATAAA a AATAAG. Aunque, a pesar de la mutaci6n,
se llegan ~~sini~tizar.·¿ad~na~~~lf~, la ~ip~~Si6n -esta iedu~~da en un sil,; (30):C
__ i'.-."._. ___ ··.: __ ··;
Globinas i~~s~abl;~ • . ::\_-~(. -.\.·
Lá's .:·muta.ciones:" de· las ·hemoglobinas: Quong Sze
(alfa1~5. ~~u--:',; Pro), de la. Hb .Suan-Dok (alfa 109 Leu -1> Arg)
y de la Hb. htah~TikJ~h .'(aÜá ÚO Ala - Asp) origina una gran
in-~Stabilfdad~:: en:--,la ::.moiécula·, 'la -cual no logra mantenerse
c¿•,¡¡c, 'tet ~amercF ·frincionaV.(n).
Hemog lobinopad.a alfa:taia;;~mica •adquirida.
Una forma adicional de alfa-talasemia merece mención,
ya que es la úñica fOrma de talasemia adquirida. Este síndrome
adquirido de la enfermedad de la llbH se ha observado en pacien
tes con desordenes micloproliferativos (32). Los análisis
moleculares han revelado un fuerte desajuste en la síntesis
de ARNm-alfa. Sin embargo los mismos estudios revelan que
los genes alfa son estructuralmente normales y, aún más, se
encontr6 que los genes alfa se hallan hipometilados (33) (ca
racterística de los genes altamente expresivos). La inacti
vación es uniforme sobre los cuatro genes alfa, lo que indica
que la mutaci6n puede ser sobre un factor intranuclear requeri
do para la expresi6n de los genes alfa (33).
Distribuci6n de las Alfa-Talasemias.
Las alfa-talasemias se distribuyen principalmente
en el Sudeste de Asia, en algunas poblaciones del Mediterráneo
Y entre individuos negros. Presentandose los casos más graves
de hidropesia fetal y HbH entre los Orientales y ocasionai'mente
en la poblaci6n mediterránea (42),
Se calcula que en la poblaci6n negra anieric'ana .·de
31
un 20" á· un"' 30% dé los 'individuos .són •.heterocigoticos para
la ·a1f~';t818Selliia, mierit-ras que ·un -~·os .por ~·ierít~' de·· esta
. població~ af~c~~d.a es homocigo~a (i7); ·
··La .alta prevalencia de alf~-talasemia :en las· pobl8-
·éiones ·m·e·n~i0n8das se ha· tratado d~--·~x-j,11~-~~- ;~~-.. t.r~vés ·:de ia
posi.b1e· moderaci6ri de. los cuadros beta-;-ta-la.~émicos,~····qu_e tam
,.,biérí son frecuentes en estas poblac-iones: La ·=-~lfa-t818sefnia reduce la severidad de estos males,:_. __ ya Q.ue._ la patofisiologí.a
.-_ d_e 'la - b_eta-tal_asem_ia aguda se debe' a el ~e.la ti va .exceso de
la _cadena Blfa. Cualquier mOdifiCad~-i Qiie re·duZ·ca este · .. exceso
~elatijb ser& henifico (42).
Manifestaciones Cl!nicas y· Diagnbstico de .las .AÚ.a-T.alaseínias
grave.
Este cuadro repres~nta un problema obstétrico muy
Se manifiesta como toxemia del embarazo y hemorragia
postparto. Los infantes afectados mueren en-utero entre les
semanas 28 y 40, aunque, ocasionalmente, fetos con este mal
han vivido por una o dos horas después del alumbramiento.
Los fetos ·afectados muestran un cuadro de anasarca y anemia
con valores de hemoglobina de 60-80 g/1. El froÚs sanguineo
se caracteriza por hipocromia, poiquilocitosis y retículocito-
sis. La electroforesis de sangre umbilical
he~oglobina- se compone en un 80% de Hb Bart
Hb Portland (zeta2
-gama 2)y 10% de HbH (beta4
);
HbF (alfa2
-gama 2 ) o HbA (alfa2-beta
2) (39).
Mal de la ~emoglobina H
revela que la
(gama 4 ), 10% de
no se encuentra
El mal d.e ra HbH lleva a grados variables de anemia
Los pacientes usualmente no requieren de
tran·sl~s'.i,~nef(~·~;~.~~-~-i-ri~··~s .·:·n:i-: .sufren de hemosideros.i's. Tipica
ment~.::d·e9·~:~-{~i:1·~ri'..~,~~-~~-Íi·S::{s agudas con infecciones que dificul
ton. su cdi~gnÚticb y manejo (39). :.·.--~ < ,,._ ..
-¡·~:s· ·-\~l ~eles de hemoglobina var!an entre 70-100 g/l
_y ·:·~1 frotis sanguineo muestra hipocromia
Se observo reticulocitosis del 5-10%.
y poiquilocotosis.
Tras la incubaci6n
de los hematies con azul brillante de creso!, se forman cuer
pos de inclusi6n, debido a la acción redox de los colorantes
que provocan la precipitación de la HbH. En los pacientes
esplenoctomizados algunas, no todas, las células rojas contie
nen grandes inclusiones preformadas demostrables con violeta
de metilo. El patrón hcmoglobínico demostrable por electro
foresis es muy variable consistiendo primordialmente de HbA,
H y A2 con cantidades variables de Hb Bart. La proporción
de llbH varia de 5-40%, la HbA 2 esta casi siempre reducida
o un 1. 562%, la HbA forma alrededor de un 70% del total
en la mayoría de los casos la llbBart puede ser evidenciada
a plls de 7.0 o menores. Los estudios de biosíntesis in-vitro
demuestran un gran desbalance en las proporciones de cadenas
alfa/beta; entre 0.25 a 0.5 (39).
Tratamiento de las Alfa-Talasémias.
El mal de la HbH es la única forma de alfa-talasemia
que, en ocasiones, requiere tratamiento (esplenectom{a) aunque
algunos pacientes se mantienen bastante bien sin tratamiento
específico; en otros, la esplencctomía es ocasionalmente nece
saria .pero no curativa (39).
Naturaleza de las Beta-Talasemias
Las beta-talasemias son un grupo heterogéneo de desor
denes caracterizados por una deficiencia cuantitativa de cade-
nas beta en relaci6n a las cadenas alfa presentes en las célu
las eritroides. El exceso re1at.ivo ·de cadenas alfa provoca
su precipitación con el consiguiente daño a la morfofisiologla
celular y a la eritropoies_:is. Los estados homocigotos de la
beta-tálasernia pue.den di~~dir.se ~n :. betaº -talasemias, en las . . +
cuales rio se d~~ecta biosintesis de cadena beta y; beta -tala-
semias, en las cuales· lás cadenas beta si estan presentes
pero en,caritidades:.muy.·inferiores a las normales (7, 8, 42).
Deleciones en J~s 'lci.cus beta y beta-like.
Aun .antes del advenimiento de las t~cnicas del ADN
re·-¿:~~b·.t¡¡:a:~te. se sospechaban deleciones de la familia beta.
En par'i:ic.ular, la observaci6n de que la hemoglobina Lepare
tenia el extremo amino terminal del gen del ta y el carboxilo
term~nal de beta 1 sugería la ocurrencia de un entrecruzamiento
desbalanceado entre estos genes. Un argumento similar se
formul6 para explicar la existencia de la Hb Kenya, que es
una fusión de las globinas A gama y beta. Con la llegada de
la genética molecular se hnn podido corroborar estos supuestos
y describir otras dclecioncs no previstas (180),
En la figura 9 se muestran las deleciones descritas
para la familia beta-likc. Estas varían en tamaño, desde
una delcci6n de 619 pares de bases que causa una forma de
talasemia betaº en hindues, hasta una <lcleci6n gama-delta
beta-talasémica que elimina a toda la familia beta-like abar
cando por lo menos 105 Kb de ADN. Aunque vnrias de estas
deleciones son muy grandes, en ninguna de ellas ha sido posible
observar la deleción por técnicas citogcnéticas. También
vale la pena hacer notar que en homocigotos para estas grandes
delecionea no se ha observado manifestaciones clínico-pato16-
gicas aporte de las talasémicas, Esto sugiere que en esta
regi6n 3 1 del brazo corto del cromosoma 11 no se presentan
02.'f6~1a Kb
~r \. '!'~ t (3 '"}ZS t~ m m m m n IJ-- ;. t
>3•t\ E 5' -l~J--.. '"-~~_.. .......... ..__..._~ ..... .__.JLJL-~
• -, . ·~ :.,t.'---~,_ ri ·-·-··
lr.:ml ____ _ .... ____ _ • • . ... ~~
:34
Fenotipo
f.>º tal (Hindu)
Hb Lepore
Hb Kenia
't tal
\l ( J P)0
(Siciliano)
y'i(Jp)1a1 (Hindu)
y ('á~)º tal (Turco)
ú¡'( í'u11>)º tal (España)
~ir Plli!F (USA)
G,(nl" PHHF (Ghana)
(;¡ '( (J r.>)º tal (Chino)
(~ÍJ(!>)° tal (Anglosa jon} a f, (>)ºtal (Dutch)
('íli(!>)0
tal (Mexicano)
(r 6 r>)º ta1 (Esco~es)
Figura 9. Suu;arlo de las delecio118s de l.; fa1.1ilia beta-like. En esta
se sumarizan todas lao grandes delaciones descritas para este compl~
jo. El fenotipo y, en la matoria de los caoos, ol origen etnico del paciente en quien fueron descritas por priir.ora vez. Lo deai¡;nacion
de tal(J~)0 indica que el cromosoma afectado por la mutacion no da ligar a la sintesis do cadenas beta,ni delta; la designacionl{J ~ )0
talaaemica origina la falta de ::·;::' .. c~c;1 do todos los genes de la
familia beta-like. La designacion G~ y A~ en el fenotipo indic~ .\ue
tipo de globina fetal se slntetiza;por ejeraplo en la talaso,.iia "i
35
Figura 9 con t •••
(Sr:> f(Chino) ,se sinterizan cadenas G\í ,pero no cadenas beta,delta
o Agama. La hemoglobina Lepare desarrolla un fenotipo talasemicb
mientras que la hemoglobina Kenia presenta una persistencia her.!! ditaria de la hemoglobina retal (PHHF) (180)
36
otros genes cr.~cial.es_ ·p~~a _e~· de~arr.Oi10 n·Or:mal:· dei- in~viduo (180).
Para· analizar.· el fenotip.ó resultante de las delecio
nes en ia ~amiiia beta-like deb~'establecerse una distinci6n,
un :tanto artifl~iai", pe~o 6ti1, para su estudio clinico: prime
ro, -:"aquellO~ ·en que un componente talasémico es evidente (por
ejempla·.· la talasemia del ta--beta) y¡ segundo, los que se carac
terizan por la persistencia en la expresi6n de los genes de
la HbF durante la vida adulta (slndrome de persistencia here
ditaria de la hemoglobina fetal o PHHF). Se dice que esta
distin_cib~ ~s un tanto cuanto artificial ya que los síndromes
de PHHF incluyen un cierto razgo talasémico y, las talasemias
del ta-beta cuentan con un aumento en la producci6n de HbF
(39).
Síndrome de PHHF
t.a PHHF es una condici6n benigna caracterizada por
siOtesis aumentada de HbF en el adulto; usualmente acompañada
por una sint.esis dismind.da o ausente de la globina beta del
mismo cromosoma. El alto nivel de expresi6n de ambos genes
gama, en el cromosoma afectado, es suficiente para igualar
la producci6n de la cadena alfa, de tal manera que no se obser
van efectos fisiopatol6gicos (42).
Delta-Beta-talasemias.
Por otro lado, en las delta-beta-talasemias, existe
una síntesis disminuida o ausente de las cadenas delta y beta
del cromosoma afectado y, el aumento en la síntesis de hemo
globinas fetales no es suficiente para prevenir la aparici6n
del fenotipo talasémico.
37
i'Por '·· cfu~i).:~.:~-t-~~,~· ai~ün&~ · d·e·iecioileS- de·· la f amil i B. b~ ta·l-Ík~( 1 o~ g~nes ga~~Ós~~Cxpr'es..:n_' de'. manera. elevada; (PH~F)? - .·
- "'-'-;:~::,~-.. -' -- ·-_- ·-'-0:
lPor q~¿;',~n~{o¿·~s deleciones se repiime ·su -¡,,ipréú.I~' ¡~~que intactos (delta-,bétatcai:/ 'fl~L~p'Óre, ·
:v;.:: -.~)!,:t /~. -· :~:~~ -
... •;t h:n: iro~uesto dos ·expÚca~f~n~s ··p~ia 'el comporta
~ient~ v~riaÚ~ de los. genes gama ~rite· dff~~~n;t-es Úpos de
dele_cioné~ ·-~~-- l~ familia beta-like:
Flavell· (34) ·propone que. las deleciones alteran la
conforma-ci6.n · dE! la croma tiria ejerciendo influencia sobre la
:~xpre-;:i.(;n cié l~S gep_es de las globinas gama. Según este mode
lo. las diferentes deleciones causarían diferentes efectos
dependiendo de su posici6n y extensión. Por otro lado, según
Tuan y cols. (35). las regiones que son 11 traidas 11 al complejo
beta, por efecto de la deleci6n, son críticas y pueden actuar
como amplificadores de la expresi6n de los genes gamo.
Otro caso interesante dentro de las dcleciones es
el de la deleci6n Dutch. El cromosoma afectado presenta una
deleci6n cpsilon-gama-delta que termina 2.5 Kb antes del inicio
del gen beta. A pesar de estar presente, el gen beta no se
expresa. Esto implica que las secuencias que son 11 traidas 11
a la vecinidad del gen beta reprimen su expresibn (36).
Hemoglobinopat!as beta-talasémicas
Las diferentes que --2.r_igina~--
Se defin.e como pró.motO_( ' . ,•
secuen-
.38
TABLA V. Hemoglobinopatias Beta Talasemicas (36)
Clase Cambio en Grupo
secuencia Tipo etnico
~:.:'.SCRIPCIO:?
Elementos distales
-87 ACACC'é·ACACQC ~+ Mediterraneo
-88 ACACCC-ACA_TCC (!>O Negro
Caja TATA
-28 1:t,T/IA.~t.-CA':!AI;.AA (.!>+ Kurdo
-28 CATAAAA-CATAQAA ~· Negro
-29 CAT/Jill.-CATQAAA (:>+ Chino
A!l"{~ :m EJ1l!CXO'lALES
Mutaciones sin se::tido
Codon 15 G-A C:>o Hindu
Codon 17 A-T ~o Chino
Codon 39 C-T (.\o Hediterraneo
Corrimiento de fase
Codon 6 -1 (A) ('o He di terraneo
Codon 8 -2 (AA) ~o Turco
Codones 8-9 +1 (G) ~o fü.ndu
Codon 16 -1 (C) ('o Hindu
Codones 41-42 -4 (TCTT) ('o llindu
Codon 44 -1 (C) ('o Taiwan Kurdo
Codones 71-72 +1 (A) ~o Chi~10
39
cont ••• TABLA.V. l!emoglobiilopatia.s Beta Talasemices (36) ' .. - -",·$"'-' ,; -
E!·IPAL.'!E DEL AR:l
Uniones de empalme
Sitio donaC:or: IVS-1 h· 1 IVS-1 n. i
I'/S-2 n. 1
IVS-1 n.5
IVS-1 n.6
Sitio aceptar: IVS.1
IVS-2
01'-AT GT-TT
GT-AT.
G-C
T-C
a 25 pb del ext 3' AG-GG
::,,~vo sitio de empalme :'1uevo aceptar:
IVS-1 n,110 G-A :luevo donador:
IVS-2 n,705 T-G IlfS-2 n. 745 C-G
Ac:.1·1acio~·1 ae sitios ocultos
Codo:> 24 T-A (silenciosa) Codon 26 G-A (Glu Í.is) Codon 27 G-T (Ale Se::)
Tipo
~o (!lo ~o P+
{\ +
Po ('o
(1 +
p +?
(' +
~+ PE (h
Grupo etnico
Medite::-raneo
Hindu Me di terraneo
Hindu Chino Me di terranoo
Hindu
Negro
Me di terraneo
Me di terraneo Me di terraneo
Neg:-o
Asidico
Me di terraneo
cias. de ADN· (¡ú~ sori ~~enci~{e~ par~ la i~iCiac~6n, eficiente
y.: ·co-riii.Xb"!~-'~··: _d-~-;~:~1&·5. tf.:~-~~d;i.'p¿·t:6n-~f;·_ ~~-~ --~,·~·ecuenc_i/~s promotoras
se Í.ociiÚi.iri' 'c~'rca'~~ .. 'al sitiéi de i~icio de la transcripci6n
y._.--fu'n_cio~~n. ;~_n_·::'.·~-:~~- >s~l~:<o~i~--r{t~-~¡·frn COn respecto a las secuen
ctas' c~dÜi.éant:~s:.
·:Una sé.Cuencia ri-cB en timiná.s y adeninas (TA), cono
cida :.co~o· c~ja TATA, comi0
e~za de 28 a 31 pares de bases antes
del·.· sitio .:.c;,rrespondiente al. CAP del ARNm (se conoce como
CAP al ·primer nucleotido del extremo 5' del ARNm y que es
modificado por metilaci6n). De 46 a 58 nucle6tidos antes del
sitio CAP se encuentra otra secuencia promotora que incluye
al pentanucle6tido, CCAAT, y que se conoce como la caja CAT.
El promotor para el gen de la globina beta incluye ademhs
secuencias duplicadas en tandem
de bases del sitio CAP (36).
localizadas a 86 y 100 pares
Se han descrito cinco genes beta-talas6micos con mu-
tac.iones en
(36). Dos,
una sola base dentro de secuencias promotoras
en las posiciones -87 -88 (la posición cero
se asigna al primer nucle6tido de ADN transcrito y que corres
ponde al CAP en el ARNm). Cada una de ellas afecta a la se
cuencia PuCPuCCC (Pu = purina) que forma parte de las secuen
cias duplicadas en tandem. Ambas mutaciones son rclntivamente
benignas en cuanto a sus consecuencias funcionales, por ejem
plo, la expresi6n de los genes beta se reduce a un 20 o 30%
de lo normal. Por lo menos en el caso de la mutación -88
vista en negros y, probablemente en la -87, 1,•ista raramente
en mcditerraneos, los pacientes no se ven severamente afecta
dos. Por ello estas son auténticas lesiones beta+ -talasémi-
cas.
Se han observado sustituciones nucleótidicas dentro
de la caja TATA de tres genes aislados de individuos de origen
41
disimbolos. Cambios en las bases- de las. poSiciones_"~28 y
-29 se- han descrtto en pacientes kurdos; chi.nos_-y negrós (36).
F:stos genes expresan al gen· de le ·:&lob.in_a_.. be-ta a uO niVel -
de 20 a 30% de lo normal y, por tanto, inuésti:an 'un fenotipo
beta•-talasémico en la homo~igosi~.
ARNm no fu-ndonales.
:varios : gen~s bet~~tal~~6~icos contienen mutaciones
sin s~rlti:éÍci .:'o" d~·;.c~-rrim'ien·-~;o ·-~,~ fase _que dan como resultado
la t'erminaci'60.·'·prem8tUra_ de la cadena polipeptídica durante
la Ú~duúió-n _(tabla. V). E_n estos casos no se producen cade
nas :b~ta·1·_ .pc;>r -.¡:Q'· ~~;- e~t."cis geBes son del tipo betaº. Hist6-
-f.ic-a~-e·nt-e-~'-=-. fe. mutaci6n sin sentido en el codon 17 hallada
en u·n pnC:iente chino, es importante ya que fue el primer gen
~alasémico en el que la sust.ituci6n de un s6lo nuclebtido
demostró ser responsable del fenotipo talasémico (37).
La mutación sin sentido del codón 39 es importante
por su alta prevalencia entre lo_s mediterraneos {30% de los
genes betaº en esta área son de este tipo y contribuye al
100% de la beta0 -talasemiavista'- en Cerdeña) (36).
Las mu_taciones por corrimiento de fase son debidas
a la delec'i?n -¿, inscrci6n ·de uno, dos o cuatro pares de bases.
La riueVa s~cu_encia generada puede dejar en fase a un codbn
de ter.ñi'inacib~ p~ematuro 1 originando así, el fenotipo betaº
(36).
ARN mtitante pa~a el empalme.
El ARNm heterogéneo 1111clear (hn) debe de someterse
a.un proceso de empalme (splicing) como parte de su maduracibn.
Durante eSte proceso las secuencias no codificantes {intrones=
IVS) los. 'exones · son re-unidos para formar
ai::ARNm. f~ncicinal. · Se···.ha. desé~bierto que en los sitios de
e~pnl~~ Cu.~~~'.,~-~s:_::~:~-~~!~n~-~~~~:~-j- ··ex1~ten senc-uencias conservada·s
quC- s_f~v:~~>·~-~~J~.~-_ña~:-:~_p:·a~,a-"' ia·:;realiZ~ci6n corree.ta de los cortes y···. ~mp~lm~.C· d.él. ARN·. •.: Los dinucleótidos GT en el extremo
5' (d~~ad:~r) >}i•,\'c e~· ~i 3' (aceptor) del intron, son esencia
les ·en :est~s ·;;ecu.~ncias de reconocimiento (38).
s'ec~Cnci'irn con cierta similitud a las señales de
empelm.·e p·-~e~~~- 's'.er encontradas en otros sitios que no sean
los l:!mites intron-exon. Por ejemplo, en el gen de la globina
ti''eta, -el dfnucle6tido GT se presenta 44 veces dentro de se
cuenci&s· ·similares en un 60% a los sitios de empalme, y el
dinucle6tido AG, 49 veces. Estos sitios de empalme 11 ocultos"
son· raramente (si es qu-e alguna vez) usados durante el proce
samiento normal del ARN pero 1 pueden activarse por mutaciones
que los asemejen aún más a un sitio de empalme activo o como
resultado de la inactivaci6n de un sitio de empalme original
(36).
Se han descrito tres diferentes mutaciones en el
sitio donador (de GT a AT o TT) tanto del IVS-1 como del IVS-
2, y dos en el sitio aceptar del IVS-2, que originan una su
presi6n total del empalme en las uniones alteradas (tabla
V). Como consecuencia no hay formaci6n de ARNm maduro y el
fenotipo resultante es de betaº.
Otras dos mutaciones descritas para los nucleótidos
5 y 6 del sitio donador del IVS-1 (tabla V), originan una
reducción del empalme normal, originando una disminuci6n de
entre 25 a 50% del ARNm normal maduro. Estas mutaciones dan
lugar a fenotipos beta+.
Se han descrito ciertas mutaciones que generan nuevos
43
sitios. d~~·· e'm~-~;~me-·;._: t'ant~;-,.\1~-~~~o·;/de·_ -exo~·es ::·como de .i~trones Ctablá v). ·. í::stos•'nuevas :sfrtos i:om~iten crin iós_or1g1na1es
en la r~a1Í:zaCi6ri,,del e'~~alm~ del .ARN.' Álgu~os .ÁRN llegan a-. s~:r ~~-~~~~ad~~s.- -ri~~~:~·1m~~-~-te·?~: Ei':o f~-~:~t-Í.'pO ::-'~~su:it~Ote_ e'·s ··por
tant~ beta+ .. (36);.
Dist;ibUci6ii de' las
·-,· Lo_~~-B~J1~S se concentran primordial-
_·'mente_ 8)r·e4~dOi:_:_ ·~e-· la·- cuenca, del mediterraneo, en la India,
:~~----~'~'-~i-~i:~~-e-~~---~-u·~- ·y_ occidental y en pob~aciones negras. La -- deit-a.::6e°ta~'º~ta-lasém:la se halla limitad.a a Grecia, pudiendosele
encontrar r.Bramente en la India. En la raza negra la beta
tBl-kSem~a e·s en general mejor tolerada y menos sintomática.
Existe la misma distribuci6n geográfica de los genes talaslmi
cos ,: el gen falciforme, el gen para la deficiencia de la enzima
G6PD (glucosa 6 fosfato deshidrogenasa) y la malaria, asumien
d~se el .que estos genes confieren al portador cierta resisten
cia ante la infecci6n (4),
Manifestaciones Clínicas y Diagn6stico de las Beta-Talasemias
~Homocigosis beta0 /beta 0
Las· manifestaciones clínicas generalmente aparecen
tras' lós·· pii,~ercis cuatro o seis meses de vida 1 cuando ocurre
--eT-c.-ambü.l ___ e_n_ l"a -biosíntesís de ·cadenas gama a beta. Adamás
de una anemia profunda, los rasgos clínicos sobresalientes
de la ta_lasemia mayor o enfermedad de Cooley, son las deforma
ciones 6~eas (resultantes de la hiperplasia medular) la
hemocromatosis (provocada por las constantes transfusiones
san guineas y la hiperabsorci6n de hierro dietario). La hiper
plasia medular da lugar a una facies característica de aspecto
mongoloide, con 11 craneo en torre" y mala oclusi6n man di bular.
Los iñfan-tes presentan retardo del desarrollo y del creci
miento. En los' adolescentes la aparici6n de los caracteres
sexuales secundarios se ve retrasada. Los pacientes muestran
un color de piel particular debido a la combinaci6n de icteri
cia y exceso de melanina. La anemia severa lleva al surgi
miento de fallas cardiacas congestivas a menos que se hagan
transfusiones. La sobrecarga de hierro (hemosiderosis) pro
vocada por las transfusiones, desarrolla cardiomiopatías,
desordenes inmunol6gicos, hipogonadismo, diabetes mellitus,
disfunci6n pancreatica exocrina con malabsorción y, cirrosis
hepática. La mayorla de los pacientes desarrolla la cardiomio
patía en la adolescencia y mueren uno o dos años después de
la aparici6n de los síntomas cardiacos (39).
