Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi...

Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996

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IJIYIVERSIDAD DE ALICANTE

INSTITUTO DE NEUROCIENCIASDErARTAMBNToS DE NnuRoeuÍurcl y FrsrolocÍ¡,

ESTUDTo FIINCToNAL DE LA ct,rcopRorpÍNl-p(TRANSpoRTADoR nB uúr,TrpLES r¿huncos)TRANSPLAhITADA A ovocrros DB xenopus laeuis.

José Antonb Ferragut Rodrfguez

Andr6 Morales CatMn

TESIS DOCTORAL

Jordi Aleu Vilafta

Alicante, Junio 196.



rNsrrruro oe uNrvEltstDAD DE AI-ICANTE.

NEURoCTENCÍAS 'fel.

96 / 565981 I Fa-\ 96 / 51)4 l i;1oE-030flo ALIcAN',rc

D. José Antonio Ferragut Rodríguez, Catedrático de Bioqqímica y Biología Molecular

de la Universidad de Alicante y D Andrés Morales Calderón. Profesor Titutar de

Fisiología de la Universidad de Alicante.

CERTIFICAN: Que el trabajo de investigación conducente a la obtención delgrado de Doctor titulado:

"Estudio funcional de la Glicoproteína-P (transportador de

múltiples fármacos) transplantada a ovocitos de Xenopus

Iaevis", del que es autor D. Jordi Alet¡ Vilalta" ha sidorediz¿do bajo su dirección en los Departamentos de

Neuroquímica y Fisiología de la Universidad de Alicante.

Para que conste y surta los efectos oportunos, firman el presente certificado en Alicante,

a29 de Abril de 1996.

: Jose Antonio Ferragut Rodríguez Fdo: Andrés Morales Calderón



Fe no és esperar,

fe no és somniar.

Fe es penosa lluita per l'awi i pel dema.

Fe és un cop de falg

fe és donar Ia ma.

Ia fe no és uiure d'utt record passat.

I{o esperem el blat

sense haver sembrat,

no eq)eÍem que I'arbre doni fruits sense podar-lo,

I'hem de treballar,

I'hem d'anar regant,

encaÍa que I'osada ens faci maL.

Fragment de:. Cal que neixin flors a cada instant (üuís lJach).



Als meus pares



AGRAIMENTS

En primer lloc vull expresar el meu agraiment al Dr. José Antonio Ferragut i

al Dr. Andrés Morales Calderón, directors d'aquesta Tesi Doctoral per I'ajuda

constant, I'ensenyanga, els consells i, sobretot la amistat. Sense ells no hauria estat

possible aquest treball.

De la mateixa manera, vull agrair en primer lloc la gran ajuda que he tingut en

tot moment dels meus companys de laboratori, des dels meus inicis amb Flori, Rosa i

Jaume fins avui en dia amb Isabel, Mavi, Beaúiz, María i Mariló, i la dels meus

companys del curs de doctorat i tota la gent que conforma els departaments deNeuroquímica i Fisiologia.

També vull agrair la col-laboració de la Dra. Carmen González i delDr.Valentín Ceña en la consecució del resultats de les mesures dels nivels de ATp enles cél-lules tumorals, i la dels Drs. Adolfo Campos i Javier Bauzá en els decitometria de fluix.

Un agraiment especial per al Jaume, per la Maite i per a tota la colla delbalneari, amb qui he compartit fabulosos Valldarques i nits inobtidables de disbauxa iavenfures, i per a tots els qui, d'una manera o una altra, m'han donat suport duranttots aquests anys.

Finalment, vull donar les grácies als meus pares, pel seu suport i per lapaciéncia que han tingut amb mi, i un record especial per als qui em van animar arealitzar aquesta tasca, tot i que avui ja no puc comptar amb la seva companyia(Grácies tatá i iaia).



ABREVIATT]RAS



Ahtcvínhttsc

'H-DNM: Daunomicina tritiada.

ABC: Familia de transportadores con sitio de unión de ATP.

ACh: Acetilcolina.

ADNc: Ácido desoxirribonucleíco complementario.

AMP: Adenosín monofosfato.

AMPq Adenosín monofosfato cíclico.

ARNc: Ácido ribonucleico complementarío.

ARNm: Ácido ribonucleico mensajero.

ATP: Adenosín trifosfato.

BSA: Albúmina sérica bovina.

CF"TR: Regulador Transmembrana de la Fibrosis Cística.

CIC-O: Canal de cloruro de Tbrpedo marmorata.

CHO: Células de Ovario de Hamster Chino.

DIDS: Ácido 4,4'-diisotiocianoestilbeno-2,2'-disulfónico.

DNM: Daunomicina.

DPBS: Tampón fosfato salino de Dulbecco.

EDTA: Ácido etilentriamino tetraacético.

fm: Fracción microsomal.

GTP: Guanosin trifosfato.

HBS: Tampón Hepes salino.

VV: Corriente/Voltaje.

IC5s: Concentración de fiírmaco que produce un 50Vo de la respuesta

máxima.

LL2IOz Línea celular linfocítica de ratón.

L1210/S: Sublínea parental sensible de la cepa Ll2t0.

Ll2l0l65z Sublínea derivada de las células L1210/S con fenotipo MDR, 65 veces

resistente al fármaco inductor DNM.

LL21:O1L60: Sublínea derivada de las células Ll2IOl65 con fenotipo MDR, 160

veces resistente al fármaco inductor DNM.

LDH: Enzima I¿ctato deshidrogenasa.

MDCK: Células Epiteliales de Hígado de Perro Madin-Darby.

6



MDR: Resistencia a múltiples fiírmacos.

nAChR: Receptor nicotínico de acetilcolina.

NAI)-: Nucleótido de Nicotinamida y Adenina.

NAIIH: Nucleótido de Nicotinamida y Adenina Reducido.

NPPB¡ Ácido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)-benzóico.

ORCC: Canales de cloruro que rectifican hacia afuera.

P-gp: Glicoproteína-P.

P1: Fracción insoluble obtenida tras la solubilización de la fracción

microsomal de las células L12101160 por Colato de sodio.

P388: Línea celular de neoplasma linfoíde

Pti88/S: Sublínea parental sensible de la cepa P388.

P388/20: Sublínea derivada de las células P388/S con fenotipo MDR, 20 veces

resistente al f,írmaco inductor DNM.

P388/100: Sublínea derivada de las células P388120 con fenotipo MDR, 100 veces

resistente al fármaco inductor DNM.

pHi: pH intracelular.

PMSF: Fluoruro de fenilmetanosulfonilo.

RH-45: Ringer de Rana hipotónico, 45 mM NaCl (95,5 mOsm).

RII-75: Ringer de Rana hipotónico 75 mM NaCl (150 mOsm).

RN: Ringer de Rana (224,5 mOsm).

RPMI 1640¿ Medio de cultivo celular Roswell Park Memorial Institute 1640.

RVD: Disminución regulada del volumen celular.

52: Fracción soluble resultante del tratamiento de la fracción Pl por

Zwittergent 3-12.

SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato

de sodio.

SDS: Dodecil sulfato de sodio.

SITS: Ácido 4-acetamido-4'-isotiocianoestilbeno-2.2'-disulfónico.

T¡o: Corriente de entrada de cloruro transitoria.

U.A.: Unidades arbitrarias.

YRP: Verapamil.



t

INDICE



ín¡lioe

1- Características generales de la Glicoproteína-P. 15

2- Implicaciones clínicas. . . l7

2.1- Farmacología en MDR. 19

INTRODUCCION

3- Bstudios funcionales de Ia P-gp.

3. 1- Actividad ATP-ásica.

3.2- Actividad de transporte de f¿írmacos.

3.2.I- Modelos de la actividad transportadora de la P-gp. . . . .

3,3- Actividad de canal de ATP.

3.4- Actividad de canal de cloruro.

3.4.1- Canales de cloruro activados por hipotonicidad.

3.4.2- Actividad de la P-gp como canal. de cloruro activado

por volumen. . .

OB.IETWOS

MATERIAT,ES Y I\,TÉTODOS

I- Metodología referente a los cultivos celulares.

1.- Mantenimiento de los cultivos celulares.

2- Extracción de células procedentes de ratón.

3- Ensayos de viabilidad

4- Preparación de las disoluciones de DNM.

5- Ensayos de citotoxicidad. .

6- Ensayos de acumulación de DNM.

II- Metodologfa referente a la incorporación funcional de proteínas en la

membrana de los ovocitos de knopus laevis.

1- Extracción y aislamiento de la membrana celular que contiene la

proteína de estudio

1-l Obtención de membranas que contienen el nAChR.

2- Purificación de la proteína

2.1- Membranas enriquecidas en nAChR: Extracción alcalina. .

Pásl 4

2t

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26

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40

40

4l



Ínüce

2.2- Purtficación del nAChR mediante cromatografía de afinidad 4l

2.3- Procedimiento de reconstitución. 42

2.4- Caracterización del nAChR purificado. 42

2.5- Determinación de proteína 43

3- Preparación de los ovocitos. . . 43

4- Microinyección. 44

5- Estudio funcional de la proteína insertada en la membrana del ovocito. 45

5.1-Registroselectrofisiológicos.. ". 46

5.2- Estudio de las corrientes activadas por acetilcolina. 49

5.3- Aplicaciones locales de acetilcolina. . 49

III- Metodologia referente al estudio funcional de la P,gp

1- Extracción y aislamiento de la membrana celular que contiene la P-gp

1.1- Obtención de la fracción microsomal

1.2- Determinación de proteína

1.3- Fraccíonamiento de proteína

1.4- Detección de la P-gp mediante Western-inmunotransferencia

2- Punftcación de la P-gp.

3- Estudio funcional de la P-gp insertada en la membrana del ovocito. .

3.1- Detección de la P-gp en la membrana de los ovocitos. . . . .

3.2- Medidas de actividad de hansporte de fármacos. . .

3.3- Medidas de osmolaridad.

3.4- Estudio de las corrientes activadas por hipotonicidad. . . . .

IV- Metodología ¡eferente al requerimiento energético de las células P388. . . .

1- Consumo de oxígeno. . .

2- Medidas de lactato

3- Medidas de ATP.

V- An¿flisis estadístrco.

CAPITUI,O I

¿PRESENTA LA P-gp ACTTVIDAD DE CANAL DE CLORURO?. . . . . .I- RESULTADOS.

1- Incorporación del nAChR en ovocitos de )bnopus laevis.

1.1- Respuesta nativa a ACh en ovocitos. . . .

1.2- Respuestas a ACh en ovocitos inyectados con membrana purificada

51

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55

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58

58

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60

6l

6263&&

10



fndícc

procedente de Tbrpedo marmorata 65

1.2.1- Incorporación del nAChR en la membrana del ovocito. . . 65

I.2.2- Curso temporal de la incorporación del nAChR en la

membrana de los ovocitos. 66

1.3- Respuestas a ACh en ovocitos inyectados con el nAChR purificado

y reconstituido. . 67

1.3.1- Incorporación del nAChR en la membrana del ovocito. . . 68

I.3.2- Dependencia de la variedad de los donadores sobre la

respuesta de las muestras.

I.3.3- Dependencia del volumen de la muestra inyectada sobre la

amplitud de la corriente. .

t.3.4- Curso temporal de la incorporación del nAChR en la

membrana de los ovocitos.

1.3.5- Propiedades de1canal iónico asociado al nAChR.

1.3.5.1- Curva dosis-respuesta. .

t.3.5.2- Potencial de reversión. . . .

I . 3. 5. 3- Relación corriente-voltaje.

t.3.5.4- Desensibilización del nAChR.

69

69

70

72

72

73

74

75

t.3.6- I-ocalización de los nAChRs en la membrana del ovocito. 77

L.3.6.1- Distribución de los nAChRs en la membrana del

ovocito. 77

1.3.6.2- Orientación de los nAChRs en la membrana del

ovocito. 78

2- Punficación de la P-gp. 80

2.1- lL Etapa de purificación de la P-gp. 80

2.2- 2a Etapa de purificación de la P-gp. 83

2.3- Balance Global de las dos etapas de purificación de la P-gp. . . . . 85

3- Medidas de Funcionalidad de la P-gp 87

3.1- Incorporación de la P-gp en Ia membrana de ovocitos. . . . 87

3.2- Actividad de la P-g¡l como transportador de fármacos . . . 88

4- Corrientes iónicas evocadas por medio hipotónico 90

4.1- Corriente nativa activada por hipotonicidad. 90

4.1.2- Características de la corriente 91

4.L.3- Efecto de fármacos antitumorales sobre la corriente. . . . 94

TI



índiap

4.1.4- Efecto de la desfoliculación por colagenasa sobre Ia

corriente. 95

4.2- Cornentes en ovocitos inyectados con la P-gp. 97

4.2.1- Características de la corriente 99

4.2.2- Efecto del donador en la aparición de la corriente. . . . . . 101

II- DISCUSIÓN. IO2

1- Inco¡poraciín funcional de proteínas erl la membrana del ovocito 103

1.1- Incorporación del nAChR en la membrana del ovocito. 104

I.2- Cancterísticas funcionales del nAChR incorporado. . . . 1.07

2- Purificación de la P-gp. 1@

3- Incorporación funcional de la P-gp en la membrana del ovocito. 111

3. 1- Incorporación de la P-gp en la membrana del ovocito 111

3.2- Actividad de la P-gp como transportador de fármacos . . . 111

4- Actividad de la P-gp como canal de cloruro

4.1- Corriente nativa de los ovocitos activada por volumen. . . Tl4

4.2- Actividad de canal de cloruro de los ovocitos inyectados

con la P-gp. 116

CAPITTJLO tr

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LAS CÉLIJLAS P388.

I- RESULTADOS.

1- Requerimientos energéticos de las células P388 en condiciones basales.

2- Requerimientos energéticos de las células P388 en presencia de DNM

y/o VRP.

II- DISCUSIÓN.

l- Niveles energéticos de las células P388/S.

2- Niveles energéticos de las células P388/100.

3- Niveles energéticos de las células P388/20.

CONCLUSIONES.

APENDICES.I- Electrodo de Clark.

II- Ovocitos de Xenopus laevis.

t20

tzlt22

t23

t27

r28

r28

130

133

t36

t37

t39

1392.1- Generalidades.

12



2.2- Morfología del folículo ovárico.

III- Receptor nicotínico de acetilcolina.

3.1- Descripción.

3.2- Aspectos funcionales.

IV- Principales propiedades de los detergentes empleados.

BTBLTOGRAIÍA.

l4l

r44

145t47

t49

150

13



INTRODUCCION



Infroútcción

1- CARACTERÍSTICAS GENE,RALES DE LA GLICOPROTEÍNA-P.

F"rgura 1: Esquema de la Glicoproteína-P.(De Karher y Ling (3))

Se denomina con el nombre de

Glicoproteína-P (P-gp) a una familia de

fosfoglicoproteínas que se sobreexpresan en

la membrana plasmática de las células que

presentan el fenotipo de resistencia a

múltiples fármacos (MDR).

Estas proteínas fueron descubiertas en

t976 por Ling y cols. en la membrana

plasmática de las células de ovario de hamster

Chino (CHO) que presentan un alto nivel de

resistencia a fármacos (1, 2). [r pusieron el

nombre de Glicoproteína-P, en virfud a su

implicación con la barrera de Permeabilidad a

una amplia variedad de fármacos que

acompaña al fenotipo MDR.

I¿ estructura primaria de la P-gp se

obtuvo a partir de las secuencias completas de los ADNc de los genes que la codifican

(genes mdr). I"a primera publicación de las secuencias de los ADNc de los genes mdr

de ratón (4) y humano (5), condujo a proponer el modelo de la P-gp recogido en la

Figura 2 (6). Se trata de una proteína de 1280 amino¿ícidos, con 12 segmentos

transmembrana (según postula el modelo), constituyendo dos miades homólogas,

cada una de las cuales contiene seis regiones transmembrana y un laza

intracitoplasmático que codifica una zona de unión de ATP. Las secuencias de las dos

mitades de la proteína tienen entre sí un 43Vo de homología, si bien la falta de

homología en los lugares de los intrones (7), sugiere que cada una de las dos mitades

de la molécula ha evolucionado de forma independiente o que han desarrollado un

mayor movimiento de intrones después de un evento de duplicación (8). El hecho de

presentar en su estructura 12 segmentos transmembrana dificulta enormemente su

$



Inlrnútrción

solubilización y es, junto a su condición de proteína minoritaria, causa de que aún no

haya podido ser purificada y reconstituida, a pesar de los enormes esfuerzos que los

diversos grupos de investigación esfín realizando para alcanzar este objetivo.

Figura 2: Modelo de la estructura de la P-gp basado en la secuencia de aminoácidos deducida a partir

del ADNc. I.os aminoácidos que son diferentes en las secuencias del gen humano y ratón están

representados en negro. Los sitios pot'enciales de gücosilación se señalan mediante espirales, y los sitios

de unión de ATP mediante círculos. (Adaptado de Gotüesman y Pastan (6))

I¿ P-gp pertenece a la superfamilia de los transportadores ABC, cuyas

iniciales provienen del inglés "ATP-binding-cassette", gus incluye una gran variedad

de transportadores de moléculas dependientes de ATP en procariotas y euc¿Iriotas.

Esta familia se caractÉrlza estructuralmente por ser un componente integral de

membrana con 10 ó 12 segmentos transmemb¡ana con estructura de cr-hélice y dos

regiones de unión de ATP (9). Dentro de esta gran familia de transportadores, se

encuentran el regulador de conductancia de la Fibrosis Cística (CFIR); la adenilato

ciclasa; transportadores bacterianos para azúcares, aminoácidos, peptidos, e iones

inorgrínicos (10); los transportadores Tap que transportan peptidos a través de la

membrana del retículo endoplasmático para la unión a moléculas MHC de clase I (11)

y una proteína de membrana en peroxisomas (12).

Desde el punto de vista funcional, son varias las observaciones experimentales

que apoyan el papel de la P-gp como transportador de eflujo activo de f,írmacos a

través de la membrana plasmática:

16



Inhoútcción

i) Su localización en la propia membrana plasmática (requisito imprescindible

para poder ser una bomba celular).

ii) El an¡flisis mutacional demuestra que modificaciones en aminoácidos

específicos alteran la especificidad de unión de la P-gp a determinados fármacos (13,

14, 15) e inhiben la hidrólisis de ATP (fenómeno necesario para que exista actividad

de eflujo).

iiÍ) Frírmacos e inhibidores del eflujo se Lrnen mediante fotoafinidad a la P-gp

(16, 17) .

iv) Anticuerpos monoclonales anti-P-gp inhiben el eflujo de fármacos (18, 19,

20).

vl Vesículas de membrana plasmática de células MDR que expresan la P-gp

muestran un mayor nivel de transporte que aquellas procedentes de las membranas de

las células sensibles (21).

vil Ia prueba crucial y determinante de la P-gp como transportador de

fármacos, fue la demostración de que la sóla transfección de células con el gen mdr,

resultaba suficiente para conferir el fenotipo MDR (22, 23).

El hecho de que la P-gp sea el transportador responsabte del eflujo activo de

fármacos antitumorales en células MDR y por tanto de la mayoría de los fracasos en

el tratamiento por quimioterapia, indica el grado de importancia que tendría el

conocer los mecanismos de actuación de la P-gp para el diseño de nuevos fármacos

antitumorales que no fuesen reconocidos como sustratos por la bomba.

2. IMPLICACIONES CLÍMCAS.

El fracaso del tratamiento de diversos tumores por quimioterapia se debefundamentalmente a la presencia o desarrollo de resistencia celular a los fármacos

empleados. Existen dos tipos de resistencia: la intrínseca y la adquirida. Se habla deresistencia intrínseca cuando los tumores no responden inicialmente a la terapia con elfármaco o combinación de fármacos, y de resistencia adquirida cuando los tumoresque inicialmente eran susceptibles al tratamiento por quimioterapia, adquieren conposterioridad resistencia al fármaco inductor. Dentro de la resistencia adquirida, se

I 7



presenta la resistencia celular a múltiples fármacos en el que las células tumoralespresentan resistencia cruzada a una gran variedad de agentes citotóxicos que no tienenuna estructura común. El fenómeno de MDR representa la mayor causa del fracaso dela curación del cáncer por quimioterapia. r,a búsqueda de las causas del fenotipoMDR ha ocupado la atención de numerosos grupos de investigadores en el campo delcáncer durante más de cuatro décadas.

A parrir de estudios molecula¡es realizados en el genoma de las células MDR,se observó la presencia de una pequeña familia de genes que codificaba la p-gp. Enhumanos, han sido identificados dos genes que codifican la p_gp: MDR1 (5) y MDR3(también denominado MDR2) (5,24,25); y en ratones tres: mdrl (o mdrlb), mdr3 (omdrla) y mdr2 (4, 26,27), siendo el producto del gen mdrl el objeto de estudio deesta Tesis.

un examen preliminar de más de 400 tipos de cánceres en humanosdemostraron una amplia expresión del gen MDR1 en los tumores con fenotiporesistente intúnseco o adquirido (28). Las P-gp codificadas por el gen humano MDR1o su coffespondiente en ratones, mdrl y mdr3, pueden transportar, desde el interiorde las células de mamífero al espacio extracelular, una gran variedad de fármacoshidrofóbicos (22,23,29,30). ra expresión intrínseca del gen MDR1 se encuenrra encánceres derivados de riñón, hígado, colon, páncreas y glándula adrenal (2g, 3r, 32,33, 34), üejidos que expresan de forma naturar el gen MDRI. Los niveres de ARNmdel gen MDRI también son elevados en tumores carcinoides y feocromocitomas, enleucemias agudas y crónicas en niños y adultos, linfomas del tipo no-Hodgkin,leucemia mieloide crónica en fase blástica, cáncer de pulmón de células no pequeñascon propiedades neuroendocrinas, neuroblastomas, sarcomas y astrocitom as (2g, 35,36, 37,39, 39, 40, 41., 42, 43, 44).