El diagn6stico de talasemia mayor debe considerar
se en pacientes con anemia hemolítica severa y hemuties hipo
dr6micos microcíticos. La hemoglobina en la talasemia
mayor se halla en valores de 40 a 70 g/l. El frotis sanguíneo
muestra anisocitosis poiquilocitosis, células en diana,
bandeo bas6filo, normoblastémia, palicromasia células en
forma de lágrima. La electroforesis de la hemoglobina muestra
cantidades elevadas de l!bF, la llbA2
se eleva al doble y no
se detecta RbA (39).
Homocigosis beta+/beta+ (variedad negroide).
Esta condicibn usualmente produce uno anemia na grave
con valores de hemoglobina de 70 a 110 g/l. Los cambios peri
f6ricos en la sangre son típicos de los homocigosis para betaº
el patrón hemoglobÍnico se compone de un 30 a un 60% de
~bF con un nivel normal o elevado de 1lbA2 y presencia de HbA.
Los trastornos 6seas son mínimos, la absorci6n gastrointesti
nal de hierro dietario por lo general no se eleva. La cali-
45.
dad de vida y e1.pro.n6stico en general son ·buenos (39),
Beta-talasemia intermedia.
Talasemia intermedia es un 'térmi~o clínico. usado
para des~ribir a un tipo de homocigosis de beia-tala~emia
menos grave, en la que el paciente puede· sobrevivir_ sin tran-s
fusiones. No es una condici6n uniforme sino .que incluye desde
individuos con desordenes mínimos hasta paci'entes que- sufren
de patologia severa y variada. Por mucho, el origen de la
mayoría de las beta-talasemias intermedias es la coincidencia
de __ un_o o más genes alfa-talasémicos con genes beta-ta.lasemia
en homocigosis; esto reduce el desbalance de J.as cadenas alfa
y beta, aminorando as! el mal (42).
Tratamiento de- las Beta-Talasemias.
El tratamiento de la b~ta-·t~lasemili' esta· indicado
para los homocigotos. Los. po-rtador.es "del rasgo · beta-talasémico
(heterocigotos) no req~ieren t~ot~miento (39, 42).
Terapia convenciO_"nal
Transfusiones.
Con· transfuciones continuas de sangre se busca mante
ner0 -los ni~_eles d12 hemoglobina en valores tales que, al mismo
tiein'pa _qué----_effmlnen la anemia, eviten la hiperplasia 6sca1
la hepatoesplenomegalia y la hiperabsorción de hierro dietario.
En ocasiones, y para disminuir en cierta medida la hem6lisis
la esplenectomía es parte de la terapia de transfusiones (40).
Se han descrito recientemente dos metodologías que
·permiten 18. óbtenci6n de hematies jovenes, "neocitos 11 , que
al ser transfundidos permiten espaciar más, en el tiempo,
las sesiones·.de' transfÚsi6n '(40, 4i).
Terapia de quelaci.61'1.
.. Para eliminar la hemosiderosis,
~onstantes tran~fusiones, los pacientes
Desferrioxiamino (Desferal). Esta droga
46
subproducto de las
deben tratarse con
induce la excresi6n
de hierro y es relativamente at6xica: desafortunadamente para
que sea efectiva debe suministrarse continuamente por 8 a
12 horas por vía intravenosa. Además aún no hay pruebas con
cluyentes de que esta droga prevenga las cardiomiopatías origi
nadas por lo hemosiderosis (9).
Actualmente se trabaja con la droga dietilentriamino~
pentaacetato (DTPA) que parece ser una promesa para la terapia
oral de la hemosiderosis (9).
Esperanzas para la terapia del futuro.
Transplante de ~~dula 6sea.
El transplante exitoso de médula 6sea a un paciente
talasémico puede significar su curaci6n total. Se han trans
plantado m6dulas, tratadas con anticuerpos monoclonales que
eliminan a las células responsables del rechazo injerto vs
receptor, a individuos j6vencs mínimamente transfundidos
tratados con drogas supresoras de la respuesta inmune. De
los cinco sujetos transplantados, dos murieron de complica
ciones del transplantc los otros se encontraban bien al
momento de la publicaci6n de la comunicaci6n (9, 42) (2 años
después del injerto). Ya que es posible brindar al niño tala
sémico varios a~os de buena vida con un tratamiento de manteni
miento, parece poco probable la instauración de programas
a gran escala de transplante medular. Aunque los transplantes
47
},.'· ... . ·' .·> de médula 'se. hiciéran.: c'on el· tiemp_o s_eguros y confiables'
su alto costo i~~ ,ha~e eli~i.tÍsi:a~ • . _:.:..;
Terapia' ~én~ca ~úéct~~ ''
E~ist¡n -dos ·acercamientos teorices para la terapia
génica de la beta tBlasemia. La primera seria la introducci6n
de nueva y correcta informaci6n génica a las células eritro
poieticas. Resultados éxitosos alrededor de ésta idea se
han obtenido al microinyectar en zigotos de ratones ya sea,
un plasmido rccombinante que lleva al gen de la globina beta
humano (43) o sencillamente fragmentos de restricción con te-
niendo los genes gama beta humanos (44). Los ratones
transgénicos resultantes no sólo expresan los genes de las
globinas humanas sino que lo hacen de formo diferenciada,
expresando al gen gama en su vida embrionaria y al beta en
la adulta (43,44). En una aplicación de estos logros a la
terapia humana se podria considerar la introducci6n de los
genes correctivos clurnntc la vida fetal o embrionaria (terapia
de linea germinal) s6lo células somáticas específicas
(terapia somática) (45),
El otro acercamiento a la terapia g~nica pvr intro
ducci6n de nuevo material genético seria la correcci6n funcio
nal de mutaciones de terminación prematura mediante la intro
ducción de un gen codificante para un ARNt supresor. Tales
ARN ºleen 11 los codones de terminación pueden modificarse
para que inserten al aminoácido apropiado en la cadena globini
ca (9). El riesgo que se corre con estos ARNt supresores
es el de que supriman a los terminadores normales alargando
anomalamente al polipeptido.
El segundo acercamiento a la terapia génica de las
beta-talasemias es la reactivación de los genes gama. Al
-~.--:~> ' :--· /\:>-.º-; re·activar~se· de :1os·:- genes·· _.8~~8~ · :es'tos formaran
HbF con él exc~so 'de ¿~d~nas alf~ y; p~r t~nto eliminan la
causa de la i:i·sdpatologia Celular.
·-La mÚilac:l6n de las Citosinas en el gen gama origina
su -r.epresi6n. durante el desarrollo. La droga 5-Azacitidina
es un_~n~logo de la citidina que, al incorporarse al ADN duran
te la 'división celular, no puede ser metiledo y además inactiva
e las metiltransferasas responsables de la emtilaci6n de otras
cif:idinas. Así pues, el ADN de celulas expuestas a la droga
5-Azacitidina se vuelve hipométilado tras de unas pocas divi-
siones. La administración regular de esta droga a pacientes
beta"-homocigotos ha aumentado, de 5 a 7 veces, la expresión
de sus genes goma con la consiguiente atenuaci6n de las altera
ciones patol6gicas. El hecho de que de entre todo el ADN
hipometilado por la azacitidina, sólo los genes gamo se reac
tiven, hace pensar que el aumento en la HbF no se 'deba a ·el
efecto hipometilante de la droga sino. a otro mecanismo, mas
especifico, aun no conocido (9),
2. Las Hemoglobinopatias
Se han descrito más de 300 variantes hemoglobinicas
con sustituci6n de un s6lo aminoácido y se les refiere usual
mente como hemoglobinopatias de ''mutantes cualitativos'' ya
que dan lugar a la biosintesis de globinas anormales. Las
hemoglobinapatias pueden dividirse en: a. variantes resultantes
de la sustitución de aminoácidos externos o síndromes falcifor
mes, que son aquellos en los que el defecto ocurre en la peri
feria de la molécula produce una alteración en la carga
neta total de la molécula, detectuble mediante la electrofore
sis y¡ b~ variantes resultantes de la sustitución de aminoaci
dos internos, en estos casos la sustitución de un aminoácido
interno, no polar, resulta en una severa anormalidad en la
49
estructura o for~i de la molécula (7,8).
Sindromei falcifo~m~s
- Hemoglobin~ s·falcif~ime
La hemoglóbina S (HbS) resulta de la sustitución
del ácido glutilmico por valina en la sexta posici6n de la
cadena beta (alfa2beta
2Glu __...Val). Esta sustituci6n cambia
la carga de la molécula y le permite la formación de uniones
hidrof6bicas anamalas con otras cadenas, desatando así, una
reacci6n de polimerizaci6n que conduce a la formaci6n de fila-
mentos helicoidales polihemoglobinicos (46). La polimeriza-
ci6n de la HbS se favorece por tensiones reducidas de oxígeno,
acidosis e hipertermia. Bajo estas condiciones los filamentos
helicoidales de hemoglobina forman un gel que deforma al
eritrocito, pasando este de ser un disco biconcavo a una célulo
en íorma de hoz (falciforme)~ La repetici6n de este proceso
reversible in-vivo finalmente origina daños y pérdidas a la
membrana eritrocitariaty a una célula irreversiblemente falci
forme, la cual, por su falta de deformabilidad, origina daño
tisular vaso-oclusivo (46).
La frecuencia del gen falciforme es extremadamente
c,levada en el Africa Central Occidental, situandose entre
un 5 y un 20%. También se le encuentra en algunos sitios
aislados como Chipre• Grecia, el oeste medio y algunas regio
nes de la India. Por otra parte, ln HbS es ln hemoglobinopatia
más común en los Estados Unidos de Norteameríca, encontrnndose
le predominantemente en la población negra (8% de la poblaci6n
negra norteamericana presenta heterocigosis para este gen)
( 42).
50
Man~fest~ciog~s ¿linicas
La anemia falciforme es el·· cuadro provocado por la
homoci'go.sis beta 5 /beta 5 y presenta una gran variedad de proble
mas clínicos gruesamente ilustrados en la tabla VI.
La enfermedad no es aparente hasta los seis meses
de vida, cuando el efecto protector de la llbF disminuye (se
ha observado que la presencia de otro tipo de hemoglobina
dentro del eritrocito aumenta la solubilidad de la HbS, de
ah! el efecto protector de la HbF). Inicialmente se presenta
anemia, palidez, ictericia y, esplenomegalia. La asplenia
funcional, secundaria al infarto esplenico, se presenta usual
mente a los dos afias de edad. A travé?s de toda la \•ida, pero
especialmente en la infancia, las infecciones, particularmente
las causadas por neumococos, !J.. influenzae, estafilococos
y. selmonela, son el mayor riesgo para la vida y el bienestar ..
Las razones de cstn supcrsensibilidad n lus infecciones no
cstan claros. Lo que si se sabe es quf.? el bazo, que es el
principal 6rguno eliminador de microorganismos en la sangre.
juega un papel importante en la susceptibilidad a infecciones,
junto con el dafio tisular originado por ln deformaci6n eritro
citaria. Además, hay evidencias de que en estos pacientes
la opsonizaci6n, por complemento, de los microorganismos es
deficiente (39).
Ocurren en estos pacientes varios tipos de crisis
qu~, junto con las infecciones, son responsables, en casi
to-dOS -loS --casos, de la morbilidad de la enfermedad. El tipo
más com6n de crisis es la vaso-oclusiva o dolorosa. Las crisis
ocurren periodicamente y se caracterizan por dolor en abdomen,
espalda y miembros. Virtualmente cualquier 6rgano o tejido
puede estar involucrado. La estasis capilar focal es seguida,
secuencialmente, por hipoxia, generación aumenta~a de drepono-
51
TABLA VI. Manifestaciones Clinicas de la Anemia Falciforme (39)
Constitucionales
A Retardo. en el desarrollo y el crecimiento
B Susceptibilidad aumentada a las infecciones~
II Vasooclusivas ~ A Microinfartos ~
Dolorosas B Nacroinfartos --..------------'
~Deño ~ orea nos
III Anecia
A Hemolisis Severa
52
cit.os .. Y, finnlmente, trombosis e infarto. Las crisis vaso-
oclusiva·s por lo general duran vlirios días requiriendo· hosp:I-
tafización. Frec~entemente se ·~r~~ipi~~n p~r i~fe¿i~ones, hip.otermia o deshidrataci6n. Algunas de .es.tas· crisis pueden
hacer peligrar la vida.
El segundo tipo de .crisis es la apl&sica. Estos
raros ep_i~odios se presentan cuando uri proceso- infeccioso
disminuye la eritrop·a'iesis ·agraVaridÓ, .·aún -má·a·, · 1a anemia;
pudiendOse llegar a _valores de hemoglobina incompatibles con
·la ;·v-ida. -una vez diagnosticada esta ·crisis es facilmente
~01_1~-jii~~a ~~-~:di~~te t'ransfusiones.
LB Criáfs de secuestramiento esplénico son raras
:rai:·ales; ·La obstrucci6n de las venas esplénicas produce
un -.s.út:>"itO·-;·-y -m_asiv_o almacenamiento de sangre en el bazo_. El
dÓ.lór. abdominal ·y v6mito se ven seguidos por shock hipovolémi
co y 1 · frÍ!-cuentemente 1 la muerte sobreviene en pocos horas
(39).
'L:os,.~eferoc.igotos AS, o portadores del rnzgo falcifor
me~ pr.e-5:e,nta_n·-. pr_oblemas clínicos m:lnimos. Estos individuos
deSa_r~()llan c_~iSi!! falciformes s6lo si se ven sujetos a hipo-
xia severa. Por .ello los individuos AS no deben incluirse
entre 'los grupos de alto riesgo (39).
·Hallazgos:en el laboratorio.
En la anemia falciforme se presenta anemia hemolíti
ca, con concentraciones de hemoglobina de 70 a 80 g/1 y reti
culocitosis del 10 al 20'%. El frotis sanguineo muestra aniso-
citosi"s
típicos.
ocurrido
poiquilocitosis
Se pueden hallar
infarto esplénico.
con policromasia drepanocitos
cuerpos de Howcll-Jolly si ha
La velocidad de scdimentaci6n
53
. . . '
celúlar .se ve 'di~miÓuída,. ~i conte'o pl~qJ~taffo ~e h~Ua elev "ádo ."·y rr·~c·u~ñ'te~·en t'e:)se·/\p~·e-se"ii ta t~~c·d~-i t·o~ i~ "<c_«:J·n_;:~- pred~~-~nan-cia di(g~a~lii~ci.~~~;·(/, 8).: ..• ;' > .). . ·.
;-:~s~~~~-... : "·-~·- ... y_<:~ . ,: .··_.,_--
• ·~~ ~},ü~V'a d;i· .·iDet~bÍ~uifito ¡le sodio es útil para
: ~ t adbii;suril6farttº~r .~h¡se/m;o.f:c.:i:gáo~ltoeozs'.~:s~.s1neaja ! ~:: t: :is s a nsger e m :rn: ~:: s:: ~ ¡.~~ c~i~i~_;\'.{~ .. .. .. . .. · ..... ···. se deforman por completo en u_n-á~=:~:do-~.-:\~~or~a:s.·r.r,~1~~c~~'ra-i( :_ q ~e· -l_a·s_ ··de-- he te roe igotos r eq uer iran
:·ia~~-~~ª212~~j2;o;5:>Ht¡ .~}::tr;:;;e:~sH~: 2 ~a ~:morgelsotb0in:8 m~:;~ No se 'cietecta ·ÍlbA. (7; 8) •
Tratamiento. __ .
Desafortunadamente a la fecha no existe una terapia
específica para la anemia falciforme. Existen una serie de
agentes que se piensa pueden ser efectivos en la prevcnsi6n
de la formación de drepanocitosis pero ninguno hn comprobado
su inocuidad y eficacia. Por tanto, el manejo de estos pacien
tes se limita a la prevcnci6n de graves complicaciones. Se
les inmuniza contra probables agentes infecciosos, se les
suplementa la dicta con ácido fólico para prevenir la aplasia
megaloblástica 1 se les hidrata oralmente para evitar crisis
vaso-oclusivas y las crlsis aplásicos se trdtan con transfu
siones sanguineas acompañadas de terapia de quelactón (39).
Hemoglobina C.
La hemoglobina C es el resultado de la sustituci6n
del ácido glutamico por lisina de la sexta posici6n en la
cadena beta (alfo 2-beta2 6 Glus-<> Lis), Esta variante hemoglo
b:!nica produce cristales que al precipitarse reducen la de
formidad de la membrana eritrocitaria. El gen de la hemoglo-
54
bina ,·C ,e~_· muy· comun en :el:'_A(rica_-o'cc.ideri·taf. Eil lo·s :·_negrOs
~-ort~'ame~;¡-ca·~·a·s--: ;e >e·n~~~n-~r·a, ai,-_:g·~~-: e~ ,un· 2% dC fo·s individuos
y. e~ rarame~t~ ~is ta en hlarÍcos (42).
Él ·estado homocigoto ·ce~ aunque raro•· pr~_duce una
anemia -de le:ve ·a moderada con esplenomegalia leVe, _icterici·a
y·, extraordfnariamente, fen6menos vaso-oclusivos .. En el frotis
sanguineo la presencia de HbC origina c6lulas e.n diana. En
la electroforesis la l!bC comigra con la HbA2 (39).
El. mayor riesgo de la HbC es su · inteiacCió·a· ·~·on ¡',; HbS para producir la anemia CS falciforme. Esta condición
~~esenta manifestaciones similares a las de la ·anemia S falci~
forme.· La anemia CS falciforme tiende a ser menos grov':;
pero puede producir todas las complicaciones vistas_ en los
estados SS.
Al encontrar a individuos con electroforesis sugesti
vá de HbSC pero con sintomatolog{a más severa, debe de sospe
charse de una heterocigosis para HbS y HbO Arab (beta
2 !21 Glu ~Lis) ( 7 ).
- Hemoglobina D
La HbD comigra con la HbS en la electroforesis
.. •s __ e1.,·z:.esu.!tad.o_. de_ la _.sustituci6n del· ácido ·glutámico jior gl u
tamina en la posición 121 de la cadena beta (alfa2~beta/21 Glu-Gln) (39).
La HbD es encontrada, con baja frecuencia, en varias
partes del mundo. En el Punjab (India) la frecuencia del
gen es de 2% y los estados homocigotos no son raros. En la
población negra norteamericana la frecuencia del gen es de
0.5% (42).
55
La HbD comigra con la HbS electroforlticamente.
Sin embargo, la HbD no produce drepanocitos a bajas tensiones
de·· oxigeno_- y no da resultado positivo en la prueba de solu
bilidad para la HbS. El estado de homocigosis DD produce
·una· anemia leve asintomática. Como la HbC, la HbD cobra impor
tancia por su interacci6n con la libS. La anemia DS falciforme
-~s menos severa que lo anemia SS, y el infaLto esplénico no
se presenta. Debido a la comigraci6n electroforética de las
Hemoglobinas S y D, la anemia DS puede ser erroneamente diag-
nosticada como anemia SS. Por tonto, casos leves de anemia
falciforme deben ser sospechados como heterocigocis DS. Las
hemoglobinas S D pueden ser separadas por electroforesis
en agar a ph 6.2 (7, 8),
Talasemias falciformes
La combinaci6n de la HbS y beta-talasemia heterocig6-
tica produce un síndrome similar en severidad a la anemia
SS. Al igual que las anemias CS y DS, la talasemia falciforme
es generalmente menos severa que lo homocigosis SS (39).
-VBiiaRtes resultantes de sustituci6n de aminoácidos internos.
La sustituci6n de amino6cidos internos no polares
resulta en severos anormalidades en la estructura y/o funci6n
de la hemoglobina. Las variantes pueden ser divididas en
tres grupos: i. Hemoglobinas H¡ ii. las hemoglobinas con
afinidad alterada y; iii. las hemoglobinas inestables. Estas
variantes s6lo se han descrito en el estado hetcrocigoto y
es probable que la severidad de la anormalidad molecular,
en homocigosis, sea incompatible con la vida (8).
Hemoglobinas M.
Estas variantes hemoglobínicas resultan-: en .una forma
de 111etahemoglobinemia conglonita. En las cinco variantes des
critas (tabla VII ) la anormalidad uiolecuí-a'r es la misma:
La cadena lateral del nuevo aminoácido es 10 suficientemente
larga para alcanzar .. al· átomo ~erroso del;, gruP.~ h~mo y aceptar
- al electrón· no aparead~, Ox~d-~nd~~ ~-~·~s-~:e! 'a)." estado ~érrico (7).
. Estas he-m<iglobinas -producen--'1evea -anormalidades cll.
nicas, como policitemia cian~~is~·- La anemia hemolítica
no es evidente pero, la vida ~edÍ:8- -~.f~-'-·:1~~--: h-é'~Oties se encuen
tra disminuida.
El diagnóstico puede hacerse por- las propiedades
de absorción de las metahemoglobines. La detección de estas
metahemoglobinas congénitas puede lograrse por electroforesis
si el lisado es previamente convertido a metahemoglobina y
corrido a pH 7.1 (7).
llemoglobinas con afinidad por el Oxígeno Alterado.
La sustitucibn de aminoácidos importantes para los
procesos de unión y liberación del oxígeno, producen hemoglo
binas con afinidad aumentada por el oxigeno (tabla VIII).
Las siete hemoglobinas con afinidad aumentada resultan en
policitemia, debido a la hipoxia tisular, y rasgos clínicos
como dolores de cabeza y laxitud. Las variantes con afinidad
disminuida producen cianosis y anemia. Sin embargo en general
los pacientes son asintomáticos (7).
57
TABLA VII. Las Hemoglobinas M (7)
/vriante Susti tucion Afinidad por el oxigego
¡Jos ton "" ( 56) P.is-.Tir Disrninui da
Saskatoon (S (63) His-Tir Aumentada
Iwate .( (87) His-1':1.r Disminuida
Hyde Park (!. (92) His-4"Tir Aumentada
·!ilwauki::e (S (67) Val-o.Glu Disminuida
TABLA VIII. Hemoglobinas con afinidad por el oxigeno alterada (7)
Variante Sustitucion Afinidad por el oxigeno
Cheaapeake «.. i92) Arg-Leu Aumentada
Cape Town .eJC. (92) Arg-Gln Aucentada
Ye.ki::!a (?I (99) Asp-+-His Aumentada
Kempsey ~(99) Asp-Asn Aumentada
Ranier ~ ( 145)Tir -c1s Aumentada
Hiroshima ~ (146)His -...Asp Aumentada
Ypsilanti ~ (99) Asp -.Tir Aur.ientada
Hemobloginás inestables.
. . . ' '
.:La )1ere:ncia de.· estas hemoglobin:as. ~.normBle.s resulta
en i'a ~ondi¿i6n conocida como anemia congénita. d~ Cuerpos
de Heinz.
Todas las sustituciones aminoacídicas encontradas
en. estas hemoglobinas resultan en una hemoglobina inestable,
debido a cambios en su tamaño o carga (tabla IX). Esto pro
voca una uni6n deficiente del hemo a las globinas o una inter
ferencia en la estructura terciaria de la hemoglobina. Esto
desencadena la disociación del hemo y lns globinast seguido
del desdoblamiento de las cadenas y de su precipitaci6n forman
do cuerpos de inclusi6n de Heinz (7).
tic a
Todos los pacientes afectados sufren de
congénita no esferocítica de severidad
anemia hemolí
var iable. No
existen manifestaciones clínicas específicas excepto la dipi
rroluria (excreci6n de orina oscura) y ocasionalmente cianosis.
La dipirroluria es debida al catabolismo anormal de los cuer
pos de inclu~i6n de Heinz o de grupos hemo libres (39).
El frotis sanguíneo muestra hipocromía bandeado
bas6filo. Los esferocitos no se observan excepto durante
la crisis hemolítica precipitadas por drogas o infecciones.
Los cuerpos de Hcinz se observan s6lo después de
la esplenectomía o pueden ser inducidos mediante ln incuba
ci6n de la sangre con colorantes redox como el azul de mcti
leno (B).
La prueba de precipitaci6n en caliente se realiza
calentando una diluci6n 1:25 de hemoglobina en un buffer de
fosfatos pH 7.4 a SOºC por 60 minutos. Bajo estas condiciones
.59
TABLA IX. Algunas Hemoglobinas Inestables (7)
Variante
!!ammersr.iith
Ko1.n
Bristol
Gu:i -:C:!.11
Sustituc:.on
~(1¡2) Fer.-ser
~ (~8) Val- Met
(' (67) Val-Asp
~ Delecion de una porcion no de te!: r.iinada de FG
Anor::alidad
La fe~ilalanina es un contacto invariable con el grupo hemo 1 l~ cad2 na lateral de serina es muy corto para alcn~zar al grupo he:no
La cadena lateral volurr.1nosa de rnet1on1na di& torsiona nl segmento FG, rompiendo varios contoctos ;,,,_:o-¡;lobina
La valina r.o polar es ree~plazada por el ncido ~S~?rtico polar¡ para neutralizar la car&e del ospartico se requiere de '.1.nc gran distorsion Cel
La delecion resulta en la perdida de ~uchos conta~ tos he!:!o-glo';:)ina
Go
•,., '
la mayada de las v~ri°¿nt.;; ~riestables 'cono;cidas precipitan _.;:·/:· .. :>' ._;· -_.)'. :.·) .. . ··· ·.··;:
-· · \.·· · ~~:.:.. , :·,. ;'~{·.:'S.: .. :.· . ·~::.f:.
aunque .l~Noe~epxli~s~teect:r~~::mH~~:fit:litd~}f·º~ri~•:ifü::.to:.:::.ien~:: pacientes deben ser. ad.v.ei: .. Údtis . del ·•riésgo: de tomar drogas oxidantes (8). -::••,
111. TECNlCAS DE GENETICA MOLECULAR
61
_.-;~He ;.~~;t~. --f-~"~z~-~o-,·-a·> prtú~e~t~.r~e .-_como bi6logo molecular .• ·. · (. ,:. ). •: porque estaba·. cansado/•. de ·. e'xplicar· :•'.que e'ra .a·.:_ ·la .vez', :un'. crl'st-a16gr_afo, un··: bio.qu!mico, u.n ·:·biof!sico y. un·. "geneti,sta".. · ·
Fra'nds Cri~k (47)·
La genética•'de hoy y la genética del mañana proceden
en línea 'directa 'de la genética de ayer de la que, como se
sabe, H.endel .f~e el ge.nial iniciador (48). Nadie ha pretendido
nunca. que. tod.a .la genética haya nacido en 1865, fecha de la
expoSic.i6n' de los trabajos de Hende!, pero si es innegable
que- fu'e é.1 qUien primero descubri6 lo esencial: la naturale
za diScreta, es decir discontinua, de los determinantes here
ditarios, su independencia de unos con respecto a otros,
todo_ ello en una época en la que reinaba la concepci6n de
que la herencia era el resultado de la mezcla de sangres.