El incremento en la expresión del gen MDR1 es común en tumores tratadoscon quimioüerapia que han sufrido recaída durante el curso, o después del tratamiento.Ejemplo de ello lo constituye er cáncer de mama, cáncer de ovario, linfoma,leucemia, neuroblastoma, feocromocitoma, rabdomiosarcoma y mieloma múttipl e (2g,43' 44, 45, 46' 47, 48, 49, 50,51). En estos casos, se supone que un pequeñonúmero de células que expresaban MDRI al inicio de la terapia han sido seleccionadaspor el tratamiento y promueven la recaída, aunque también es posible que un efectodirecto del tratamiento hubiera inducido la expresión del gen MDRI.

I8



Inhnútcción

También se ha estudiado la distribución de la P-gp en diversos tejidos no

tumorales. Por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos monoclonales (52, 53, 54,

55), se han detectado niveles de P-gp procedente del gen MDR1 en la superficie

apical de células epiteliales en varios órganos secretores y en células endoteliales de

los capilares sanguíneos. Basado en estas zonas de localización de la P-gp en tejidos

de humanos y roedores, se ha propuesto que la principal función ñsiológica de la P-gp

procedente del gen MDR1 sea la defensa natural de las células frente a compuestos

xenobióticos. También se ha especulado con la posibilidad de que la P-gp esté

involucrada en el transporte de esteroides a través de la membrana plasmática (56, 57,

58, 59, 60, 61).

Las P-gp codificadas por el homólogo de MDR3 en ratón, mdr2, a diferencia

de las codificadas por MDRI, no presentan actividad de transporte de antineoplásicos

y recientemente se ha descubierto que esuín involucradas en el transporte de

fosfatidilcolina desde el hígado a la bilis (62).

2.1- FARMACOITOGÍA EN MDR.

El patrón usual de MDR incluye una gran variedad de agentes citotóxicos que

no tienen una estructura o una diana infracelular común. Existen docenas, y quizís

cientos, de productos hidrofóbicos naturales (derivados de plantas o microorganismos)

(63), anáJogos semisintéticos de tales productos natu¡ales y productos de síntesis

orgiínica (64) capac.es de inducir la aparición de MDR.

Entre los fármacos utilizados rutinariamente como agentes antitumorales,

destacan los pertenecientes a la familia de las antraciclinas. l¿s antraciclinas se

empz:rron a estudiar en los años 50 como antibióúcos pigmentados aislados a partir

de diferentes especies de hongos del género Streptomyces (65). Sin embargo, el uso

extensivo de antraciclinas como agentes antineoplásicos no comenzó hasta el

aislamiento de Daunomicina (DMvf) en 1963, procedente de dos especies de

Stteptomyces (5. coeroleorubidus y S. pucetius) (66). El descubrimiento de este

compuesto representó el comienzo del estudio de un nuevo tipo estructural dentro de

la familia de las antracicünas, ya que al confirmarse que tenía un efecto antineoplásico

potente, especialmente en el tratamiento de leucemias, condujo al desarrollo de

nuevos análogos semisintéticos. Asimismo, fue el desencadenante del estudio

T9



Infin¡hrcción

intensivo de los efectos biológicos de estos agentes en animales y humanos, en los que

se estudiaron los mecanismos de su acción en tejidos normales y malignos.

o o , o

ffi}'=, . . " ó 6 ¿ " i oaunor rc rnA

ñ= CX3

ADRI A I I IC INAR = C t t 2CH

. . oHCOOCH3

V l i lALAST l t tÁ R =CH¡v l t { C R l S T t t { A R : C H 3

. H

o¡

O-C{H¡tlo

R : C H 3 - V P - 1 6

"=4L vM-26

Bigura 3: Eskuchrra de algunos fármacos empleados en el tratamienüo de cáncer que conducen a la

adquisición del fenotipo MDR. (Corúesía de Clnaves (67))

El descubrimiento en 1982 por Tsuruo y cols. (68) de que el bloqueante de

canales de calcio verapamil (VRP), podía aumentar la üoxicidad de Vnca alcaloides en

células P388 resistentes, representa la primera de numerosas investigaciones cuyo

objetivo es el hallazgo de compuestos que sean capaces de revertir el fenotipo MDR.

Los quimiosensibilizadores descritos hasta el momento se pueden agrupar en seis

grandes categoías: Bloqueantes de canales de calcio; análogos de esteroides y

hormonas; análogos no citotóxicos de antraciclinas y Vnca alcaloides; compuestos

catiónicos hidrofóbicos, ciclosporinas y antagonistas de calmodulina.

Las distintas clases de fármacos con actividad quimiosensibilizadora parecen

actuar mediante diferentes mecanismos, pero comparten caracteísticas esfructurales

comunes. Los parámetros estructurales compartidos por diversos agenties reversores de

resistencia han sido estudiados en detalle pr T,amora y cols. (69).

c-oto

20



Inhnútcción

NC _ -CH rCl ' | 's l2

c H 3 o \,\¿k---T

-.--r-.-¿..". o. n.

c*,o\) én' (4o.",

V E R A P A M I L

CH3COO

C H s

Figura 4: Estructuras moleculares de algunos de los fármacos más comrinmente usados como agentes

reversores de resistencia in vitro (Cortesía de Cánaves (67)).

3- ESTUDIOS FLINCIONALES DE LA P-gp

Las funciones adscritas a la P-gp son tres: Ia de transportador de fármacos

antineoplásicos, la de canal de ATP y la de canal de cloruro. P-gp constituye la

primera entidad molecular que supuestamente presenta función de transportador y de

canal. Esta bifuncionalidad hace incrementar más, si cabe, el interés científico de su

O C H 2 C H 2 N ( C H 3 l z

N o e

C O O C H s

C H ¡

N I F E D I P I N ATAMOXIFEN

ouf NtoilvA

<-\(sY\t _ i l l t l-T* t t '

' Í t '

f t 'C H ¿I

IN \t l\ ru/

IC H ¡

T R I F L U O P E R A Z I N A

C H ¡

21



Intuvútcción

estudio, pero la asignación inequívoca de tal bifuncionalidad, así como su regulación,

requiere su purificación a homogeneidad y reconstitución funcional en sistemas

vesicula¡es apropiados. Hasta el momento se han utilizado diversas estrategias

encaminadas a la purificación de la P-gp, de entre las que destacan: la solubilización

parcial de P-gp por detergentes (70, 71, 72), inmunoprecipitación (73, 74), y uso de

distintos sistemas de purificación por cromatografía: de afinidad con lectinas (71, 75),

de intercambio iónico (71,76) y de inmunoafinidad (76,77).

Las distint¿s estrategias no han logrado la purificación a homogeneidad de la

P-gp, ya que cada una de ellas adolece de alguna limitación. Así, la solubilización por

detergentes implica purificaciones parciales de la P-gp. I-os métodos de

inmunoprecipitación conllevan la pérdida de la estructura espacial de la proteína con

la consiguiente alteración de la funcionalidad. I.os métodos cromatográficos de

afinidad con lectinas resultan de bajo rendimiento (75), mientras que las resinas de

intercambio iónico unen de manera casi irreversible a la P-gp, originando la

autoasociación de la misma (78).

El desarrollo de anticuerpos monoclonales específicos anti-P-gp (18, 79, 80,

81, 82, 83, 84, 85) ha abierto nuevas posibilidades de purificación de la proteína.

Asl, los métodos de inmunoafinidad estiín siendo desarrollados en cuanto ala ele¡;ción

de los detergentes a utilizar, disociación de la P-gp de los anticuerpos usados como

ligandos en cromatografía, etc.

Aunque aún no se ha conseguido la completa recnnstitución funcional de la

P-gp, si se ha conseguido cierto progreso en dos áreas: el estudio de la actividad

transportadora de f¿írmacos en vesículas aisladas y el estudio de su actividad

ATP-ásica.

3. 1- ACTMDAD ATP-ásica.

Poco después de la identificación de la P-gp, se descubrió que los inhibidores

metabólicos como cianuro de potasio, 2-4 dinitrofenol o azída de sodio,

incrementaban la acumulación intracelular de antineoplásicos (86), y dado que éstos

entran en las células por difusión pasiva, pareoía que la acción de los inhibidores

metabólicos implicaba un bloqueo del eflujo de los fármacos que era dependiente de

energía (87). Este hallazgo se consolidó con el clonaje de la P-gp confirmando la

, t



Intutútcción

existencia de dos lugares de unión de ATP en su estructura, además de presentar una

gran homología con la familia de proteínas transportadoras ABC (5, 88).

En 1988, Tsuruo y cols. (77) purificaron la P-gp mediante cromatografía de

inmunoafinidad empleando el anticuerpo monoclonal MRK-16 en presencia de1

detergente CHAPS y demostraron que dicha preparación presentaba trazas de

actividad ATP-ásica. l¿ actividad ATP-ásica de la P-gp se ha detectado

posteriormente mediante la sobreexpresión del producto del gen MDR1 en celulas de

insectos Sf9, presentando una alta actividad específica estimulada por la presencia de

f¿írmacos en la membrana plasmática (89, 90).

Recientemente, se ha demostrado la presencia de altos niveles de actividad

ATP-ásica en las fracciones que contienen la P-gp parcialmente purificada,

observiíndose que la presencia de ciertos sustratos de la bomba: daunomicina,

colchicina, progesterona, nifedipina, verapamil, eüc., producen un incremento de la

actividad ATP-ásica de las mismas (70,71,72).

3.2- ACTTVIDAD DE TRANSPORTE DE FÁRMACOS.

El transporte de fármacos antitumorales por la P-gp se ha demostrado,

mediante el empleo de vinblastina marcada con tritio, en vesículas de membrana

plasmática procedentes de células que sobreexpresan la P-gp (21, 91, 92). Se observóque el transporte no tenía lugar cuando las vesículas se preparaban a partir de las

membranas procedentes de células sensibles que no expresan la P-gp. Además, eltransporte dependía del constante suministro de una fuente de energía (o ATP, o un

sistema de regeneración de ATP o GTP) y era inhibido por agentes que revierten elfenotipo de MDR (verapamil, quinidina y diltiazen). Se pudo comprobar mediante

experimentos de fotomarcaje que estos reversores se unían a la P-gp, posiblemente

compartiendo el mismo sitio de unión que los fármacos antitumorales. En el caso deverapamil, los estudios realizados por Spoelstra y cols. sugieren que este fármaco

actúa como sustrato no competitivo de DNM para su transporte por la p-gp (93).

Estudios realizados en proteoliposomas que contienen la P-gp parcialmente

purifi.cada, han @ido demostrar conjuntamente la presencia de la actividadtransporiadora de fármacos y la actividad ATP-ásíca (72).

23



InAoútcción

3.2.1- Modelos de la actividad transportadora de la P-gp.

Se han propuesto varios modelos, todos especulativos, sobre los mecanismos

de acción de la actividad transportadora de la P-gp. Estos modelos, ilustrados en la

Figura 5, son: el "convencional" de bomba, el de aspiradora hidrofóbica, flipasa y el

de bomba de protones (6, 94).

El Modelo "convencionalr de bomba considera que los fármacos, vna vez

hubieran entrado en eI interior de la célula, se uniían a la porción citoplasmática de la

P-gp y serían expulsados al exterior celular a través de la P-gp mediante la hidrólisis

de ATP.

Este simple modelo presenta un problema conceptual: requiere que los

f¿írmacos citotóxicos se unan a la P-gp con mayor afinidad que a sus dianas

intracelulares. Este punto contrasta con el hecho de que estos fármacos han sido

seleccionados principalmente por su habilidad de unión a dianas intracelulares de

forma fuerte y selectiva (p.e. la citotoxicidad de colchicina y Vinca alcaloides es

como resultado de su fuerte unión a la tubulina). Además, puesto que la p-gp

reconoce un gran número de compuestos no relacionados entre sí que se unen a ella,

resulüa controvertido que su afinidad por cualquier compuesto individual sea muy alta.

El Modelo de aspiradora hidrofóbica, se basa en que los f¿írmacos seríandetectados y expulsados tan pronto como se hubieran incorporado a la membranaplasmática, explicando así el hecho de la disminucidn en la acumulación de f,írmacos

en el citosol. Este modelo se apoya fundamentalmente en:

i/ Datos cinéticos referentes al eflujo de fiírmacos (95, 96).

iilfa propiedad más importante de los fármacos a la hora de ser transportados

al exterior celular por la P-gp, es su índice de hidrofobicidad (69,97).

¡¡r) Rhodamina t23, una sonda fluorescente utilizada para marcar mitocondriasy que es un excelente sustrato para la P-gp (98), tiene diferenüe espectro de excitación

en células sensibles que en células resisüentes, siendo el espectro en las célulasresistentes más parecido al de la sonda en medio acuoso, sugiriendo que ésta ha sidoeüminada desde la membrana plasmática (99).

iu) l-a evidencia final de esüe modelo viene dada por la detección, mediante

experimentos de transferencia de energía, de la presencia de Adriamicina dentro de lasmembranas de las células sensibles, mientras que en las membranas de las célulasresistentes la antraciclina sólo se ha detectado asociada a la P-gp. Es decir, fármacos

24



Inütútcción

como Adriamicina son eliminados directamente de la membrana plasmática por la

P-gp (100).

Modelo de flipasa. Según este modelo, una molécula de fármaco situada en la

capa interna de la membrana plasmática, se uniría a la P-gp y sería llevada a la capalipídica externa (donde difundiría al exterior celular) o directamente al espacio

extracelular por la P-gp, mediante un cambio conformacional de la proteína (101).

Bomba de protones. En este modelo, la hidrólisis de ATP estaría asociada al

transporte de H* al exterior de la célula a través del transportador, lo que conllevaría

un movimiento pasivo de iones Cl-. Estos iones arrastrarían moléculas de H2O a supaso a través de la P-gp y las expulsarían al exterior celular. Los fármacos anfipáticosque estuvieran dentro de la membrana se verían arrastrados con el movimiento de las

moléculas de H2O (6). El bombeo de H+ al exterior celular a través de la P-gpproduciría, además, un aumento en el pHi observado en determinadas células confenotipo MDR al exterior celular (102, 103).

lspacio Exbacehrlr

i Mry,_-h31,.,l=?;¡t-rizliii.iiiifi

Citoplesma

figura 5: Modelos de l¿ actividad hansportadora de la P-gp: A) Convencional de bomba, B) Aspiradorahidrofóbica, C) Flipasa y D) Bomba de proúones.

B

D

,<



Inl¡othrcción

3.3. ACTIVIDAD DE CANAL DE ATP.

En 1993, Abraham y cols. (104) observaron en las células CHO que

sobreexpresan la P-gp, la existencia de un transporte de ATP al exterior celular cuya

actividad em proporcional a la concentración de la P-gp en la membrana plasmática.

l,os autores especularon con la posibilidad de una función autocrina del ATP

extracelular que se uniría a receptores purinérgicos (105) y propusieron que los

movimientos de ATP observados dentro del retículo endoplasmático (106) y en

vesículas secretoras (107) podrían deberse a la P-gp.

3.4- ACTIVIDAD DE CANAL DE CLORURO.

3.4.1- C_anales de cloruro activados por hipotonicidad.

I-a mayoúa de las células, si no todas, responden con una disminución

regulada de su volumen (RVD) ante un incremento en el volumen celular producido

por su exposición a un medio hipotónico. Esta disminución de volumen suele ser

mediada por la salida de iones K+ y Cl- del citoplasma a través de canales específicos,

acompañados por un flujo de moléculas de HzO. los principales mecanismos

involucrados en RVD se muestran en la Figura 6 y son (108, 109):

i) Cornente producida por un flujo de iones K+ ylo Cl-.

Se han descrito canales de cloruro que se activan por hinchamiento celular en

una gran variedad de tipos celulares: linfocitos, células cromafines, neuroblastomas,

fibroblastos, células endoüeliales, ovocitos de &nopus, etc., y se caracterizan por su

inactivación a potenciales muy positivos ()+10 mV) y presentan una moderada

rectificación hacia afuera (110, 1 ll, ll2, ll3, 174, 11.5, 116).

En ovocitos de Xenopus laeüs, sistema celular experimental utilizado en el

desarrollo de la Tesis que se presenta, Ackerman y cols. (115) han descrito una

corriente de cloruro activada por hrpotonicidad denominada fcl-swe', que no depende

de voltaje, no es calcio dependiente y no es sensible a ácido niflúmico, y por tanto, es

claramenüe distinta a las corrienües de cloruro activadas por calcio y ala de los canales

mecanosensoriales no selectivos. [¿ corriente presenta una inactivación dependiente

de tiempo que se hace más evidente a despolarizaciones mayores de +30 mV, y que

26



Inftoútcción

es sustancialmente acelerada con la disminución del pH extracelular. Presenüa una

dependencia extracelular de cloruro y se bloquea de forma reversible por dos

antagonistas de transporte aniónico no selectivos, SITS y DIDS, por un bloqueante

más selectivo de cloruro, NPPB, y es sensible a la presencia externa de cationes

lantánidos trivalentes y de nucleótidos.

ii) Cotransporte electricamente neutro de K+ y Ct-.

Este ha sido descrito en eritrocitos de varias especies, en células del tumor

ascítico de Ehrlich y en células epiteliales, y se caracteriza Wr el requerimiento

interdependiente de K* y Cl-, y porque su extrusión del citoplasma no altera de forma

detectable el potencial de membrana.

fii) Intercambio eléctricamente neutro de K+/H+ funcionalmente acoplado a

uno de C|/HCO3- produciendo una perdida de KCl sin cambio en el pH intracelular.

El intercambio de K*/H* acoplado a la regulación del volumen celular ha sido

estudiado extensivamente en eritrocitos de Amphiuma. El sistema es efe¡tivo siempreque exista en la célula sistemas que tamponen el pHi, tales como proteínas que fijan

H* o el intercambiador CI-/HCO"-.

Sistcma Conductivo

Sistcm¿s dc i¡fcrcanbio

Ftgura 6: Principales mecanismos implicados en la regulación de volumen (RVD). i) Corrientesproducidas por un flujo de K* y/o Cl, ii) Cotransporte electricamente neutro de K* y Cl- y iii)lntercasrbio electricamente neutro de K*/H* funcionalmente acoplado al intercambiador CI/HCOr'(Adaptado de Hoffinann y Simonsen (109).

Sistema de cotransporte

27



Inhutú.tcción

3.4.2- Actividad de canal dq cloruro activado por volumen de la P-sp.

I-a P-gp y el CFTR son proteínas pertenecientes a la misma superfamilia de

transportadores ABC. Mediante la expresión del gen CFTR en sistemas heterólogos y

por mutaciones en la proteína que alteraban la selectividad iónica de esos canales

(117,I18, 119), se ha podido determinar que el CFIR presenta actividad de canal de

cloruro dependiente de AMPc. I¿ activación del canal requiere de la hidrólisis de

nucleótidos trifosfato en al menos uno de los dos sitios de unión de ATP de dicha

proteína (120). Recientemente, se ha descrito por Reisin y cols. (121) que CFTR

presenta; además de la actividad de canal de cloruro, una actividad de canal de ATP,

proponiendo que el transporte de ATP por CFTR podría facilitar la conductancia de

Cf de CFTR, la activación de la conductancia de los canales de cloruro con

rectiñcación hacia afuera (ORCC) (122) y posiblemente, la regulación de otros

canales iónicos, como el de sodio, cuya actividad está alterada en la fibrosis cística

(r23).I¿ P-gp y el CFTR tienen una similitud t¿nto en su estructura como en su

secuencia (124, t25), y presenüan patrones complementarios de expresión en varios

tejidos epiteliales (126). El CFTR, como miembro de la superfamilia ABC, se

caractenz.a estructuralmente, al igual que la P-gp, por poseer 12 segmentos

transmembnna y dos dominios que contienen las secuencias de unión de ATP, pero a

diferencia de P-gp, CFTR posee entre los dos grupos de segmentos transmembrana un

dominio R con varios sitios de fosforilación. Los genes de la P-gp y del CFTR en el

intestino poseen patrones de expresión complementarios, el gen CI¡'[R estií expresado

en células de las criptas mientras que el gen MDR1 estií expresado en células del

epitelio más diferenciadas como son el villi (126). Curiosamente, en células HT-29

que noffnalmente expresan CFIR, cuando se cultivan en presencia de Colchicina se

les induce la expresión de la P-gp y se reduce la correspondiente a CFTR (127).