Se suele decir que fue a principios de este siglo
cuando tuvo lugar el verdadero arranque de la genética. Nume
rosos trabajos fueron dedicados entonces al análisis de la
transmisi6n de los genes mediante la reproducci6n sexual.
Por aquella época ya se conocía el mecanismo de la meiosis 1
desde 1902 W,J. Sutton T. Boveri (49), demuestran que
existe un paralelismo entre el modo de transmisi6n de los
determinantes hereditarios, denominados genes por Johansen
algunos afies mas tarde, y el comportamiento de los cromosomas.
Estudios posteriores por parte de W. Bateson y R.C.
Punet (49) originan resultados que parecen estar en desacuer
do con un comportamiento totalmente independiente de los genes
entre s.í. Estas aparentes excepciones a las leyes de Mendel
encontraron su explicaci6n cuando Thomas H. Margan (SO) funda
la teoría cromos6mica de la herencia.
62
También fue ,a· principios .del siglo vdnte cuando·
se formuf~ron·: otras ··~as· ·nac_iones fundBm.e'ntales. Una, 18 _l_e·y
de Har.dy-Wei.nbérg, •relativa·'.a la distribuci6n .de los alelos
en uná poblaci6n, enc:.lacual se basa la genética de p~bla'cio-: nes. (59)
La:,:otra nocibn .se debe al médico inglh<A.B'. GarrÓ.d
(51), qui~n fue .. el primero en proponer que uri, defecto en •. un
~:ó'ío -f:~-~~·e~<·P·~~d~~ -·----~·-ri.Si~a r una p-rot~'Ína def ei: t·u~sa re.sPOnsB:bl,e
de .una e,l1ferineda·d, estableciendo es! ~-1 c~ncepto'_.·de' errores
innatos ,del metabolismo.
Descubrimientos posteriores (1944-1961) establecie
ron conceptos pilares para la genética moderna: i) El estable
cimiento de la relaci6n "un gen-una enzima 11; ii) La descrip
ci6n de que la unidad de mutaci6n es la base nuclcica; la
unidad de recombinaci6n es también la base nucleica, ya que
las recombinaciones pueden efectuarse entre dos bases adyacen
tes; y que la unidad funcional es el gen que está formado
por unBs mil bases; iii) Los experimentos de Avery y Mcl..eod
por un lado y los de Hershey y Chase por otro que establecie
ron sin lugar e dudas que los ácidos nucleicos son el mate
rial portador de la herencia; iv) La elucidación por parte
de J. Watson y F. Crick de lo estructura en doble hélice del
ADN; v) El concepto del Operan, de J. Monod y F. Jacob, como
sistema regulador de la actividad génica y; vi) Como punto
culminante el desciframiento por W. Niremberg, J.H. Hatthae
y S. Ochoa, del c6digo genético que permite el flujo de infor
maci6n de los ácidos nucleicos a las proteínas explicandose
as{ la relaci6n funcional: genotipo-fenotipo (49,50).
Cuando se pretende formular una dcfinici6n se co
rre el riesgo de caer en la sobresimplificnción y/o en el
rcduccionismo. Es por ello que cuando se estudia a la Vida
63
_en vez de _tratar de definirla sé prefiere enunciar sus cuali
dades y pro-piedades. De la misma manera, antes que dar una
def inid6n de lo que es la Genética Molecular es preferible
enumerar- sus carocter{sticas, objetivos, métodos y campo de
acci6n: La Genética Molecular aisla segmentos de ADN, locali
za aquellos que corresponden al gen que quiere estudiarse
y determina la secuencia de sus bases. El gen así aislado
puede ser obtenido flanqueado por sus regiones adyacentes,
de las que también pueden determinarse las secuencias. Se
accede de este modo a las bases nucleicos que, situadas con
frecuencia en el exterior de los genes sobre el mismo segmento
de ADN, pueden cumplir la función de lugares de reconocimiento
para los proteínas de regulaci6n. Conociendo, efectivamente,
la secuencia de las bases de un segmento de ADN cuya funci6n
es desconocida, es posible deducir la secuencia de los amino
ácidos de la proteina cuyo sintesis rige, Este tipo de gen{,ti
ca permite tambi6n actuando directamente por v!a química sobre
una o varias bases de un segmento de ADN, inducir mutaciones,
que, en este caso, son mutaciones dirigidas. De donde, o6n,
la posibilidad por una parte de hncer síntesis de proteínas
modificadas en sus propiedades y que podrían ser de interés
agron6mico, industrial o ml!dico, y por otra parte, de conocer
mejor los procesos que operan en el funcionamiento de los
seres vivos (49).
La v~nguardia de la genética molecular es la inge
niería genétiCa, la cual, al permitir el análisis fino del
S_o_p_or-i::e--o-riat·i?r'tal ___ de--1n herencia -hace posible su modificaci6n;
su aplicaci6n a las ciencias de la salud reside en los
originales métodos de producci6n de sustancias biolbgicas
de interés ml.dico y en el diagn6stico de enfermedades heredi
tarias.
La genética, una ciencia relativamente joven, tiene
: ,_,_ ,'
ya un brillante- .,p8s640 •... Su f~~-~r~, "n~·, {~:::.~S~ .. :_·m,~n'Ol~ ._·P~_estO_ que los ml!todos que. empl~D son de: Una frnur.i•. yc'de Un~ 'precisi6n
in.com'p·arablés~ __ Y_. son· a~gunas ·d~ -.é-~t~:¿·-"·m~-·~od'ti·ios_!~~-:,._:._c¡U_~: h-~-~ servido para, el diagnóstico de :dÍ.vkrso.s U pos .·de hemoglobirio
patl.as, l'as que se describen a c~ntinua2i6n~
A. OBTENCION.DE.ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO HUMANO
Muchos de los estudios de la gen6tics molecular
se inician con la obtenci6n de ADN de et.lulas humanas en un
É!stado i"o suficientemente puro que permita un análisis confia
ble' del mismo. El paso crucial en su purificnci6n, la remo
ci6n de proteínas, puede lograrse extrayendo la solución acuo
sa de ácidos nucleicos con fenal y/o cloroformo. Sin embargo,
medidas adicionales son requeridas cuando los ácidos nucleicos
se purifican a partir de una mezcla compleja de moléculas
como un lisado celular. En estos casos, se destruye a la
mayoría de las proteínas digiriendolas con enzimas proteolí
ticas antes de realizar las extracciones con solventes org&ni
co (84).
l. Fuentes de ADN Humano
El leucocito es un tipo celular conveniente para
la extracci6n de ADN; suficiente ADN (aproximadamente 200 ug) pueden obtenerse de 10 a 20 ml de sangre (7,8).
_' __ -__ ;~_..:'. ~!~~:~~_,:,~nc_i_6n_ de células fetales, cuyo ADN servirá
para el diagn6!ú:icoc'preiiatal, pueden obtenerse por diferentes
métodos:
., Amniocentesis; su aparici6n en 1960 la hace la
técnica mas antigua para la detecci6n en útero de alteraciones
fetales. En la decimoséptima semana de gestación puede obtc-
ncrse liquido amni6tico con numerosas' ~éiuiBs descamadas del
feto. La punci6n se efect6a' ii t'ravés de la> pared. abfominal
con la ayuda de una aguja. 'La ecografía que visualiza la
maniobra permite, con gran se.guridad, controlar con precisión
el lugar y la profundidad de la punci6n. La técnica es extre
madamente fiable si es realizada por técnicos diestros. En
19 años de práctica, el riesgo para el feto está bien evalua
do: varia de 0.5 a 1.0% seg6n la experiencia de los equipos
(52). Los amni6citos colectados mediante la centrifugaci6n
de 5-20 ml de Hquido amni6tico proveen suficiente ADN para
los an6lisis pertinentes.
técnica es lo tardio del
Sin embargo una limitaci6n de esta
examen: decimoséptima semana de
gestaci6n ¡ este retraso significa que en caso de descubrir
una anomalía grave en el feto, la madre sufriría un aborto
de Segundo trimestre, que, en este momento y desde cualquier
punto de vista, es particularmente penoso.
Obtenci6n de sangre fetal; los mhodos de obtenci6n
de .sangre fetal aparecen en 1973; los principales son la fe
toscopia la punci6n directa bajo control ecográfico. La
feto~copia es en principio un m6todo de visualizaci6n del
feto: un tubo rígido que contiene fibras 6pticas y una aguja
que permite puncionar los vasos de la base del cord6n umbili
cal. Esta técnica que impone la hospitalizaci6n de la mujer,
comporta un riesgo fetal elevado, entre un 1 y un 4%. Uno
vez más, la ecografía ha permitido progre.5ar fttcilitando la
técnica y reduciendo el riesgo: la obtención de sangre puede
ser realizada ahora por punci6n directa de la vena umbilical
con la ayuda de una aguja que atravieza la pared abdominal.
Esta técnica presenta para el feto un riesgo inferior al 1%.
Estos dos métodos se practican entre las semanas decimosépti
mas Y vigésima presentando, por tanto, el mismo inconvenien
te de diagnóstico tardío que la amniocentesis (52).
66
Biopsia ·de las vellosidades del cori6n: esta tilc
nica, _,de~8:rr'ollad~ a finales de. )os años 60 1 s pero puesta
•en prácd.ca cHnica· a iÍliGios de 1980, permite la obtenci6n
de· células i~tales en un estadio precoz ·del embarazo (53).
Al .~principio de la embriogénesis, alrededor del embri6n apa
re·c~ · progresivamente una en vol tura externa, el cori 6n. En
una parte del cori6n situada en contacto con el tejido ( trofo
blas.to} que se convertirá en placenta, se desarrollan prolon
gaciones celulares (vellosidades) de origen fetal, La idea
bhica de esta técnica es la de obtener por la via vaginal
-e1-· cori6n tiene un acceso relativamente directo- estas vello
sidades (aunque recientemente se ha reportado un caso de mues
treo transabdominal (54)). La obtenci6n puede llevarse a cabo
de forma precoz, entre la novena y undécima semana de gesta
ci6n y no necesita anestesia. Con respecto al riesgo que
acarrea al feto esta biopsia, los Últimos resultados conocidos,
publicados en 1984 y que provienen de 42 centros europeos
y americanos, arrojan un riesgo de 4% de pérdida fetal (en
aquellos. centros que han superado las 100 biopsias el riesgo
fetal ob~-erva_do es de 2.3% (52).
~Bs indicaciones de este nuevo método para el mues-
__ treq. pre~etBl están en estudio. A este respecto hay dudas
sobre'_ .·la· calidad del proceso de obtenci6n; la contaminaci6n
~~-r :céiul~s mat.ernas puede ser una grave fuente de error (55,
56); ._Las primeras aplicaciones de este método se han llevado
a_ c.abo0
. para .ia·.detecci6n de la anemia falciforme (57).
2. Puriffcaci6n del ADN
El ADN de las células en estudio; leucocitos, amnio
citos o trofoblastos, es obtenido de la siguiente manera (58):
a. Laa células son Usadas mediante tratamiento
una vez -C.~D ·-f-enoi, seguido de otra extracci6n' con una mezcla
1 d d~ friñol y cloroformo, y por 61timo con cloroformo. Este
p~ocedimiento aprovecha el hecho de que la desproteiniznción
eS-- más efectiva cuando se usan dos solventes orgánicos en
vez de uno solo. Aún más, la Última extracci6n con cloroformo
elimina restos de fenal presentes en la prcpnraci6n de ácidos
nucleicos que podrían inhibir a las enzimas modificadoras
del ADN utilizados en pasos posteriores.
e. El ADN en la fose acuosa es concentrado por
prccipitaci6n al adicionar etanol fria. El precipitado de
ADN, que se forma a bajas temperaturas (-20 C) y en presencia
de concentraciones moderadas de cationes monovalentes, es
recuperado por ccntrifugaci6n y redisuclto en un buffer adecua
do.
El ADN as! obtenido es de aproximadamente 40-100
kilobases de largo y suficientemente puro para ser sustrato
de enzimas modificadoras del ADN (58),
B. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
El ADN obtenido y purificado del sujeto en estudio
debe de ser analizado para determinar el tipo de alelo presen-
68
te en el locus de interh. Esto significa que se requiere
localizar caracterizar a un fragmento de aproximadamente
1000 pares de bases, o 1 kilobase, de entre un total de -
6 000 000 kilobases que conforman el genomio completo de un
ser humano. En términos prácticos esto significa que un re
quisito para el a·nUisis directo de un gen es la habilidad
para identificar a un fragmento de ADN del tamaño de un gen
de entre 6 millones de fragmentos de tamaño similar. Para
~ograr. esto se requiere de una estrategia metodológica que se
inic-ia - con la fragmentaci6n del ADN por medio de las enzimas
de restricci6n.
Una definici6n que se ha dado en forma general para
lo que es una enzima de restricci6n es: Endonucleasa que degra
da ADN duplex modificado impropiamente (59). Estas enzimas,
especificas de cepa, son parte de los sistemas de defensa
bacterianos
rápidamente al
excisiones en
sobre el ADN.
permiten a la bacteria reconocer destruir
ADN extraño, como ol de los vjrus, al causar
la doble cadena en un número limitado de sitios
Para tener una actividad de restricci6n, cada
una de estas cepas bacterianas posee una metilasa ADN-cspecí
ficn que transfiere grupos metilo S-adenosil metionina (Ado
Met) a Adenina específica o o residuos de citosina en el ADN.
De esta manero, ~l ADN de las células es protegido contra
su propio actividad restrictivo (60).
Por muchos años se ha sabido que los virus bacteria
nos tienen un rango limitado de hospederos. Desde 1952, va
rios grupos de investigoci6n describieron el fen6meno de modi
ficaci6n del cromosoma viral inducida por el hospedero; fenó
meno por el cual el espectro de bacterias hospedadoras para
ciertos virus depende de lo cepa bacteriana en que este se
hubiera propagado originalmente (61). A principios de los
años 1960's, Arber (61) demostr6 que la replicaci6n viral
69
exitosa se acompañaba de la permanencia del ADN vírico en
su forma macromolecular intacta, mientras que el fracaso en
la infecci6n se caracterizaba por la destrucci6n del genomio
viral. Arber predijo la existencia de enzimas que hidroliza
rian el ADN extraño mientras que el ADN propio seria modifica
do para evitar ser reconocido por tales enzimas. A principios
de los años 1970's, Smith y llilcox (62) describieron a las
endonucleasas de restricci6n que destruían al ADN extraño,
mas no al ADN de la bacteria hospedadora. Smith y otros han
purificado y descrito mas de 200 de tales enzimas, la mayoría
de las cuales tiene una especificidad de secuencia absoluta
(63).
Originalmente las endonucleasas de restricci6n fueron
clasificadas en dos grupos en base a su complejidad estructu
ral y a sus requerimientos de cofactores. Conforme el conoci
miento ha avanzado se han establecido criterios adicionales
para,_ dif.erenciar entre varios sistemas de restricci6n y modi
fic·aci6n. Como resultado actualmente se reconocen tres tipos
diferentes de enzimas de restricción: Las enzimas del tipo
I y- III portan las actividades de modificaci6n (mctilaci6n)
y de restricci6n dependiente de ATP (excisi6n) en la misma
prote!na~ Ambos tipos de enzima reconocen secuencias no mcti
l_ádas eri· 'el ·-ADN sustrato, pero las del tipo I realizan cortes
~_zarpsos, ___ m;entras que las del tipo III cortan el ADN en sitios
específicos,
Las enzimas del sistema de restricci6n/modificaci6n
tipo II consisten de una endonucleasa de restricción y de
una metilasa de modificaci6n separadas una de otra. Un gran
número de enzimas de rcstrícci6n tipo II han sido aisladas
(63), muchas de las cuales son indispensables en las metodolo
gías de genética molecular (véase Tabla X donde aparecen
nu~vc populares). Estas enzimas cortan al ADN dentro o cercn
?O
TABLA X. Endonucleasaa de restriccion rle uso comun y sus especificidades de corte~ c59> Enzima Secuencia blanco
Bam HI GIG A T e e e e T A GIG
Bgl I G e e N~N G G e CGGN NCCG
Eco RI GfA A T T C e T T A AIG
Hae III a ªle e e e G a
Hind III AIA a e T T T Te a AIA
Msp I C~G G C
Pst I e T Ge A!G GJA e G T e
Taq I Tt.g-g,A A T
Xba I TLC TA G A A G A T CIT
+ Las secuencias reconocidas y restringidas por una enzima de restriccion es tipicamente un palin--dromo: esto quiero decir que se lee igual de 1z quierda a derecha, QUe cuando se invierte de d,!J, recha a izquierda. N= cualquier base nucleica.
71
de sus-. ~·~-e~.~~.¿~~ª-- pár~~cu~~re~: de reCon~~im~.~-nt~-~·-~ ~u~ ti_~ic~- -ment.e s<in de 4·:··.·a 6 .nucleotidos de largo. co.n' un doÚe 'eje de
simetría: La i.'nzima Úó RI, por ejeinplo, (llamada asi porque
es ·~·•. RY .· .. 13) ,' reconoce
la s~cue~cfíi ·. hei~nulleotÚic.a :e
/ .• 51 G4.·A: i .:·.:• . ,. ·.· ... ··: >. <'A~T,T,;c <3 1S!Tiº,A·.·.;·.·· .. -.• ~ ... ~ .. _-.:,G 5:1
.·.•• '"' ·.· <~-- ·_-.:~:~ji.'J .:+=~~, :-{~L Al igual ~¡¡~. ~~~llJ~ cifi~-~:Í:énÚma's': ci;< re"~~r~~ci6n 1: Eco _ RI no
cor t ª"' ~-~~¿ t'~-~~-~-t·e ·;~~~~:·~ 1;:~'.í.~:~.'ij:~~1~~·~-:~~~i~·~,t~;¡-9--~~;- '._~in~~-~,~~ ':.'·J.o sic iones
· sep~radaLp<ifc¿¡¡;.t;i'o'' ¡¡¡f¿f'~'ó'ifil'i>1i-:e1i~l~~- éii;'~ ~ili!ii';¡¡s· ü•ADN: ".-)i>~:··_,:?;'>- <.;-:.·_ t;_/'·-··-.> '<'.,"'-- -~·~':·;.~'-:'-='. ~,-_ ..
'51''31• - cs!xh· : -0·31,\
-.:;.:fr_~.iT;:r~~ ~S;. 1_._':.:\. - _ ]§i ¡g 5 / . - ~o:,;-·
·. ;<_;_-.-. ~_::'·' :~·-_:/:~---.---;_·:' _ ... -._-,_ ·:·_. ·_ '·-··--'_ .. _.': '--" /
EstéiS Co'ites~-"desfesíidos orfgi~a~ frag'mentos de ADN con extremos
5 ! .. · c_~h~~'.~ .. ~.~~~:'_~ · .. _--,.~~~--~q ~_ie~~'.~- 'd,~_ :.-'e·at~s·. -e~t remos puede aparear se con.:~~tr_o:--e~frerD_O.·'·Orfgfná.d_O·:-p·o~ la actividad de la misma enzima
de restricci6n. ·As! pues, cualquier molEcula de ADN que
posea. erit·aS··.-e?Cfr~m-~:s c·oheáivos -complementarios puede ser un1da
.a º~-~oB ':_f~~-8-~entos .-.pa-ra for~ar nuevas moléculas recombinantes
(84).
Muchas enzimas de rcstricci6n, como Eco RI, generan
-'-~-~~~~e-~~~-ª ~e- ADN con extremos 5' cohesivos; otras (por ejemplo Pst I) generan fragmentos con extremos 3' cohesivos, mientras
otras (por ejemplo Bal I) cortan en el eje de simetría produ
ciendo extremos rasurados (64).
~lgunns enzimas de restricci6n se emplean en el labo
ratorio para cortar al ADN humano en fragmentos definidos
para su posterios manipulaci6n y análisis. Un gran número
72
d-e e'nzi~~s de~ res.tric'ci6n, ·de dif~fentes bacterias, son comer
~--1.aim:ent·~:. acCeS:Ú~·les~ /La ·~m-~y~i{~ >~o~··\estables por meses si
se almacerian a -20 C, y cÓÍ:ta~·'ie1 ÁDN a 37 ºe en buffers sim
p~~~---·qu1{:·:~ontengan a.al~·~. --~--~_g·~:~-~·i:~: y' un agente que prevenga
su oxidaéi6n como. el ditfotr~itol.
El genomio ·humano-- diploide puede ser cortado por
una enzima de restricci6n en cerca de l 000 000 de fragmentos
discretos con tamaños que van de los 100 a los 100 000 pares
de, bases de largo. Solo uno de tales fragmentos (o dos o
- _tres- ·s·f_ el gen de interéB tie·ne·· sitios de corte internos para
la enzima empleada) contendrá al gen en estudio, Estos frag
mentos portadores del gen en estudio pu~den ser separados
d~l- re_~to,_ en base a su tamaño, mediante la técnica de electro
foresis (84).
C. ELECTROFORESIS DE FRAG~ENTOS DE RESTRICCION DEL ADN
Se define como electroforesis a la migraci6n de por-
·-t{ciJlas, cargadas eléctricamente, en una soluci6n bajo el
influj.o de un campo eléctrico. Los métodos electroforéticos
-se--div_iden -en -dos categorías, que dependen de si la separaci6n
se efe~túa en ausencia o en presencia de un medio de sosten
o estabilizador. La electroforesis de soluci6n libre, que
fue la· primera en desarrollarse, presenta muchas dificu1 tndes
que _se-evitan si la separaci6n se efectGa en un medio de sopor
te como un papel, una capa de s6lido finamente dividido como
celulosa, geles de almid6n o de poliecrilamida, polvos de
vidrio, geles de agar, etc. (84).
En la electroforesis convencional, la corriente eléc
trica es conducida por medio del buffer a través de un medio
de soporte tal como el gel o la poliacrilamida. La separaci6n
tfene lugar a :un pll y· fuerza i6nica constantes. Los iones
73
de la muestra_ se desplazan dependiendo de su carga neta hacia
el ánodo-· o cátodo, en el caso de los ácidos nucléicos estos
migran hacia el ánodo debido a su carga neta negativa (84).
La electroforesis a través de geles de agarosa es
el método estandar para separar, identificar y purificar frag
mentos de ADN (fig, 10), La técnica es simple, rápida y capaz
de resolver (resolver = separar a los fragmentos de ADN en
virtud de sus tamañas moleculares) mezclas de fragmentos de
ADN que no pueden ser separados adecuadamente por otros proce
dimientos, como la centrifugaci6n en gradientes de densidad.
Aún más, la localizaci6n del ADN dentro del gel puede determi
narse directamente: Las bandas de ADN en el gel son teñidas
con bajos concentraciones del colorante, intercalante, bromu
ro de ctidio; tan poco como 1 ng de ADN puede ser detectada
mediante observaci6n directa con luz ultravioleta (65).
La migraci6n electroforética del ADN a través de
los geles de agarosa depende de cuatro factores principalmen
te:
a. El tamaño molecular del ADN. Las moléculas linea
les de ADN duplex migran a través de la matriz del gel a velo
cidades inversamente proporcionales a el log10
de sus pesos
moleculares (66) (Véase fig. 11)
b. La concentraci6n de agarosa. Un fragmento de
ADN con un tamaño determinado migra a diferentes velocidades
a través geles con diferentes concentraciones de ogarosa.
Existe una relaci6n lineal entre la movilidad elcctrofor6tica
del ADN y la concentraci6n del gel.
Así pues, al usar geles con diferentes concentracio
nes, es posible resolver una amplia gama de tamaños de molécu-
Fieura 10. Preparacion
de geles de agarosa;
1 - 3 1 preparacion del molde
con báse de vidrio o acri
lico '· en que se formara
el gel;4, colocacion del
"peine" que originara
los p'.l;us en los que se
colocaran lns .~ues".;rfls;
liquiUa¡G y 7, al onrrl~~
:; solidificar la agarosr.
co.1 cuiJ,,Jo p~ra 110 ares
t.~r la integr:t..10.U de los
pozos; 3, se retiran los
1iordt:G clel r.tolde y; 9,
el gel es colocado on la
camara de electroforesis
a
~ ~ 'º
previamente aforada con la solucion buffer de electroforesis; 10,
la enmara de electroforesis se conecta a u11n fuente de poder, con
la cual se establece la fuerza del campo electrico bajo el cual
se llevara a cabo la corrida electroforetica (34).