Fundamentándose en estos hechos experimentales, surgió la hipotesis de que la

P-gp presentara actividad de canal de cloruro, y en 1992, apareció publicado en

Ilature el primer trabajo en el que se asocia a la P-gp con una acúvidad de canal de

cloruro reguladora de volumen celular. I-os autores, Valverde y cols. (128),

registraron una corriente de cloruro activada en medio hipotónico en fibroblastos

MH3T3 transfectados de forma permanente con el clon MDR-I humano, cuya

magnitud se reducía drásticamente mediante el bloqueo de la expresión de la P-gp por

28



Inhtútcción

oligonucleótidos antisentido. Experimentos posteriores de transfección transitoria de la

P-gp con{irmaron los resultados anteriores, puesto que sólo se evocaba la corriente

activada por hipotonicidad en las células transfectadas. Por último, la farmacología de

la corriente era consistente con la observada para la P-gp: compuestos tales como

verapamil, didesoxoforscolina, nifedipina y quinidina, que inhiben el transporte de

fármacos a través de P-gp, también bloqueaban las corrientes de cloruro activadas por

volumen.

Posteriormente, Gill y cols. (129) propusieron un modelo bifuncional para la

P-gp, ba*índose en las siguientes observaciones experimentales:

i/ t¿ unión de ATP a la P-gp era suficiente para que se produjera actividad de

canal, mientras que el transporte de fármacos requería la hidrólisis de ATP por la

proteína.

ii) Ambas funciones, la de transportador y canal, se podían separar mediante

mutagénesis dirigida a los dominios de unión de ATP, donde la sustitución de un

residuo de lisina condujo a que la proteína perdiera su capacidad de hidrólisis de ATP,

generando una proteína que mantenía su actividad de canal de cloruro pero que había

perdido su actividad transportadora de fármacos.

iÍi) ta adición de sustratos de la P-gp en la pipea durante los registros

realizados en configuración de célula entera inhibían la activación del canal de

cloruro, revirtiéndose dicha inhibición mediante la empleo de anáiogos no

hidrolizables de ATP.

El modelo, ilustrado en la Figura 7, sugiere que una molécula de P-gp podría

funcionar, dependiendo de la osmolaridad del medio extracelular, como bomba

extrusora de fármacos o como canal, pero no simultáneamente. Acorde con el modelo

bomba-canal, la unión de sustrato conduciría a la molécula de P-gp a actuar como

bomba e inhibiría la activación del canal.

CHANNEHYPOIONIC¡IY

Pgp .ATP '

Figura 7: Esquema del modelo bifuncion¿l propues&o para la P-gp. (Ad¿ptado de Gill y cols. (129))

29



OB.IETIVOS



Obietiwts

Ler OB.IETIVO:

El primer y principal objetivo de esta Tesis es la dilucidación sobre la función

de canal de cloruro activado por hipotonicidad asignada a la P-gp. En el caso de que

la P-gp presente dicha actividad, se procederá a su estudio funcional, y se analizará el

efecto de bloqueantes de canales der.cloruro y sustratos de la bomba de P-gp sobre

dicha actividad.

JUSTIFICACIÓN

El hecho de que la P-gp pudiera presenüar actividad de canal de cloruro

ayudaría tanto a entender su papel fisiológico como al estudio de la regulación del

volumen celular, regulación de canales iónicos, mecanismos de MDR y al

conocimiento de una entidad molecular que presenta la doble función de canal y

transportador.

La asignación de la actividad de canal de cloruro a la P-gp se encuentra en la

actualidad muy controvertida ya que cuatro meses después de la asignación de dicha

actividad a la P-gp apareció publicado un trabajo realizado en células T84 en el que la

función transportadora de la P-gp era independiente de la regulación de volumen

celular (130), resultados que se contraponen a los descritos por Valverde y cols. (128)

y Gill y cols. (129).

DISENO EXPERIMENTAL

El estudio de la posible actividad de la P-gp como canal de cloruro se efectuará

empleando una metodología original que consiste en la incorporación funcional deproteínas en la membrana del ovocito. Esta metodología aporta la ventaja de poder

estudiar la protefna tal como fue sintetizada por la cétula origen, es decir, totalmente

31



Obietivns

procesada, en un sistema, el de los ovocitos de &nopus laevis, que tantas ventajas ha

aportado al estudio de proteínas expresadas mediante la inyección de su

correspondiente ARNm o ADNc.

Ins principales aspectos a estudiar son los siguientes:

1- Validación de la nueva metodología utilizando una proteína de membrana

modelo, el receptor nicotínico de acetilcolina procedente de la electroplaea de Tbryedo

marmorata.

2- Aplicación de la misma al estudio funcional de Ia P-gp. Este apartado

conlleva la previa experimentación relativa a:

2.1- Purificación de la P-gp procedente de células tumorales.

2.2- Incnrpración y deúección de la P-gp en la membrana del ovocito

después de su inyección en el ovocito.

2.3- Actividad de transporte de la P-gp incorporada en la membrana del

ovocito.

2.4- Actividad de canal de cloruro activada por hipotonicidad de la

P-gp en los ovocitos que han incorporado la proteína.

2.5- Estudio y modulación de la actividad de canal de cloruro asociada

a la P-gp.

2O OBJETIVO:

El segundo objetivo propuesto consiste en la monitorización de los niveles

energéticos de las células que sobreexpresan la P-gp cuando éstas se incuban en

presencia de un fiírmaco antineoplásico.

JUSTIFICACIÓN

I-os datos bioquímicos, farmacológicos y estructurales indican que la P-gp

presenta una actividad extrusora de fármacos citotóxicos (13, 18, 21, 22). Sin

embargo, se desconoce el mecanismo exacto de eliminación de fármacos por la P-gp

32



Obieüws

Y, Por tanto, la existencia de un acoplamiento entre la hidrólisis de ATP y la actividad

extrusora de fármacos. El estudio de los niveles energéticos permitirá profundizar en

el conocimiento del mecanismo de bombeo de los fármacos antineoplásicos.

DISENO EXPERIMENTAL

El estudio de los requerimientos energéticos de las células que sobreexpresan la

P-gp se rc,alizará mediante el anrflisis de los niveles de ATP, lactato y consumo de

oxígeno de las células P388/100, y sus valores se contrastar¿ín con 1os

correspondientes a una sublínea parental sensible (P388/S) y con otra sublínea

resistente (P388/20) que no sobreexpresa la P-gp. Inicialmente se estudiaran 1os

panímetros energéticos antes mencionandos en condiciones basales, para proceder

posteriormente a su estudio cuando las células se incuban en presencia de un inductor

de resistencia (DNM) y un reversor de la misma (VRP).

33



MATERIALES Y NIÉTOI}OS



Mabrials ytuIébdos

I.I\IETODOI,OGIA REFERENTE A I,1OS CULTTVOS CELULARES.

En este apartado se incluye la metodología empleada para la obtención y

mantenimiento de las distintas líneas celulares que se uttlizan como maierial biolégico

en los diversos estudios de esta Memoria.

1- MANTENIMM,NTO DE I,OS CT]LTIVOS CELTJLARES.

Las diversas sublíneas celulares, tanto de la cepa linfocítica de r, rtón LI2I0

como de la cepa de neoplasma linfoíde P388, también de ratón, se mantuvieron en

cultivo con medio RPMI 1640 (BioWhittaker) suplementado con 2 gl\ de

hidrógenocarbonato de sodio (Merck), LO% de suero fet¿l bovino (BioWhittaker), 10

¡rM B-mercaptoetanol (Bio-Rad), 2 mM Glutamina (Biowhittaker), 50 U/mlPenicilina y 50 p,glml Estreptomicina (BioWhittaker). El cultivo se mantuvo a 37oC

en atmósfera humidificada con el 5% de CO2 en una incubadora (B 5060 EK,Heraeus). Diariamente se diluyeron las células hasta una densidad de 3 x 10s

células/ml (131).

Las sublíneas resistentes de ambas cepas fueron desarrolladas en nuestro

laboratorio a parar de las líneas parentales Ll2l0 y P388 medianüe exposición aconcentraciones crecientes de la antraciclina Daunomicina (132). Ia estabilidad delfenotipo resistenúe se comprobó periódicamente y el cultivo se mantuvo homogéneomediante selección de la población celular por incubación a concentraciones deffrmaco apropiadas. I-a capacidad tumorigénica se preservó y comprobó mediantepases por ratón cadaZ ó 3 meses

2. EXTRACCIÓN DE CÉLULAS PROCEDENTES DE RATÓN.

Tanto para obtener células en grandes cantidades como pÍua comprobar el

carácter carcinogénico de las células LI2LA y P388, se inocularon 1 x 10ó células por

35



Materials v Méhtúx

ratón mediante inyección intraabdominal en ratones jóvenes DBAlzlI de 6-8 semanas

suministrados por Iffa Credo (Barcelona). En un periodo de 10-12 días, tras el

desarrollo de tumores ascíticos masivos, se procedió a sacrificar los ratones por

dislocación de las vértebras cervicales. El fluido ascítico se recogió mediante lavado

de la cavidad abdominal con 10-15 ml de disolución tampón DPBS sin calcio

(Biowhittaker) y 1 mM EDTA.

La disolución que contiene las células extraídas se centrifugó inmediaüamente a

405 x g durante 7 min a 20oC (rotor de brazo basculante Gh-3.7, Beckman,

la50 rpm). Las células sedimentadas se resuspendieron en el mismo tampón, se

aplicaron a un gradiente discontinuo de Ficoll tipo 400 [Lymphoprep (Nycomed

Pharma)J y se centrifugaron a 450 x g durante 25 min a 20oC. I¿ interfase Ficoll-

PBS se recogió y mediante dilución 1:1 con tampón PBS se centrifugó a 405 x g

durante 10 min. El sedimento de células se resuspendió en tampón PBS

determinándose el número de ellas así como su viabilidad.

3- ENSAYOS DE VIABILIDAD.

Previamente a cualquier ensayo celular, a fin de garantizar la buena

disponibilidad de las células se realizaron ensayos de viabilidad celular mediante el

método de exclusión con Azul Tripano (Kodak), colorante azul que permea hasta el

citoplasma en el caso de que la membrana plasmática esté dañaÁ:,, criterio utilizadopara considerar la célula como no viable.

4 PREPARACION DE LAS DISOLUCIONES DE DNM.

Los niveles de resistencia y de acumulación de fármacos de las células

tumorales, así como los estudios de funcionalidad de P-gp, se realizaron empleando

Daunomicina. [¿s disoluciones concentradas de este fiírmaco se prepararon a partir de

2-3 mg de DNM (Sigma) que se disolvieron en 5 ml de agua bidestilada.

Posteriormente se tomaron alícuotas de la disolución anterior, se diluyeron en metanol

(concentraciones inferiores a 10 ¡rM para evitar la autoasociación de las moléculas del

fármaco) y se determinó su concentración midiendo la absorbancia a 480 nm usando

36



úIaterials vMéhtdtx

como coeficiente de extinción molar 11500 M-tcm-r (133) en un espectrofotómetro

(DU 7500 Spectrophotometer, Beckman). I¿s disoluciones se guardaron en atmósfera

de nitrógeno a -20oC y periódicamente se comprobó su pureza mediante

aromatografía en capa fina en placas de silicagel 60, empleando como solvente de

desarrollo cloroformo: metanol : agua ( 80: 20: 3).

5- ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD.

Estos ensayos tienen como objetivo el determinar el grado de resistencia a

DNM de cada una de las sublíneas de las dos cepas celulares a través del panímetro

IC56, Que se corresponde con la concentración de fármaco que inhibe el crecimiento

celular en un 50V0.

L¿s células se sembraron en placas de24 pocillos a una densidad de 1 x 105 ó

2,5 x 105 células/ml, según se tratase de la cepa LI2L0 o P388, en presencia de

concentraciones crecientes de DNM (cada una de ellas por duplicado). I¿s placas se

incubaron durante 48 h a 37oC y 5% de CO2, determinándose por triplicado el

número de células por pocillo empleando un contador electrónico (Counter HF-24,

Ibercell), basado en cambios de conductividad, que lleva incorporada una sonda

apropiada para el tamaño de las células.

A partir de los datos obtenidos se construyeron las curvas de crecimiento frente

las distintas concentraciones de fármaco, obteniéndose los valores de IC56 y a partir de

ellos, el grado de resistencia definido como cociente entre IC5s de las células

resistentes e IC56 de las sensibles.

G ENSAYOS DE ACUMULACTÓN DE DNM.

Células procedentes de las líneas parentales sensibles o de las sublíneas

resistentes fueron centrifugadas durante 7 min a 405 x g y lavadas en una disolución

compuesta de: Hepes 10mM pH 7,2 NaCl 130 mM, KCI 5 mM, CaCl2 1,8 mM(HBS). Tras una nueva centrifugación a 405 x g durante 7 min, se resuspendieron en

la misma disolución y se diluyeron a una densidad final de 1 x 10ó células/ml

incubándose en presencia de DNM 3 pM, a20"C. Cuando las células fueron tratadas

37



Mabrtals v Mébús

con Verapamil (Sigma) 5 ¡rM, éste se adicionó 2 h antes de incubar con DNM. A

tiempos predeterminados se extrajeron alícuotas de la suspensión celular que se

analizaron por citometría de flujo en un instrumento Epics Profile I equipado con un

láser de argón y conectado con un sistema de adquisición de datos y análisis IBM.

Los datos analizados incluyen la cuantificación del- i) el número de células que

tienen un contenido significativo de DNM (se excluye la autofluorescencia y el

fármaco asociado a restos celulares), y ii) la intensidad media de fluorescencia que,

para una población dada, es proporcional a la concentraeiÍn de fármaco asociado a

cada célula. [,os histogramas resultantes corresponden a medidas realizadas en 10.000

células. Al final de los experimentos se analizaba la viabilidad celular (134).

38



LIaMda vMtutu

tr. METODOLOGÍA RETERENID A LA INCORPORACIÓN FUNCIONAL DEPROTEINAS EN LA MEMBRANA DE L¡OS OVOCITOS DE Xe¿ap¡s /aens.

I^as actividad funcional de la P-gp se estudió en ovocitos de Xenopus laeuis

mediante un método novedoso que consiste en la inyección de fracciones purificadas

de la proteína. I"as principales etapas metodológicas son:

L- Extracción y aislamiento de la membrana celular que conúene la proúeína de

estudio.

2. Purificación de la protefna.

3. Preparación de los ovocitos.

4- Microinyección.

5- Estudio funcional de la proteína insertada en la membrana del ovocito.

Ibtynfuratunn&=@ sTl* -/ffiJ

-ffi-

- Iromogenizacidu

r--j

ffiffil--"--> w

o*!.-

/ ['&i],/ Crcrnatografia

-/ deAfinidad

Centrifugacién

Diálisis

Frgura E: Esquema de las diversas etapas de la que consüa la nueva metodología.

39



Maerials vMébdos

Para la validación de esta nueva metodología, se partió del estudio funcional

del receptor nicotínico de acetilcolina, proteína mayoritaria en la electroplaca del

Tbtpedo marmorata y cuyas propiedades están perfectamente caracterizadas.

El esquema que resume las etapas correspondientes a la metodología empleada

se presenta en Ia Figura 8.

A continuación se detallan las diversas etapas recogidas en el esquema para el

estudio del receptor nicotínico de acetilcolina:

1. EXTRACCIÓN Y ATSLAMMNTO DE LA MEMBRANA CELTILAR QUECONTIENE LA PROTEÍNA NE ESTUDIO.

1.1- Obtención de membranas que contienen el nAChR.

Las membranas de receptor nicotínico de Acetilcolina (nAChR) se purificaron

a partir del tejido eléctrico de Tbrpedo marmorata. Ios peces fueron suministrados

por pescadores locales y guardados en el Acuario del Excelentísimo Ayuntamiento de

Santa Pola hasta el momento de su uso en el laboratorio.

Se homogenizaron 200 g de electroplaca de Tbrpedo marmorata en baño de

hielo en tampón de extracción Tris 10 mM pH 7,4 EDTA (sigma) 5 mM, PMSF(Sigma) 0,5 mM, Iodoacet¿mida (Sigma) 5mM. El homogeniz,ado se centrifugó 10

min a 1900 x g (rotor JA-14, Beckman, 3500 rpm). El sobrenadante se filtró a través

de seis capas de gasa y el filtrado se centrifugó 30 min a 70.000 x g (rotor 35,Beckman, 30.000 rpm). El sedimento (fracción de membranas crudas) se resuspendió

en 30 ml de tampón Tris 10 mM pH 7,4 NaCl 100 mM para su posterior purificación

(135). Todas las etapas se llevaron a cabo a 4oC.

2- PI.JRIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA.

La purificación del nAChR a partir de las membranas obtenidas en el apartado

anüerior comprende los siguientes puntos:

40



I|[abrials v Mé,lnúts

2.1"- Membranas enriquecidas en nAChR: Extraccién alcaüna.

I-a fracción de membrana cruda se diluyó con H2O hast¿ obtener A,6 mg/ml de

proteína total y se llevó a pH 11 con NaOH 0,1 M, agiuíndose durante 2 h a

temperatura ambiente. l¿s membranas alcalinizadas se sedimentaron a 70.000 x g

durante 30 min (rotor 35, Beckman, 30.000 rpm). El sobrenadante, que contiene la

mayor parte de las proteínas periféricas extraídas, se descartó y la parte superior del

sedimento (pequeño velo) se extrajo con 2 ml de tampón Hepes 10 mM pH 7,4

NaNO3 100 mM para eliminar la proteína periférica depositada (136). El resto del

sedimento corresponde a la fracción de membrana alcalina enriquecida en nAChR.

2.2- Purificación del nAChR mediante cromatoerafía de afrnidad.

[,a purificación de nAChR fue realizada por el grupo de1 Dr. Gonález*Ros y

se llevó a cabo ¡rcr cromatografía de afinidad con bromoacetilcolina (137).

I-a' fuacción de membranas crudas correspondiente a la preparación de 200 g de

electroplaca, se diluyóa2 mglml con tampón DB-l (Tris 10 mM pH7,4 NaCl 100

nM, EDTA 0,1 mM) y se solubilizó con Colato de sodio (Sigma) al L%

(concentración final). I.a, mez.cla se agitó suavemente durante 20 min y se centrifugó

durante 50 min a 70.000 x g (rotor 35, Beckman, 30.000 rpm). El sobrenadante

resultante se aplicó a una columna de Affigel 10 (ó a01) (Bio-Rad) derivatizado y

equilibrado con tampón DB-z (DB-1 + colato l%), manteniendo un flujo constante

de 1-1,5 ml/min.

Tras el lavado de la columna con 100 ml de tampón DB-3 (DB-2 suplementado

con 1 mg/ml de lípidos de asolectina), la elución del receptor se llevó a cabo con 50

ml de tampón DB-4 (DB-3 + carbamilcolina (Aldrich) 10 mM), recogiendo

fracciones de 1,5 ml y uniendo aquellas con mayor concentración de proteína. Ia

concentración de proteína eluída se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm (1

U.A. corresponde aproximadamente a 0,6 mg/ml de proúefna (137)). El rendimiento

normal obtenido es de unos 12,5 mg de proteína purificada por 100 g de tejido

aproximadamente.

41



Mabrials vMéftiúts

2.3- kocedimiento de reconstitucién

Ia reconstitución de nAChR se reaJiza por eliminación progresiva de

detergente por diálisis según los métodos descritos en (138, 139).

Inicialmente se prepararon las vesículas preformadas de asolectina empleadas

en la reconstitución del nAChR. Para ello, lípidos de asolectina de soja (tipo II de

Sigma) se disolvieron en cloroformo, se secaron en rotavapor y se sometieron a vacío

durante 3 h para eliminar el solvente orgánico. ta película seca de los lípidos, se

resuspendió en tampón Tris 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM y se solubilizó con CHAPS

(Sigma) al 2-3Vo (concentración final). Mediante ciclos de agitación, sonicación en

baño (15 min) y sonicación con sonda de titanio (3 ciclos de 3 min) alternados con

enfriamiento en baño de hielo, se obtuvo un solubilirado transparente compuesüo

básicamente de micelas mixtas. Estas micelas se dializaron extensivamente obteniendo

vesículas útiles para reconstitución (140), que se dividieron en alícuotas y se

congelaron a -40oC.

El nAChR purificado, recién eluido de la columna, se meznló con lípidos de

asolectina o con vesículas de asolectina preformadas según apartado anterior, enpresencia de Colato de sodio al 4%. Estas mezclas solubilizadas de lípido y proüelna

se dializa¡on exhaustivamente frente a Tris 10 mM pH 7,4 NaCl 100 mM, EDTA

0,1 mM, NaN¡ 0,02% durante 36 h con 3 cambios de tampón (3 x 1 l). A

continuación se dializú frente Hepes 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM duranüe 8 h en

condiciones de esterilidad. I-as vesículas resultantes son unilamelares y contienen

incorporado el nAChR con los sitios de unión de cr-Bungarotoxina orientados en m¿ís

de un W% hacía el medio extravesicular (1a1). l¿ muestra reconstituida se dividió en

alícuotas las cuales se utilizaron inmediatamente para inyectar en ovocitos o se

congelaron a -198oC en presencia de trehalosa (Merck) (5mg de trehalosa/mg

proteína).

2.4- Caracterización del nAChR purificado.