5
.. o
"' Ti .., o
4 "' ... o g
"' 'O .. Q)
" "' "' .. o
3 ... Q) 'O CJ,':'.
o o,á"" o ...
2 2 3 4 5 e 7
distancig recorrida (cm)
FiGUra 11. Comportamiento electroforetico del ADll en
galos de agarosa en funcion de su tamaño~molocular •
(adaptado de la referencia 84)
75
las de .ADN _ (84),
Cantidad d~:agarosa en
eL.geL·. (%) - -
0~'3 '0;6c
'• 0;'7--'--co .. --~-C'-------1 :2
LS 2;0
e• Conformaci6n del ADN.
76
Rango efic~ente de sepa
ra¿i6n de mol6culas de -
ADN (Kb)
60 -
20 -
io - o.a 7 - 0.5
6 - 0.4
4 - 0.2
3 - 0.1
Fragmentos de ADN del
mismo tamaño pero con diferente conformación {cerrado circu
lar (tipo !) , circular con excisión en una de las cadenas
(tipo II), y lineal (tipo III)), migran con diferentes velo
cidades a trav~s de geles de agarosa (67, 68), Las movilidades
relativas de las tres formas depende primordialmente de lo
concentraci6n de agarosa en el gel pero están también influi
das por la inter1sidad de la corriente aplicada, lo fuerza
i6nica del buffer de electroforesis, y de la cantidad de tor
ciones supcrhelicoidales presentes en la forma I del ADN (69).
En algunas condiciones la forma I migra más r.c'!pido que lo
III; en otras, el orden se invierte. Una forma de identificar
lns diferentes especies conformacionales del ADN es el llevar
a cabo electroforesis en presencia de cantidades crecientes
de bromuro de etidio. Conforme L1 concentrución del coloran
te aumenta, m6s de este compuesto se une al ADN. Las torciones
negativas presentes en la forma I de las moléculas se eliminan
progresivamente, y su velocidad de migrnci6n va decreciendo.
Cuando todas las lorciones negativas han desaparecido, la
velocidad de migraci6n de la forma I alcanza su valor mínimo.
77
Si·- se añade mas bromuro de etidio, Se generan torciones super- -
helicoidales positivas, y la movilidad· de la forma I aumenta
rápidamente.
d. La corriente aplicada. A voltajes bajos'· la
velocidad de migrad6n del .ADN lineal es proporcional al vol
taje aplicado. Sin embargo, conforme la intensidad del campo
eléctrico se incrementa, la movilidad de los grandes fragmen
tos de ADN aumenta diferencialmente. Así es que, la efectivi~
.dad ~~ ia~~epa~aci6n de fragmentos de ADN en geles de agarosa
disminuy-e conforme el voltaje es elevado. Para obtener la
máxima resoluci6n de los fragmentos de ADN, los geles deben
correrse a· no mas de 5 volts/cm. (84).
e. Composición nucleotidica y Temperatura. El com-
port.amiento electroforl.tico del ADN en geles de agarosa no
es afectado significativamente ni por la composición nucleotí
dica dC las muestras (70}, ni por la temperatura a la que
se corre el gel. Así es que en geles de agnrosa la movilidad
electroforética de los fragmentos de ADN de diferentes tamaños
no varía entre 4 y 30 °C. En general, los geles de agnrosa
se corren a temperatura ambiente. Sin embargo, los geles
con menos de 0.5% de agarosa son muy delicados y se recomienda
corr:erlos a 4°C, temperatura a la cual adquieren mayor rigi
dez,
El m~todo mas conveniente para visualizar al ADN
en geles de agarosa es mediante el uso del colorante fluores-
cente, bromuro de etidio (65). Estn sustancia contiene un
grupo planar que se intercala entre las bases del ADN. La
posici6n fija de este grupo y su proximidad a las bases provo
ca que el colorante unido al ADN fluorezca mas que el que
está libre en soluci6n. La radiaci6n ultravioleta absorbida
a 260 nm por las bases nucleicas, transmitida al colorante
78
o a 300 y 360 nm por el colorante
mismo-, se· .. emite a 590 nm en· la regi6n rojo-naranja del espec
tro v"isible. ·cuando la eleé:trofo-resis se ha completado, el
gel es inmer~o en una soluci6n _de bromuro de etidio (Q;S ug/ml)
por 45 mini.itas,, y ·se procede a observar lBs bandas· de ADN
por i~ansilbminaci6n con luz,ultraviolet~ (65).
n. IDENTIFICAáON DE SECUENCIAS GENICAS PARTICULARES
La localizaci6n de una secuencia de ADN en particular
,_(p~; ~~-j. el: gen en estudio) de entre los fragmentos de restric
ci6n-- d~l·-·-ADN- que han sido separados por tamaños gracias o
u_n·li:-~- el~cctror·o-resis- en gel de agarosa se logra por medio del
uso de· dos t~cnicas muy comunes en genética molecular: la
transferencia Southern (71) y la hibridaci6n con sondas génicas
moleculares radiomnrcados: Los fragmentos ya resueltos en
el gel de agarosa son desnaturalizados, transferidos a un
filtro· de nitrocelulosa, e inmovilizados en el. Las posiciones
relativas de los fragmentos de ADN en el gel se conservan
durante la transferencia a el filtro. El ADN unido al filtro
es hibridado a ADN o a ARN radiomarcado con 32r, y la autorra
diografía es empleada para localizar la posici6n de la(s)
banda(s) complementaria(s) a la sonda radioactiva (84).
l. Transferencia Southern (71, 84)
Los fragmentos de ADN ye ref!~e}_tos en el gel de aga
rosa- son desnatilralizandos, volviéndolos de cadena sencilla,
mediante inmersiones repetidas del gel en una soluci6n 0.5
M de NaOH. Enseguida el gel se coloca encima de un papel
filtro cuyas orillas estén inmersas en un recipiente que con
tenga una solución salina concentrada (fig. 12). Encima del
gel se colocd una hoja de papel filtro de nitrocelulosa previa
mente humectado y encima de esta se colocan varios papeles
Fif;ura 12. Metoclo para transferir AD'.l ele geles de agarosa
a filtros de nitrocelulosa (transferencia Southern). El
buffer establece un flujo capila1• desde el deposito hacia
los papeles absorbentes arrastrando consigo a loa rragmen
tos do /Jlll que se adsorben a la nitrocelulol>a (34).
79
ESTA TESfS SAUI D(· LA
H6 Dm BISUITECA
80
' -absorbentes· con un- objeto pe,;~-do rematando el .conjunto (fig.
12). · La. soluci6n: saHna >estable.ce un flujo capilar: del r~d::pie.~te que -ia -~on~iene. hacia los papeles absorbentes, a .. ~ravés_ del" gel - y del filtro de nitrocelulosa, y en _el p_rocesci
acarrea al ADN de una sola hebra del gel hacia el: fÚtro; de
nitrocelulosa. Después, de 12-24 .horas de t·~ansfer~nci:a·,,· .los
fragmentos de -ADN. se encuentran ya ·adsorbidos_·· al: ·filtro-.; de·
'nitrocelulosa. Un h.orneado posterior de los ,fili:~os/ ·a· ·ao•" C durante 2 'horas, estabiliza la uni6n filtro"."ADN.
- - -·· ·.·
El ADN "de· cadena sencilla unido a. -la· nitro~elul~sa" aún··· pu~de c--_ªP~rJa~-~~··- a·- ··s~~úe~-c-1á~ comp-1e~e-n-fa·r-i1is ~-~~-e--~-.ADN; -uñ. -
proceso llamado hibí-idáCi6n.
2. 'i1i~~i~a:~6'.ri; con -Sondas ·Génicas Moleculares
Una vez que se cuenta con una réplica en nitrocelulo
sa de los ff"agmentos resueltos, de la restricci6n del ADN,
se requiere localizar e identificar al gen particular que
deseamos estudiar. Para lograrlo se requiere contar con un
fragmento de ADN que sea complementario a la secuencia, o
a parte de ella, del gen en estudio. A este fragmento de
ADN se le llama sonda g6bica molecular (en adelante referida
solo como sonda) y debe de estar radiomarcada para poder ser
visualizada. De esta manera, cuando se pone a la réplica
en nitrocelulosa del ADN en uno solución de la sonda, esta
Última se apareara por complementnriedad (hibridara) con el
gen de interés, y a6lo con el, y la posici6n del hibrido puede
determinarse mediante la autorradiografia.
Sondas Genéticas Moleculares
·Una· so~da :sénica molecular 'puede ser definida 'como
un ác_idó.nucléico: radioactivo de_ ca_dena sencilla que 'es empleado
_---·::;\:_:__._ - .. ·- s-oi.t~~·-~:·c-o-nO_c_e------1a·· s-ecüencia aminoac idica, total o par
ci,8!'• :de 18,:,"pr'o'úÍn~ codificada por el gen de interés, la
.cd-~·~-'es};·ci'ódie~t-~>.s-ec.~encia del ADN puede ser inferida gracias
· ·-~a.1:~-~~~ .. o~-~{.1:~¡-~~-~~: .. dé.--que triple te codifica para cada aminoácido
·.-:--(1·2·;--.:_:--·~;-:EO'=-·:·;e·s~~~cio, se estudia lo secuencia de la proteína : -:· ~ - ..
en.\_bu~.é-~ ·d·e -áreas ricas en aminoácidos codificados por sólo
un·:,~,od6'~ (po',, ej. metionina, AUG; trp, UGG) o a lo más por
doS.:'· (p-·. eJ., ·fenilalanina, UUU, UUC; tirosina. UAU 1 UAC; his
ti_dina·, CAU, ·cAC). Conociendo la frecuencia con la cuol se
--·_emp.lean diferentes codones degenerados (p. ej. glutamina es
us_µ~lm~~te codificado por CAG) y aprovechando los aparcamien
tos G:T, a menudo es posible reducir la lista de oligonucleb
tidos Posibles a una cifra manejable. Estos oligonuclc6tidos
son entonces sintetizados in vitre, mediante una serie de
reacciones químicas en cadena que van añadiendo un nucle6ti-
·- ·d·~- en--cada ciclo, ya sea por el método del fosfodiester (73)
o ·el mas eficiente del fosfotriester (74). (Para una discu-
si6n completa de estos métodos v~ase la referencia (75).
Una vez que se ha sintetizado químicamente a aquellos
oligonucleonútidos que representan todas las posibles combina-
e.iones codificantes para una
aminoacldica de la proteína
pequeña porci6n de la secuencia
de interés, se requiere saber
82
cual ___ de e·11o·s fOrma un -dúplex perfectamente ap_areado con la
secuencia del ADN gen6mico. Ya que los .oligonucleótidos
que no sean 100% complementarios al ADN gen6mico sufrirán
de errores de apareámiento, si las cciñdiciOries de hibridaci6n
se h~~en severas, s6lo los duplex perf~ctamente complementarios
serán estables y de esta manera podremos eiegir al oligonuclho
tido .que nos servir& como sonda.
Sintesis de ADN copia
La conversión enzimáiica j~l ARNm poliA en ADN copia
de doble cadena es una herramienta fundimental de la biología
molecular de los eucariotes. El procedimiento más com6n para
sintetizar copias de ADN de doble cadena a partir de ARNm
conste de los siguientes pasos: síntesis de la primera cadena
de ADN copia gracias a la transcriptasa inversa (ADN polimera
sa dependiente de ARN), remoci6n del templado de ARN por degra
daci6n alcalina 1 sin tesis de la segunda cadena de ADN con
la ADN polimerasa I de g. sill (usando como cebador para ini
ciar la síntesis un pasador formado en el extremo 3' de la
primera cadena de ADN copÍa), finalmente, la digestión,
con la nucleasa Sl (especifica de cadena sencilla), de la
conexión covalente que liga a la primera con la segunda cadena
de ADN copia (90).
Una c6lula tlpica de mamífero contiene alrededor
de 10-5 microgramos de ARN, del cual 80-85% es ribosomal
(285, lBS SS), 10-15% esta constituido por una variedad
de especies de bajo peso molecular (ARN de transferencia,
ARN nuclear, etc.). Todos estos ARN5
son de tamaño y secuen
cia definida pueden ser aislados mediante electroforesis,
centrifigUaci6n en gradientes de densidad, o por cromatogra
fía de intercambio i6nico. En contraste, el ARNm' que consti
tuye entre un 1 y un 5% del ARN celular total, es heterogéneo
83
tant·ó en tS'maño comO :en. SéC:ueíl¿i~-/ Sf~:':~mbargo·J----vii:tue~ment~ tod-~s los ARN · df? mamíf,~ros- · poS·~en··::_·e~\-~u ~,~-"xt~e'~o: 3' un .residuo
poliadenil ico m que.• per~ite alslarl.~ •• media~te. cromatografía
de afinidad 'en una 'colu'm~a; con ~e_lüló:~:a 'llgada a deoXioligoti-
midinas (90);
Una forma'·. 'pr·á.cticá de ·iniciar el aislamiento del
ARNm, dé .{~fe~é( ~s ''¡jaftie~do de polirribosomas (grupo de ribo
~~omas. ·~n~~d.~-~;- p~r una· ··larga molécula de ARNm) provenientes
de -·Ú·n·a-·:_ ;c'é"ful~- e~p-ec·ializada , que transcriba activamente el
~};~;~ddee:~}~~~elil1~~. po~~sej:::::· pa:: :~·:~:::::e:ta:a so:151~8sr s;~ ·guiente·s:
Las- células son lisadas en un buffer que contenga
i~hibido.ies·· de las ARNasas, los núcleos se colee tan por
centrifugaci6n.
b. Los polirribosomas se precipitan del sobrenadan
te por adici6n de grandes concentraciones de iones magnesio.
Estos polisomas contienen ARNm y ribosomas.
c. El ARNm es ai.slado por cromatograf!a de columna,
gracias a la adsorci6n selectiva de las colas poliadenllicas
de los ARNm a los restos politimid{licos ligados al medio
de soporte.
d. Finalmente, el ARNm es cluído de la columna usan
do soluciones con bajas concentraciones de sales.
Para identificar a los ARNm aislados se puede hacer
uso de un sistema de traducci6n in vitro. Este es un extracto
libre de dlulas (obtenido de reticulocitos de conejo) que
presenta un alto nivel de síntesis proteica. Cuando el ARNm
84
purificado es agregado, la sin tesis proteica se inicia. Si
se agregan anticuerpos dirigidos a la proteína codificada
por el ARNm de i~terés, estos reconocerán a la cadena polipep
tídica naciente y sé le uniran provocando que -precipiten aque
llos complejos ribosoma-ARNm que contengan el mensaje de inte
rés. De estos precipitados, el ARNm de interés puede ser
aislado por una segunda cromatografía de afinidad en columnas
de polidT-celulosa (90).
Una vez que se cuenta con el ARNm de interés, en
una forma pura, se le puede usar para hacer una copia de él,
pero en forma de ADN (ADN copia o ADNc) con la ayuda de la
ADN polimerosa dependiente de ARN (transcriptasa reversa halla
da en algunos virus-ARN) y de un oligodT que se agrega para
que sirva de cebador en el inicio de la duplicaci6n. El dia
grama de flujo del proceso se muestra en lél figura 13 •
Una vez que la transcriptaso reversa ho copiado al ARNm en
una cadena complementaria de ADN, el ARNm es removido por
hidr6lisis alcalina selectiva una segundo cadena de ADN
es sintetizada sobre lo primer cadena de ADN usando un frag
mento de la ADN-polimcrnsa I de ~· E.Q...1.i (el fragmento Klenow)
que carece de la actividad de cxonuclca5a (82).
La síntesis de la segundo cadena se autoceba por
un rizo que se forma en el extremo 3' de la prjmer cadena
del ADNc La doble cadena resultante es cortnda en su unibn
covalente con la nucleasa Sl (82).
Clonación de Sondas
Para que el ADN copia tenga utilidad práctica como
sonde seº requiere contar con una gran cantidad de copias del
mismo, Eato se logra mediante la clonación del ADN copia:
AR1lra
hibrido entre ol AR:lm ·y el cebador
sé rorma un rizo autocebador
85
--------AAAAn
1.---- Oligo dT
' • cebador
--------~~~An
como
f_ transcriptasa reversa ~ .. mas deoxinucleotidos
~~~~~~.t;.AAA -------~TT f_ tratamiento con i elih1ina el AR:lm
':.-..--·- •- • _TTT
Fragmento Klenow de la AD;/ polimarasa
ADHc de doble cadena t': =--=-:: .-: - -
ADlic con extra mos rasurados-
--- ------ -.............. nucleasn Sl que rompe la union covalonte en el AD~rc
Figura 13. Diagrama de flujo para la sintesis de ADil COJ!l
plementario o copia (ADllc) a partir de ARll mensajero
(ARNm) (90).
86
Lá existencia de sexualidad o transferencia de infor
maci6n 8ené):ic8_ entre cepas bacterianas se ha conocido y es
tudiado por mas de 30 años (76). En la década de los 1960's
el ·rápido ~tirgimiento de cepas bacterianas resistentes a mól
tiples: antibi6ticos condujo al descubrimiento de los factores
de ~esistencia (factor R), o plasmidos de replicaci6n aut6noma
que forman parte de la herencia genética extracromos6mica
de·-algunas bacterias y que en ciertas condiciones puede indu
cirse su. réplicaci6n acelerada (77). Es a esta clase de plás-
~i~os a la que se ha explotado como vectores para la
ci6n.·:·de··fi-agmentos específicos de ADN dentro de las
bacterianas (clonaci6n) (fig. 14).
propaga
dlu las
Hay varios métodos para insertar al ADN copia de
doble cadena en el vector: uno es el de añadir, por síntesis
química, sitios artificiales de Eco RI en los extremos y des
pués ligarlo a los sitios Eco RI del plasmido; el otro m~to
do es el añadir una cola de 10 e 20 deoxicitidinas al ADN
copia y un nlímero similar de deoxiguanidinas a los extremos
del vector. Cuando las dos moléculas son puestas en contacto
los extremos complementarios se aparearan por acci6n de
una ligasa del ADN (enzima que cataliza el enlace entre el
grupo fosfato del extremo 5 1 y el grupo hidroxilo 3') la uni6n
covalente entre las dos moléculas se formalizará (fig. 15)
(90).
El plasmido recombinante resultante debe ser introdu
cido en una cepa bacteriana adecuada para su propagaci6n.
posteriormente se le recuperará en grandes cantidades para
su uso como sonda:
lle 1944, cuando Avery (SI) demostrará que el ADN
extraído de neumococos era capaz de inducir la transformaci6n
de otros neumococos genéticamente distintos y de ser replicado
87
plasmaido vector sitio <le
corte sitio~<le i'i , corte 5 ~ ~ ue ~ cor~e
~/A;:;;¡ a \ clonar
~ ..... ndonucleasa
Je restriccion
Endonuclaat de
restriccion
recombinacion y--G~
~~
¡ue;asc.
o plasmido recombinante
Fisura 14. Creacion <le un plasmido recombinante. El area
rayada representa al gen para resistencia :; tetr::iciclina,
y el areá obscura i·epresenta al gen para resistencia <• ªl!l
picilina. Despues de la restriccion con Eco RI el ;,n;¡ a
clonar es insertado dentro del sen para resistencia a a~
picilina (85)
-----........ AD:r copia con extremos rastirados
¡.-- transferasa terminal + dCTP
•·--~·-CCCC cccc ...... . zen de resistencia
88
e a empicilina
gen de resistencia digestion a tetraciclina coa P~t I i
ADH copia insertado
ACGTC _.....,;;._._..;,CTGCA
I_ h'ansferasa ..---- + dG1'P
G ____ CTGACGGGG GGGGGATC G
gen de resistencia a tetraciclina
Figura 15. Diagrama de flujo para la clonacion
de ADll copia (90).
terirlnal
39
e.n·.· citos~·~.: a·~~-,:1a fec~a, ~e han estable;cido condiciones .. exp_eri
me'nt~'les,:·:''~-~~:·:)~ff-_in.iten hacer de la transformaci6n un ·método
~~nfl~bl~ y ~~p~odu;ible .. para introducir a los plásmidos recom-,
bfoarites~·en 'las bacterias que les propagaran. El cultivo
bact·~~,ianá. a···. ~ransformar debe de estar en competencia (esto
es 'e"O .. :.:;un~ f~_se logarítmica de crecimiento) y debe ser someti
do a. un tratamiento con cloruro de calcio, factores ambos,
que i~crementan la tasa de transformaci6n (78).
tas ·Células transformadas por el plasmido recombinante
son ·aeleccioñ-adas en medios con antibi6ticos gracias a las
propiedades de resistencia portada por el plásmido (gen de
·resisteñcia _a· tetraciclina en la figura 14) y a la no resis
tencia a otro antibi6tico debido a la inserci6n del ADNc (gen
de resistencia a ampicilina inactivado en la figura 14). Los transformantes ya seleccionados son crecidos en medio
liquido. Cuando el cultivo alcan¿o la fase logarítmica del
crecimiento se agrega una alta concentreci6n del antibi6tico
cloramfenicol. El grupo nitrobenccno presente en la molécula
del cloramfcnicol (figura 16) se intercala en el ADN cromos6-
mico bacteriano e impide su dupl icnción, ejerciendo así un
efecto bacteriostático sobre el cultivo (figura 17). Sin
embargo el ADN Plasmídico no sufre alteración alguna por el
antibi6tico y su duplicnci6n prosigue normalmente originando
que cada célula bacteriana transformantc acumule una gran
cantidad de plasmidos recombinantes (amplificaci6n del plasmi-
do) (79). El ADN de los plasmidos recombinantes se obtiene
mediante lisis alcalina de las células y posterior centrifuga
ci6n diferencial en gradientes de densidad (BO).
Para liberar al inserto de ADNc del resto del ADN
plasm!dico, se trata al plasmido recombinante con la misma
endonucleasa de restricci6n que se us6 para introducir ini
cialmente al inserto en el plásmido nativo. La mezcla resul-
::'~ .. ,,
Figura )6. Estructura molecular del antimierobiano
Cloranreniclo (91 ).
A. Turbidez
cloranfenicol
tiempo ( l1oras)
,., z ..... ., .,, bl o
B. Supervivencia
..... i--....1.~..1-~L........L~-'---A tio:,;po (horas)
Figura 17. Curso de la accion aotiurl.crobiafla del "1edi-
camento clornnfenicol. El medicaljlento rue añadido en el
momento tle crecimiento expouencial, co::10 señaln.n lns
flechas (91).
90
91
tante de la restricci6n, ADNc y plasmido linearizado, es sujeta
• electroforesls en un gel de agarosa de bajo punto de fusi6n.
Con bromuro de etidio ~ luz ultravioleta se visualiza l~-~~pa
raci6n del inse-rto y del plasmido linearizado y se corya la
por¿i6n ~el" gel en que se encuentra el inserto. E•t~ fr~gmen~ to :,dél gel es sUjeto a extracciones con fénol -"y Ci~r¿-f_¿-r~;nd, quedá.ndo_ en lo fase ?CUOSB e.l ADNC puro qu~ e~ c'·a'nc~ó'tr~'do por precipitaci6n con etano_l (81)._
-Pára que el ADNc sirva como sonda en la identifica
_:ci6n ;-.-de·- un· .. gen en~ pa"rticular de entre los varios presentes
"e.~ -:·~_a, r_~pÚ.-ca de nitrocelulosa, se requiere que esté marcado
i-adioactivamente para su visualizaci6n. El marcaje radioacti
vo ·de la sondo se realiza por el m6todo de traslaci6n de la
- ruptura (nick translati6n): La ADN polimerasa I de Jl_. coli
añade residuos nucleotldicos al extremo hidr6xi lo 3' que se
crea cuando una cadena de una molécula bicatcnario de ADN
sufre una ruptura.
exonucleolitica 5 1
5' de la ruptura.
Además, la enzima, gracias a su actividad
3', puede remover nucle6tidos del extremo
La eliminaci6n de nucle6tidos del extremo
S' Y la adici6n secuencial de nucle6tidos al extremo 3' resul
to en el desplazamiento de la rcuptura (traslaci6n de la
ruptura o nick translation) a lo largo del ADN (82). Si se
reemplaza a los nuclcótidos preexistentes por nucle6tidos
radioactivos, es posible preparar ADN marcado con 32 P (83)
(figura 18).
Hibridaci6n
Así pues, cuando se cuenta con una réplica en nitro
celulosa de los fragmentos de restricci6n del ADN, resueltos
por tamaño molecular, y una sonda radi.omarcada para identifi-
11 11 1111111
! ruptura en una cadena por la AD:iasa I
5' + 3' 3' '] 1 1 1 1 1 11 11 1 1 1 5'
I
ADN duplex escindido +
ADN polircerasa +
4 d NTPs (uno Je ellos marcado con 32p)
i ""'"" '";'."'" 1 1 11 1 1 1 5'
92
5'
3'
... ,.,.J.,,., ,, 1 11 1 1 u 1. 11 l 1 [ 5'
ADi! eacindi do, radioma.J: cado
Figura 18. Diagrama que ilustra la translacion de la
ruptura en el ADH. J..a ADN polimerasa I produce una
incision o ruptira en una cadena del ADN, a part"lr
ele este punto la 01dena puede ser clagrarlada, y re-
puesta por sintesis con nuevos nucleotidos (90).
93
car· al gen de interés, se procede a realizar la hibridaci6n.
Esta se realiza en un medio liquido salino y durante un perio
do de tiempo que depende del tamaño de los f ragmcntos de res
tricci6n, la actividad radioactiva específica de la sonda
(cpm/ug), y de la cantidad de sonda adicionada. Si la secuen
cia complementaria a la sonda se halla en la réplica de nitro
celulosa estas hibridarán. Y si sobre la r~plica de nitrocelu
losa, ya hibridada y lavada (para que s6lo la sonda que haya
hibiidado permanezca en ella), se coloca una placa radiográfi
ca,, en esta se imprimirán la o las bandas correspondientes
al gen.de interés (autorradiografia) (64).
Por Último, un resumen del proceso seguido pera iden
. tificar- ~-~\:_·p.~~~e,ncia de una secuencia g~nica especifica de
entre el.-~otal.de un genomio eucarionte se muestra en la figu
ra
Para :mayor. informaci6n sobre las t~cnicas de genética
molCcUlar' t<Su .~ ·,"8plicaci6n clínica / consultar las referencias
64-90.
LeucocÚos ,nlsnlados de
ann~e O PlasmiUo recombinante conteniendo al gen on ostud
0
io
ADll oxtraldo ~ ~igorido -e·c1n áriziinns de restriccion
! Liborncion dol e;on del plns~ido para au
uoo como noncl:l
Origen
ADH cli¡¡erido y
separado p0r electroforesis en e;olos do agnr : 11 t T '. ll I T._____.: T.__,..._._,:
t Trnnororoncia Ilit•ridHcion ílovolndo de lns l Southern con nonda bnnd.1s hibrltlndna
Mnrcat1oros do rndiomo.rc3dn por· nutorrn.dio-peso 1ooleculor
Figura 19. Diaer,111\a qua respresenla loo ditürenteo procoooo oocuidos para ln identificncion de un gen ospecirico de entro •l genomio com
pleto de un eucorionto ($5).
grafin Loa benJ.1s <lo la
aurorrmlioern fin c.Q.
rrooponden n los rrn,&
mentoo que contienon al t;on do. !nteres
IV. DIAGNOSTICO DE HEMOGLOBINOPATIAS Y TALASEMIAS MEDIANTE TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR
95
LaS técnicas de genética molecular, expuestas en
páginas anteriores, han desempeñado un papel muy- importante
en el campo de la genética clínica en los 6ltimos años,
estas nuevas metodologías han permitido el
los -mecanismos moleculares que subyacen en
algunas hemoglobinopatías, la detecci6n de
discernimiento de
la etiología de
portadores de las
mismas y el diagnóstico prenatal de fetos en riesgo de padecer
las (92).
El empleo de las técnicas de genética molecular por
divei-sos grU.pos científicos de trabajo, en diferentes sitios
y ~omentos, ha dado lugar al surgimiento de varios enfoques
experimentales dirigidos hacia el mismo objetivo (el análisis
molecular de las hemoglobinopatíos), en donde, obviamente
los enfoques mas recientes se enriquecen con el contenido
y experiencias de los anteriores. Los protocolos experimenta
les de estas metodologías comparten elementos comunes: todos
dependen de la digesti6n (fragmentaci6n o restricci6n) de
las muestras de A .D.N. con cndonucleasas de restricción, la
separaci6n de los fragmentos generados mediante electroforesis
(resoluci6n) y del uso de A.D.N. 's marcados radioactivamente
para estudiar los patrones obtenidos de las digestiones ya
resueltas (análisis de los fragmentos de restricci6n). Sin
embargo, debido a que cudn metodología posee una base te6rica
propia existen diferencias en los detalles de la realizaci6n
de cada protocolo. Estas incluyen diferencias en las estrate
gias de restricción enzimática del A.D.N., en el tamaño de
los A.D.N.s empleados como sondas --largos A.D.N.c u oligomeros
nuclcotidicos cortos para el análisis de los fragmentos
de restricci6n, asi como en las características de los geles
empleados para la resoluci6n. de los mismos.
La suma de estas variaciones determina el que cierta
metodología resuelva el problema de la identificaci6n del
defecto genito molecular directa o indirectamente. Y para
facilitar el análisis o integración de los resultados, que ..
estas metodologías han aportado al conocimiento de las hemoglo~
binopatías, en este trabajo se los han organizado en dos grupos
y sus respectivos subg~ripos:.
A. DETECCION INDIRECTA.· DE LOS. DE.FECTOS MOLECULARES EN. LOS GENES CODIFICANTES
hibridaciones.diferenciales.
A. DETECCION INDIRECTA DE LOS GENES DE LAS GLOBINAS
Polimorfismos en el tamaño de los fragmentos de restricci6n.
La primera de las metodologías es, como se señala
en el encabezado del capítulo, indirecta y depende de la aso
ciaci6n de cierta mutaci6n puntual con un polimorfismo del
A.D.N. Por ejemplo, si una enzima de restricci6n corta al
A.D.N. a ambos lados y en el medio de una secuencia que es
reconocida por una sonda específica para esa secuencia, en
una autorradiografía se observarían dos bandas. Si el sitio
de restricci6n intermedio se perdio a causa de una mutaci6n
97
·en uno_ ·.de_, __ los c~-omosoMas >del par·, 18 perso~a_ portadora de
e_s_o_s '.~·ro~~so~_aS m~straria - un patr6n ~e los · fragm~ntos de res-
- tricci6n difer~nte del normal (fig< 20). Uno de los cromosomas
ge'nerar_i8 :solo una banda que hibridaria con su sonda especifica
y· ·el~ otro -cromosoma produciría los dos fragmentos típicos.
A le_~< va~ieciónes presentes en el A.D.N. que son detectables
por ~l análisis de los fragmentos de restricci6n se les llama
polimorfismos en el tamaño de los fragmentos de restricci6n
(92). Da.tos de secuenciaci6n del A. D.N, humano sugieren que
en, aPro~imadamente 1 cada 100 o 200 nucleotidos de les regiones
del _A.D.N., no involucradas con la codificaci6n de proteínas,
e~iste un sitio. polimorfico que no causa ningun defecto aparente
en-los individuos (93, 94). Este elevado nivel de variaci6n
en las secuencias que flanquean al A.D.N. codificante puede
producir que cada cromosoma de un par origine un patr6n distin
tivo ·en el análisis de los fragmentos de restricci6n, Esto
e- su vez permite el que se pueda determinar cual cromosoma
de un par se heredo a la descendencia.
Para ser Útil en la asignación de un cierto gen a
determinado cromosoma, el sitio polimorfico debe de estar
suficientemente cerca del gen en estudio de tal manera que
ambos se hereden de manera ligada. Pero debido a que la fre
cuencia de ligamiento entre un gen y cierto polimorfismo nunca
es del 100% esta metodología requiere un estudio familiar
para determinar el patr6n de segregaci6n génica de los fragmen
tos de restricci6n polimorficos entre los miembros de una familia.
- Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricci6n
originandos con Hpal.
Relaci6n con el gen .de la. g_i:~bi~a beta _s
En 1978¡ K¿n t•~az~,(9S);••1•me.Íi'ante el mapéo con enzi-
98
(A)
z y
~ J. J. ~Electroforesis
Kb
' X
i que~ncela
~ mutacion un sitio de restriccion
(B)
Figura 20. Si el cambio de un nuclootido en uno de los cro
mosomas produce la ral ta del sitio de reconocimiento de la
enzima de restriccion, los fragmentos (A) mostraran un pa
tron electrororetico diferen'·e del nor1nal (B). X,Y Y· Z su-
puestos tamaños de los fragmentos de restriccion en kiloba-
ses (Kb)(92).
X
z
y
mas_ de traron
de la
99
restricci6i ~e los genes de las-globinas huma~as, _enc~n.·u~a"· ·.Vat-.f8ci6ñ genética en .un sitio de r~conoc~miento -
endoiíucleasa de restricci6n HpaI, que corta el A.D.N.
en.~e secuencie.GTTAAC, hallado e 5000 nucleotidos del extremo
3 1 del ien-esti~cturel de la globine beta.
Cuando el A.D.N. normal es digerido con _le enzima
Hpal, el gen estructural de la globina beta se Cf!CUentl-a en
un· fragmento de 7.6 Kb (Fig, 21, cerril 1). Cua~d-o'.-~e estudio
el A.D.N. de individuos negros de origen efrié:ano,··con···1e
,enzinia._ Hpal, se encontraron variaciones en ~l: taul8ño ·del:- f~ag-
mento de A.D.N. que contenie el gen de-lailobinecbi~a;· Algu~
nos-·muestres de A.D.N. de individuos_ negro.a, :'or.lgina-ba~ un
fragmento de 7 .o Kb y otros uno d~ iJ:·¡; Kb-. ''i.a·a' Variantes
se heredaban en forma mendeliana de. los padres a 'los hijos.
Las variantes del patr6n 7 .6/i.6 halladas fueron: 7. 6/7 .O,
• 7.0/13.0, J.6/13.0 y 13,0/13.0 (Fig, 21)
El mecanismo que produjo la alteroci6n genica, del
sitio Hpal, y que dio como resultado las variantes de 7.6,
7.0 y 13.0 Kb, no es conocido, Pudo originarse por mutaciones
qUC'. cr"Caran o _·de~truyeran secuencias de reconocimiento para
Hpal, por deleci6n o inserci6n de secuencias adicionales (Fig.
22).
Inicialmente el patr6n 13.0/13.0 fue observado en
un individuo negro con anemia falciforme. Para estudiar la
relaci6n-del fragmento de 13,0 Kb con el genotipo de la hemo
&lobina S, se analiz6 el A.D.N. de individuos negros con o
sin hemoglobinopntias (Tablo XI). El fragmento normal de
7 .6 Kb Y el variante de 7 .O l<b son los patrones comunes en
los individuos con el genotipo de hcmoglobinn A. S6lo uno
entre 15 de toles individuos sanos presento el palr6n 7.6/13.0.
Por el contrario, la variante de 13.0 Kb se hallo frecuentemen
te ligada con el genotipo de la hemoglobina S. De 15 pacientes
2 3 4 5
EJEJ CJEJ~
100
Kb
13.0
7.6
7.0
Figura 21. ADl> restrin¡;;ido con lipa I e hihridado con unn
sonda para el gen de la @:>bina beta, Los individuos mue.!!
treados fueron negros americanos con diferentes fenotipos
llemoglobinicos. Carril 1, hemoglobina AA ; 2,3,y 5, he11,t
globina AS; 4, hemoglobina SS. Los cinco pa.tTones obser
vados son: 7.6/7.6, 7.G/7.0, 7.6/13.0, 13.0/13.0 y ?.O/
13.0 respecMvamente (95)
~ 7.0 Kb
~ 7.6 Kb
7lD' 1}.0 Kb
t t
Figura 22. Diagraraa do los tres tipos de
fragmentos Hpa I. Las flechas indican los
sitios de reconocimiento Hpa I. A y S, ~
nea de globinns beta normal y CalciformJ
respectivamente (95).
101
102
ABLA -xr.J. Relacion entre los fragmentos Hpal y los ~
no ti os de la he~o lobina
Genotipo Patron de los fraz. Frecuencia he?:Of'lo:.. m~r. ... os E12al Total de1 fragi:¡en
binico 7.b 7¡._. 7JJ ?.'. 13.0 to do 13 Kb .o 1 o 1• .. o 1~0
i;egros AA :: o 15 0.03 AS .7 1 cp g 16 0.31 SS : e o 4 11 15 0.37
Cauca&i cos
t./.. 12 o 12 o.oo
Asiatj,
cos
AA 15 o o.oo
1C3
con anemia .falciforme¡ se· halló el pai:r6n '13•0/13,0. en 11 de ellos y el patr6n 7.6/13 ;o en: 4. Así pues la ::·frecuencia
de asociaci6n del frag~ent~. de lJ,O. Kb ~on el gen de. la hemo
globina A es de 0.03 éri negr~s a~erica~os, .y de 0 •. 89 con el
gen de .la hemoglobina:.· s en . pacientes c~n áne~ia . falciforme.
En 16 inÚviduo'.s · Íuiterozigoto-s (AS), 9 ·preseritaron el patr6n
7.6/13.0, uno e-1 de 7.0/13.0 y séis el de 7.6/7.6 o 7.6/7.0.
En contraste, . en la poblaci6n Caucasica o Asiática, solo se
·observaron .los pat~one~ 7.6/7.6 (Tabla XI),
Kan y Dozy (96) y Phillips y colaboradores (97) demos
trar-on .la utilidad practica de la al ta frecuencia de ligamiento
(0,87) hallada entre el fragmento Hpal de 13.0 Kb y el gen
de la hemoglobina S al diagnosticar exitosamente los genotipos
hemoglobinicos de fetos en riesgo de padecer anemia falciforme:
En ambos casos parejas negras con hijos, portadores del gen
de la hemoglobina S e hijos que podecian de anemia falciforme,
solicitaron diagn6stico prenatal para un nuevo embarazo.
Se preparo A.D.N. a partir de células bluncas de los padres
y de los hijos afectados y A.D.N. fetal a partir de amniocitos
obtenidos de líquido amni6tico del nuevo producto.
Los padres, portadores del gen de la hemoglobina
S, presentaron dos bandos, 7.6/13.0, que contenian a los genes
de las globinas beta (patr6n 7.6/13.0). Se confirmo el hecho
de que el fragmento de 13.0 Kb portaba al gen de la globina
S cuando el patr6n de los hijos afectados mostro ser 13.0/13.0.
En el A.D.N. de las c&lulas amni6ticas se observo el patr6n
7 .6/13.0, indicando que el feto poseia los genes para las
globinas A S, obteniéndose asi el diagn6stico de portador
del gen de la globina S (Fig. 23),
104
3 4 Kb
13.0
7,6
Figura 23. ADN digerido con Hpa I e hibridado con
la sonda espec1C1ca para el gen de la globina be
ta. Carriles 1 y 2, padree con hemoglobina AS;
3, hijo afectado con hemoglobina SS; l¡, cel.ulas de
liquido amniotico (96).
105
- Relaci6n con el gen de lá glÓbina beta C.
En ·e.St.Udios de'· negros americanos. con hemoglobinas
CC, AC y'···sc •se ,o.bserv6 que el fragmento HpaI de 13.0 Kb esta
ta~bi·e~ f0
re.cU~n·t:é·~en'~e·,,~·9oci~do. con el gen'· de :1a globina .beta
e ·este·· hiého·:;lia ···servido tanto como para el diagn6stico prenatal
(98) .· 'com'ó: ·¡;ara · e'stúdios antropologicos evolutivos ( 4).
~~ .• 2¿·: ~· -Uso ~n .ei: estud.io. de la .e.voluci6n de
binas:·sy··c enla: póbl8d6n mundial.
los genes de las hemoglo-
Lás . mutaciones beta S y beta C afectan al codon GAG
(G, guanina; A, .adenina) que codifica para el ácido glutamico
como sexto aminoacido de la cadena de la globina beta (99).
La mutaci6n beta S esta dada por GUG (U, uracilo) (codon para
Valina), y la mutaci6n beta C por AAG (lisina). Los genes
de beta s y de beta e seguramente surgieron independientemente
a partir del gen beta A ya que la tronsici6n de A a S o A
a C involucra el cambio de un solo nucleotido, mientras que
una mutaci6n S C necesitaría el cambio de 2 nucleotidos por
triplcte lo cual es altamente improbable. Ya que tanto el
gen S como el C estan ligados a el fragmento Hpnl de 13.0
Kb, Kan y Dozy concluyen que la mutación que produjo la varian
te Hpal de 13.0 Kb surge antes que los mutaciones para las
hemoglobinas S y C, las cuales surgieron despucs, por separado
en cromosomas que contenian la variante Hpal de 13.0 Kb ( 11).
La anemia falciforme puede encontrarse en Africa,
la regi6n mediterránea y Asia. Para determinar si en todas
ellas existía el ligamiento entre el fragmento Hpal <le 13.0
Kb Y el gen, S, Kan y Dozy extendieron sus estudios o Sicilia,
Chipre, Gnbon, Kenia, Snudia Arabia e India ( 4)(Tabln XlI).
En Sicilia le asociaci6n si se presenta y en proporción eleva
da. En cambio en Gabon (Africa Occidental), Kenia (Africa
Orientál)¡ s.~údiaArabia e I.ndia el gen S e~ta daso'ciad~ al f;agmento ·HpaI'. de. 7 ,6·Kb (Tabla . XII y l'fg,;.24)i .-
¿~s ~atoa. anteriores sobre la •Jli~tri~~din ~e~g¡¿~ica de lo,; áagmeátos HpaI asociados a' los 'gen.es s.·y e· pe;~úier6n elabot~r un arbol evolutivo de los Sitios HpaLy Ú su re1Bci6n
c0
on los genes de las globinas A, S y C_ .. (Fig,''25)( 4); En
la· mayor parte de la poblaci6n mundial, el gen de lá globina
beta. esta normalmente asociado al fragmento HpaI de 7 •. 6 Kb.
En Africa Occidental, una mutaci6n que afecto el sitio de
reconocimiento HpaI hallado al extremo 3' del gen de la glóbina
beta produjo un fragmento HpaI de 13.0 Kb (A-13.0 Kb). Las
mutuaciones S y C surgieron independientemente, cada una en
un cromosoma que con tenia la variante de 13.0 Kb (S-13.0 y
C-13.0). Una mayor proporci6n de fragmentos S-13.0 y C-13.0
que de A-13.0 se propago debido a que los genes S y C protegen
contra la malaria y asl aumentaron su frecuencia sobre A-13.0,
que no ofrecía ninguna ventaja selectiva. Parece ser que
despues el gen S ligado al fragmento HpaI de 13.0 Kb se propago
hacia Africa del norte y el mediterraneo. La asociaci6n entre
el gen S y el fragmento Hpal de 7,6 Kb en la poblaci6n Asiatica
favorece la conclusi6n de que la mutaci6n Asiática surgía
independientemente de la Africana ( 4).
Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricci6n
obtenidos con BamHI.
Cuando el A.D.N. humano es digerido con la enzima
de restricci6n BamHI, que corta en la secuencia GGTACC (T,timi
na), hibridado con una sonda radioactiva complementaria
al gen de la globina beta, se observan dos fragmentos (ya
que contiene un sitio de corte BamHI intragenico) uno de 1.8
Kb que contiene el extremo S' del gen de la globina beta y
otro de 9.3 Kb que contiene el extremo 3', un intron de aproxi
madamente 850 nucleotidos de largo y las secuencias no codifi-
Frecuencia de los ganes S falciforliles
1111> 10% a 1.5-1 l:S:i! 5 - 7. ~ i'.5 -5% '-' 0-2.5%
Figura 24. Distribucion geografica de los rragme~
tos Hpa I que con!:ienen al een do la globina beta
y su relacion con las hemoglobinas S y e (4)
107
103
Tf.BLA :a1. !"r•gc;ento¡; V.pal .;.1 ~•n r.!e globina beta en 1i ¡:'crentes blacion~s C"): l-e~o lobinas s e
'Ii.po tle ::o. F? tror. lipd Jo ¡;,
r.~:::o¡:lobinF r: ol·ir• 'bt"i.:-!' A~~c-t:;1g~"JO 7.0 7../ 7.S/ 7.,/ 1~ globinas s-~-¡ .... ::o l~O 13.0 13.1> y e con el
rr~gme::to de l'. Kb
:.:.s.h.. Presente
AA o AS 1 SS 30 ce 5 AC 1 S6 9
SiciliE . Presente AA o AS o S T~: s; <'
c;;ipn P:'.'e.,,nte /.A o AS G
G8.bon Ausrnte AS o
Kenil' Ausente /./. i SS o s~udiArsbia Ausente
t.t.. 2 2 o o o o SS 4 4 o o o o
India Ausente AA 17 1(. 1 e o o AS 34 29 1 o o o SS ~
.., e o o o
A 7.6
A 7.6 .._ __ A 7.0
--....... 1o:---s 7. 6
7.6
7.6 13.0
----e 13.0
A 13.0
Figura 25, Evolucion del sitio Hpa I y de los
genes de las globinas beta. Las l~tras A, S y
C representan los genotipos de globinas beta
y los numeros indican el tamaño del fragmento
Hpa I que contiene al gen de la globina beta.
No se ha empleado escala en el tiempo para el
diagrama. La divergencia del gen S antes que
el C indicada en el diaerama os arbitraria. Los
circulos señalan sitios en d~ndo el modo de
evolucion no es conocido; - normal; -- , va--
riantos; y - recombinantes (~).
109
cantes-3'- al gen estructural de la g-lob-ina b-eta (100).
,
·~ <V
Cuando Kan y colaboradores en 1980 (101) estudiaron
el A.D.N. de un grupo de Sardos (habitantes de Cerdeña, isla
del mediterraneo) con la enzima BamHI, encontraron variaciones
en el tamaño del fragmento que contenia al extremo 3' del
gen de la globina beta, Ademas del fragmento usual de 9.3
Kb, observaron, un fragmento de 22.0 K~. Estas dos variantes
del fragmento BamHI se heredan de una manera mendeliana, y
los siguientes patrones pueden ser reconocidos: 9,3/9.3,
9.3/22.0~-y 22.0/22•0 Kb _como __ se muestra en las figuras 26
y- 27, Ef p-olimorfismo no_ altera al sitio BamHI del extremo
5' del ge~ de la ___ glohlnil b-ei:a;-ya que el tamaño de este frag-
mento, no se Sltera.
De ·entre 71 Sardos sin beta-talasemia se observaron
33 con un patrbn de 9.3/9,3, 29 con uno de 9.3/22.0 y 9 con
22.0/22.0 Kh. De estas proporciones se cnlculo la frecuencia
del fragmento de 9.3 Kb en esta poblaci6n en 0.669 y la del
fragmento de 22.0 Kb como de 0.331. En contraste impresionante
todos los 42 Sardos homocigotos para betaº -talasemia mostraron
el patrbn de 9,3/9,3, indicando que el fragmento Bamlll de
9.3 Kb esta asociado con la lcsi6n de bcta0
-tulasem{a en todos
los B4 cromosomas betaº -talascmicos estudiados (tabla XIII).
Para probar la utilidad de este hallazgo en el diagn6stico
prenatal se estudio el A.D.N. de amniocitos provenientes de
15 fetos cuyo fenolipo ya h'1bia si do establecido previamente
por análisis sanguineos (tabla XIV). El fragmento Bamlll de
22.0 Kb fue visto solamente en el A.D.N. de fetos normales
Y en el de portadores del gen de betaº -talasemia. El patr6n
de 22.0/22.0 Kb no se hallo en fetos portadores, y ninguno
de los fetos homozigotos para beta 0 -talasemia presento el
fragmento BamHI de 22. O Kb. Estos resultados son consistentes
con la observaci6n de que a1\ esta poblaci6n el gen de la betaº
111
2 3 Kb
22.0
9.3
U3
Figura 26. AD?l digerido con Bam HI e hibridndo con una
sonda especifica para el gen do la globina beta. Carr1
les: 1, patron 9.3/9.3; 2, patron 9.3/22.0; 3, patron
22.0/22.0 Kb (101).
"-1. 8 Kb ?.3 Kb
-rp----r 1.8 Kb 22.0 Kb
t
Figut·a 27. Diagrama de los tres tipos de frag1ne.n
tos Bam HI. Las flechas indican los sitios de r~
conocimiento de la en<lonucleasa de restriccion
Balí,HI (101 ).
112
TABLA XIII,• Distr1buc1on del rra¡;ciento Ba:i;:t que contiene al oxh ~rcr.o ; !el ¡;e:: :!e la globina beta en el AD:: de Sardos (lOÍ )''
Grupo N-:i. ?~~!"-').: ;,¡i!';.;;;: Frecuencia
da los fr .. D}!.
9.3/9.:;-· 9.3/22.0 22.0/22.0 t::9ntos(%). 9.3 22.0
:;ormales 71 33 29 9 E:G,9 33.1
l!ococi&¡ 42 42 o o 100.0 o tos bct.!!. tslese:ni cos
TABLA XIV ,•Distribuc!-':: -~o los '~· s::iontcs Ba:iHI polimor!icos en el AD:-i aislado de ccl~l·• • :;:.·:otio•s cult~v.~as. (101)
po •.ron BamHI ~ia[.i10stico :·~ . . •. zu~~tos ) .. ;/9.3 9.3/22.o ·22¡0/22.0
i:f)r:JE.l 8 4 2 2 Port~·:ar
!; 3 de bt ';~ o tel~sc~:ifl
lio:::ocigotos beta ~--lE"- 3 scr.,icos
o
114
-talasemia esta. sieoipré ligado al fragmento BamHI de 9.3 Kb.
Asi pues en esta poblaci6n Sarda el hallazgo del fragmento
BamHI de. 22.0 Kb, en el A.D.N. de un feto en riesgo de betaº
-talasemia, elimina la posibilidad de homocigosis para la
enfermedad (101).
La explicaci6n mas plausible para la invariable aso
ciaci6n del fragmento BomHI de 9.3 Kb con el gen de lo betaº
-talasemia es la de que la mutaci6n que dio lugar al gen de
beta 0 -talnsemia en la poblaci6n Sarda ocurrio en un cromosoma
que poseia el fragmento BamHI de 9.3 Kb (fig 28)(101).
Desafortunadamente en familias en las que tanto el
gen normal como el anormal estan asociado5 con el mismo frag
mento de restricci6n, esta metodología no es Útil para estudiar
a la descendencia a menos de que exista un segundo polin1orfismo
en los tamaños de los fragmentos de restricci6n. Tal fue
el caso que reportan Phillips y colaboradores (102), cuando
al intentar el diagn6stico prenatal del producto de una pareja
de negros americanos mediante el estudio del polimorfismo
de el sitio Hpal (95,96) se encontraron con que no era posible:
De la pareja de padres portadores uno presentaba un patr6n
llpal de 13 .0/7 .6 Kb mientras que el otro tenia un potr6n de
7.6/7.6 Kb. Lo pareja tenia un hijo previo afectado de anemia
falciforme cuyo patr6n Hpal era 13.0/7.6 indicando que el
fragmento Hpal de 13.0 Kb contenia el gen de beta globina
s (fig. 29).