Una cuantiñcación más rigurosa del nAChR purificado se realizó mediante

solubilización de la muestra con SDS (Serva) tVo y post€rior precipitación con 10

volúmenes de la mez*la acetona:trietilamina:ácido acético 95:5:5 (v:v), formándose

42



Mabrials vMfufus

un par iónico que permite que la proteína precipite quedando en disolución el

detergente y la asolectina (142). Tras centrifugar a 3500 rpm durante 10 min, el

precipitado se lavó con acetona para eliminar la trietilamina. Posteriormente la

acetona se eliminó mediante centrifugación a vacío. La proteína precipitada se

resuspendió en SDS I% y se determinó su concentración mediante el método descrito

por Peterson (143).

El perfil electroforético (en medio reductor) del nAChR purificado mostraba

las cuatro bandas prominentes coffespondientes a las subunidades del receptor,

apareciendo un componente minorit¿rio, de alto peso molecular, adscrito a un canal

de cloruro que copurifica c¡n el mismo (L42).

2.5- Defenninacién de proteftra.

I¿ concentración de protelna de las diversas fracciones de membrana se realizó

según el método descrito por [,owry y cols. (144), con la leve modificación de tener

que centrifugar las muestras para eliminar el detergente (Tritón X-100) utilizado en Ia

solubilización de las mismas, puesto que éste interfiere parcialmente con el reactivo de

Folin (Merck).

3. PREPARACIÓN DE LOS OVOCITOS.

Las hembras del sapo sudafricano Xenopus laeuiso suministrados por Blades

Biological en Edenbridge (Kent, G. B.) se anestesiaron mediante inmersión en un

baño de hielo durante unos 30 min. A continuación, y, en condiciones de asepsia,

mediante una incision abdominal se les extraía parte del tejido ovárico. Tras finalizar

se les cosía la herida y se les despertaba de la anestesia mediante la atemperación del

agua de lia cubet¿. El mismo animal podía volverse a utiliz:rr como donador enperfectas condiciones al cabo de varias semanas. El tejido ovárico extraído se

colocaba en una placa Petri que contenía una disolución modificada de Barth (145):

Hepes 10 mM pH 7,4 NaCl 88 mM, KCI I mM, NaHCO3 2,4 m}.4, MgSOr

0,82 mM, ca(No3)2 0,33 mM, caCl2 0,41 mM, suplementado con Gentamicina

43



l|[abrials v Méfrtdos

(Sigma) 0,1 mg/ml o con Penicilina 100 U.I. y Estreptomicina (Sigma) 0,1 mg/ml

para limitar el crecimiento de bacterias.

Una vez en disolución modificada de Barth los folículos ováricos en estadios V

y VI de Dumont (146) se fueron separando manualmente con ayuda de unas pinz.as

finas de relojero. Se seleccionaron los folículos que se hallaban en buenas condiciones

y se mantuvieron en una incubadora (Hotcold-S, Selecta) a l6-l8oC, en viales de

centelleo de 5 ml que contenían disolución de Barth estéril con antibióticos.

En la mayoría de los casos, y salvo que se especifique lo contrario, los

ovocitos utilizados en el registro fueron separados enzimátícamente del resto de las

capas de células foliculares, con objeto de facilitar la introducción de microelectrodos

para el registro electrofisiológico y la microinyección de distintas sustancias en el

interior del ovocito. Para ello, los folfculos previamente seleccionados se traspasaron

a viales de centelleo que conüenían 0,8 ml de una disolución de colagenasa (tipo IA,

Sigma) a una concentración final de 0,5 mg/ml disuelta en una disolución de

composicíón: Hepes 5 mM pH 7,0 NaCl 115 mM, KCI 2 mM y CaCl2 1,8 mM

(Ringer). Durante el tratamiento, los viales fueron sometidos a una suave agitación

(agitador SBS, 5 rpm) a temperatura ambienúe durante aproximadamente 50 min. Tras

ese tiempo, con la ayuda de un vorúex, se desprendieron las diversas envolturas de los

ovocitos (147, 148). Posteriormente, los foliculos se lavaron 3 veces con disolución

Ringer y se guardaron en viales nuevos con disolución modificada de Barth estéril a

16oC. En algunas ocasiones el tratamiento no fue del todo efectivo y los folículos

quedaron apatentemente intactos. En esos c¿lsos, con la ayuda de una lupa de

disección (Nikon) se pudieron desprender fácilmente con unas pinzas de relojero la

capa epitelial y con ella la teca del folículo (149).

+ MICROINYECCIÓN.

Mediante la ayuda de un nanoinyector electrónico (A203XVZ, World

Precision Instruments), se inyectaron 50 ó 100 nl de muestra (1 ó 2 pulsos,

respectivamente) en cada uno de los ovocitos. El equipo de microinyección se

completa con una lupa de disección (Nikon) y una camarita para inyectar de diseño no

comercial.

44



Para la inyección se utilizaron capilares de vidrio específicos para elnanoinyector convertidos en micropipetas (punta de 20-30 ¡^rm de Aext.) mediante unestirador de microelectrodos (PUL-I, world precision Instruments).

Figura 9: Esquema del sistema de microinyección en ovociüos. De izquierda a derecha se prese,ntan lafuenúe de luz fría, la camarita de inyección y la lupa binocular, y el nanoinyecüor elechónico.

La inyección se efectuó en el hemisferio vegetal, normalmente cerca delecuador del ovocito, evitando así inyectar en el núcleo de la célula localizado en elpolo animal. Al final de la inyección se desecharon aquellos ovocitos que no sellaronbien tras la inyección.

Cuando la microinyección se realiz¡ con muestras previamente congeladas, seefectuó una descongelación nlpida y las muestras se homogenizaron mediante 3 pasesa través de una jeringuilla tipo t{amilton de 100 pl.

5. ESTUDIO FTINCIONAL DE LA PROIE,ÍNA INSERTADA EN LAMEMBRANA DEL OVOCITO.

Para los estudios electrofisiológicos, los ovocitos se colocaron en una camaritade registro de metacrilato en donde podfan ser contínuamente superfundidos, bien condisolución Ringer de rana u otras disoluciones. La camarita de registro de formahusifome y 150 y.l de capacidad total tiene situado en su centro una pequeña base deacero inoxidable con forma de cono invertido (Aext : 1,2 mm) para que el ovocito,al ser una célula esférica, quede fijo.

45



Mabrials -vMéfttfus

En un lado de la camarita se sitúa la entrada de las disoluciones, donde un

sistema de doble via permite superfundir contínuamente al ovocito con dos tipos de

disoluciones distintas sin que ello implique una mezcla de ambas. I-a disolución llega

a la camarita por gravedad desde los reservorios situados a una altura de 1 m sobre el

lugar de registro a través de tubos de Tygon y la velocidad de superfusión se controla

mediante unos reguladores de flujo (Dial-A-Flo, Abbottt). En la entrada de la

camarita, según las condiciones del laboratorio, se conectó una célula de Peltier que

calentaba o enfriaba las disoluciones hasta llegar a la temperatura deseada.

En el otro lado de la camarita, la disolucién era extraída mediante succión a

través de un capilar de vidrio unido por un tubo de Tygon a una red de vacío a través

de dos kitasatos.

La longitud de los tubos de entrada y salida de las disoluciones de la camarita

se miniminiza en lo posible para amofiguar los movimientos y vibraciones

reduciéndose así la posibilidad de introducir artefactos en el registro. Adicionalmente,

la camarit¿ de registro esuí fijada a la base de una lupa convencional (Nikon) colocada

sobre una mesa antivibratoria para evitar que posibles vibraciones dañaran el ovocitoduranüe el registro electrofisiológico.

Una vez preparada la camarita para el registro, se transfería el ovocito desde elvial de incubación a la base metálica de fijación mediante una pipeta Pasteur,colocándose en la posición deseada mediante una varilla de vidrio.

5.1- Registros electrofuiológicos.

I-os registros electrofisiológicos se realizaron mediante la técnica de fijación devoltaje (voltage-clamp) con dos microelectrodos (Figura 10). En esta té,cnica uno delos electrodos, electrodo de voltaje, se introduce en el ovocito y se conecta a unpreamplificador (VF-180, Biologic) y se utiliza para medir la diferencia de potencial

entre el interior del ovocito y la disolución de la camarita de registro que lo rodea, esdecir, el potencial de membrana. El otro elechodo, electrodo de corriente, seintroduce tambien en el ovociüo y se utiliza para pasar corriente. El tercer elementofundamental en el sistema es un amplificador diferenciat (CA-100, Biologic) utilizadopara comparar el voltaje que se quiere mantener (potencial comando) y el que posee elovocito; la diferencia, güo es el potencial de error, es la que va a hacer que el

6



lVlabrials vMé&túts

amplificador de corriente (VF-1800, Biologic) permita el paso, en función de |aganancia, de una determinada corriente al ovocito hasta que la señal de error sea cero.

amplificador

electrodo de

registo devoltaje

ueregisto devoltaje

Figura 10: Esquema elechónico del sistema de regisho en "voltage-clampn con dos microelectrodos enovocitos.

Se utilizaron electrodos de Ag/AgCl para establecer el contacto eléctrico entrela tierra y los microelectrodos con la disolución salina de la cámara. Los electrodos detierra y del baño fueron de plata clorurada de lmm de sección con su extremo finalaplastado para aumentar la superficie de contacto. La disolución de la camarita seconectó con los electrodos de tierra y baño a través de un capilar de vidrio relleno conuna disolución de ag¿uosa al 2Vo en Ringer (puente de ágar); de esta forma lacomposición iónica del baño pudo cambiarse sin apenas modificaciones en el potencial

de referencia.

[.os microelectrodos fueron preparados por medio de un estirador demicroelectrodos utilizando vidrio de borosiliato de ñext : 1,5 mm y con unfilamento interno para facilitar su posterior llenado (World Precision Instruments). Elelectrodo utilizado para medir voltaje se rellenó con una disolución de KCI 3M y elutilizado para inyectar corriente se llenó con una disolución de CH3COOK 3M, yaque este ión permite pasar mejor grandes corrientes.

electodocorriente

ganancia del amplificador

47



MabríalsyMébdos

[.a resistencia de los microelectrodos utilizados fue baja (de 2 a 5 MO para el

electrodo de voltaje y de 0,5 a 3 MQ para el de corriente). Para ello, se rompieron laspuntas de los electrodos rozánzolas ligeramente con la base de la camarita de registro

mientras se medía la resistencia. Resulta conveniente utilizar electrodos de baja

resistencia porque así se minimiza el ruido eléctrico introducido en el amplificador de

voltaje y se pueden inyectar grandes corrientes (hasta decenas de microamperios). En

Ia ptáctica, el tamaño de la punta de la pipeta y por tanto la resistencia del

microelectrodo, fue un compromiso entre una mejora de las características del registro

y el daño producido en la membrana del ovocito al introducir la punta delmicroelecffodo. Ovocitos obtenidos de determinados knopus resultaron más frágilesque los obtenidos de otros donadores, tolerando peor la introducción de los

electrodos. Normalmente el potencial de membrana y la resistencia de entrada

disminuyeron tras la introducción de los electrodos en el ovocito, por lo que antes deiniciar los registros se dejó un tiempo de recuperación, en general de unos pocos

minutos hasta que se consiguió una línea de registro estable (147). En algunosovocitos al introducir los electrodos se evocaron oscilaciones espontáneas que

desaparecieron al cabo de unos minutos.

En general, y a menos que se indique 1o contrario, el potencial de fijación fuede -60 mV, por ser en el ovocito, un valor muy alejado del potencial de equilibrio decualquiera de los iones presentes en el medio de superfusión.

Para analizar la dependencia de las corrientes objeto de estudio frente alvoltaje, se dieron pulsos despolarizantes o hiperpolarizantes respecto al potencial defijación mediante el empleo de un generador de pulsos programable con salida aislada(SMP-310, Biologic) conectado con el amplificador de fijación de voltaje (Figura 10).

La señal de corriente se filtró a 30-500 Hz mediante un filtro pasabajos tipoButterworth de 4 polos (VBF3, Kemo) y se monítonzí simultáneamente con elpotencial de membrana en un registrador de plumillas, un osciloscopio digital(Nicoler3l0, Nicolet) y, mediante una tarjeta analógico-digiral (DT-2801A, DataTraslation), en un ordenador PC-compatible (procesador 80486DX2) para sualmacenaje y posterior anrílisis mediante el uso de distintos programas informáticos:MCOLET ofrecido por Rico Miledi (University of California, Irvine), VCANofrecido por J. Dempster (University of Stathclyde, GB), Sigma plot (Jandel

Scientific). En todos los casos, la frecuencia de muestreo utilizada fue el doble de lafrecuencia máxima contenida en la señal (frecuencia de firtrado).

I



Mabrials vfuIéfrtúx

Por convenio, se han considerado como comientes de salida ("outward")

aquellas debidas a la salida de cationes del ovocito y se representan como deflexiones

hacia arriba; mientras que las corrientes de entrada ("inward") son las producidas por

la entrada de cationes al ovocito y se muestran como deflexiones hacia abajo.

5.2- Estudio de las corrientes activadas por acetilcolina.

Se estudiaron las corrientes evocadas por la aplicación de acetilcolina (ACh)

(Sigma) tanto en ovocitos sin inyectar como en ovocitos inyectados con membranapurificada procedente de Tbrpedo o con el nAChR reconstituido en vesículas lipídicas

de asolectina.

Los registros de las corrientes se realizaron entre 4 y ñ h después de haber

teahzada la inyección. Durante el registro los ovocitos se superfundieron

continuamente con disolución Ringer a la que se le añadió sulfato de atropina (Fluka)

0,5 ¡,rM para evitar las respuestas muscarínicas que presentan ciertos donadores. [¿

concentración de ACh aplicada osciló entre 1 ¡¿M y 1 mM. I¿ velocidad de

superfusión fue generalmenüe de 3 mUmin.

5.3- Aplicaciones locales de acetilcoHna.

En algunos experimentos se realizaron aplicaciones locales de ACh, mediantemicropipetas de vidrio con ACh lmM conectadas a un sistema de inyección neumático(Picospritzer, General Valve Co.). Ia aplicación se reabzó medianüe pulsos de unos 2x 105 Pa durante 40 ms.

Las aplicaciones extracelulares se realizaban mediante la aproximación de laplpetla a la superficie del ovocito hasta que se podía observar una pe4ueña

deformación en su superficie a través de la lupa (40 aumentos), entonces se alejaba elmicroelectrodo aproximadamenüe 10 p,m y se apücaba el agonista.

En las aplicaciones intracelulares, la pipeta se acercaba hasta la superficie ycon sumo cuidado se inhoducía en el interior, muy cerca de la superficie del ovocito.Tras esperar el sello de la pipeta se aplicaba la disotución de ACh. Posteriormente se

49



Wbriales v Mébdos

sacaba la pipeta del interior del ovocito y se comprobaba que la pipeta no se había

obstruído.

En la siguiente figura se esquematizan dichas aplicaciones.

APLICACION EXTRACELULAR APLICACION INTRACELULAR

Hgura 11: Esquema representativo de las aplicaciones locales de ACh en la membrana del ovociúo en elespacio extracelular y en el espacio intracelular. El tamaño del ovociüo con respecüo a la pipeta no estárepresentado a escala.

50



Maferíalx v Mé.tn¡*x

III- METODOLOGIA REFERENTE AL ESTUDIO FTINCIONAL DE LA P-gp.

Una vez demostrada la validez del nuevo método de estudio en nAChR, se

procedió al estudio funcional de P-gp haciendo uso de una estrategia experimental

similar. las etapas de dicho estudio se corresponden con:

1. EXTRACCIÓN Y AISLAMM,NTO DE LA MEMBRANA CELULAR QTIECONTIENE LA P-gp.

1.1- Obtención de la fracción microsomal.

Para la obtención de la fracción microsomal de las células LLZIA se utilizaron

indistintamente células propagadas en cultivo o en ratonesDBN21J (150).

Las células se resuspendieron en tampón de extracción de composición: Tris-

HCI 10 mM pH 7,4 Nacl 200 mM, EDTA 5 mM, PMSF 0,5 mM e Iodoaceramina

5mM y se lisaron en una bomba de cavitación gaseosa tipo Parr (Parr Instr.),

mediante nitrógeno a 5,5 x 106 Pa durante 60 min.

La suspensión resultante se procesó en un homogenizador de cuchillas Polytron

(Kynematica), durante 3 periodos de 90 s al70% de potencia. Este homogenizado se

sometió a un proceso de centrifugación diferencial:

i) A 450 x g durante 5 min en una centrífuga refrigerada de mesa (GS-6R,

Beckman, 2.000 rpm.) a fin de sedimentar células enteras y fracción nuclear.

ü) El sobrenadante de la fracción anterior se centrifugó a 25.N0 x g duranúe

20 min (rotor 35, Beckman, 17900 rpm.).

iii) EI nuevo sobrenadante se sometió a una tercera centrifugación a 200.000 xg durante 60 min (rotor TFT-70.38, Kontron, 50.000 rpm).

El sedimento obtenido en esta centrifugación representa la fracción microsomal

(membrana plasmática, fragmentos de retículos endoplasmático liso y rugoso, y

complejo de Golgi básicamente). Dicho sedimento se resuspendió en tampón de

51



fuIabriala vMéhtúts

composición adecuada, dependiendo del tipo de proceso a que iba a ser sometido

posteriormente, y se homogenizó mediante un homogenizador tipo Potüer-Elvehem.

1.2- Determinacién de proteÍna.

El contenido en proteína de las distint¿s muestras se determinó mediante el

método de Bradford (151). Este método se basa en el desplazamiento del máximo de

absorbancia del colorante Azul Coomassie Brillanúe G-250 desde 465 nm a 595 nm

cuando forma complejos con proteínas. Como patrón de proteínas se utilizó Gamma

Globulina (Bio-Rad).

1.3- Fraccionamiento de proteína.

El fraccionamiento del componente proteíco de la fracción microsomal se

realizó por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-

PAGE) según el método descrito por Laemmli (152), empleando un equipo de

electroforesis Miniprotean (Bio-Rad). I-as muestras se desnaturalizaron mediante la

adición de tampón de desnaturalización Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8 glicerol 5%, SDS

2%, azul de bromofenol 0,005% en condiciones reductoras (p-mercaptoetanol 5%).

El grado de reticulación fue de 7,5Vo en el gel separador y del 4Vo en el concentrador.

[¿ electroforesis se realizó empleando un voltaje constante de 80 V para el gel

concentrador y 180 V para el gel separador.

Para el revelado de las bandas de proteína, los geles se tiñieron con una

disolución de Azul de Coomassie R-250 (metanol 40%, ácido acético l0%, AzuI de

Coomassie R-250 A,LTo). I"a destinción se realizo mediante repetidos lavados con

metanol 4A%, ácido ac'étíco 7 Vo .

1.4- Dgtección de la P-gp mediante Western-Inmunotransferencia.

El análisis de la presencia de la P-gp se llevó a cabo por western-

inmunotransferencia mediante el método descrito por Towbin y cols. (153) empleando

52



Mahrínlx vMé.lnúts

el anticuerpo monoclonal específico C-2L9 (Centocor Inc.) que reconoce un epítopo

interno de la P-gp cercano a la zona de unión de ATP (79). Finalizada la

electroforesis, las proteínas se transfirieron a soportes de nitrocelulosa mediante el

método de elución electroforética, que consiste en sumergir el conjunto gel-membrana

en una cubeta llena con tampón de transferencia Tris 50 mM, Glicina 380 mM, SDS

0,1% y Metanol 20%. La transferencia se realizó duranüe 3,5 h a 4oC y a corriente

constante de 150 mA.

Posteriormente la membrana se bloqueó con un tampón compuesto de DPBS

(Biowhittaker), Tween-2O (Bio-Rad) O,lVo,leche desnatada en polvo 0,5% y azida de

sodio 0,01% durante t h a temperatura ambiente, para evitar la unión del anticue{po a

la superficie de la membrana. Tras el bloqueo, la membrana se lavó con DPBS,

Tween-20 0,1%, azida de sodio 0,0I% y seguidamente se incubó con el anticuerpo

monoclonal C-219 a una dilución I:250 en el tampón anterior suplementado con

2 mg/ml de BSA (fracción V, Sigma) durante toda la noche, a temperafura ambiente

y con agitzción contínua. La membrana se sometió a cuatro lavados, de 5 min cada

uno, con el tampón de lavado anterior, y se procedió a la fase de detección del

anticuerpo primario, que dependiendo del método utilizado (fosfatasa alcalina o ECL)

ésta podía desarrollarse como:

i) Fosfatasa alcalina: La membrana se incubó con un segundo anticuerpo IgG

de cabra antirratón conjugado con fosfaüasa alcalina (Boehringer), a una dilución

1:3.000 (0,4 p.glml) en el mismo tampón que el primer anticuerpo durante t h a

temperatura ambiente y con agitación. La membrana se lavó con tampón Tris-HCl

100 mM pH 8,8 NaCl 100 mM, Mgcl2 5mM durante tres periodos de 5 min. La

actividad enzimátíca de la fosfatasa alcalina se detectó mediante revelado con una

disolución que contenía 4-nitro azul de tetrazolio 3,75% y 5-Bromo-4-Cloro-3-

Indolilfosfato (Boehringer) l5Vo. Ia" reacnión se detuvo lavando la membrana con

agua.

ii) Sistema de detección ECL (Enhanced chemical luminiscence, Amersham).