Como se observa en la figura 29, el feto en estudio
habia recibido de su padre el fragmento Hpal de 13.0 Kb ligado
al gen S, Y un cromosoma 7.6 de su madre, pero lera el cromoso
ma beta S· o el beta A? en este caso el polimorfismo lipa! no
era· informativo.
115
'13º talasemia/ 9.3
A 9.3
A 22.0
Figura 28. Arbol evolutivo de los genotipos de globinas
beta y los rragmontoe ~e restriccion de la enzima llam HI
en la poblacion Sarda (101).
AS AS ¿ AS o SS
11G
SS
Figura 29. Allll restringido con Rpa I e hibridado con una sonda para el gen de la globina beta. Carriles: M, madre; P, padre; A, amniocitos; H, hijo primogenito afectado con anemia falciforme. El fenotipo hemoglobinico ae indica~ bajo de cada carril (95).
M P A H
·BBBB AS AS ¿ AS
o SS ?
SS
Kb
?.8
?. ,
Figura 30. ADN restringido con Hind III e hibridado con una sonda para el gen de la globina gama. Carriles: M,
madre; P, padre; A, amniocitos; H, primogenito afectado.
El fenotipo hemoglobinico se indica abajo de cada carril
( 102).
.- .=é. < -:--. -.-<~---~-Afo~túnadamen"te ·,'rúan (103)
descrito p·~e~·i:~:m~~·~:~ .: ... ,~'~ ·-~:p_ol_:i:nior_fismo, enzimíi .de.· r~·s~rt"~Ci6n. IÍÍmdIII en el
Jef f reys (93)
en el A.D.N.,
gen estructural
habian para la
de la
:::b7¡: .·.::~tiit:0
i~cutLt su c;::does :: :::::em::t:. ~~~:dohu:.:~ con Ú ~nh~~·;·Hiiiºc!tri y se hibrida con una sonda radioactiva
p~~a·.-:-re\:·._i~~?'dc!·:-,la ... 'glÓbina gamma, puede encontrarse al gen
de J.~-, gl.obirfa gamma en un fragmento de 7 ,8 Kb o en uno de
7. l. Kb ií.egun ,·el sitio de restricci6n para llind III este ausente
. . .PhilHps y colaboradores (102) procedieron a digerí r
el A;D.N. de los miembros de la familia en estudio con la
e~zi'!la "Hindlll encontrando lo siguiente: La madre presentaba
el patr6n 7,8/7.1 el padre el patr6n 7.l/7.1, el hijo afectado
7,8/7,l y el feto 7,1/7.l (Fig. 30),
El hijo afectado dcbio recibir el cromosoma con el
fragmento llindIII de 7 ,8 Kb por parte materna puesto que su
padre tiene el patr6n 7.1/7.1; ya que el niño es homocigoto
SS entonces en su madre el gen beta S se encuentra ligado
al cromosoma con el fragmento llindlll de 7 ,8 Kb. El hecho
de que el feto presente el patr6n 7. l/7 .1 nos indica que por
parte materna rccibio el gen beta A y por lo tanto el diagn6s
tico definitivo es el de portador del gen beta S (102). Usando
este mismo enfoque ha sido posible diagnosticar exitosamente
el genotipo de fetos en riesgo en casos en los que un solo
polimorfismo no es informativo (104, 105, 106).
Polimorfismos Originados con Ava II
Para el diagn6stico de la beta-talasemia, por med1.o
113
de polimOrfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción
en iridividuos del mediterraneo (Chipriotas, Griegos, Italia
nos. y ·Malte~es) se cuenta con un nuevo polimorfismo evidencia
ble con la endonucleasa de restricci6n AvaII ( 107). Cuando
el A.D.N. de estos individuos es restringido con la enzima
AvaII e hibridado con una sonda específica para el gen de
la globina psi-betta (pseudogen situado cerca (en términos
de· ligamiento) al gen de la globine betta), se observan varios
patrones en los fragmentos de restricci6n (Fig. 31). Estudios
familiares mostraron que hay tres tipos de individuos, de
a~uerdo a la herencia Mendeliana¡ homocigotos para los fragmen
tos menores de 1.1 2.8 Kb (genotipo +/+, carril 3, fig.
31)¡ homocigotos para el fragmento mayor de 3.9 Kb (-/-, carril
2, fig. 31); y hetcrocigotos que presentan los fragmentos
de 3.9, 2.8 y 1.1. Kb (+/-, carril 1 y 4, fig. 31). Estos
resultados muestran que la prcencia del sitio polimorfico
AvaII resulta en la escici6n del fragmento de 3.9 Kb en dos
fragmentos menores de 1.1 y 2,8 Kb respectivamente (107).
En estudios epidcmio16gicos se demostro que la ausencia del
sitio AvaII-psi-betta en el A.D.N. de individuos del mediterrá
neo, lo que origina el fragmento de 3.9 Kb, es raro en los
cromosomas normales (3.9%) y es mas frecuente en los cromosomas beta-talasemicos (22.3% en Italianos 71% en Chipriotas)
(108), lo que ha permitido exitosos diagn6sticos prenatales
de fetos para los cuales otros polimorfismos (101) no son
informativos (107).
Polimorfismos originados por delcciones o adiciones
Existen, también, casos en los cuales hay variaciones
en los tamaños de los fragmentos de restricción, pero no debido
a la presencia dimorfica de un sitio de restricci6n ligado
al gen de interés sino por raz6n de haberse sufrido una. dele
ci6n o una inserci6n en el locus en estudio.
2 3
+!- -1- +/+
119
Kb
3.9
2.8
1.1
Figura 31. Autorradiogrnfir, mostrando ejemplnres de
AD:I ( 1-4) digerido con Ava II e hibridado con una sou
da especifica para el pseudogen psi-beta. El genotipo
de cada muestra de AD~ se indica abajo de caJa carril
(107).
120
. .. . . -
cu'ando·. el .A.D;N •. de individuos sanos; nó talasemicos,
es .restringido· éon', la .enzima .de restriccion PstI e hibridado
con· ·una. so_nda .especifi.ca para el gen de la globina betta se
observa una han.da de 4.4 Kb que contiene el gen de la globina
, beta (109) Un tipo de gen talasemico betaº común entre los
hindúes es aquel que presenta una delecion de 700 pares de
- bases¡ e que incluye una porci6n del intron mayor del gen asi
como el extremo 3 1 codificante (110) (Fig. 32), Cuando se
digie_re el A.D.N. de individuos portadores u homocigotos para
este ~en de heta0 - talasemia y se hibrida con la sonda espe
-dfica «para globina beta, se evidencia un fragmento de 3. 7
Kb, en lugar del fragmento normal de 4.4 Kb, conteniendo al
gen de la globina beta (Fig. 33)
- Delecion de Génes'Completos
Los genes de la globina alfa estan, normalmente dupli
cados esto es que hay dos genes de globina alfa en cada cro
mosoma 16 (111). El A.D.N. genomico, de individuos normales,
al ser digerido con la enzima BamllT e hibridado con una sonda
especifica para el gen de la globina alfa, revela un frag
mento de 14 Kb (112). Este fragmento de A.D.N. contiene ambos
genes de la globina alfa. Asi pues, sujetos no talasemicos,
tienen tal fragmento en ambos cromosomas y mostraran un patron
de 14.0/14.0 Kb (fig. 34).
EN la poblaci6n negra americana se ha calculado que
hasta un 20 o 30% de los individuos poseen un cromosoma con
un solo gen de la globina alfa (113). Cuando el A.D.N. de
un individuo heterocigoto para un cromosoma 16 normal {alfa,
alfa) y un cromosoma 16 con un solo gen de globina alfa (alfa
se digiere con BamHI e hibrida con la sonda específica para
! ,, J, 5' cu/ 3
1~00.;.--..
¡ / ' I
l ff I/ i 5' ar
Figura 32. Defecto molecutax .te un tipo 1le gen beb."
-talasemico presente en los hindues. Las flechas in dicen los sitios de reatriccion de la endonucleaaa
i1at I ('10).
121
2 3 Kb
4.4
3.7
Fi¡;ura 33. AD:; restringido con Pst I e hibridado con
la sonda para el gen de globina beta. Carrlles: 1,
homocigoto betaA/betaA; 2, heterocigoto betaA/be
ta0; 3, homocigoto beta0/beta°C110).
122
123
'({
ll' 1 ~
5'~3' t 14 Kb t
...t --t 1 ~ .........
~ 11 ll' 1
~ \' 't
5•-:-@--::--- 3' t 10 Kb t
.-
5
5t.-................ .,_ 3'
Figura 34. Diferentes cromooomaa 16 que tienen cero,un~ 1 das,
o tres genes de la globina alfa. Las nech;:;s indican sitios
de restriccion Bnm HI. Las bandas se obtienen al restringir
el ADN con Bam HI e hibridarlo con una sonda para el gen de
la globina alfa (103).
Kb
:s.o
14.0
10.0
el gen de la ·g1obina alfa, se observan tanto el fragmento
normal de 14.0 Kb como un fragmento de 10 Kb, que es el resul
tado de la delecion de uno de los genes de la globina alfa
(113) (Fig, 34), De forma similar se han reportado casos
en los cuales han encontrado cromosomas 16 sin un solo gen
para globina alfa (113,114) dando como resultado el sindrome
de la hemoglobina 11 (heterocigotos para un cromosoma 16 con
un solo gen de globina alfa y un cromosoma 16 sin genes de
globina alfa (alfa,-/-,-), en estos casos existe un solo gen
funcional para globina alfa por celula diploidc y solo se
observa el fragmento de lOKb en el análisis de los fragmentos
de restricci6n con Bam!II. Este fragmento de 10 Kb representa
al único gen de globina alfa (Fig. 34).
- Adicion de Genes Completos
Un cromosoma 16 con tres genes de globina alfa ha
sido reportado también (115), El fragmento de A.D.N. que
contiene tres genes de globina alfa es de 18 Kb, en vez de
ser de 14 Kb, al ser digerido con Bam!II (Fig. 34),
Este nuevo cromosoma se encuentra en la poblaci6n
negra americana con una frecuencia de 0.0036 ;entre los grie
gos con una frecuencia de O.OS y no se le hallo entre los
Sardos. Los heterocigotos para el triple locus del gene de
la globina alfa con cinco genes de globina alfa por celula
diploide (alfa, ulfa, alfa/alfa, alfa) no muestran manifesta
ciones clínicas anormales (115),
El origen tanto de los cromosomas con un solo gen
para la globina alfa., como para los cromosomas con tres de
ellos puede explicarse por un entrecruzamiento no balanceado
(116) (Fig. 35), Este proceso debe de producir igual número
de cromosomas con un solo gen de la globina alfa como de cromo-
125
sOmas con el locus triplicado. Sin embargo, como se observa
en la tabla XV en las poblaciones negras y Sardas, la frecuen
cia del cromosoma (alfa,alfa,alfa) es muchisimo menor que
la del cromosoma (alfa,-), Esta di fercncia sugiere que el
cromosoma (alfa,-) es ventajoso evolutivamente, La prevalencia
de la alfa-talesemia en las áreas donde la malaria es endémica
sugiere que, por algún mecánismo, aún no definido, la alfa
talasemia protege contra la malaria (115).
12G
B
5'~3'
t 14.0 Kb T
Figura 35. Entrecruzamiento no balanceado: Es un mecanismo comun
de delecion o adicion de moterial genetico. A, entrecruzamiento
no balanceado intercromosomal entre los genes de globina alfa
explica tanto al cromosoma con un solo gen de e;lobina alfa como
al que lo tiene triplicado. B, entrecruzamiento intracrJbmosomal
en la region de los genes de globina alfa explica solo al cromOSQ
ma con un unico gen de globina alfa(115)
127
TAll;..A_XV. L~ frecuoncin de el cro~ooJ~~ con t:e3 genes de slob1na al!a(a,a,a) y del ·'l'lC tieC'O UIÍ SOlO gen (a,-) se muestran en di-ftrO!lhS poblacio;1c=. ( 115)
Poblacion Frecuencia Re foroncias a a a a -
:\t;tros /.mcr1canos :.o::::;6 0.16 (115, 117)
Surdo o ~.004 o. 13 (115)
Griccos 0.05 0.07 (115.11R)
128
B. DETECCION DIRECTA DE LOS DEFECTOS MOLECULARES EN LOS .GENES
CODIFICANTES PARA LAS GLOBINAS.
l. Mutaciones Puntuales que Afectan ~itios de Restricci6n
Conocidos.
Esta mctodologia depende directamente de la mutuaci6n
puntual que convierte al gen funcional en inactivo. Si la
mutaci6n crea o destruye un sitio de restricción, el ADN gen6-
mico puede ser estudiado directamente con la enzima de restric
ción especifica para ese sitio. Para visualizar los patrones
de los fragmentos de restricción esta metodologia como la
primera, emplea ADN marcado radioactivamente como sonda.
El ADN sonda detecta el (los) fracmento(s) gencrado(s) y aso
ciado(s) al gen normal asi como el (los) nuevo(s) fragmento(•)
gencrado(s) y asociodo(s) con el gen mutado. Este acercamiento
es más simple y directo que el de los polimorfismos en los
fragmentos de restricci6n ya que no necesita estudios familia
res. Sin embargo, esta más limitado en su uso, ya que no
todas las mutaciones afectan a un sitio de rcstricci6n conocido
A continuaci6n describiremos los resultados que se
han obtenido al aplicar esta metodologla al estudio diagnóstico
de varias hemoglobinopatias como:
Anemia Falciforme
En 1978 Niehuis sugirio que la mutoci6n responsable
de la Anemia Falciforme (CCTGAGG que cambia a CCTGTGG en el
ADN y que· origina que el aminoácido Valina en la posición
seis de la cadena de la globina beta sea sustituido por el
Acido Glutamico) podria ser detectada directamente con la
129
--· - .. •"'
. . ·- - -
-: . . - "·. ,,
-. 'o - ·'" _,• -~~
endonuClea~.a·· de·'·~~~t~·icc~b~ -Mrii ·:r, la cual reconoce la secuen
cia GAGG.,i.<11.9) •.. ··Esta secuencia esta presente diez veces en
ei· .. g1ú\·. de< la '.globina beta de individuos normales sanos y solo
n~~v~ vec~s·~~ el~gen de la globina beta falciforme, originando
asl. ·un patron de restriccibn diferente que permite distinguir
entre ·individuos sanos, portadores y enfermos (119). Desafor
tunadamente los fragmentos que se originan al digerir con
Mnl I son muy pequeños (de 60 a BO pares de bases ) y por
lo mismo no son adecuados para ser evidenciados confiablcmente
mediante la técnica de Southern. Con el descubrimiento de
la endonucleasa de restricción ílde (120), que restringe
la secuencia CCTNAG (donde N es igual a cualquier nucleosido),
el grupo de Gcevcr y cols, demostró poder diferenciar entre
el gen normal de la globina beta (betaA) y el gen falciforme
(betas) (121) (tabla XVI),
Al restringir el ADN de individuos sanos, no anémicos,
con la enzima Ddc I e hibridar con una sonda especifica para
el extremo 5' del gen de globina beta, se obtienen dos frag
mentos de 201 y 175 pares de bases respectivamente ( fig. 36).
Si se considera que la mutacibn de la anémia falciforme elimina
el sitio de restricción para Dde I beta5 +6 (fig. 36) entonces
en homocigotos para el gen HbS solo se debera de ver una banda
de 375 pares de bases complementaria a la sonda S' del gen
de globina beta y en hetorocigotos (betaA/beta 5 ) se espera
observar las tres bandas de 175,201 y 375 pares de bases res
pectivamente. efectivamente eso fué lo que encontraron
Geever y cols. al estudiar el ADN de diferentes individuos
(121) (fig. 37).
~an y Chang (122) y Wilson y cols. (123) demostraron
el poder diagnbstico de esta técnica al aplicarla exitosamente
a un par de embarazos con riesgo de padecer anémia falciforme.
Ambos tenian un genotipo AS, un hijo previo era SS.
130
TABLA XVI. Comparacion del sitio de mutacion de la Anemia
Falciforme en HbA y en HbS (121)
Tipo de Secuencia de am~noacidos (codones 5,6 y ?) Hb y secuencia nucleotidica correspondiente
A Pro-Glu-Glu QQ!::Q!Q-GAG
s Pro-Vol-Glu CCT-GTG-GAG
El sitio de reconocimiento de DdeI esta subrayado.
5+6 D p D _:. l 175 pbl
---h\\\\\\) 201 pb
l~St
sonda 5'
Figura 36. Mapa de la porcion 5' del gen de la globina beta.
Los sitios Dde I (D),incluyendo el que se arecta por la mu
t•cion !alcirorme (beta 5+6) 1 y los tamaños de los fragmen
tos Dde I en pares de bases. El tafüafio y especificidad de la
sonde empleada para detectar el extremo 5' del gen de la gl.Q
bina beta tarnbien se muestra (121). I'/S: intrones
131
132
3 Kb
376
201
175
Figura 37, Diagrama de la autorradio.:~·afia de los fragmen
tos Dde I que hibridaron con la sonda especifica para el
e;rtremo 5' del gen de lr.. globin:; beta. Carriles: 1, indivi
duo control (AA); 2, individuo homocigoto para la anemia
falciforme (SS); 3, individuo portador del gen de la anemia
falciforme (AS) (121).
133
El análisis 'con Dde I del ADN de . ambos padres revelo, como
s.e esperaba, los fragmentos de 175,201 y 376 pares de bases,
. el ADN del hijo afectado solo origino el fragmento de 376
·pares de· bases, conforme a lo esperado. En el ADN de los
amniocitos cultivados se hollaron los fragmentos de 175
201 pares de bases, lo que es indicativo de un genotipo AA,
lo cúal fue confirmado con estudios sanguineos del neonato.
Ya que existe evidencie de que la mutación falciforme
se origino mas de una vez en la poblaci6n mundial (4), Kan
y Chang se preguntaron si el ensayo con Ode I seria útil para
detectar al gen falciforme en diferentes poblaciones: Estudia
ron el ADN de negros americanos, de individuos del Mediterraneo
(Sicilia, Grecia), el este medio (Jordania, SnudiArabio),
Africa (Nigeria, Kenya) y Asia (India). En todos los casos,
el gen A produjo los fragmentos de 201 y 175 pares de bases
mientras que el gen S origino solo el fragmento de 376 pares
de bases (122).
Aunque este nuevo acercamiento a la detecci6n del
gen falciforme es mas sencillo, directo, no requiere de grandes
estudios familiares y sirve para diferentes poblaciones mundia
les, tiene dos limitaciones importantes: Primero, el análisis
con Dde I no detecta al gen betaC' ya que esto mutaci6n (betaA
CCTGAG-.. beta e CCTAAG) produce una secuencia que si es restrin
gible por Dde I, y por lo tanto no puede ser distinguida de
el genotipo bctaA. Entonces para la detecci6n de bctnC el
polimorfismo Hpo I es mas Útil ya que el 95% de los genes
betaC eston asociados con el fragmento Hpa I de 13 Kb (4,
123). Otro inconveniente de la técnica, es que se requieren
de 10 a 20 ug de ADN para el anil.lisis ya que los pequeños
fragmentos de ADN generados por Dde I producen débiles señales
de hibridaci6n. Esta cantidad de ADN solo puede obt·enerse
mediante el cultivo de amniocitos lo que aumenta el costo
alarga ·la,, . . ·de la prueba. Afortunadamente, poco
después, ,Charig 'y ,Kan, (124) y 'Orkin y cols. (125) introdujeron
una' mo'difi'~aci6n a la 'técnica hadendo uso de 'ta endonucleasa
de restri,cÚ6~, Hst II.
,La enzima MSt III reconoce la misma secuencia nuclco
tidica, que Dde, I (CNTAG) pero tiene ademas una especificidad
adici,onal, de ,dos bases mas (CCTNAGG), Asi pues la restricci6n
de'! ADN 'c.;n Mst í:I genera fragmentos mayores que los que origi
na Dde I ( fig. 38) 1 ya que los fragmentos grandes de ADN
favoie~eri ·la "hibridaci6n- y por_ lo mismo producen scfialcs fucr
t"cs •. el ·ensayo con Hst· II no requiere cultivo de amniocitos
):a. qu-~-=con tan poco co"mo -1 ug de ADN se puede realizar la
p~ueba (124).
-~¡ ·:~esti'ing.ir-·ADN normal de personas sanas, no ancmi
caS; -Con_- ·Mst>.-.- 11> e· '.hibridarlo con una sonda específica para
el extre~o S,~:,, del gen de la globina beta (fig. 38) se revela
un frágmeiíto~de,'. l', 15 Kb. Ya que la mutaci6n falciforme elimina
el sitfo Hs't' II beta5 • 6 • 7 (fig. 38) el ADN de homocigotos
para::¡,¡ gen ,:bet'aS al ser restringido con Hst II e hibridado
c~·n ·la sonda d.el extremo 5 1 del gen de globina beta revela
un 'fragmento de 1.35 Kb (fig, 39).
Este nuevo enfoque demostro ser Útil tambien para
el diagn6stico de fetos en riesgo de padecer anemia falciforme
(123, 125) ser Útil en diferenles poblaciones mundiales
(Negros americanos, Kcnianos, Hindues y de Snudi-Arabia (124),
con la ventaja de ser mas rápido y barato por no requerir
cultivo
ensayo.
al gen
tambien
de amniocitos para obtener el ADN requerido para el
Sine embargo este ensayo tampoco sirve para identificar
beta , pues lu enzima Hst 11, al igual que la Dde I,
reconoce al sitio mutante bctaC (124 1 125).
Region Adyacente
1 Gen de la Globina lleta
{}5,G,7
~.2Kb~ 5' + 1.15 Kb
sonda especifica para el extremo 5' del gen
Je globina beta \
/,. 1.15 Kb
s 1.35 Kb
r11su\
Figura 38. Diagrama de la region adyacente y del extremo
51 del gen estructural de la globina beta. Las flechas
indican los sitios Mst II, incluyendo el correspondie.n
te a la posicion de los aminoacidos 5,6,7. El fragmento
de 1. 15 Kb es visto en el ADN normal, y el de 1. 35 Kb en
el AD;! portador del alelo S del gen de la ¡;lobina beta.
IVS= intronee (12!¡).
135
2 3
~ § [] Kb
1.35
1. 15
Figura 39. ADN restringido con !4st II e hibridado con la
sonda especifica para el extremo 5' del gen de la globi
na beta. Carril 1, homocigoto AA;2, heterocigoto AS;3,
homocigoto SS (125).
Figura 40. Deteccion por analisis con la en<lonucleasa Eco RI
del defecto molecular en el gen de la globina beta-Arab. La
mutacion elimina un sitio de restriccion Eco RI. Las flechas
indican sitios de corte para Eco RI (127)
1.37
La glob·:Í..~a ·'.bet~O Arabiga, beta 1 21 GLu-Lis, in teractua
can la glabina ·fi!lcifarme y causa la enfermedad hemoglobinica
soArab, ia cual es cllnicamente tan severa como la anemia
f~lcifarme (126). La sustituci6n nucleotidica que do origen
a esta variante puede ser detectada en el ADN genomico usando
lá endonucleasa de reatricci6n Eco Rl (fig. 40). El sitio
de reconocimiento de Eco RI es un grupo de seis nuclcotidos
(5' G4AATTC 3') que codifica para los aminoacidos 121 y 122
(127) de la cadena normal de la globina beta. La sustituci6n
nucleotidica sencilla en el gen betaOArab(G-A) elimina el
sitio normal de corte de Eco Rl al cambiar la secuencia del
ADN a 5' AAATTC 3' (128). Cunndo el ADN genomico normal es
digerido con Eco Rl o hibridado con una sonda para el gen
de globina beta , se revelan dos bandas de 5.2 y 3.2 Kb de
largo. En el caso de un homocigoto para ilbOArab solo un frag
mento de restricci6n, de 8.4 Kb, es detectado debido a la
ausencia del sitio de reconocimiento para Eco Rl en los codoncs
121-122 (fig. 40) (97). Esta técnica se ha usado en combina
ci6n con el polimorfismo Hpa I paro diagnosticar prenatalmcnte
a fetos con riesgo de SOArab y tambien para detectar al gene
beta de la variante hemoglobinica DPunjab (beta 121 Glu-Gln)
(4).
Hemoglobina JBrouasais
Los genes humanos de la globina alfa contienen la
secuencia AAGCTT en el sitio que codifica para los aminoacidos
90 y 91 (129). Eeta secuencia codifica para lia-leu y es
tambien el sitio de corte para la endonucleasa de restricci6n
llind 111. La variante hemoglobinica HbJBroussais (126) tiene
en la posici6n 90-91 de la cadena alfa, lis-asn, siendo la
secuencia nucle6tidica que codifica para ellos AAGAAT. Este
cambio vuelve al ADN resistente al corte de Hind III en este
13S
Sitio.
Cuando se restringe el ADN de una pers.ona homocig~ta
p~ra· ·la HbjBroussais y se hi.brida con una s.onda P~.ra ::e,1 · gen
de _lo globina alfa, se revela un fragmento de 7 .5 -Kb. Este
fragmento esta formado por la fusi6n de l_as fragmentos_ de
4. 6-- y 3. 7 Kb observadas en las individuos sanos (130 )( Úg.
41).
Talasemia Beta0 (gene betaivs ·2 G-A)
Una mutaCÍ.6n puiltual en el _sitia de empalme (sitia·
de _uni6n °entre un - intran y- un exon) del segundo intra-n del - - - - o gen de _la glablna beta es una etiología de la talasemia beta •
La mutación (G-+A) elimina un sitia de reconocimiento para
la enzima·Hph -I (GATGA _en lugar de GGTGA) (131) (fig. 42).
Se sabe- que la endonuclessa de restricción Hph
tiene uno de sus Sitios de corte en el extremo S' del intron
II del gen de glabina beta (132) (fig. 42). Cuando el ADN
humano nor~al se digiere con Hph I y se hibrida con una sonda
específica para el intron II del gen de ln globino beta se
obtiene un fragmenta de 0,9 Kb de largo (fig. 42). llaird y
cols. (131) hallaron en tres pacientes homocigotos para talase
mia beta, uno Italiano y dos Iranies, un nuevo fragmento de
1.0 Kb de largo, en lugar del de 0.9 Kb, debida a la pérdida
del sitio de restricci6n para Hph 1 en el extremo 5' del intron
11 del gen de globina beta, y consiguiente alargamiento del
fragmento Hph I hasta el siguiente sitio de restricci6n hallado
100 pares de bases mas hacia el extremo 5' (fig, 42).
Avances en la Detecci6n de las Mutaciones Puntuales
En fechas mas recientes se han elaborado protocolos
Figura 41. Deteccion por analisis con Hind !II del defacto molecul.'.lr en el gen Je la hemoe;lobina J-Brou
ssais. La mutacion elimina ur1 sitio llind III. Las
flechas indican sitios Hind III (130).
139
Kb
7,5 4,6
3,7
1.0
0.9
Figura 1¡2. Analista c<on la ondonucle~sa Rph I del defecto molecular en un tipo de bet.l'-talasemia con una mutacion en
el extremo 5' del sitio de empalme Jel segundo intron. La
mutacion elitnlna un sitio de restriccion Hpit I. L-Os sitios Hph I se indican con flechas ( 131).
140
c..... .; .. -
novedoá.os; que :.·i~t·~'~d·~·~e~'., ~odi fi~,fi~i~¡ries :~··i~:~'· .'.~-~,:~-~i~~-¡·6~-:/d·i·~"e.cta :: 6:u;·:~:~:~~;¡;~t:·~:.sdt~ti6~NJLe1m~r~~::;i~:~.j~f de ····~es~ric-
·: :·.¡:.' . -r··- --;,)~ ··:., >,,: ~ -- Usod~Mi.nis~i~s'.~ la R~~";1~~i6~··d~;Fri~me~if~~ de Restricc'i6n
uso
'-~
é~~¿,;~·se•ih~ expuesto ~n los párrafos
de;. erl~-o-nti·cÍ~eB:sas de re-stricci6ri para la
anteriores,
detecci6n,
el
en
~~·f~~~'·: __ ~:-_~r~~%_t_~_:.·< d~ __ uña mutaci6n puntual que haya creado o destl-U'id-ó .. jin-.-_:_sit:t'O de l-estricci6n dentro de un gen de interés,
permÚ~·;·:el~~análisis de ADN genomico desde 1 (124) hasta 20
_ug-·_(4), Pa_ra obtener en aproximadamente dos semanas un diagn6s
_ti~_o· confiable del genotipo hemoglobinico de los sujetos en
estudio (121, 122, 124, 117). Law y cols. han desarrollado
un protocolo, para la preparaci6n y análisis del ADN genomico
de amniocitos, que es mas sensible, pcrmltiendo un diagn6stico
prenatal con tampoco ADN como 50 ng y en un lapso de cinco
días o menos (133). Este protocolo se hn aplicado satisfacto
riamente al diang6stico prenatal de: anemia falciforme con
Mst II, mapeo de los alelos betaA y beta3 con Dde I, mapeo
del alelo betaD Punjab con Eco RI, mapeo del alelo betaEcon
llph l y al estudio de muestras de ADN mediante polimorfismos
de los fragmentos de restricci6n ( 133). Los puntos novedosos
de este protocolo son:
a. Extracci6n del ADN. En los protocolos de lisis
celular convencionales, al rcsuspcnder a los amniocitos en
el buffer de lisis con S.D.S., se forman agregados celulares
que requieren prolongados periodos de incubaci6n para disper
sarse y lisarse. En el protocolo modificada por Law , las
células amnioticas (provenientes de 5 a 20 ml de líquido amnió
tico) se .suspenden homogcneamente antes de agregar el S.D.S,
dando como resultado que ln lisis se obtenga en dos horas.
El pequeño volumen de lisis usado (0.4 ml) permite rapidez
141
en las extracciones fenolicas, de tal manera que el ADN puede
se~ obtenido y cuantificado en unas dos horas.
b. Resoluci6n de los fragmentos de ADN. Una vez
que el ADN ha sido digerido con la-endonucleasa de restricci6n
requerida para el estudio en proceso. se procede a separar
los fragmentos de restricci6n obtenidos, mediante electrofore
sis horizOntal en minigeles de agarosa al 1.4% con dimensiones
de 6 x 10 x 0.5 cm, durante dos a tres horas.
c. Detecci6n del fragmento de interés mediante hibri
daciones con sondas radióactivas.
Los procesos de transferencia del ADN a papel de
nitrocelulosa y la posterior hibridaci6n con la sonda radioac
tiva precisa, son iguales que en los protocolos convencionales,
solo que aqui la sensibilidad con este nuevo ensayo se ve
aumentada. Mientras que con los geles de tamaño convencional
se requieren de 1 a 2 ug de ADN total para poder delectar
a un gen presente en una sola copia, por juego haploide cromo
somico, el uso de minigeles permite la detecci6n de estos
genes usando 200 ng de ADN totul y una cxposici6n autorradio
gráfica durante toda la noche. Aumentando el tiempo de cxposi
ci6n de la autorradiografía ( ';>' 2 días) la sensibilidad aumenta
hasta requerirse solo 50 ng de ADN total.
La mayor sensibilidad alcanzada con el ensayo con
minigelcs no implica perdida de la resoluci6n. Bajo las con-
diciones de Law y cols., la rcsoluci6n se mantiene comparable
a la obtenida con los geles convencionales.
- Amplificación Enzimática del Gen de Interés
Aunque esta metodología, desarrollada por Saiki
11¡2
cola, (134_), fue' ori.g-¡~;,lmente aplicada a la 'detecci6n de
los alelos_ de la ane~i~ 'falciform~; puedé'seic utiHzada para
cualquier- muta'ci6n pu'ntual que afecte a·_:un-_·sitio de .re;,tricci6n
conocido'.
Inicialmente, un
del gen de globina beta,
Dde I, es amplificado, A
fragmento de 110 pares de bases
que contiene al sitio diagn6stico
20 ng de ADN total desnaturalizado,
se le agregan cebadores para la replicaci6n (oligomeros sinté
ticos de 20 pares de bases) que se alinean a bandas opuestas
del ADN genomico que flanquea a la secuencia gcnica de interés
Estos cebadores quedan colocados de tal manera que en presencia
de la polimcrasa I de h coli y nucleotidos trifosforilados,
el producto de extensi6n de un cebador puede servir como bantla
molde para la sintesis replicativa del otro. Con esta estrate
gia de ciclos repetitivos de desnaturalizaci6n, alineuci6n
y extensi6n de los cebadores, se obtie11e unn acumulaci611 expo
nencial de 1 fragmento de 110 pares de bases componente del
gen de ln globina beta. Por ejemplo, 20 ciclos de amplifica
ci6n producen un aumento de 220,000 en la cantidad original
del fragmento genico de interés.
El ADN amplificado es hibridado con una oligosonda
de 40 nucleotidos de largo, complementaria a la región del
gen de globina beta que rodea a la mutación falciforme. En
el alelo betaA, la secuencia nucleotidica de esta regi6n contiQ.
ne un sitio de rcstricci.6n Dele I, que ha sido perdido en el
alelo beta 5 • Lo estrategia pnra gencrur productos de restric
ci6n especificas para cada alelo (mutante o normal), n partir
de las sondos radioactivas se muestra en la figura 43. Se
basa en la presencia invariable de un sitio de restricción
para llinf· III inmediatamente adyacente al sitio diagnóstico
de restricción para Ode I. La resolución en geles de pol ia
crilamida de los productos de restricción, generados a partir
143
A B
--;.-------GACTCCTGAG---:.-~---;.
__ ,.;-, __ "'.i-:c~aAaGAcTc--;.---------.--------GACTCCTGTG-'--------
---------'-CTGAGGACAC---------
desriaturalizacion y alineacion
•. ~-~~ACTCCTGAG---- con la sonda f---GACTCcrolG----
º --:-,,--'-'-::,..CTGAGGACTC---------- ----------CTGAGGAC A C---------
sri~-''."''.GACTCC • e _:,;;;.,.;_~CTGAGGACT
t. . ----GACTCC
digestion con Dde' I
TGAG----·. ~---GACTCCTGAG----c.;.c..------- -'---------CTGAGGACAC--------
digestion con Hinr III
TGAG----
-------CTGAGGACT C---------
3n~-G -----CTGA
ACTCCTGAG-
TGAGGAC A C-----
Figura lt3. Diagrame esquematico de la restriccion ele olie;omeros
mediante digestion secuencial para obtener productos de reotri,!;.
cion especificas para betaA y betas. Se muestran las secuencias,
del ADll genomico del e;en de ln globina \Je te y do la sonde, que
contienen ol sitio invariable Hinr I (GANTC, donde ll represen
ta a cualquier nucleotido) y al s1 tio polirnor rico Dde I ( CT<lAG). El simbo lo t. indica la posicion ele la marca radioac ti vn en la
sonda. (A) ProceJi,niento y resul tndos es¡1orr.dos cuando la ,;onda
hibrida con el gen normal de la e;lo\Jlna beta (bobA). Desruos do
la desna turalizacion del AD:: gonomico y de su liibridncion con la
sonda, la dieestion con Dele I libera un producto de restriccion
(8n). Debido a las condiciones estrictas durante la digestion
con Dde I, ol producto 8n se disocia del All:I genomico y la subs~
cuente cligostion con llinr I no tiene erecto. (B) Descripcion de
digestion ~on Dele I y liinf I posterior n la hibri<lncion de la
soncln con ol alelo betas. Como consecuencia de la mutncion falc!
forme, el <luplo;i contl.ene un error de eparearJiento A-f, dentro
del sitio ~de I y no es restringido por Dde I.
!'igur.~. 43~ con t • .. con Dtle I, ·el producto 8n se dlaocia del AD'.l ¡;onomico y la su~
secuente digestion con Hinf I no tiene efecto. (B) Descripcion
Lle la di¡¡estlon con Dde I y f:inf I posterior a la h:lbridocion
de lu sonda con el alelo betas. Como consecuencia de la muta
ción ralc-tfor::ie, el uuple:< contiene un error de apareaioionto A
l.. dentro del sitio Dde I y no es restrineido por la entlonucle!!_
sa Dde I. Sin embargo, el sitio Hinf I permanece intacto y la
digestion con esta enzima e.euera un pro<luc to de <ligesU.on 3n:
Asi pues la presencia del alelo betaA se revela por ln libera
cion <le un :ragmento en, mientras que la presencia del alelo
batos se revela por un fra:;;inento 3n (lJI¡).
145
. . . . .
de las oli~osondas radioactiy~s groc¡as a la digesti6~ secuen~ cial con Dde. I y Hinf· III, permite distinguii- entre los dos
alelos.· En un Índivtduo homocigoto para el alelo A de la
globina beta, la· -d1gesti6n con Dde I produce un octamero ra
dioactivo (8 nt) a partir de la oligosonda. Debido a su peque
ño tarnaño, el producto de restricci6n de 8 nt se disocia de
su ADN complementario la subsecuente digcsti6n con Hinf
111 no tiene ningun efecto. En el caso de homocigotos SS,
la digesti6n con Dde I no tiene efecto debido a la mutaci6n
falciforme, El sitio invariable Hinf III podra entonces ser
restringido, liberando un trimero radioactivo (3 nt). En
un heterocigoto AS, tanto el trimero como el octamero se pre
sentan (fig. 44).
Haciendo uso de estas técnicas se puede determinar
el genotipo beta hemoglobinico de un individuo en menos de
10 horas usando 1 ug de ADN. Una exposici6n autorradiográfica
de 4 horas es suficiente para generar una señal fuerte 1
una exposici6n más prolongada (de aprox. 12 horas) da señales
detectables cuando la cantidad inicial de ADN es de 20 ng.
Ya que este mhodo incluye hibridaci6n liquida y la adici6n
secuencial de reactivos a un sólo tubo, es más sencillo de
realizar. que una transferencia Southcrn normal y su correspon
diente hibridaci6n sobre nitrocelulosa. Todas las reacciones
previas e la electroforesis pueden ser automatizadas, lo cual
simplificarla aun mas la metodología.
En resumen, las modificaciones introducidas en los
dos protocolos descritos anteriormente ofrecen ventajas como:
(l) Detecci6n prenatal en una etapa gestacional mas temprana
y/o con menos liquido amniotico; (2) posibilidad de llevar
a cabo varios ensayos con la misma muestra de ADN¡ (3) no
requiere cultivo de amniocitos; (4) ahorro en reactivos
y tiempo de trabajo,
146
i..S SS
i:ucleotidoa
8
3
Figura 41¡, Deter1liinacion del genotlpo beta-globinico
en el AD:; huw1no n;ediante la tecnica de amplific.1cion
hibridacion en solucl.on,rtlstrlccion secuencial, y
resolucion en geles de poli&crila11tida. El genotipo de
los individ.uoe asta ; arriba de cada cnrril (134).
147
2.
,~'egun~,; ', metodoi'ogía para , la , detecci6n directa
de ·1as .. ,mu .. t-~ci·¿-ne~ en 109. ·ge·n·e·s .de·: l:a_s globinas supera muchas
·:de la·a ~:~i·m-ita·éione·a· que las metodOiogías· a1l"teriormentc ex pues-
~· .. ta$, ~~_nÚ>-· indirectas como directas·, padecen. A diferencia
-de ·-ott:ós tlícnica
[nétodos que emplean largos cDNA 1 s como sondas esta
hace uso de oligodcoxirribonucleotidos sintéticos
para este fin. Para asegurar que las oligosondas son de sufi
ciente complejidad como para ser específicas de alelo, un
largo de mínimo de 19 nucleotidos es empleado para estas son
das. Para cada sitio mutante un juego de sondas nonadecanu
cleotidica~ es sintetizado, e incluye por lo menos un oligomcro
complementario a la secuencio g~nica normal y otro complemen
tario a la secuencia mutada. Asf pués el AD~ de individuos
homocigotos para el gen normal hibridara sólo con la sonda
complementaria al gen normal y no lo har~ con la sonda especí
fica para el alelo mutante; pa,ro un indivjduo homocigoto para
el alelo mutante ocurrirá exactamente lo contrario y sólo
el ADN de individuos heterocigotos,
y el normal, hibridará con ambas sondas.
daci6n se muestra en la tabla XVII.
para el alelo mutante
Este patr6n de hibri-
A continuaci6n se exponen los resultados obtenidos
,de la, aplicaci6n de estas técnicas al estudio de varias hemo~
globinopatías como:
Anemia Falciforme
La diferenciaci6n entre los genes de la globina beta
normal {beta A) , y la falcifo,rme (beta 5 ) fue el primer éxito
del us~.d~ lo~ oligonucleotidos sintlíticos como sondas diagnos
ticas, (135, ,.136)~
TABLA l<V!I •• PBtron de hibridacion entre las oligoeondae
ee'Dflcificae ll8ra Bleloa normales o mutantes y el ADN ~
nomico. La noaitividad o negatividad de la hibridacion 11onda-ADN !le indica por loo aimboloe + y - reeneotiva-mente- ( 135)
GENOTIPO SONDA NOR/:10R unoNrrm '"""' Amm
Nonnal + + + - - -l!utante - - - + + +
149
... , -·-··- _._:_ -··- ·- --· --_· -Se ·sintet'izaron 'd'os non-~de~~~u~ie~-tido~··,- - u~·o d.e elios
pt?l- f ~c·t?m~-~-·te · · c~'mpl émeñ tario 'aÍ. :gen· ·de 18. _glob~-~a ~·et~> no~mal (beta~) y elotrocco~pleinentario al· alelo> falciforme {betas)
en.·la .regi6n qué ~odea a Ú mutacf6n falciforme (tabla XVIII)
L~ posici6n y tamafio de la secuencia oligon~cleotidica fu~ establecido en base a una serie de consideraciones:l) Se d~
cidio que el oligonucleotido tuviera 19 nucleotidos de largo
para que asi tuviera una alta probabilidad de reconcer solo
una secuencia dentro del ADN genomico (137); 2) la mutación
falciforme se situo en el centro de !a oligosonda para exacer
bar· la inestabilidad termica de la hibridaci6n no complementa
ria; 3) las secuencias sintetizadas no son complementarias
a las regiones correspondientes en los genes de las globinas A O¡ ,,.
E,'{, lf• o d (tabla XIX).
Se obtuvo ADN de individuos sanos
de heterocigotos portadores del gen de la globinu falciforme
(beta A /betas); y de homocigotos para el gen falciforme (betas/
betas). Se restringio el ADN (10 ug) con la endonucleasa
Bam 11!, con lo cual el extremo 5 1 del gen de la globina bela
(que porta la secuencia complementaria a las oligosondas)
queda en un fragmento de 1.8 Kb. Se encentro que las condicio
nes adecuadas para que solo se produjeran hibridaciones cuando
la complementariedad entre la sonda y el gen fuera de 100%
eran: Hibridaci6n en Sauthern a 45°C en 0.9 M de iones Nn+
Y lavado del Southern a ssºc. Bajo estas condiciones estrictas
solo los duplex de ADN perfectamente complementarios son esta
bles (135, 136) (fig. 45),
De esta mBnera la técnica de las oligosondas demostra
ba ser igualmente Útil que el. ensayo con la cndonucleaso Mst
II ya que ambas técnicas requieren de una pequeña cantidad
de ADN, que .. pu~de ser··abtenida sin recurrir al cultivo celular,
150
Kb
(A) --(B) -- 1.8
Figura 45. Hibridncion do las sondas nonarlecanucleotidicas
(beta A y S) al ·AD:! genoinico humano. AD:; de individuos AA,
AS y SS fue di¡;erido con Bain HI y sometido a eloct1·oforruis,
transferido a papel de nitrocelulosa y: (A), hibridado a
la sonda beta A; (B), hibridado a la sonda beta S (135, 136)
TABLA XVIII. Secuencia nuo1eotidica de le.e son ae oligome
rioae nara el gen norona1 de la globina beta (beta A) y del 11:en f'al,.tform" (h .. t~ S l (' :;G)
G a
beta A beta A 5'CT GAG GAG AAG TCT GC3•
beta A' 3•GA GGA CTC CTC TTC AGA CG5•
beta. S beta s 5•CT CCT Ja GAG A.AG TCT GC3•
beta. S' 3•GA GGA CAC CTC TTC AGA CG5•
A_..,.T
e ~t Ar (
'fA
TABLA XIX. Secuencia de lllllinoaoido11 7 del ADN d~ 1011 gene11
humano11 de la familia de la11 globinas beta-like, en la r~
~ion nue hibrida con las oli~oeondas, \135)
Brrore11 de apareamiento
152
betaA betas
5' Phe Thr Ala Glu Glu Lia Ala Ala Val 3' 2 3 T'I''I' AaT Ge! GAG GAG AAG OCT GCC G'I'C
l'he 'I'hr Glu Gli A11p Lis Ala Thr Ile 7 p T'I'C ACA GAG GAG GAC AAG GCT AC'I' ATC
Leu Thr Pro Glu Glu Lia Thr Ala Val l 2 CTG ACT CC'r GAG GAG AAG ACT GCT GTC
Leu Thr Pro Glu Glu Li11 Ser Ala Val o l CTG ACT CCT GAG "GAG AAG TCT GCC GU
'P" Leu Thr Pro Val Glu Li11 Ser Ala Val l o CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT cae GT'I'
161
-,tos col~ctados a partir de 20 ml de líquido amniótico de tres embar8"os en riesgo de padecer beta O
39 talasemia. El ADN
de los._ individuos adultos se digirió con Bam HI, se hibridÓ
con l~s oligosondas betaA y betaº 39 y los resultados obtenidos
fueron que lo sonda betaA hibridó sOlo con el fragmento de
1.8 Kb del ADN normal (AA), la sonda betaO 39
hibridÓ scilo
con el ADN de individuos betaO 39 -talasémicos (betaO 39 /beta0
39 ).Ambae sondes hibridaron con el ADN de individuos heteroci
go~cis para beta O 39 talasemia (beta A/beta O 39 ). Al probarse
el ADN de los amniocitos se observo que en un caso ambas sondas
hibridaron con el fragmento de 1.8 Kb (fig. 49 carriles 1
y :1 1) indicando un genotipo de heterocigosis para betaº
39
talesemia; en los otros dos embarazos solo la sonda betaA
hibi-idÓ c·an el ADN, indicando que los fetos eran normales
(AA) (fig. '49 carriles 2,2', 3 y 3'). Estos resultados fueron
-~--~or~obor:-ados-, ·al nacer los productos, mediante estudios hemo
glob{nfco~ (141).
Esto misma técnica se ha empleado despué's para estu
dios masivos de parejas sardas que desean diegn6stico prenatal,
siendo de inter~s hacer notar que en estos estudios se usaron
oligosondas que eran ya un producto comercial registrado y
como tal fueron compradas al laboratorio fabricante (142).
De las 103 parejas comprendidas en estos estudios en 91.3%
de ellas ambos progenitores portaban la mutaci6n beta.O 39 ,
confirmando as! reportes previos sobre la incidencia de este
alelo en la ppblaci6n Sarda (143) y sugiriendo la posibilidad
de que el diagn6stico prenatal de beta talasemia en esta pobla
ción puede ser logrado, en la mayoría de los cosos, rápida
Y facilmcnte con el uso de un solo par de oligosondas alelo
específicas.
La mutaci.6n betaivs-l llO es producida por el cambio
de un solo nucleÓtido (G-A) en la posici6n 110 del primer
2 3 ,. 2' :;•
Kb
--- 1.8
(A) ('.})
Figura 49. ADN de tres retos con riesgo de padecer beta 39
talasemia, restringido con Bam HI e hibridado con : (A) , sonda especifica para el gen normal de la globin.> beta ¡ (B), sonda especifica para el gen mutante beta-39 talasemico. Las muestras de ADll de cada reto astan por duplicado : 1 , 1'
2,2• / 3,3' (141 ).
CTGCCTATTGGTCTATTTT sonda normal (A)
162
betaIVS I-110 A sonda mutante (tal)
Figura 50. Sondas sinteticas preparadas para hibridaciones m_g leculares. El gen de globina beta esta ilustrado en la parte superior. Abajo, la secuencia de AD!: normal y la sustitucion 1oononucleotidica en el gen beta IVS I-110 comun entre los habitan tes del ;.:edi torra neo, se muestra dentro del rectangulo (, 47).
intron (ivs .. l)':dei gen de lo globina beta (144). Esta sustitu
ci~~ gener~-u~~ nueva. sefial de empalme que origina la forma
ci6~ d·e·· u~', AR'Nm anormalmente procesado que es inestable "in
vivo"· (145)·; · Ya que algunos pocos ARNm normales son producidos .. +
este gen . prodüce un fenotipo de talasemia beta ( 144). El
grupo de Orkfo y cols. (146) ha estimado que alrededor de
dos·-. tercer·as partes de los genes beta+ talascmicos griegos
y un' tercia· de los italianos son de este tipo, y es por ello
que ellos mismos decidieron hacer uso de oligosondas alelo
espedficas para el diagn6stico de esta enfermedad en indivi
duos de estas iomtinidades (147);
Fueron sintetizados dos oligosondas nonadecanucleoti
dicas una complementaria al gen normal de la globino beta
humana y la otra complementaria a la mutaci6n betaivs-l l lO
del mismo gen (fig. 50).
Se obtuvo ADN de individuos normales y de individuos
portadores del gen betaivs-l llO ya fuera en forma heterocigota
u homocigoto, se digirio con Bam HI e h!brido en condiciones
estrictas con los oligosondas sintetizadas. El ADN de indivi
duos betaA/bctaA solo hl'brido con la sonda betaA; el ADN de
individuos bctoivs-l llO/betaivs-l llO solo hibrido con la
sonda betaivs-l 110 ; y el ADN de los heterocigotos hibrido
con ambas sondas demostrandose asi, la especificidad de cada
una de las sondas por la secuencia de ADN que le es 100% com
plementaria, y con ello su valor diagnostico (fig. 51).