En este método, la membrana se incubó con un segundo anticuerpo anticueqpo IgG de

oveja antirratón marcado con peroxidasa de rábano (Amershan) a una dilución 1:1000

en el mismo tampón que el primer anticuerpo durante t h a temperatura ambiente y

con agitación. A continuación, la membrana se lavó con tamñn Tris-HCl 50 mM pH

7,5 NaCl 150 mM, Tween-2O 0,1% durante un periodo de 15 min y dos de 10 min.

Seguidamente, la membrana se incubó con los reactivos A v B del Kit de detección a

53



Mabrials vMéttús

una relación 1: 1 y tras el secado de Ia misma, se puso la membrana en contacto con

una película de autoradiografía (Hyperfilm-Ecl, Amershan) durante un tiempo que

osciló entre 1 v 20 min.

2- PIIRIFTCACTÓN DE LA P-gp.

La purificación de la P-gp requiere de la solubilización de la frapción

microsomal en la que se encuentra. Para ello, se procedió a un proceso de dos etapas

sucesivas de solubili zación.

En la primera etapa, se realizaron ensayos de solubilidad con tres detergentes

distintos: dos de tipo zwitteriónico, Zwittergent 3-12 (Calbiochem) y CHAPS (Sigma)

y uno aniónico derivado de las sales biliares, Colato de sodio (Sigma), frecuentemente

empleado en la solublLizaciún de diversas proteínas de membrana (137).

El tiempo de solubilización apropiado se determinó utilizando diversas

alícuoüas de fracción microsomal que se solubilizaron con distintas relacionesproteína:deüergente, desde L:0,25 hasta 1:15 (w:w), a intervalos de tiempo de 30 y

60 min respectivamente. El proceso se realizó a 4oC y con suave agitación duranteperiodos de 15 min. Transcurrido el tiempo de solubilizacíón, las muestras sesometieron a centrifugación a 200.000 x g durante 2O min (TFT-70.38, Kontron,

50.C)00 rpm) en una ultracentrífuga refrigerada (154). I-a, ftacción insoluble seresuspendió en tampón Tris 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM.

Las distintas fracciones (soluble e insoluble) obtenidas de la solubilización conlos diversos detergentes se analiza¡on mediante la determinación del contenido deproteína, por el método de Bradford (151), y la detección de los niveles de P-gp por

Western-Inmunotransferencia ( I 53).

I-a fracción que contenía la P-gp se sometió a una segunda etapa desolubilización en las que se utilizaron los siguientes detergentes: CHAPS, NonidetP-40 (Sigma), N-Octilglucósido (Calbiochem) y Zwinergent 3-L2.

Al igual que 1o descrito en la primera etapa, se analizaron las fracciones

obtenidas tras centrifugar las muestras en cuanto a su contenido relaúvo en P-gp.

La reconstitución de la P-gp parcialmente purificada se realizó por eliminacióndel detergente de las muestras solubilizadas mediante diálisis exhaustiva frente at¿mÑn Hepes 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM. Previamente a la diáIisis. las muesrrras se

54



Mabrial* vMéútúx

suplementa.ron con 5 mg de lípidos de asolectina por mg de proteína para evitar la

precipitación de las proteínas de membranas, particularmente de Ia P-gp.

3- ESTUDIO FTINCIONAL DE LA P-gp INSERTA-DA EN LA MEMBRANA

DEL OVOCITO.

Tras la preparación de los ovocitos y la microinyección de las distintas

muestras enriquecidas en P-gp (ver apartados II-3 y II-4), se procedió al estudio

funcional de la P-gp insertada en la membrana del ovocito.

3.L- Detección de la P-gp en la membrana de los ovocitos.

Las membranas procedentes tanto de ovocitos sin ínyectar como de ovocitos

que fueron previamente inyectados con fracciones que contenían lu P-gp, se aislaron

manualmente según el procedimiento descrito por Sadler y Maller (155). Para 1o cual

los ovocitos se incubaron en una disolución hipotónica de composición Hepes 10 mM

pH 7,0, NaCl 10 mM en baño de hielo y se les efectuó un pequeño corte para que el

contenido intracelular pudiera salir at exterior. Al cabo de 20-30 min se cogían las

membranas con la ayuda de unas pinzas de relojero el ovocito y se elevaban hasta

llegar a la superficie de la disolución donde la tensión superficial arrastraba el

citoplasma que aún se mantenía unido a la membrana celula¡. Tras lavado de las

membranas, éstas se sedimentaron mediante una centrifugación a 15.000 x g durante

5 min a 4oC (Biofuge 1"5, Heraeus, 13.000 rpm). Las membranas se resuspendieron

en tampón de desnaturahzacíón y alícuotas correspondientes a muestras de 20

membranas, se procesaron mediante Western-Inmunotransferencia para la detecciónde P-gp, tal como se ha descrito anteriormente en el apartado III-1.4.

3.2- Il,ledidas de actividad de transporte de fármacos,

A fin de deüeminar la capacidad transportadora de la P-gp, las diversas

alícuotas obtenidas en las dos etapas de purificación anteriores (apartado III, 2), se

sometieron a ensayos de actividad de transporte de fármacos antitumorales.

JJ



Mabrialu vMétodtx

[¿s muestras que contienen la P-gp: fracción microsomal, fracción insoluble

obtenida tras el tratamiento con Colato y fracción solubilizada por Zwittergent 3-L2 y

dializada, se microinyectaron en ovocitos de knopus. Muestras control, procedentes

de células L1210/S fueron procesadas en las mismas condiciones que las procedentes

de las células resistentes Ll2l0llffi.

Transcurridas 20-30 h de la inyección, grupos de 10 ovocitos se incubaron con

DNM 0,6 pM conteniendo 1 ¡rCi de H3-DMvI (NEN Products). La temperatura de

incubación fue de 25oC, el volumen total de muestra de 0,5 ml siendo el tampón

empleado Ringer pH 7,4. A los 90 min los ovocitos se trasvasaron a viales de

centelleo conteniendo 200 ¡rl de SDS al 27a. Una vez solubilizados, se les añadió 5 ml

de líquido de centelleo [Ready Micro, (Beckman)] a cada viat y se procedió a su

medida en un contador B (LS 2800, Beckmann). En los experimentos de reversión del

transpofte por VRP, éste se adicionó 60 min después de la DNM y se mantuvo

durante 30 min.

Los niveles de acumulación de DNM se presentan como el porcentaje de

radioactividad del contenido intracelular de los ovocitos con relaeíón a la

radioactividad total añadida en el pocillo respectivo. El transporte de DNM al exterior

celular se expresa como diferencia entre los niveles de DNM acumulada por los

ovocitos inyectados con muestra cont¡ol respecto de los inyectados con muestra que

contiene P-gp.

3.3-Medidas de osmolaridad.

La osmolaridad de las disoluciones empleadas en el estudio de la actividad de

canal de cloruro activado por hipotonicidad se realizó en un osmómetro Knauer, que

se basa en el ciflculo de la conductividad eléctrica de una disotución cuando ésta pasa

del estado líquido al sólido. Para calibrar el aparato se utiliza H2O desionizada como

valor 0 mOsm y una disolución de NaCl al1,2687% en H2O desionizada como valor

400 mOsm.

3A



Mnle¡ínls v Mélndx

3.4- Estudio de las corrientes activadas por hipotonicidad.

El estudio de las corrientes activadas por hipotonicidad se realizó mediante el

método de fijación de voltaje con dos electrodos. Tanto las células no inyectadas

como las inyectadas con muestras control o con aquellas con P-gp, se sometieron a un

protocolo de pulsos despolarizantes de 800 ms de duración, desde -100 mV (potencial

de fijación) a -60 mV, -20 mV, +10 mV, +40 mV y +80 mV. I.os pulsos se

aplicaron en Ringer Normal isotónico (RI$, y en dos medios hipotónicos derivados

del anterior donde únicamente se disminuye la concentración de NaCl, pasando de

115 mM a 75 y 45 mM (RH-75 y RH-45, respectivamente). Los pulsos

despolarizantes se aplicaron tras 5-10 min de haber cambiado la disolución para

asegurar que el intercambio de los medios en la camarita fuera tot¿l.

Las relaciones corriente/voltaje de la corriente activada por hipotonicidad se

presentan como el valor medio de las corrientes evocadas en medio hipotónico, eü€previamente habían sido normalizadas mediante la asignación de lffiVo al valor

máximo de corriente. Las corrientes netas debidas al medio hipotónico se calcularon

mediante la diferencia entre las corrientes evocadas en medio hipotónico y en medio

isotónico. En los pulsos a +4A y +80 mV aplicados en medio hipotónico, el valor de

c¡rriente se extrapoló a t: 0, debido a que el componente capacitativo de la

membrana del ovocito impidió el registro de la corriente iónica en los primeros 5-20

ms.

El cálculo de las amplitudes de la corriente evocada Wr medio hipotónico, se

efectuó en los pulsos a +80 mV, extrapolando la corriente a t: 0 para evitar su

inactivación. Esta determinación se realizó únicamente en aquellos experimentos

donde se aplicaron pulsos en medio isotónico anúes y después de su aplicación en

Ringer hipotónico.

En las corrientes nativas del ovocito activadas por hipotonicidad, se analizó el

efecto de diversos f,ármacos sustraúos o moduladores del transporte por P-gp (DNM,

vRP).

s7



Mabrials vMéb&ts

TV. METODOLOGÍA REFERENTE AL REQUERIMM,NTO ENERGÉTICO DE

LAS CÉLTJLAS P38S.

I¿ P-gp transporta f¿írmacos al exterior celular mediante la hidrólisis de ATP.

Para estudiar los requerimientos energéticos de la P-gp como bomba activa del eflujo

de f¿írmacos, se han estudiado algunos aspectos relativos al metabolismo energético en

las células P388. Las determinaciones experimentales comprenden:

1- CONSUMO DE OXÍGENO.

I¿s medidas de consumo de oxígeno se realizaron de forma amperoméffica

mediante un oxígrafo (YsI-5331, Yellow Spring Instruments) que emplea un

electrodo de Clark, uno de los más selectivos que existen. Sus especificiones se

recogen en el ,Afrndice I.

Las muestras celulares se mantuvieron aisladas para prevenir el intercambio de

02 entre la cámara de muestras y la atmósfera mediante el cierre entre el soporte del

electrodo y las paredes de la cámara de muestras. Antes de cada experimento seprocedió al calibrado del aparato. EI rcU% representa al tampón saturado de oxígeno

a la temperatura del experimento y el 0% a una disolución saturada de tiosulfito de

sodio en dicho tamprón. La temperatura de la cámara de muestra y el dispositivo del

electrodo se manfuvieron constantes a 37oC mediante el empleo de un baño de

temperatura circulante de precisión * 0,1oC (K, Haake).

Las suspensiones de células en HBS se llevaron a una densidad finat de 1 x 106

células/ml (condiciones basales). Alícuotas de 6 ml en la cámara de muestra se

equilibraron al aire con agitación suave y continua durante 7,5 min. A continuación seintrodujo el electrodo en la camara y se selló. Tras la espera de otros 7,5 min, tiempo

requerido para alcanz-ar el equilibrio térmico de todo el sistema, se procedió al

registro contínuo del consumo de oxígeno duranüe 10 min.

58



Mabrials vMéhtúts

La adición de glucosa (Merck) 10 mM o azida de sodio (Merck) 10 mM como

efectores del metabolismo energético, se realizó inmediatamente antes de introducir el

electrodo en la cámara de muestra.

Para analizar el efecto de DNM en el metabolismo energético, suspensiones de

células en condiciones basales se incubaron con el fármaco a una concentración final

de 3 ¡rM a 37oC y se procedió al registro de consumo de oxígeno a diversos tiempos:

0, 30, 60 y 90 min. I-os experimentos en presencia simultiínea de DNM y VRP se

llevaron a cabo preincubando con VRP a una concentración de 5 pM durante

120 min. Al finat de cada experimento se efectuó el correspondiente ensayo de

viabilidad celula¡.

2- MEDIDAS DE LACTATO.

El procedimiento empleado fue de tipo enzimático basado en la reducción de

NAD+ por la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) que tiene como sustrato al ácido

lactíco. La ecuación que rige el proceso es la siguiente (156):

Lactata + NAD+.- lactato deshi4logt$3- piruvato + NADH + H+

El NADH tiene un miíximo de absorbancia a 340 nm, propiedad utilizada para

cuantificar la cantidad presente de lactato en la reacción mediante espectrofotometría.

El ensayo se llevó a cabo partiendo de suspensiones de 10 rnl de células de

densidad 1 x 106 celulas/ml en medio HBS a 37oC (condiciones basales). Tras

centrifugación a 405 x g durante 10 min a temperatura ambiente, el sedimento se

resuspendió en ácido perclórico aI l0% con el fin de liberar el contenido

citoplasmático y precipikr la proteína así como las diversas estructuras celulares.

Posteriormente, todo ello fue sedimentado mediante dos centrifugaciones sucesivas a

15.000 x g durante 1 y 5 min respectivamenúe (Biofuge 15, Heraeus, 13.000 rpm).

Del extracto citoplasmático se tomaron diversas alícuotas que se incubaron durante

30 min a37oC con una disolución tamponada con glicina apH9,2 que contiene el

enzima (LDH de músculo de conejo, Boehringer) y NAD+ (grado II, Boehringer). I-a

absorbancia de NADH se registró con un espectrofotómetro (Ultrospec III, Pharmacia

LKB).

59



Ma@iak v Métutus

Las incubaciones con efectores del metabolismo energético y las referidas a

VRP y DNM se efectuaron de la misma forma como se describe en el apartado IV-1.

3- MEDIDAS DE ATP.

Estas medidas se realizaron mediante un ensayo bioluminométnco que se basa

en la luminiscencia de oxiluciferina que se genera en la siguiente'reacción catzlizada

por la enzima luciferasa obtenida de Photinus pyralis ( American firefly) (157):

ATP + D-luciferina* o.1-!y9lrgt1tl!'tg2t* oxiluciferina+ ppi + AMp + cor * luzL

El método es altamente sensible y permite la determinación de niveles de ATP

comprendidos entre los rangos de 1 x 10-8 a 5 x 10-13 M.

Para ello se parte de suspensiones de células con una densidad de 1 x 106

células/ml en medio HBS a 37oC (condiciones basales). Alícuotas de 50 f¿l se

incubaron con la mezrla de reacción 1:1 (v:v) [Kit ATP bioluminiscence HS,(Boehringer)1, y se midió la luminiscencia al solubilizar la membrana de las células

con Tritón-Xl00 (Bio-Rad) a una concentración final del lVo (w:v). I¿s medidas deluminiscencia se realizaron en un luminómetro LKB-1250 de alta sensibilidad.

I¿s medidas de ATP en presencia de glucosa, azida de sodio, vRp y DNM seefectuaron en las mismas condiciones especificadas en el apartado IV-l.

60



Mabrialw vMébdos

v- eNÁr,rsrs nsrloÍsrrco.

Los datos de los experimentos fueron analizados según el siguiente tratamiento

estadístico:

i) Determinación de la media aritmética (;) y error esuíndard de la media (e.

s .m. ) .

iil Aplicación del criterio t de Student para determinar si dos medias eran o no

significativamente diferentes.

iiíl Construcción de histogramas de distribución de frecuencias de los valores

experiment¿Ies dentro de una población.

iv) Anrílisis de la varianza ANOVA para comprobar las diferencias entre los

valores de los distintos grupos. Si los grupos comparados mostraban diferencias

significativas (p< 0,05), se utllirn la prueba de Student-Newman-Keuls para

discriminar entre qué grupos existían diferencias. Cuando los valores presentaban una

variabilidad consíderable entre ellos, y no se ajustaron a una distribución normal, para

comparar diferencias entre grupos se utilizó el test de Wilcoxon. Cuando hubo que

establecer si más de dos grupos eran diferentes o ño, se utilizó el test de

Kruskal-Wallis. Las diferencias significativas entre grupos se han representado según

la siguienúe nomenclatura:

(*) p ( 0,05

(**) p ( 0,01

(***) p ( 0,001

61



CAP.ITT]LO I

¿PRESENTA LA P-gp ACTIVIDAD DBCANAL DE CLORURO?



REST]LTADOS



CarútuIo I

1.1- RESPTJESTA NATIVA A ACh EN OVOCITOS.

I-os ovocitos de algunos donadores responden a la aplicación de ACh con una

reducción del potencial de membrana (158). En la Figura 12 se muestra la corriente

evocada por ACh debida a la activación de receptores muscarínicos nativos del

ovocito. El carácter muscarínico de esta respuesta se demostró con el bloqueo

completo de la corriente al añadir sulfato de atropina 0,5 ¡rM a Ia disolución de

superfusión. La aplicación de pulsos hiperpotarizantes justo después de la activación

de la corrienúe muscarfnica evocó la corriente T¡oo como consecuencia de la activación

de la cascada de los inositoles fosfato y del consiguiente incremento de La

concentración de calcio intracelular (149, 159). I¿ ausencia de esta corriente se utilizo

como control de que las respuestas producidas por la aplicación de ACh no eran

debidas a receptores muscarínicos.

Ftgura 12: Corriente de cloruro evocada por ACh 100 pM en un ovociüo de Xenopus laevis a tn

potencial de me¡nbrana de -60 mV. La flecha indica la aplicación de Ach. El recuadro muestra la

corrienúe T¡" inducida por pulsos hiperpolarizanfes, desde {0 mV hasta -140 mV en incrernenüos de

20 mv, tras evocarse la respuesta muscarÍnica- El potencial de filación fue de -20 mv.

Ar

f oo nAl_2 c

úl



Rer;ulkfus

r.2'RESPI.]ESTAS A ACh EN OVOCITOS INYECTADOS CON MEMBRANAPURIFICADA PROCEDENTE DE Toryetu mamnrata.

1.2.1- [rcorporación del nAChR en Ia membrana del ovocito.

En ovocitos previamente inyectados con membrana purificada de electroplaca

de Tbrpdo marmorata y con el potencial de membrana fijado a -60 mV, la aplicación

de ACh 100 ¡rM en el medio de superfusión evocó en un 64% de las células (30 de

47), una respuesta compleja, como se muestra en la Figura 13A. Esta corriente podría

estar formada por la suma de la corriente activada por los receptores muscarínicos

nativos del ovocito y la corriente del canal iónico asociado al receptor nicofnico

inyectado, si bien el primer componente de la corriente podría ser, por su morfología,

el componente D1 de la corriente muscarínica.

10 nA I20E

Flgura 13: Corrientes evocadas por la adiciÍn de ACh l0o pM al baño de superfrrsión en un ovociüoinyectado con membrana purificada. El potencial se fiió a -60 mV. A) En ausencia de sulfaüo deahopina. B) Tras la incubación con zulfaüo de akopina 0,5 ¡rM. I a* barras indican el tiempo deaplicación de ACh 100 ¡rM.

65



Capíútlo I

Para discernir entre si dicho componente pertenecía al canal asociado al

receptor nicotínico exógeno o bien era sólo parte de la corriente asociada a la

activación de los receptores muscarínicos nativos, se incubó el mismo ovocito con

sulfato de atropina 0,5 ¡rM. En la Figura 138 se muestra la corriente evocada por

ACh tras la incubación con sulfato de atropina. Obsérvese que tras abolir la respuesta

muscarínica permanece una corriente con las características de la descrita para el canal

asociado al receptor nicotínico de Tfupedo.

1.2.2- Curso temporal de la incorToración del nAChR en la membrana de los

ovocitos.

Después de comprobar que la membrana purificada fusionaba con la membrana

del ovocito, el siguiente punto de interés fue determinar la amplitud de las respuestas

en función del tiempo transcurrido tras la microinyección de la muestra. Para ello, seregistraron las corrientes evocadas por ACh 100 pM a un potencial de membrana de-60 mV a distintos tiempos tras inyectar la membrana purificada en el ovocito. I¿Figura 14 muestra un histograma de frecuencia tridimensional en el que se representa

la amplitud de la corriente nicotínica en función del tiempo de registro tras lainyección.

IN 20

Tierpo (horas)160fonpl itu¿ (r¡A) ZOO

-- O

Figura 14: Histograma de frecuencia 3D en el que se expresa la amplitud de las distintas respuestas conel tiempo hanscurrido has la inyección con membrana puriñcada. [¿ corriente se evocó con ACh 100¡rM fljando el poúencial a -60 mV.

Tt:ta)riil,1¿,,:,'

it;:I1tlri:!!i¿"]

ii,l*

6



Rutilhdm

Del histograma se deducen varias observaciones:

i) Ia mayoría de las respuestas fueron menores de 40 nA, siendo el valor

medio de23 t 7 nA (n: 47).

ii)87 rango de las mismas osciló entre los 0 y los 178 nA.

iii) I-as amplitudes máximas se localizaron entre las 16 y Ias 24 h.

De los experimentos de inyección de membrana purificada procedente de la

electroplaca de Tbryedo nnrmorata se deduce que existe una fusión entre las

membranas inyectadas y la propia membrana del ovocito. I-os receptores incorporados

en las membranas mantienen su c¿rpacidad funcional, pero el tamaño de las corrientes

(de sólo unas decenas de nanoamperios), no permite realízar un estudio exhaustivo de

las propiedades de los receptores transplantados a la membrana de los ovocitos en

cuanto a analizar si éstas han sufrido algún tipo de modificación durante el proceso.

Ello nos llevó a purificar el receptor nicotínico de ACh medianüe columnas de

afinidad, reconstituirlo en una matriz lipídica artificial de composición definida e

inyectarlo en los ovocitos para su estudio electrofisiológico.

1.3- RESPUESTAS A ACh EN ovoclTos INYECTADOS coN EL nAchRPI]RIFICADO Y RECONSTITUIDO.

1.3.1: Incorpor?ción del nAChR en la membrana del ovocito.

En ovocitos inyectados con receptor nicotínico purificado y reconstituido en

lípidos totales de asolectina, se evocaron corrientes iónicas en presencia de ACh

100 ¡rM mientras se mantenfa el potencial de membrana a -60 mV. L¿ respuesta se

observó en un 89Vo de los 200 ovocitos registrados, siendo el valor medio de la

corriente de 139 + 19 nA (Rango: 0- 1,6 ¡¿A). Ia inyección del receptor nicotínico

purificado aportó valores de amplitud de corriente considerables, posibilitando los

estudios funcionales del receptor, hecho que no sucedía cuando el receptor seinyectaba mediante membranas purificadas.

En la siguiente figura se muestran las corrientes obtenidas en un mismo

ovocito mediante la aplicación de dos concentraciones distintas de ACh, donde se

67



eaffitlo I

puede apreciar que al incrementar la

aumento tanto en la amplitud de

desensibilización.

concentración del agonista, se produce

la corriente como en la velocidad

un

de

ACh 10 ¡M ACh lo0 pM

figura 15: Bjemplos representativos de corrientes evocadas por dos concenhaciones de ACh a un

poüencial de fijación de -60 mV en un mismo ovocito inyectado con nAChR reconstituido. En el baño se

adicionó zulf,ato de atropina 0,5 ¡r.M para abolir la respuesta muscarínica de receptores nativos.

1'3'2- Dependencia de la variedad de los donadores sobre la resmresfa de lss

mu€stras.

Una de las posibles variables que podría afectar a la incorporación de los

receptores en la membrana de los ovocitos, y por tanto, al valor de la amplitud de la

corriente evocada por ACh, es el donador. Dicha posibilidad se analizó en diversos

donadores haciendo uso de una misma muestra en la inyección de receptores. En

todos los ovocitos se inyectó un mismo volumen de muestra de 100 nl, y la corriente

fue siempre evocada por ACh 100 ¡rM. [¿ muestra recién procesada se utilizó en elprimer donador (Xenopus-rcm%) y se guardó congelada en nitrógeno líquido enpresencia de un crioprotector (trehalosa) para ser usada en los siguientes donadores

68



Res¡ulá'dos

tras una descongelación nípida y homogenización. En la siguiente tabla se presentan

los datos de la corriente nicotínica obtenida en los diversos donadores.

DONADOR CORRJENTE (nA) CONGELACIÓN

Xenopus-l60293

Xenopus-010693

Xenopus-l40693

319 + 87 (n:4)

307 + 77 (n:7)

209 + 54 (n:6)

425 + 163 (n:7)

NO

SI

SI

SI

Tabla 1: Corrientes evocadas por ACh 100 ¡rM en ovocitos de diferenúes douadores mantenidos a

-60 mV. El volumen de invección fue de 100 nt.

El estudio estadístico de los resultados de las amplitudes de las corrientes

señala que no existen diferencias significativas (p> 0,05). Es decir, los diferentes

donadores utilizados no influyen en Ia amplitud de la respuesta. Asimismo, no se

observaron diferencias significativas (p> 0,05) entre la muestra recién obtenida y tras

haber sido descongelada y homogeneizada.

1.3.3- Dependencia del volumen de la muestra inyectada sobre la amplitud de la

corriente.

Para estudiar el efecto del número de los nAChRs inyectados sobre la amplitud

de la corriente iónica, se emplearon dos volúmenes distintos, 50 y 100 nl, de una

misma muestra. Los ensayos se realizaron en un mismo donador al que se le inyectó

el nAChR reconstituido en asolectina con una concentración final de proüeína de

0,34 mg/ml. Las corrientes obtenidas al aplicar ACh 10 ¡¿M a -60 mV a ovocitos

inyectados con 50 ó 100 nl de la muestra fueron de 79 + 24 nA (n: 13) y de 457 +

I37 nA (n: 9) respectivamente (p( 0,01). Debido al incremento en la respuesta

obtenido al aumentar el volumen de inyección de 50 a 100 nl, en los siguienües

experimentos se tomó como volumen normal de invección este último. esto es.

100 nl.

69



CapítuIo I

1.3.4- Curso temporal de la incorporación del nAChR en la membrana de los

ovocitos.

El estudio de las amplitudes de las corrientes inducidas por ACh en función del

tiempo transcurrido tras la microinyección, se realizó en 14 células de un mismo

donador e inyectadas con la misma muestra. En todos los experimentos la corriente se

evocó con ACh 100 ¡rM y fijando el potencial a -60 mV. Los tiempos estudiados

fueron de 4, 8, 12, 16, 24, 36 y 48 h tras la inyección. Se desecharon tanto aquellos

ovocitos que no superaron los 10 nA de respuesta máxima, como aquellos ovocitos en

los que no se registraron más de 4 tiempos distintos.

+h th 12 h 2+h

50 nA l_

B16 h 24h

l0 s

56hth

lr \rT11 20 nol_

u

10 I

figura 16: Corrientes registradas en 2 ovociüos a distinúos tiempos has inyectar el receptorreconstituido. I¿s barrx indican la apücación de ACh 100 pM. El potencial de fijación fue de -60 mV.A) Ejemplo de ovocitos que presentan un pico de corrienüe. B) Ejemplo de ovociüos que presentan dospicos de corrienüe.

La respuesta de los ovocitos aumentó normalmente hasta un máximo parÍr

luego disminuir, aunque en algunos ovocitos se observó más de un pico de respuesta,

es decir, la corriente presentaba fluctuaciones con el tiempo. Estos dos

70



comportamientos se presentan en la figura anterior, ilustrando en el panel A ia

respuesta típica de los ovocitos que dieron un sólo máximo de corriente y en el panel

B un ovocito representativo de una respuesta con doble pico de corriente.

Los valores de corriente obtenidos en esos 14 ovocitos se normalizaron

respecto del valor máximo de la corriente evocada en cada ovocito (100%) y sepresentan en la Figura 17.

100

-xI

f 7 5al¡lJa-v,l¡¡É' go

¡¡¡cll¡¡?

É25-t4(,É,oIL

0

o f0 20 50

T|ETPO TRAS tNYECCtOt¡ (h)

50

Figura l7: Porcentaje de la corriente máxima evocada con ACh 100 pM frenúe al tiempo transcurridodespués de la inyección del receptor nicotínico purificado. El poúencial de membrana se fijó a -60 mV(n: 14).

Como se puede observar en la Figura anterior, la miíxima respuesta se obtuvoalrededor de las 16 h, valor que coincide con el obtenido cuando la microinyección delos nAChRs se realizó con la membrana purificada (16 a 24 h). Además, se observadespués del pico de amplitud una meseta de respuesta de aproximadamente un 25Vodel valor máximo que perdura hast¿ el final del tiempo estudiado.

71



Canítulo I

1.3,5- hopiedades del canal iónico asociado al nAChR.

En este apartado se plantea comprobar si las propiedades funcionales de los

nAChRs transplantados en el ovocito, eran similares o no a las descritas mediante los

estudios de la inyección del clon o del ARNm correspondiente, puesto que la

composición lipídica de las vesículas en las que el receptor había sido reconstituido,

podía haber alterado sus propiedades como canal. Por ello, se analizaron la relación

dosis-respuesta, potencial de reversión, dependencia de voltaje de las corrientes

evocadas por ACh y desensiblhz.aciún del receptor.

1".3.5, 1- Curva Dosis-Respuesta.

La primera propiedad que se estudió fue la dependencia de la corriente iónica

con la concentración de agonista utilizada. Para ello se aplicaron concentraciones

crecientes de ACh, desde 1 ¡rM hasta 1 mM, en cuatro ovocitos inyectados con dos

muestras diferentes de nAChR. Las registros se realizaron fijando el potencial de

membrana a -60 mV. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 18 donde serepresenta el porcentaje de la corriente m¿íxima evocada por ACh frente a la

concentración de ACh utilizada. Tras ajuste de los puntos a una curva sigmoidea, se

obtuvo un coeficiente de Hill de 2,08 y un IC56 de 72 ¡rM, valores que concuerdan

con los datos descritos en la bibliografía para este receptor $6A, rcI, rcZ).

A partir de la amplitud máxima de las corrientes inducidas por una alta

concentración de ACh (1 mM), es posible estimar el número de receptores nicotínicos

incorporados en la membrana del ovocito, asumiendo una conductancia del canal en la

disolución Ringer de 40 pS. (163, 164). Durante el pico de corriente, el cambio deconductancia observado (pico de corriente/(potencial de membrana-potencial dereversión)) fue de 40 ¡rS lo que significa la presencia de al menos I x 106 receptores

funcionales en la membrana del ovocito en un momento determinado.

7t



Ruulhfus

=.=

Éootnl¡¡3o-v,l¡¡É, +oIl¡lctxza

-6 -+ -3Loc [Ach]

Figura 18: Relación dosis-respuesta. [¿ curva representa el porcent4ie de la mríxima corriente inducidapor diferen&es dosis de ACh a un potencial de fljación de -60 mV en 4 ovocitos (cada uno representadopor un sinbolo diferente) inyectados con nAChR reconstituido.

1.3.5.2- Potencial de Reversión.

Una de las propiedades que caracterrza a los canales iónicos es su selectividad

iónica. La comprobación de que la selectividad iónica del canal no se alteró durante elproceso de transplante al ovocito se efectuó mediante la estimación del potencial dereversión de la corriente. Así, se registraron a diversos potenciales, las corrientes

evocadas por ACh utilizando aplicaciones breves y una baja concentración de ACh (10

¡rM), para evitar la desensibilización del receptor.

El valor medio del potencial de reversión obtenido fue de -5 mV, (el rango

osciló entre -17 y +4 mV) (n: 5), valor próximo a los descritos con la inyección delARNm o ADNc del nAChR en ovocitos (165, 166).

En la Figura 19 se representan las corrientes evocadas por ACh a diversospotenciales de fijación en un ovocito. Si se inteqpolan los valores de corriente

obtenidos a -20 y + 10 mV se obtiene, que para ese ovocito, el potencial de reversión

es de -2 mV.

t

73



CaoítuIo I

ACh l0 ¡rll

* 1 0 m V-2O mV-¡f0 mV-80 mV-EO mV

- 1 0 0 m V

II roo na

f 0 ¡

Figura 19: Corrientes evocadas en un mismo ovociüo por aplicaciones breves de ACh a distinüospoüenciales de fijación (indicados en el lado izquierdo de cada regisro). Nótese que el sentido de lacorrienúe cambia entre los valores de +10 y -20 mV. Labarl señala la aplicación de ACh 10 ¡rM. Elnivel de base de los registros de corriente para cada potencial ha sido desplazado arbibariamente.

1.3.5.3- Relación Corriente-Voltale.

La relación corriente-voltaje (I/V) sirve para conocer en todo momento la

conductancia de los canales ionicos. Dicha relación se obtuvo mediante Ia aplicación

de pulsos cortos a distintos potenciales antes y durante la meseta de corriente inducida

por la aplicación de una baja concentración de ACh (10 pM).

En la Figura 20 se muestra en la parte superior del panel A la corrienúe

evocada por la aplicación de ACh en el baño de superfusión y el lugar de aplicación

de los pulsos de voltaje; en la parte inferior, los diversos pulsos de corriente obtenidos

a distintos poüenciales (de -120 a 60 mV en saltos de 20 mV). En el panel B se

representan las relaciones corriente-voltaje tanto instantánea (t: 0) como estacionaria

(medida al final del pulso).

Se observa que la relación coffiente instantánea-voltaje sigue una relación

lineal, lo que significa que la conductancia del canal no es voltaje dependiente. Sin

embargo, cuando se considera la corriente en la fase estacionaria, se obserya una clara

74



rectiftcaeión hacia dentro, es decir, el canal pasa más corriente a potenciales más

negativos de -60 mV. Este fenómeno, posiblemente debido a un incremento de la vida

media de apertura del canal con la hiperpolarizacíón, se observó en todos los ovocitos

registrados, aunque su magnitud fue bastante variable.

Aü

I I

re | ñ -Y fq I'no

2 0 s

5OO nA

Corr iente (nA)

Ftgura 20: Dependencia de Voltaje de las corrienües evocadas por ACh 10 ¡rM. A) En la parte zuperiorse muesha la meseta de corrienüe evocada por ACh donde se aplicaron los pulsos y e,lr la parte inferior,las respuestas a pulsos de volt4ie antes (negro) y durante la meseta de corriente inducida por ACh l0 ¡r.M(rojo)' B) Representación de la corrienüe instantínea (0) y estacionaria (o) frente al voltaje, en el mismoovociüo que A. Nótese la marcada rectificación a potenciales negativos en la corrienüe estacionaria.

ResuIá.d¿ts

1.3.5.G Desensibilización del nAChR.

Otra característica bien conocida de los receptores nAChR de Torpedo es surápida desensibiliracíón cuando se aplican pulsos de ACh de larga duración (167,

168). Esta propiedad se ha conservado en los nAChRs reconstituidos e incorporadosposteriormente en la membrana del ovocito. [¿ desensibilización de estos receptoresinducida por aplicaciones prolongadas de ACh 100 ¡rM mostró al menos dos

Voltoje

75



CaoítuIo I

componentes y fue similar en magnitud a la que ha sido previamente descrita (167,

168).

La gentamicina, un antibiótico frecuentemente utilizado en el medio de

incubación aumenta la desensibilización de los nAChRs procedentes de clones de

ADNo de Tbrpedo (169). Su presencia afectó la cinética de desensibilización de los

nAChRs reconstituidos (comparar A y B en la Figura 21). Por esta razón,la mayoría

de los registros se reaJizarcn en ovocitos cultivados en presencia de

penicilina/estreptomicina, antibióticos que tienen sólo un pequeño efecta sobre la

desensibilización del receptor nicotínico (comparar A y C en la Figura 21).

c

Figura 2t": Efecúo de los antibióticos en la desensibilización de las corrientes inducidas por ACh(100¡rM). A) Regisko de un ovociüo no expuesüo a antibióticos. B) Corriente evocada en un ovocitoincubado con gentamicina (0,1 mg/ml). C) Ovocito incubado con penicilina (100 UI/ml) yestreptomicina (0,1 mg/ml). D) Ovociúo del mismo donador, incubado en las mismas condiciones que C,e inyectado con receptores reconstituidos congelados en presencia de trehalosa (5 mg/mg proüelna). Lasbarras indican la aplicación de ACh.

Sorprendentemente, aquellos ovocitos que esfuvieron en presencia de

penicilina/estreptomicina y se inyectaron con muestras de nAChR reconstituidas que

habían sido congeladas en presencia de trehalosa, mostraron una desensibilización

significantemente más lenta (ver C y D de la Figura 21).

BA

76



Rer,ulá.dos

En la siguiente tabla se presentan los valores de desensibilización de los

diversos grupos, calculados como el porcentaje de reducción de la corriente, medida a

dos tiempos distintos, respecto al valor alcanzado en el pico:

Medio de Incubación Tiempo

10s 40s

No de

Ovocitos

Sin antibiéticos

Gentamicina

Penicilina/estreptomicina

Penicilina/estreptomicina

* Trehalosa

78+ 17

96+6*

83r9

75 + t3#

94+4

N.D.

97+3

92+7#

12

19

28

2A

Tabla 2: Porcentaje de la desensibilización del nAChR inducida por ACh 100 ¡iM. * p( 0,05 enhe Sin

antibióticos y cualquier otro grupo. y p( 0,05 enhe los grupos de penicilina. N. D. : No determinado.

1.3.6 Localización de los nAChRs en la membrana del ovocito.

1.3.6.1- Distribucién de los nAChRs en la membrana det ovocito.

Se analizó la distribución de los receptores a 1o largo de la superficie del

ovocito para saber si se distribuían de forma homogénea o se localizaban en zonaspróximas al lugar de inyección. Para explorar este punto se realizaron aplicacioneslocalizadas de ACh en la superficie del ovocito.

La aplicación de ACh evocó corrientes en ambos hemisferios del ovocito.

animal y vegetal, obteniéndose respuestas cuyo rango de amplitud era de 7 a 2A5 nA y

de 10 a 150 nA respectivamente, para cada hemisferio (10-20 ensayos por ovocito,n: 3). Un ejemplo representativo se muestra enlaFigvra22.

Las respuest¿s a la aplicación de ACh no fueron homogéneas a lo largo de la

superficie del ovocito, existiendo zonas que presentaban claras respuestas y zonas

cercanas a las anteriores que resultaron silentes. Este patrón de respuesta sugería unadistribución de los receptores en "parches" a 10 largo de toda la superficie del ovocito.Analizando las respuestas, se encontró que algunas de las evocadas cerca del lugar deinyección tenían mayor duración que las evocadas en zonas más alejadas. Las

77



Caoítulo I

derivadas de las corrientes indicaron que las respuestas evocadas cerca del lugar de

inyección tenían dos componentes, mientras que las evocadas en otros puntos

presentaban un único componente.

j50nA

Figura 22: Aphcaciones de ACh en el hemisferio animal (A) o vegetal (B). C) Derivada de lascorrientes mostradas en A y B en una escala de tiempo expandida. Aparecen dos picos en la derivada dela corrienúe evocada en el hemisferio vegetal, y uno cuando la aplicación se hizo en el hemisferio animal.[¿s flechas indican la apücación de ACh.

1.3.6.2- orientación de los nAChRs en la membrana del ovocito.

Una vez comprobadas las propiedades funcionales de los receproresmicroinyectados, se procedió al estudio de la orientación de los mismos en lamembrana del ovocito.

Para ello, se aplicó en 3 ovocitos, mediante una pipeta y de forma localizada,ACh I mM en las proximidades de la membrana, primero en el espacio extracelular ydespués en el intracelular (ver lVkteriales y lWtodos, apartado II-5.3). Un ejemplorepresentativo se presenüa en la Figura 23.

BA

C

78



RxuIbfu

Del experimento se deduce que, al menos la mayoría de los receptores

funcionales esf,ín orientados de la forma correcta, es decir, con la parte extracelular

del receptor dirigida al espacio extracelular, ya que sólo se evoca respuesta cuando la

aplicación se realiza en la superficie externa del ovocito. La aplicación intracelular

originó unos picos en el registro de corriente, que representan artefactos debidos al

incremento de la presión en el interior del ovocito por la aplicación del agonista.

C

Figura 23: Aplicaciones locales de ACh en el hemisferio vegetal de un ovocito cuyo potencial demembrana se flió a -60 mV. A) I¿s aplicaciones de ACh en el espacio exhacelular inducen una corrientetransitoria' B) Las aplicaciones de ACh en el espacio intracelular no producen ningún efecto. Nóúese losnípidos arüefacúos que siguen a los pulsos de ACh. C) Las respuestas se repiten tras volver a aplicar AChen el espacio extracelular. I¿s flechas indican el momento de la aplicación de ACh.

A

B

2 0 s

79



CanítuIo I

La purificación de la P-gp utilizó como material biológico de partida la

sublínea Ll2t0/160 de leucemia de ratón, gu€ presenta una elevada expresión de la

P-gp en su membrana celular (103).

La fracción celular de partida la constituyó la fracción microsomal de dichascélulas obtenida de acuerdo con el procedimiento descrito en Iulateriales y trulétodos,

apafiado III-1.1. I¿ selección de los detergentes empleados en los estudios desolubilización se hizo atendiendo a aquellos que preservan la actividad ATP-asa de la

P-gp (2, 70,71,72,76).

2.t- 1" ETAPA DE PURIFTCACIÓN DE LA p-gp.

La elección de las condiciones para la solubilización de la fracción microsomalse realizó en base a la eficacia de sotubilización por cada detergente de la proteína

total y de la P-gp.

El estudio de la solubilización de la fracción microsomal de las células LI2l0se inició con Colato de sodio, un detergente derivado de las sales biliares y de carácteriónico. Se eligió como tiempo de solubilización 30 min, émpleando criterios basadosen experiencias anteriores y en datos que aparecen en la literatura (154, 170).Posteriormente, experimentos puntuales a 60 min, confirmaron que la eficaciasolubilizadora del detergente no mejoraba con el tiempo de incubación, si bien sepodla favorecer la desnaturalización de la proteína debido al carácter iónico deldetergente.

Seguidamente se procedió al estudio del efecto de la relaciónproteína:detergente (w/w) en la solubilización. Alícuotas a concentraciones deproteína de l, 2 y 5 mg/ml se solubiüzaron empleando distintas relacionesproteína:detergente (w/w) en un rango entre 1:0,25 y 1:15. De forma global, larepresentación del porcentaje de proteína solubilizada por Colato de sodio utilizando

8t)



muestras con distinta concentración de proteína y a distintas relacionesproteína:detergente se presenta en la siguiente figura:

IPROTEINAI (mglml)

F gura 24: Represenüación del porcentaje de proteína solubilizada por Colaüo de sodio de la frawiónmicrosomal de las células LI2LalL6a, a distintas concenhaciones de proteína y diversas relacionesproteína: detergente (dw).