En los párrafos anteriores se ha expuesto que el
alelo beta talasemico mas comun en Cerdeña es el betaº 39
Y en Grecia e Italia lo es el alelo betaivs-l l IO, pero es
un hecho 4ue entre las diferentes poblaciones del área Medite
rranea ha habido intermigraciones que han originado un 11 pool"
genico con características compartidas pero, que al mismo
(A) (B)
I~ A í•I l"I' p-ª¡·' f ~ F'~ ?:-' e>'f.J l·'
CEB Kb -- 1.3
Figura 51, AD:: de individuos con diferentes een.Q_
tipos para el ,;e1• ele la _;lolilM beta, dieerido
con !lam HI e hibriclado posterior.llonte con: (A),
sonda especifica para el gen normal de la globJ.
na ueta (beta A)¡ (B), sonda especifica para el
e;en de talasomin IVS I - 110 ( 147).
tiempo originan mayor variedad en los alelos-- presentes en
una -·comunidad determinada. Es por ello que surge 18·, i~terrogante 'd_e_ con.-cua~ta's oligosondas .se requi~.re Canta~ para _esta
·~·~~~t u~ p~og~~ma de diagn6stico __ prenata~ de~los hemoglobino
palfa-~ ··e_n uria poblaci6rt en particular. PBra contestar a esta
frite~fóg-ilntC, en lo referente- al· área Mediterranea, Thein
y cols. (148) realizaron un estudi6 mediante oligosondas alelo
espedfii:as- en el que hallaron que en la poblaci6n Chipriota
u,n áo% de los· genes beta-talasemicos eran del tipo betaivs-l -
l.lOJ"~Ya·- -mutaci6n beta O 39 no se hallo en ningun caso. En
los Italianos la mutaci6n betaivs-l llO se encentro en 22%
de los cromosomas beta-talascmicos la mutaci6n heteo 39
en 66% de ellos. Con base en estos resultados se han logrado
diagn6sticos completos (se refieren como diagn6sticos completos
cuando en ambos padres la mutaci6n puede ser identificada
medinnte las oligosondas) en 65% de familias Chipriotas usando la oligosonda para la mutaci6n betaivs-l llO y en 75% de fami
lias Italianas usando las oligosondas para las mutaciones betaivs-l llO y betaº 39 (148, 149).
Beta Talisemias en Asia
Impulsados por una inquietud similar a la Thein
cols (148) descrita en el párrafo anterior, el grupo de
Kazasian y cols decidieron determinar el espectro de mutaciones
responsables de la betaº talasemia en China y el sureste de
Asia para hacer posible un programa de detecci6n directa de
los genes mutantes de globina beta en esta rcgi6n del mun
do (150).
Mediante análisis de restricci6n del ADN y de hibrida
ci6n con oligosondas alelo-específicas encontraron siete dife
rentes mutaciones puntuales. De estos siete alelos beta-tala
semicos, dos constituyen el 62% del total y otros dos constitu
yen un 29%. Ya que solo cuatro alelos forman el 91% de los
genes beta .. níut~rii:e~, y eritre los· s:lete;,álelos. llegan ... al 96%
del .total ;de• genes betá,,-globinfr.of;, mut~ntes en ;~hipa el
. sureste: de Ásiií (talil~ XXII) eLdi~gno~Úco;'pre~~i:~l ;;; éstas
poblaciOnes sérh poslble 'mediant~ ·t&'c:niás. de de'tecci6n direc-
ta de l~ mu~aci6n p~n~'ual. .
El. grupo. de Saiki y cols ha publicado un protocolo
experimental ClSi) que hace uso de la amplificaci6n de regiones
esp~·c:t:ficas del ADN genomico total (ref. 134) y de oligosonda
sal~~o.:.e_specíficas ·para la detecci6n de mutaciones puntuales.
Aunque el reporte original (151) esta aplicado a la detecci.6n
de.los alelos betas y betaC falciformes esta metodología puede
ser útil para la detccci6n de cualquier mutaci6n puntual para
la cual se pueda contar con oligosondas alelo-específicas.
Inicialmente, siguiendo la estrategia de ciclos
repetitivos de desnaturalizaci6n, alincaci6n cxtensi6n de
cebadores (expuesta en las pags, 142 y 1 41 de este escrito},
se amp! i fica un fragmento de 110 pares de bases del gen de
globina beta (partiendo hasta de 1 ng de ADN total), El ADN
amplificado, obtenido de individuos con cualquier
combin8ci6n de los alelos beta A, beta 5 y beta C, se
posible
dividio
en tres porciones que se aplicaron a cada uno de tres filtros
para hibridaci6n en punto (dot blot hybridization). Cada
uno de los filtros fueron hibridados con una de tres oligoson-
das alelo-específicas radioactivas (fig. 52). La autorradio-
grafía (fig. 53) muestra claramente que cada oligosonda hibrido
solo con aquellas muestras de ADN que contienen por lo menos
una copia de algun alelo de globina beta que le sea 100% com
plementario.
3. Migraci6n Diferencial en Geles de Poliacrilamida
La desnaturalizaci6n diferencial del ADN, al migrar
electroforeticamente al travez de un gel desnaturalizante 1
TABLA XXII • Alsloe beta-tnl,.semico11 presentes en la po
blacion de China y del aureete de Asia y frecuencia de lns mismos. (150)
MUrACION PORCENTAJE EN EL TOTAL
167
DE GENES BETA-TALASEMICOS
Ineercion 41-42
26"} .... '
62" 36" ivsII-654
Sin sentido 17 13" 91"
Codnn 2~ 16" ~ 9P"
Codon 29 4" iveI-5 1.5" Delecion 71-72 1.5"
beta - globina
5' 3' 5•----3• cebador (+) 19A
195 19C
CEBADORES Cebador (-) ACACAACTGTGTTCACTAGC Cebador (+) CAACTTCATCCACGTTCACC
SONDAS 19C CTCCTAAGGAGAAGTCTGC 19A CTCCTGAGGAGAAGTCTGC 195 CTCCTGTGGAGAAGTCTGC
3' cebador (-)
Figura 52. Secuencia de los cebadores y de las sondas y de
su relacion co11 el gen de la globina beta. Los dos cebado
res, (+) y (-), son de 20 pares de bases de largo y son CO.!!!
plementarios a las hebr11s positiva y negativa del ADll res
pectiva1nente. Las tres sondas, 19A, 195 y 19C, son de 19
pares de bases de largo y cubren del codon 4 al 17 del gen
e 151 >.
168
• AA
• • /J3
• SS
• • se
• ce
• • AC
19C 19s 19A
Figura 53. ADll someticlo a· ciclos de amplificacion
fue aplicado a filtros de nitrocelulosa para ser
expuestos despues a hibridacion con oligosonclas -
especificas de alelo (151).
169
170
es otro recurso ";para lá "detección de sustituciones de una
sola" base:"en el ADN (152). EN e"sta metodología, las moleculas
'de -:AON.:·.mu~·a·~t:~s-- y,. normales so~ s·epata-das mediante electrofore
sis en geles de:" poliacrila,m"ida que tienen un gradiente de
""formamida "y, urea" (desn,aturalizantes del ADN). Los fragmentos
,de" ADN dú~lex "migran al i:raves de estos geles a una velocidad
pr~·POI'.'C_~a·ri~~ 8-. sii:_-:pes() mo_lecular hasta que alcanzan una regi6n
·d-e1 -g-el c .. Oil 'Uria ·con·centraci6n tal de desnaturalizantes que
ha~en :"q~e,"'~1 :duplé"x se desnaturalice. Cuando el ADN se des na-
. _ t~-~~l·~--~a .:~·:~;~u,. '.mayilid_ad e lec trof o ret i ca decrece a bruptamcn te.
"D~"tal,,for~a-~~e, la posici6n final del fragmento de ADN depen
fei ~:d·é~'-~=: 5-b\~~tempE!ratu ra de des natural i zac i6n. La diferencia
er,_ -.-la te-iDPer~tura de desnaturalizaci6n entre dos fragmentos
qúe:' di-Íiel--~n ~-en un -solo nucleotido es suficiente para permitir
s·ú."Lse·p~ra~~.'.f6n -_e~ . el gel. Una mayor separaci6n es lograda
•" c"~ll" duplex"~ de ADff, que porten un error de apareamiento y en
ello se basaron Hyers y cols. (153) para elaborar un protocolo
ei~~riment~l destinado al "diegn6stico molecular de las hemoglo
binopa tías.
El trabajo de Hyers y cols. (153) fue sobre cuatro
mu~acioncs b~ta-talasemicas, que ocurren en las posiciones
l,5,6""y !lo ílel primer intron (ivs-1) del gen de la globina
beta .humana. El esquema general del protocolo experimental
e~el siguiente (fig. 54).
---- -·_·,-,--- ---L8 --muestra de ADN geno mico total (se trabajo con
ci·n-co muestras de ADN: la primera de un individuo sano y de
la·s otras cuatro cada una tenia en forma heterocigotu una
de las cuatro mutaciones mencionadas en el párrafo anterior)
se restringe con las enzimas Bam HI y Neo I (que cortan fuera
de la secuencia mutante de interés), se desnaturaliza por
calentamiento a ebullici6n y se mezcla con un exceso de 6,400
veces de sonda para el gen de beta globina humana normal.
171
3. 5' _____ ,.. Exon I
t Neo I l Ba! HI
restricclon con Neo I y Bam HI
".:'""'"Lll~ ~
1 Deenaturalizacion oor calenta
~ miento a ebullicion
1~y ADN de una sola hebra
l)Adicion de sonda especifica del gen normal, en exceso de 6,400 veces 2)Hibridacion en medio liauido 3)Digeetion de sonda no hibridJi da y de ADN de una sola hebra con nucleasa Sl 4)Restriccion con Hae III
-A------ ADN genomico sonda radioaotiva -v
lfeteroduclex con un malaparenmiento
l l)Bleotroforeeie en p:P.l de col.! acrilamida con gradiente dHn.1-tural i!:ante. 2)Autorradiografia
~igracion diferencial entre
el homoduolex y el hetero~
duclex.
Pig •. 54 Diagrama eequematioo de la eat~ategia de Myere y oole. cara distinguir genes mutantes de silvestres, P~ ra explicacion leer el texto.(152)
172
,_. ..
Se permite ·1'a h.ibrÍdacicSn en medio·,líquido y. se agrega nu.cleasa
Sl. para··,remov.e~:: p·~~'. hÚrolisis ii. la ... sonda que :no .híbrido y
a todo et ADN :de .una cade.na. El ADN duplex se· restringe con
Hoe IiI, q~·e s'~.;er~ ~n tragmen to de ADN duplex de 272 pares
de bases 'que :.~ontfene ,al primer intron del gen de globina
betá. E.st~, fragmeñ'to de ADN es sometido a electroforesis
en u~.gel de·polia~iialmida con un gradiente de desnoturalizan
tes_··Y-- m~d~ante-. autorradiografía se evidencian los resultados.
Com'o se muestra en la figura 55 1 cada uno de los
hete.rod_up.lex_· (duplex de ADN que contienen un error de aparea
miento) ... ' claramente se separa del homoduplex de ADN (duplex
de ADN 100% complementario) cuando se someten a la electrofore
sis en el gel desnaturalizant.e (carriles 1-5 de la fig, 55),
En e~tos casos la separaci6n entr~· los homoduplex y los hetero
duplcx vario dé uno a cuatro centímetros 1 dependiendo de el
tipo de mutaci6n. Estos resultados indican la posibilidad
de determinar sin ambigÜedades el genotipo hemoglobinico de
un sujeto haciendo uso de una sola sonda (la específica para
el gen normal) y no de varias como lo requiere la hi bridaci6n
con oligosondas alelo-específicas. Desafortunadamente en
el mismo reporte se hace notar que en algunas otras mutaciones
estudiadas no se observo diferencia en la migración entre
los hamo y heteroduplex. Este comportamiento puede ser debido
a que algunas mutaciones se localizan en sitios que no alcanzan
e desnaturalizarse bajo las condiciones empleadas.
Parte de la solución a la limitación de esta metodolo
gía podría ser la técnica recientemente reportada por Novack
Y cols. para detectar malapnreamientos únicos en el ADN ( 154)
Y que hace uso de la rcacci6n, descrita por
(155, 156.), entre bases malapareadas el
clohcxil-3- (2-(4-(4-metil) morfolin) etil)
aquí en adelante referida como carboiimida):
Lebowitz y cols. reactivo -ci
car bo iimi da (de
173
LB-: c1frb.oii-M{da ·reaccJona ,--: formaódo estructuras cova
lentes 1 e~~ _r~~~~du_~-~ de gu~ni11dat_os Y timidilatos no aparcados
en el 'ADN··superh.eÚcoidal sin .afectar a los bases de Watson
Crick intac'tas·· (fig. 51\). Novack y cola. (154) encontraron
que·· s1.'·\1 ,u~ _h~-ter~dupl·ex, de ·hasta 1,500 pares de bases, con
un sOlo- malapa'reamiento en que interviniera timina o guanina,
se ie hace-_-reaccfonar con la carboiimida yse le somete a elec
troforesis a través de un gel de poliacrilamida al 15%, su
corrimiento es claramente menor (aproximadamente 10%) que
el que muestra el homoduplex, el cual por ser 100% complementa
rio no reacciona con la carboiimida. Esta técnica promete
se~-6til para la asignaci6n de genotipos hemoglohÍnicos necesa
rios para el diagn6stico prenatal diferencial.
lfonnal ivsI,l ivsI,6 ivsL,110 ivsI,5
.JL
e D
A
Fig, 55 AutorraCliografia de la electroforesis, en ~el~e de noliacrilamida con gradiente deenaturalizante, de muestras de ADN; mutante (carriles 2-4) y normal (carril 1), hibridado con una sonda esoecifica para el nrimer intron (iveI) del gen de globina beta, A, migracion del homodunlex entre el ADN normal y la sonda; B,C,D, y E, migracion diferencial de loe heterci. dunlex entre cada uno de loe alelos beta talaeemioos y la Bonda, ( 152)
Formula estructural de la ciclohexil-3(2-(4-
(4-metill morfolin) etil) carbodiimida y de su nroduo_
to de reaccion con uracilo, Una reaccion similar, en
el sitio imino, ocurre con la timina y la guaniná!155,156)
V. COMENTARIOS Y PERSPECTIVAS
1.75
La tecnologfa del .-ADN. nos ha proporci.onado un cuadro
bestailtC 'comj>let~ ·de. las .. ml":t.a¿iOnes· que dan lugar a las hemo
globinopatías y Síndrom~s Talasémicos, asimismo han permitido
el diseño de métodos para el an&lisis directo del ADN y con
ello \.in · d·iagn.ósi:ico y consejo prenatal cada vez más seguro
y confiable; Ademtls estos estudios han arrojado luz sobre
la CV01uci6Íl''.1de -los -genes normales y mutantes y, en un futuro
esper . .snzador_a·men te cercano• tal vez permitan la corrccci6n
defiiitiva de los defectos génicos,-
La ürupcibn de la genética molecular en apoyo de
la ge.rihica cllnica, médica y de poblaciones no se ha dado
8610· .. ·en er estudio de los genes glob:lnicos, su evolución,
naturaleza 1 diagnóstico y tratamiento de sus mutaciones 1 sino
que .ha _encontrado aplicaciones sobre otras varias entidades
(véase tabla XXIII), De ésta manera, los métodos y técnicas
de 18_ genética molecular dejan de ser exquiciteces de la biotec-
_nologia para, eventualmente, convertirse en técnicas rutina
rias de anblisis y diagn6stico cllnico.
Uno de los principales impedimentos para emplear
como diagn6stico rutinario a las técnicas descritas en el
segundo capítulo de esta tesis, es el uso que hacen de isoto
pos radioactivos. El manejo de los radioisotopos conlleva
una serie de requerimientos y limitantes que impiden, de ini
cio, su uso rutinario masivo: Elevado riesgo biológico
para el personal, necesidad de instalaciones y/o equipo espe
cial para su manipulaci6n, alto costo ccon6mico y una corta
vida Útil (lo que implica que las sondas marcadas no pueden
almacenarse para su uso posterior sino que deben prepararse
cada vez que se necesiten).
En un intento para desarrollar métodos para el mar
caje de sondas, que no presentase.las desventajas del radiomar-
ABLA :;xr:r. EnferMdadea CU)'O diagnostico H posibilita 7/0 faci
Enfermedad
Halaria (.f, felCipN'llll)
P'.lbroeie c¡uiatica
Ciertos tW10rea
renilcetonuria
Policiatoeis renil
Distrofia auHula de Duchenne
Distrofia muscular de Becker
SindroM de Don
Lipopatiae
Tranetornos aentalee
HHofilia
Diabetea
Citrullnolda
Kal de Huntington
Referencia
(157)
( 158)
(159,160,1G1)
(162)
(163)
(164, 1G5)
(166)
(167)
(168)
(lG9, 170)
( 171)
( 172., 73)
(174)
(175)
177
ceje pero que al mismo tiempo fuera de alta sensibilidad y
gn!n e"specificidad, Langer y col s. (176) han sintetizado nu
c1"6tidos biotinilados (unidos a vitamina 11 = Biotina) que
siiye~ para marcar sondas ya que han demostrado ser sustratos
"adecuados para las ARN y ADN polimerasas, además de que los
pol;t.ni.tcle6tidos biotinilados resultantes muestran una cinéti
:ca __ de -_reasociaci6n similar a la de los polímeros sin biotina
y de esta manera representan sondas génicas funcionales (176).
El mbtodo para la detecci6n de los duplex de hibrida
ci6n de estas sondas biotinilados se basa en la gran afinidad
que, por la biotina, tiene la glucoproteína Avidina. La Avi
"dina, proteína de la clara del huevo y con un P.M. de 68 000
d, posee una elevada constante de uni6n a la biotina
(Kdis 11:1 l0- 15 ). De esta manera, si a la Avidino se le acoplan
las moléculas indicadoras apropiadas (fluorocromos, proteínas
electrondensas 1 enzimas o anticuerpos) es posible detectar
cantidades diminutas de las sondas biotiniladas, como lo de
muestra la técnica reportada por Lcary cols. (177), que
emplea polímeros de fosfatasa alcalina unidos a Avidina
que es de 20 a 50 veces mas sensible que las técnicas repor
tadas previamente para este sistema, siendo posible el detec
tar secuencias génicas presentes en una sola copia por gcno
mio. El marcaje de sondas oligonucleotídicas con biotina
y su uso en el diagn6stico de enfermedades genéticas ya ha
demostrado su factibilidad (178).
De este modo volvemos a comprobar que los escollos
se van allanando y que cada vez esta mas cerca el momento
de que las técnicas de la genética molecular sean un aliado
práctico en el laboratorio de diagn6stico y consejo genético.
Ahora bien lSon todas bondades en el desorrol lo del
diagn6stico genético? Tc6ricamcnte 1 lo detecci6n de "genes
malos" dentro de .. la pob~aci6n humana y, con ello, la posibili
dad.de .. su···elillltn~ci6n 'del. bagage genético humano estada evi
tan~o ··~1:-q·ue i'as ··gener~CiOnes futuras heredasen estas mutacio
~es··: y '·á los p·adeé.illlientos a que dan lugar. Sin embargo esta
·.n.e~~ug·é~Oe~·J~ h.~: P_!'ovoC~do ·profundos cucstionamientos del"!tro
de.los;;álllbitos cieritificos, jurídico, laboral y civil (175,
in'idalmenté, .el ~xamencleÍ ge~oini~ de los individuos
·~esta- dirigido -a: - 1): La dete~~i6n: tenipr~-na.de anomalías enzi
·m.&.·t."i·~~S: ~u~--p~rmita poner .~n. m··arC.h-0: un tra.tamiento que garanti
c:e-_.el desrirrollo normal.de_! niño (P• ej. 1 en la fenilcetonuria,
_ leuCini:lsis, galactosemia, homocistenuria, histidinemia, etc.)¡
2). La detécci6n precoz en útero de anomalías graves del feto
que permita considerar la posibilidad de un o borto terapéuti
co lo mas temprano posible (p. ej., homocigosis para talase
mias y/o hemoglobinopatías, graves trastornos ncurofisiol6gi
cos, etc.); 3) La dctecci6n de los individuos mas suscepti
bles a sustancias dañinas, que sería la forma mas elevada
de la toxicología preventiva (p. cj., se ha sugerido que los
individuos con deficiencia de la antitripsina-alfa-1, que
predispone a transtornos pulmonares, deben ser excluidos de
trabajos que los expongan a polvos de asbesto o algod6n).
Sin embargo, la pregunta que surge ahora es lHasta d6nde llega
rá la "selccci6n" de los genes? Si bien es cierto que exis
ten, y se conocen, genes susceptibles de causar condiciones
adversas graves bien caracterizadas, también es cierto que
existen corrientes de pensadores, con muchos seguidores,
que estnn convencidos de que la herencia cromos6mica es el
factor más importante en el Coeficiente de Inteligencia (CI)
de los individuos. Conceptos como el anterior sugieren que
la caza de 11 genes deletereos 11 podría alcanzar proporciones
desmesuradas y llegar a ser absolutamente despiadada.
179
Por 'otro lado, los efecfos. sociÚes· del diagn6stico
genético no son despreciables •.. El· caso. del dfagn6stico precoz
de la ariemia falciforme es Útil ,para ilustrar el fen6meno
de la•dis¿rimina~i6n genéti2a. Eri l~s,Estados Unidos de Nor
teamérica'¡ donde uno de cada l} indivlduoa negros es portador
d.el gene. falciforme (42); se de'stinarori en 1972, 115 millones
de•· d6lares a la lucha coritra dicha ·:enfermedad. Como era 16gi
co, se hizo hincapié en el papel de ·la prevenci6n y en la
ne~·es:i:dad'~.'d~· .'Una bu~na ·.infoi-maci6n. Una vez advertidos, los " : : :. : -.ce _ -;~ -·--,-:-- ; O··-:.. _:: -
-p00,.r_ta·4~_re°'s_ :;d_el "mal" gen podrían actuar con mas cautela (pues-
--'--·o"to -,q_u~~::·da~'.-:P8:dre-s ··heterocigotos, pOr supuesto, corren el riesgo
~-:de·.~erier Un hijo homocigoto y, por tonto, enfermo).
--~~~r puras que fueran las intenciones iniciales, resul
pronto que no todas eran ventajas para los negros.
SC· produjo en primer lugar una "culpabilizaci6n". En efecto,
!Ocluso los sujetos sanos se sint icron "anorinal esu al saber
se portadores del gen defectuoso y sobre todo. fueron percibi
dos como tales en su vida social; pues era fácil confundir
un individuo "enfermo'' con otro ''portador de un gen pat6geno''.
El resultado concreto fue que hubo negros con buena salud
que tuvieron que pagar p6lizas de seguros mas caras. Seis
compañías de aviaci6n decidieron no transportar esta categoría
de negros (179). Fueron apareciendo poco a poco formas de
segregaci6n no previstas por los promotores del diagn6stico
genético. Uno de los efectos mas espectaculares se manifest6
en el campo del empleo. Con el transcurrir de los meses y
los años el problema de la adaptaci6n a las condiciones de
trabajo se plante6 en unas formas cada vez más precisas.
Aunque totalmente aptos, los heterocigotos están un poco an6mi
cos; parecia pues "racionnl 11 desde el punto de vista médico
el no admitirlos en trabajos que implicaran un contacto con
compuestos nitrogenados y aminados. Se desencaden6 asi un
proceso de selecci6n genética con consecuencias directas sobre
130
los empleos· de los negros. Aunque es imposible prever todas
las repercusiones del asunto es evidente que suscita problemas
tanto morales como juridicos. Asl. en 1980, un joven negro
peleb contra una reglamentacibn de la U.S. Air Force que le
prohibla emprender la carrera de piloto por ser portador del
gen de la anemia falciforme. Algunos meses mas tarde, lo
Air Force suprimi6 dicho reglamento, 'que habia estado vigen
te durante diez años (179).
De la misma , manera, surge la posi,bilidad de ,que, a
inÚviduos con genes que 'les predispon'en a la opad«ún 'de
transtornos e edades maduras (p. e/. 1 -.Corea 4e .Huntington,
canccr·, Alzheimer) se
educacibn ,del estado,
les nieguen beneficios- -~so~ial:eS··· ~~mo .
becas, etc. ~i~~ .. ~-.-~~-t~-éna~-1'¿-~J~·.'-:~·iabo-r:~l--es pee ializado por considerar
la inversi6n en su formaci6n.
que ·su
Con forme el diagnbstico genético 'deja el, can¡po,' de
lo hipotctico para pasar al de la ré'fllidad cotidiana. es C.1a~ó que las cuestiones planteadas anteriormente, y otras ·que _-8:.Cin'
no se han contemplado', deberán ser encarada$, y pronto.
VI. CONCLUSIONES
1. L_a~ tAcn.:1:.ca.s '.>.~-~~~ ::~·Se~-~··.~.i~-~-·, .. m_O~e~-~-~ar_: se_ revelan, hasta la fechá;· como.'1a '.m~todcilogía< m6s c~nfiable, segura
y precoz para el .iÍ:á~~6~ÚÚ de\85- he~ÓgloliiilopatÍas y .talase-
mias.- --i-·:: ·\;r:. -,.;:;" .·_·_-.'~:~_~, :;::,_._;_~~.~· ·:·-,,;.,·. ~
. ," :" /.:/ -:·;:;:_c.:.:·/·;:_.·.;,~--;_··.·. ·.:•;·'.~
La_• !'plicád6n ~ut.inaria y~inasiva de estas técnicas
._se -~~ _ ~.re~~-d-~}(~~~-~d~:~r-al ·\·reqÜérimicnto de ·material, equipo
y. re'8ctivos·::-co·stos0:S:·y-:··sofisticados, ~orno_ te_mbié'n de personal
al ta~en d~··. ~~-~·e'éi~11·z:~d~--.
,-3·~~Los~recientes avances en la estandarizaci6n comer
cial de estas técnicas así como el diseño y realizaci6n de
sondas génicas no radioactivas, adelantan la fecha en que
estas pruebas pasen a formar parte de la rutina en· laboratorios
clínicos de las zonas con al ta incidencia de hemoglobinopa
tías y talasemias.
4. Estas técnicas pueden facilitar el desarrollo
de modelos experimentales para el estudio, diagn6stico, prevcn
ci6n y tratamiento de patologías, con bases moleculares genéti
cas, comunes en nuestro país.
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