I-a' ptoteína solubilizada represenüa alrededor del 20 7o cuando se utiliza unabaja relación proteína:detergente (1:1). Conforme se incrementa la proporción deldetergente en dicha relación, el porcentaje de proteína solubilizada aumenta y paravalores de 1:10 y 1:15, el porcentaje de proteína solubilizada se situa entre el75-80%.

En base a los resultados anteriores, se escogió para solubilizar la fracciónmicrosomal, una relación 1:10 (protefna:detergente) debido a que si se emplea menosdetergente, el porcentaje de proteína solubitizada disminuye. por el contrario,relaciones mayores podían favorecer los procesos de desnaturalización.

A continuación se determinó si la P-gp se tocalizaba en la fracción solubilizadapor Colato de sodio o por el contrario permanecía en la fracción insoluble. En laFigura 25 se presentan las inmunotransferencias correspondientes a los sobrenadantesy sedimentos de muestras de la fracción microsomal de las élulas Ll2\Ollffi tras eltratamiento con el detergente en una relación proteína:detergente de l:10 y posteriorcentrifugación.

NFl

f-r-¡

a

zt r'l

F

s

pmt:det (w:rv)I l : l. l sa l:10Y 1:15

v ^ y ¡ t r ¡ a- ^

l f a

^-JtÉ a

t¡r

E1



CanltuIo I

f - h $'p**$ ' l l

Figura 25: Deúección de la Fgp por inmunotransferencia usando el anticuerpo monoclonal C-219 en lafracción microsomal (fm) y en las fracciones soluble (S) e insoluble (P) de Colato de sodiocorrespondiente alas células LIAAlrc0. Las calles contienen 1O ¡rg de proteína y fueron solubilizadascon una relación proúeína:detergente de 1:10. (*) indica la banda que corresponde a la P-gp.

En la Figura 25 se puede observar que toda la P-gp presente en la fracción

microsomal apare,c,e enla fracción insoluble, no detectándose la presencia de la misma

en la fase soluble de Colato, a pesar de la elevada relación proteína:detergente (1:10)

(w/w) capaz de solubilizar un 80% de la proteína total de la fracción microsomal.

A continuación se probaron otros dos detergentes, CHAPS y Zwittergent 3-12,

detergentes de tipo zwitteriónico con escaso efecto sobre la desnaturalízaciín de lasproteínas. Los estudios se basaron en los experimentos previos de la solubilización por

Colato de sodio, de este modo se eligió el tiempo de incubación de 30 min y elproceso se realizó a 4oC.

Alicuotas de 2 mg/ml se solubilizaron a distinfas relaciones proteína:detergente

(w/w) que oscilaban entre 1:1 y 1:10. Los resultados de la solubilización de la P-gp

contenida en la fracción microsomal de las células LL2lDlLffi por cada uno de los

detergenües en función de Ia relación proteína:detergente se muestran en la Figura 26,

donde se presentan las alicuotas más representativas de dicho estudio.

82



Rer,ulá.dm

ün;

l':m -,Ft P2

m*gtt

figura 26: Detección de la P-gp por inmunotransferencia en la fracción microsomal (frn) y en lasdistintas fracciones solubles (S) e insolubles (P) obüenidas tras la solubilización con: A: CHAPS a lasrelaciones proteína:deiergente: 1:0,5 (1) y 1:10 (2) y B: Zwittergent 3-12 a las relacionesproüeína:detergente 1:1 (1) y 1:3 (2). I.as calles contienen 10 pg de proteína. (*) indica la banda quecorresponde a la P-gp.

De la Figura 26 *, desprende que tanto CHAPS como Zwittergent 3-12

solubilizan sólo parcialmente la P-gp en todo el rango de las relaciones

proteina:detergente (w/w) estudiadas, no produciéndose en ningún momento una

solubilización preferencial de la P-gp en una de las dos fases.

Consecuentemente, de los tres detergentes utilizados, CHAPS, Zwittergent 3-

12 y Colato, el escogido va a ser Colato de sodio, debido a que toda la p-gp

detectable aparece exclusivamente en Ia fraccíón insoluble del. detergente, que

representa aproximadamente eI2O% de Ia protefna total.

2.2- 2 ETAPA DE PIIRTFICACTÓN DE LA p-gp.

Después de haber solubilizado el 80% de la proteína inicial en la fracción

microsomal y haber "concentrado" toda la P-gp en el sedimento insoluble por Colato

de sodio, se procedió a la búsqueda de un detergente aapaz de solubilizu la P-gp. En

esta etapa se volvieron a emplear los otros dos detergentes, CHAPS y Zwittergent

3-12, usados en la primera etapa de purificación.

Las condiciones fueron las mismas que se emplearon en la primera etapa, es

decir, 30 min de incubación a 4oC. Iá concentración de proteína inicial se mantuvo

E3



Capíútlo I

entre 1 y 2 mglml a distintas relaciones proteína:detergente en un rango que iba desde

l : I hasta 1: 15.

A continuación se presentan en las siguientes inmunotransferencias los

resultados más representativos de la solubilízación de la P-gp por cada uno de los dos

detergentes:

rsr#iE

f;ii *

Flgura 27: Inmunodeüección de la P-gp en distintas fracciones solubles (S) e insolubles (P) por: A:CHAPS a relaciones 1:5 (1), 1:10 (2) y 1:15 (3). tás calles contienen 10 ¡rg de proteína. B: Zwittergent3-12. Ia primera calle contiene Q pg y la segunda 10 pg de proteína. Se empleó una relaciónproúeína:detergenúe de 1:5. (*) indica la banda que corresponde a la p-gp.

Tal como se observa en la Figura 27, la incubación de la fracción insoluble por

Colato con CHAPS solubiliza muy poca P-gp, y no se consigue mejorar el grado desolubilización cuando se disminuyelarelación proteína:detergente (panel A, calles 2 y3). En cambio, cuando la incubación se realiza con Zwittergent 3-12, aparece la P-gpexclusivamente en el sobrenadante, no detectándose en la fracción insoluble (panel B).

El empleo de N-octilglucósido o Nonidet P-40, dos detergentes de tipo noiónico utilizados también en el aislamiento de complejos proteícos y estudios dereconstitución, no mejoró el rendimiento de solubilización de la P-gp de la fracciónresulüante del primer paso de purificación.

Por tanto, de los detergentes estudiados para la solubilizaciÍn de la P-gpprocedente de la fracxión insoluble por colato, se elige Zwittergent 3-12, por ser elúnico capaz de conseguir solubilizar con un alto rendimiento la p-gp.

M



Rer¡uIfa.d¿ts

2.3. BALANCE GLOBAL DE LAS DOS ETAPAS DE PURIFICACIÓN DE LAP-gp-

En la siguiente figura se esquematiza el resultado de la purificación parcial de

la P-gp a partir de la fracción microsomal (fm) de las células Ll2l0ll60. La primera

etapa supone un tratamiento por Colato de sodio (relación proteína:detergente de 1:10

(w/w)) y obtención de la P-gp en ta fracción insoluble del detergente (P1). I¿

segunda etapa de solubilización de la fracción Pl por Zwittergent 3-12 (relación

proteína.detergente de 1::5 (w/w)) rindió la P-gp en la fracción soluble (S2).

12 3 4 5

1."'

6 kDa

- 200

- 116*97

66

Figura 28: Inmunodeüección de la P-gp en las distintas fracciones empleadas en la purificación de laP-Sp. 1) fracción microsomal de las células L1210/S, 2) fracción microsomal de las células LI2LO/I60,3 y 4) fracciones insoluble y soluble procedentes de la la etapa de purificación (solubilización conColato de sodio), 5 y 6) fracciones insoluble y soluble procedentes de Ia 27 etapa (solubilización conZwittergent3-12). I.as, calles L-4 contienen 5 ¡*g de proteína y las S y 6lO p"g.

El balance global del contenido relativo de la P-gp en cada una de las etapas depurificación se recoge en la siguiente tabla:

85



(aoúhtlo I

Contenido relativo

de proteína

Contenido relativo Factor de purificación

FRACCION

fm

P1

S2

1,0

0,2

0,1

de P-

1

* l

: Y I

aparente de P

I

=5

^ ,10

Tabla 3: Valores relativos de proüeína üotal y P-gp en cada una de las etapas de purificación de la P-gp.

I-os resultados de la purifiqción parcial de la P-gp concluyen que en la

fracción solubilizada con Zwittergent 3-12 (S2), la P-gp se encuentra purificada unas

10 veces con respecto a la fracción microsomal de partida (fm). Dado que no se

detecta la presencia de la P-gp por Western-Inmunotransferencia en ninguna de las dos

fracciones desechadas en la purificación (S1 y P2), el rendimiento conseguido en la

purificación puede considerarse satisfactorio.

86



Reslulá.dos

3- MEDIDAS DB FUNCIONALIDAD DE LA P-gp,

3.1- TNCORFORACTÓN On LA p-gp EN LA MEMBRANA DE OVOCTTOS.

El anrílisis de la funcionalidad de la P-gp se efectuó a través de la nueva

metodología que se presenta en esta Memoria (apartado II de Materiales y luIétodos) y

cuya efectividad ha sido comprobada en otra proteína de membrana, el nAChR (ver

págs 64-79 del apartado de Resultados de este Capítulo).

I-as muestras procedenúes tanto de la fracción microsomal de células L1210(fm) como de la primera etapa de purificación con Colato de sodio (Pt) (ver páginas

80-83) se inyectaron directamente en los ovocitos, mientras que las procedentes de la

solubilización por Zwittergent 3-12 (S2) (ver páginas 33-84) se sometieron,

previamente a ser inyectadas, a dirflisis exhaustiva para eliminar el detergente de la

muestra.

Inicialmente se procedió a determinar la inco¡poración de la P-gp en la

membrana del ovocito, púa lo cual, la membrana plasmática del ovocito se aisló

siguiendo el método descrito por Sadler y Maller (155). La presencia de la P-gp se

detectó mediante Western-Inmunotransferencia, tal como se ha venido describiendo enel apartado de Purificación de la P-gp.

ü

2Mw_ 200

t ' ' r ' t { - l 1 6

. -979 -66

_45

Figura 29: Irrmunodeüección de la P-gp en las Buestras de las membranas de: 1) 20 ovocitos sinnyetat. 2) 2O Ovociüos inyectados con 450 ng de proteína de Ia fracción Pl. (*) indica la banda quecorresponde a la P-gp.

87



CanítuIo L

Se puede observar en la figura anterior la presencia del marcaje

correspondiente a la P-gp únicamente en la calle 2, que es la que corresponde a los

ovocitos inyectados con la fracción Pl. De este resultado se desprenden dos hechos

importantes:

i) la membrana de los ovocitos no presenta niveles detectables de la P-gp.

ii) la P-gp inyectada se incorpora en la membrana del ovocito.

Además, aparece marcada una proteína de unos 90 kDa en las dos muestras, es

decir, una proteína perteneciente a la membrana nativa de los ovocitos. Se ha podido

comprobar que el marcaje se debe a que el anticuerpo secundario se une a dicha

proteína.

3.2- ACTTVIDAD DE LA p-gp COMO TRANSPORTADOR DE FÁRMACOS.

I¿ actividad de la P-gp como transportador de f¿írmacos se comprobó mediante

la incubación de los ovocitos inyectados con la fuaeción microsomal, P1 o 52

procedentes fanto de las células L121.0/160 (expresan P-gp) como de las células

L121.0/S (ovocitos controles), con una mezclade DNM y 3H-DNM.

En el 71,43 % de los ovocitos inyecados con fm, 85,7I% de los inyectados

con Pl y en el 83,33% de los inyectados con 52, se obtuvo una menor acumulación

de DNM en aquellos ovocitos que fueron inyectados con muestras que contenían la

P-gp. Los niveles de acumulación de DNM en ovocitos control (inyectados con

muestras sin la P-gp) y en ovocitos sin inyectar, fueron similares.

La adición de vRP (10-100 ¡rM), un reversor de Ia acumulación de

antraciclinas en las células MDR (68) al medio de incubación, provocó un incremento

en los niveles de acumulación de DNM en los ovocítos inyectados con la P-gp

respecto a los ovocitos controles. Curiosamente, los niveles de acumulación de DNM

en los ovocitos inyectados (independientemente de que la muestra inyectada

contuviera o no la P-gp) y tratados con VRP eran menores que los referentes a los

ovocitos sin inyectar.

A partir de los niveles intracelulares del fármaco, se calcularon los valores de

DNM transportada por la P-gp mediante la diferencia de los niveles intracelulares de

la antraciclina entre los ovocitos controles y los ovocitos inyectados con la P-gp. Tras

88



Rxulbdt¡^s

la norrnalización de estos valores frente a la cantidad de proteína inyectada se obtiene

Ia siguiente tabla:

Transporte de DNM

(pmoles DNNf/mg proteína)

MUESTRA DNM DNM + VRP

fm

P1

S2

236 + 33 (n: 5)

707 t 123 (n:10)

1554 + 336*** (n: 4)

153 + 55 (n:4)

259 + 165 (n:2)

N.D.

Tabla 4: Eflujo de DNM por la P-gp en ausencia y presencia de VRP (10-100 ¡rM) en ovocitos

inyecüados con fm (fracción microsomal), Pl (muestra procedente del ler paso de purificación) y 52(muestra producto del 20 paso de purificación). N. D. : No Deüerminado

I-os datos presentados en la Tabla 4 indican que:

i) los ovocitos inyectados con fracciones de membrana que contienen Ia P-gp

presentan actividad de transporte de DNM.

ii) Ia actividad transportadora se incrementa con el enriquecimiento de P-gp

en las muestras inyectadas: los ovocitos inyectados con la fracción 52 presentan una

mayor actividad transportadora que los inyectados con P1, y éstos a su vez una mayor

actividad que los inyectados con ftn (en este último caso el nivel de significación entre

los dos grupos se sitúa muy cerca de 0,05 concretamente p: 0,053).

iü) El transporte de DNM por la P-gp se ve reducido por la presencia de VRP

en el medio, confirmando un efecto específico del reversor sobre la actividad

transporüadora de la P-gp.

Una vez confirmada que las diversas muestras enriquecidas en P-gp yposteriormente inyectadas en ovocitos de knopus presenüan actividad de transporte defármacos, se procedió al estudio de la actividad de canal de cloruro reguladora devolumen celular asignada a la P-gp (128).

89



Caoftub I

4.I.- CORRIENTES NATTVAS ACTIVADAS POR HIPOTONICIDAD.

El aniílisis de la actividad de la P-gp como canal de cloruro activado por

volumen, se inició con el estudio de las corrientes nativas que se podían inducir en los

ovocitos de Xenopus laeuis en respuesta a cambios hipotónicos.

Las disoluciones empleadas para la activación de corrientes de cloruro por

hipotonicidad derivan de la disolución Ringer de Rana (RN), donde se ha disminuído

la concentración inicial de NaCl, de 115 mM en RN a 75 y 45 mM y de ahora en

adelante se denominaftín RH-75 y RH-45 respectivamente. En primer lugar se calculó

el valor de las osmolaridades de estas tres disoluciones, obteniéndose, para n: 2, los

siguientes valores: 220,5 + 3,5 mosm para RN; 150,0 + 0,0 mosm para RH-75 y

95,5 + 0,5 mOsm para RH-45, con 1o que se dispone de dos medios hipotónicos cuyas

osmolaridades se corresponden respetivamente con eI70Vo y 45% de la osmolaridad

del medio isotónico (RI.D.

El 48Vo (9 de 20) de los ovocitos a los que se les eliminó el epitelio ovárico

interno respondieron ante la exposición a un medio hipotónico (RH-75 o RH-45) con

la activación de una corriente iónica que, en general, se inicia con un componente desalida, debido fundamentalmente al movimiento a través de la membrana plasmática

de iones potasio (único ión cuyo potencial de equilibrio se sitúa a un valor más

negativo que el potencial de fijación de la membrana) seguido por un segundo

componente de entrada. Tanto la amplitud como los tamaños relativos de las dos fases

de la corriente fueron muy variables entre los ovocitos de diferentes donadores. [¿s

corrientes eran totalmente reversibles cuando el medio volvfa a ser RN y podían

evocarse varias veces en el mismo ovocito, aunque la amplitud en algunos ovocitos

disminuía tras las contínuas superfusiones con medio hipotónico. ["a Figura 30 ilustra

un registro contínuo del nivel de corriente y el cambio de conductancia de lamembrana de un folículo cuando se expone al medio hipotónico RH-45. Se pueden

observar en esta fi.gura los dos componentes de la corriente, el incremento de la

90



Res;ulk&x

conductancia en la membrana en el medio hipotónico y cómo la corriente regresa al

nivel inicial cuando se vuelve a superfundir con el medio isotónico.

RH-45

0 m V

Figura 30: Cambio en la conductancia de la membrana de un folículo ovárico al c¡mbiar el medio desuperfusión de RN a RH-45. El potenciat de membrana osciló continuamente en pulsos cuadrados entre-50 y -70 mV.

4.1.2- Características de Ia corriente.

En la Figura 31A se presenta un folículo al que se le aplicaron pulsos

despolarizantes de voltaje desde -100 mV hasta *80 mV, primero en el medioisotónico RN y a continuación en los medios hipotónicos RH-75 y RH-45 en los que

se observa una corriente que desaparece cuando se vuelve a superfundir con el medioisotónico (RN post.). Nótese que la amplitud de la corriente se incrementa con elgrado de hipotonicidad del medio de superfusión.

La Figura 318 representa el porcentaje de la corriente m¿íxima en función delvoltaje aplicado en dos medios con distinto grado de osmolaridad (RH-45 y RH-75).Como se puede observar en la curva UY,la corriente exhibe una cierta rectificación

hacia fuera.

91



RItl post

%CDRRIB{TEMAXIMA

-r-RH-75-o- RH45

Flgura 31: A) Corrienües evocadas por pulsos de voltaje de 800 ms en un ovociüo superfrrndido conRinger Normal (RN), Ringer Hipotónico (RH-75) y tras su vuelta a Ringer Normal (RN post) sesuperftrndió con Ringer Hipotónico (RH-45). En esta figura y en las que siguen, el nivel de base de losregistros de corriente en los medios hipotónicos ha sido desplazado hasta el misno nivel de loscorrespondienúes a los medios isotónicos. B) Relación I/V de las corrienües nehs evocadas en medioshipotónicos en 4 ovociios.

92



Res¡ulkús

El umbral de activación de la corriente se situó por encima del valor deosmolaridad del medio RH-75 (150 mosm) puesto, de estar presente, pudo sersiempre evocada en dicho medio.

El valor medio de la conductancia de la corriente activada por mediohipotónico, calculada entre -50 y -70 mv, fue de 4,10 + 1,00 pS (Rango: 2,65- 6,g0pS) en 4 ovocitos superfundidos en el medio hipotónico RH-75 y de 7,80 + 1,83 pS(Rango: 4,65- lz,w pS) en 4 ovocitos superfundidos en el medio RH-45 (p< 0,05test t de Student pareado).

'', La amplitud miíxima de las cofrientes activadas por RH-75 y RH-45 a *g0mV fue calculada mediante la extrapolación a t: 0, incluyéndose únicamente aquellosovocitos que fueron superfundidos previa y posteriormente con RN. El valor medio dela amplitud nr¡íxima fue de 1859 + 31.1 nA (Rango: 1134- 2997 nA) en 5 ovocirossuperfundidos en el medio hipotónico RH-75 y de 2326 + 4I9 nA (Rango: 1015- 3760nA) en 6 ovocitos superfundidos en el medio RH-45.

I'a cornente presenta una inactivación tiempo-voltaje-dependiente a potencialesmás positivos de + 10 mV (Figura 31A), es decir, su inactivación con el tiempo seincrementa con el aumento del potencial de membrana. La constante de tiempo deinactivación (c) calculada a +80 mV, es de 367 ms (n: l) en RH-75 y de 510 t 170ms (n: 4) en RH-45.

El potencial de reversión fue de -54 t 4 mv (n:4) para RH-45 y de -4g + 3mV (n: 4) par:a RH-75, (p< 0,05 test t de Student pareado). Esfos valores se sitlíanentre los valores de los potenciales de reversión de los iones potasio (-105 mV) ycloruro (próximo a 0 mV), 1o que implica la contribución de al menos dos canales enesta corriente, uno de potasio y otro de cloruro. I-os valores del potencial de reversiónobtenidos indican que la corriente presenüa una mayor conductancia relativa a potasioen el medio más hipotónico.

93



CapíAlo I

4.1.3- Efecto de fámracos antitulrrorales sol¡re la corriente.

La adición en el baño de superfusión de VRP 100 FM, o Quinidina 100¡rM,

sustratos que son transportados por la P-gp y que han sido descritos como inhibidores

de las corrientes activadas por volumen en las células NIH-3T3 que sobreexpresan

P-gp (128), no alteró las corrientes generadas en los folículos por el medio

hipotónico. Del mismo modo, la adición de otros sustratos transportados por P-gp

como DNM 3 ¡rM o Forskolina 100 pM, tarnpoco alteraron la corriente, aunque en el

caso de la Forskolina se observó una pequeña reducción en la amplitud de la

corriente. En la Figura 32 se ilustra un ejemplo represenlativo de un ovocito al que se

aplicó DNM 3 ¡rM después de haber activado la corriente mediante la superfusión del

mismo en RH-45. Posteriormente y tras lavado con el medio RN, el mismo ovocito se

superfundió por segunda vez en el medio RH-45 y entonces se aplicó VRP 100 ¡rM.Nótese que la presencia de estos sustratos no alteró la corriente activada por

hipotonicidad.

a.II-4s

5oo nA l_

fll mV70 mV

l min

DNM

Figura 32: Carnbio de conductancia de la membrana de un folículo ovárico al pasar de RN a RH-45. l¿aplicación de DNM 3 ¡,cM o VRP 100 pM en el medio RH-45 no produjo alúeraciones en la corriente

activada por hipotonicidad. El potencial de membrana se hizo oscilar entre -50 y -70 mV me<liantepulsos de corüa duración.

94



Besulttúts

4.1.4- Bfecto de la desfoliculación por colagenasa sobre la corriente.

Los folículos de knopus laeuis sufren un proceso de desfoliculación mediante

un tratamiento enzimático por colagenasa (apartado II-3 de lVfateriales y lWtodos)

antes de ser microinyectados con las distintas muestras.

Una vez tratados con colagenasa, se redujo tanto el porcentaje de los

donadores como el de los ovocitos que respondieron ante un medio hipotónico (RH-75

o RH-45) con la activación de una corriente iónica: de un 69% al25% (8 de 32) en

los donadores y de un46Vo all9Vo (15 de 77) en el caso de los ovocitos. También la

amplitud de la corriente disminuyó con respecto a los folículos, así, a + 80 mV y

t:0 ésta pasó desde 1859 + 311 nA hasta 752 +254 nA en 3 ovocitos

superfundidos en el medio RH-75, y desde 2326 + 419 nA hasta 939 +226 nA en 6

ovocitos superfundidos en el medio hipotónico RH-45, es decir, la amplitud se redujo

en un 6AVo debido al tratamiento de desfoliculación por colagenasa. Se han excluído

del cálculo de la amplitud de coniente, los ovocitos de un donador (XEN-250496) que

tuvieron corrientes especialmente grandes (hasta 8,8 ¡rA).Las demás características de la corriente no se alteraron con la desfoliculación

enzímática. En la siguiente figura se ilustra en el panel superior un ejemplo de los

registros de corriente de dos ovocitos desfoliculados enzimáticamente a los que se les

aplicaron pulsos despolarizantes de voltaje, desde -100 mv hasta +80 mV, en elmedio isotónico RN y en el medio hipotónico RH-45. En A se presenta un ovocitoque no respondió ante la exposición al medio hipotónico con la activación de unacorriente iónica, y en B un ovocito que si la presentó. Obsérvese que en este último

caso, la corriente presenta la misma morfología que la evocada en un ovocito al que

se le eliminó manualmente el epitelio oviírico, como se muestra en la Figura 31A. En

el panel inferior de la Figura 33, se presentan las curvas VV de ambos ovocitos, enlas que no se aprecia una variación de la conductancia del ovocito A ante la

exposición del mismo a un medio hipotónico, mientras que si se aprecia en el caso del

ovocito B. Nótese que la curva I/V correspondiente al ovocito del panel inferior es

similar a la obtenida en los folículos (Figura 31B).

9s



{:asihtfu I

VOLTAJE (mV)

F¡gur¿ 33: Corrientes evocadas por pulsos de voltaje de 800 rns en dos ovocitos desfoliculadosenzimáticamente y superfundidos con Ringer Normal (RN), Ringer Hipotónico (RH-45) y vuelta aRinger Nonnal (RN post). Obsérvese la aparición de una corriente activada por cambio de volumencuando se superfrrnde el ovocito A con el medio RH-45 y la ausencia de ta misma cuando essuperfundido con el mismo medio el ovocito B. C) Relación VV de las corrientes evocadas por mediohipotónico en los dos ovocitos A y B.

96



RcsulA&s

4.2- CORRIENTES EN OVOCITOS INYECTADOS CON LA P-gp.

Después de haber estudiado las corrientes nativas activadas por hipotonicidad,

se procedió al estudio de este tipo de corrientes en ovocitos previamente inyectados en

muestras que contienen la P-gp y los resultados se compararon con los obtenidos con

el estudio de las corrientes nativas. El estudio se amplió a ovocitos inyectados con

muestra procedente de las células sensibles que no conúene la P-gp, (control) y a

ovocitos inyectados con muestra de diversos grados de riqueza en P-gp (Pgp+). El

medio hipotónico empleado en la rnayoría de los,estudios fue RH-45 puesto que el

tamaño de las corrientes evocadas son mayores en este medio que en el medio RH-75.

En el 90Vo (36 de 40) de los ovocitos control y en el 94% (169 de 179) de los

ovocitos Pgp+ no hubo activación de una corriente cuando las cáulas se

superfundieron en el medio RH-45. Este hecho podría deberse a que las muestras

inyectadas hubieran perdido su funcionalidad en el proceso de obtención, purificación

o se hubieran hidrolizado en el interior del ovocito.

\ ih:-100mV

RH-75

40mVl250 ms

RH.45

25onAL500 rrs

Figura 34: Ausencia de la acüvación de rna corrriente por cambio de volumen en un ovocito inyectadocon fracción Pl, zuperñrndido con medio isotónico (RN) y con dos medios hipotónicos (RH-75 yRH-45). l:s corrientes se registraron mediante la aplicación de pulsos de voltaje desde -l0O mV hesta

* 80 mV (margen zuperior derecho).

97



eaúailo t

No obstante, se pudo comprobar que las muestras mantenían al menos la

funcionalidad transportadora de la P-gp mediante registros simult-¿íneos de transporte

de fármacos y de corriente activada por hipotonicidad. Así, en 6 experimentos donde

se obtuvo una menor acumulación intracelular de DNM en los ovocitos inyectados con

la P-gp (74% de acumulación) con relación a los ovocitos controles (100% de

acumulación), hecho que evidenciaba la incorporación funcional de la P-gp en el

ovocito, no se evocó corriente alguna en el medio hipotónico. En la Figura 34 se

ilustra un ejemplo de un ovocito Pgp+ perteneciente a un grupo en el que se

comprobó la actividad transportadora de DNM y que no se evocan corrientes de

membrana al superfundir la célula con medios hipotónicos.

Vl¡= -lfi) mV

Figura 35: Corrientes evocadas por cambio de volumen en: (A) ovocito control y @) ovocito inyectadocon fracción Pl en RH-45. l¿s corrientes se registraron mediante la aplicación de pulsos de voltajedesde -100 mV hasta + 80 mV (margen superior derecho).

A pesar de que el resultado recogido en la Figura 34 es el mayoritariamente

obtenido, en algunos casos se pudo observar una corriente inducida por choquehipotónico. Así, en el 6% (8 de L25), 4% (2 de 50) y 0% (0 de 4) de los ovocitos

tratados con colagenasa e inyectados con muestras de las fracciones fm, Pl y 52

RII45 Rl{ post

98



Rxulkdos

respectivamente, y en el l0% (4 de 40) de los inyectados con muestra control, se

evocó una corriente activada por el medio hipotónico RH-45. En la Figura 35 se

ilustra un ejemplo de un ovocito control y uno Pgp+ que respondieron ante la

superfusión en un rnedio hipotónico con un incremento en la conductancia de la

membrana.

4.2.1"- Características de 14 corriente.

Las características de la corriente evocada en medio hipotónico en los ovocitos

Pgp+ son indistiguibles de las de la corriente nativa, tal como se puede comprobar en

la Figura 36.

%ORRIA\TEMÁXIMA

-r-Noiny.-O*tgr+

Ftgura 36: Relación VV de las corrientes netas evoc¿das en medios RH-45 en ovocitos tratados concolagenasa y no inyectados (n: 13) y en ovoci0os Pgp+ (n: 8).

[¿s dos curvas I/V se solapan a 1o largo de todo el rango de voltaje analizado.

I-a constante de tiempo de inactivación (t) en medio RH-45 a *80 mV fue de 621 X

57 ms (n* 2) y 354 + 63 ms (n: 10) respectivamente para los ovocitos control y

Pgp+. Estos valores no difieren significativamente (p> 0,05) de los obtenidos en los

ovocitos no inyectados (331 + 47 ms, n: 13), lo que significa que las características

99



Capífrtlo I

del canal sllpuestamente adicionado en las muestras inyectadas coinciden con las del

canal nativo de los ovocitos.

Como la arnplitud de las corrientes es directamente proporcional al número de

iones que cruzan la membrana celular, la cantidad de corriente debería ser

proporcional al número de canales existentes. De acuerdo con ello, si la P-gp fuese un

canal, la amplitud de la corriente evocada en medio hipotónico debeía ser mayor en

los ovocitos inyectados con la P-gp y además debería correlacionarse con el grado de

riqueza en P-gp de las muestras inyectadas.

Para comprobar si realmente la amplitud de la corriente se veía afectada por la

presencia de la P-gp en la membrana de los ovocitos, se inyectaron muestras con

distinto grado de contenido en P*gp, (fm y Pl) y se calculó la amplitud de la corriente

en medio RH-45, en las mismas condiciones en las que se determinó la corriente

nativa. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5:

FRACCIÓN AMPLITUD (nA)

793 x lW (n: 2)

893 L269 (n: 7)

788 x253 (n: 2)

Tabla 5: Valores de arnplitud de la corriente (nA) evocada en medio hipotónico RH-45 a un potencial de+ 80 mV y a t:0 en función del grado de riqueza en P-gp de las mueshas inyectadas en los ovocitos.

Los valores de la amplitud de la corriente en los ovocitos inyectados confracción fm o Pl no difieren significativamente (p> 0,05) de los obtenidos en los

ovocitos inyectados con muestra control y los no inyectados y tratados con colagenasa(939 t 247 nA). Es decir, la incorporación de la P-gp en la membrana del ovocito no

altera en absoluto la amplitud de la corriente nativa. Consecuentemente se deduce que

la P-gp no represente un canal iónico activado por volumen.

control

fm

P1

r00



Rer¡ul&tfus

4.2.2- Efecto del donador en la aparición de la corriente.

En el pequeño porcentaje de ovocitos inyectados con la P-gp en los que se

indujo una corriente por hipotonicidad, se analizó la respuesta en función del donador

(ovocitos extraídos de un sapo en una fecha determinada). L,os result¿dos se recogen

en la siguiente tabla:

DONADOR NO

INYECTADO

INIYECTADO

CONTROL

INYECTADO

Pgp+

xEN-28/09/92

xEN-12/10/92

xEN-19/10/92

xEN-23/11/92

0(0de2)

0 (0de1)

0 (0de3)

0 (0de2)

2 (2de3)

1 (1de3)

0 (0de5)

0 (0de1)

1 (1de5)

3(3de6)

2(2de3)

2 (2 de23)

2(2de9)

2Qdea)XEN-03/10/94 2 (2 de2)

Tabla 6: Número de casos entre diversos donadores en que se evocó corriente activada porhipotonicidad. Sólo se tabulan aquellos donadores que dieron corriente en ovocitos inyectados con laP-gp.

En 3 de los donadores, aparece corriente activada por hipotonicidad además delos ovocitos inyectados con la P-gp, en los ovocitos de uno o los dos otros grupos. En

cambio, en 2 de los donadores, XEN-1yrc192 y XEN-23111192 sólo aparece la

corriente activada por hipotonicidad en los ovocitos inyectados con muestra que

contiene la P-gp. Pero, dada que la probabilidad estimada de aparición es del 9% para

XEN-19/10192 y del 22Vo para XEN-23111192, se deberían de haber analizado unmínimo de 11 y 5 ovocitos control o no inyectados en cada uno de los donadores parapoder estadísticamente detectar la corriente activada por medio hipotónico en algúnovocito.

101



DISCUSIÓN



&pítuIa I

DEL OVOCITO-,

La incorporación de proteínas de membrana a través de sistemas vesiculares en

células huesped por microinyección representa una vía original que abre nuevas

posibilidades en la caracterización de la actividad funcional de las proteínas de

membrana y de sus mecanismos de regulación.

Esta vía de incorporación funcional de proteínas en células huésped, como

alternativa a la inyección del correspondiente ADNc o ARNm puede resultar

especialmente útil en:

i/ El estudio de los receptores heteroméricos, donde se requiere tanto de la

expresión de cada una de las diferentes subunidades que 1o componen como de su

posterior correcto ensamblaje con la estequiometla adecuada para que sean

funcionales (1.71, 172). Existen en laliteratura cont¡adicciones en resultados a partir

de experimentos aparentemente similares, de expresión de receptores heteroméricos,

por ejemplo distinto número de conductancias en ovocitos inyectados con los ARNm

de las subunidadeS cr, F, y y 6 del nAChR de ratón (173, 174).

ii) Aquellos casos donde el procesado del producto final, esto es la proteína,

pueda experimentar modificaciones postransduccionales. El sistema de los ovocitos

ampliamente utllizado en experimentos de transfección (175), podría no disponer o no

suministrar la requerida maquinaria celular para la elaboración correcta de la proteína

a expresar. Esto podría conducir a que las propiedades de la proteína expresada en los

ovocitos fueran distintas de las de la proteína nativa. Por ejemplo, el nAChR de la

electroplaca de Tbrpedo expresado en ovocitos contiene menor número de residuos de

manosa y oligosac¿{ridos complejos que el receptor nativo, desconociéndose si estos

alteran las características funcionales del canal (176). Por otra parte, el canal de sodio

de Electrcphorus no puede ser funcionalmente expresado en ovocitos debido a una

deficiencia en el procesamiento (177). Otro ejemplo 1o constituye el canal de sodio de

cerebro de rata que presenta diferencias en la cinética de inactivación una vez

expresado en ovocitos (178, 179, 180).

103



Discusión

iii) El estudio de los mecanismos

membranas en una célula viva, ya que la

vehículo lipídico a tal fin.

La validación de esta nueva estrategia experimental de transplantar proteínas se

ha realizado mediante el empleo del nAChR. La elección de este receptor se basó en

los tres siguientes hechos: ser el mejor canal iónico catacterizado; tratarse de una

proteína mayoritaria en la electroplaca del pez Tbrpedo marmorata, lo que facilita su

purificación; y poder ser ser aislado y reconstituído en membranas artificiales

manteniendo sus propiedades funcionales (181, 182, 183).

1.1- INCORPORACIÓN DEL NAChR EN I,A MEMBRANA DEL OVOCITO

La incorporación del nAChR en la membrana del ovocito se demuestra de

forma explícita mediante el bloqueo con atropina de los receptores muscaínicos

nativos (Figura 13). Este proceso se efectúa en pocas horas, puesto que la presencia

de los nAChRs puede ser detectada electrofisiológicamente transcurridas 4 horas de la

microinyección, no descaruíndose la presencia de algunos receptores en la membrana

con anterioridad a ese tiempo. De hecho, Marsal y cols. (184) describen, de formaparalela a nuestros resultados, la presencia de los nAChRs entre 1 y 2 horas después

de la inyección de membranas enriquecidas en los ovocitos. La razón por la cual no serealizaron registros anteriores a las 4 horas estriba en la fragilidad de las células por

presentar aún la herida de la inyección y en la necesidad de que presenüasen una larga

supervivencia para poder realizar el estudio temporal de la incorporación en la misma

célula.

Se obtuvieron respuestas a ACh en los ovocitos inyectados hasta 60 horasdespués de haber inyectado la muestra, observándose un máximo en las respuestas

entre las 16 y 24 horas (membrana alcalina) y 16 horas (nAChR reconstituído),

valores que no se diferencian de los obtenidos por Marsal y cols. quienes describenque las respuestas permanecen durante varios días produciéndose un incremento de laamplitud a 1o largo de las primeras L6 horas (184). Estos resultados sugieren que la

composición lipídica de las diversas muestras inyectadas no parece ser determinante

del curso temporal de la incorporación, puesto que las distintas muestras presenran

una diferente composición lipídica.

implicados en los procesos de fusión

proteína exógena a incorporar utiliza

de

un

r04



Canítulo I

Las amplitudes de las respueslas evocadas por ACh en los ovocitos fueron muy

variables, tanto en los ovocitos inyectados con membrana purificada como en los

inyectados con receptor reconstituído, coincidiendo también con los datos de Marsal y

cols. (184). Se observa, sin embargo, que éstas dependen del grado de pureza de las

muestras y de la cantidad de muestra inyectada: al duplicar tanto la concentración del

nAChR (de 4 a 8 nmoles de a-bungarotoxina (142)), como el volumen de las

muestras (de 50 a 100 nl), el tamaño de las respuestas se multiplica por 6.

Adicionalmente, no todos los ovocitos presentaron un sólo máximo de corriente,

observándose en algunos de ellos la presencia de dos máximos relativos. Por el

momento se desconocen los motivos que implican tal diversidad en la respuesta,

pudiendo ser la heterogeneidad de las vesículas inyectadas, tanto en su tamaño como

en la cantidad de receptor, uno de los factores que influiían en la amplitud de las

respuestas, puesto que se ha demostrado que ovocitos de distintos donadores se

comportan de forma similar (Tabla 1).

Aunque las amplitudes de la corriente asociada a los receptores incorporados

son grandes, usualmente de cientos de nanoamperios, las respuestas corresponden sólo

a un número pequeño de los receptores microínyectados. De hecho, el número

estimado de receptores funcionales incorporados a partir de los registros

electrofisiológicos se corresponden con unos pocos millones de los aproximadamente

6 x 1010 receptores que se inyectan en el ovocito (determinados por la unión de

o-bungarotoxina). Es decir, sólo 1 de cada 105 receptores inyectados aparece como unreceptor funcional en la membrana del ovocito. Esta observación puede deberse a:

i) Infuaestimación del número total de los receptores funcionales incorporados

debido a la nípida desensibilización inducida por altas concentraciones de ACh.

Usando la ecuación de Hill y asumiendo un coeficiente de Hill de 2 (i85) se puede

estimar una mayor amplitud de la corriente, entre 2 y 3 veces mayor que la medidadirectamente.

iil fa' inserción de algunos nAChRs en diferentes organelas intracelularespuede conducir a registros electrofisiológicos silentes.

iiil Que una vez que los receptores se insertan en la membrana citoplasmáticapueden sufrir una r:ípido recambio que resultaría en una menor respuesta de laesperada tras la simultiínea incorporación de todos ios receptores inyectados(recordemos que las respuestas permanecen más de 60 horas después de lamicroinyección).

10s



Díscusíón

irl Que algunos de los nAChRs pueden ser "silentes", Íro filncionales, tal como

ha sido propuesto para los nAChRs de músculo expresados en la membrana del

ovocito después de la inyección de poli-A (160) o a que han sufrido desnaturalizacíón

durante los procesos de purificación y reconstitución.

v) Una tápida degradación de los receptores dentro de la célula, por 1o que

sólo una pequeña fracción de ellos alcanzaría la membrana.

Desde luego, es posible que más de uno de estos factores contribuyan a la

discrepancia observada. Estas y otras posibilidades van a requerir un mayor estudio,pero es evidente que el número de receptores incorporados es suficientepara permitir

su estudio funcional en detalle. :

Está perfectamente demostrado que los nAChRs resultantes de la inyección delos correspondientes ARNm, se orienüan coraectamente en la membrana del ovocito y

no se distribuyen de forma aleatoria en la superficie de la célula (136). Cuando semapeó la incorporación de los nAChRs reconstituidos en la membrana del ovocito se

encontró que aparecen como pequeños parches distribuídos de forma desigual en losdos hemisferios del ovocito, apareciendo una mayor densidad de parches cerca de lazona de inyección, probablemente debido a la mayor concentración de vesículas quecontienen el receptor en esa zona. La densidad de nAChRs en cada parche fueprobablemente similar en ambos hemisferios debido a que las corrientes evocadas por

aplicaciones locales de ACh en las ¿íreas estudiadas, mostraron las pendientes

máximas similares.

Aunque los ensayos con ACh inyectada indican que los receptores seincorporan con la orientación corcecta, no se excluye completamente la posibilidad deque se presente una incorporación errónea en aquellas áreas donde la respuesta a AChextracelular resultó muy pequeña o nula. Se descarta, sin embargo, que la ausencia derespuesta al inyectar ACh en el interior del ovocito se deba a la hidrólisis de la mismapor esterasas intracelulares, puesto que no se conoce la presencia de acetilcolinesterasaen los ovocitos. Además, la hidrólisis por esterasas inespecíficas del ovocito, debidotanto a su baja especificidad relativa por la ACh como a la cantidad que se inyecta, nosería 1o suficientemente rápida como para impedir la apertura de aquellos canalesiónicos asociados a los receptores que estuvieran próximos al lugar de aplicación.

IM



Caoíútkt I

1.2- CARACTERISTICAS FUNCIONALES DEL nAChR INCORPORADO.

Las propiedades funcionales de los nAChRs incorporados resultan similares a

las previamente descritas para los nAChRs de Tbrpedo expresados en ovocitos a partir

de sus ARNm o ADNc (160, 164). Así, de la curva dosis-respuesta se obtiene un

coeficiente de Hill cercano a 2 lo que implica una cooperatividad de unión de ACh a

cada una de las dos subunidades c[ presentes en cada receptor para la apertura del

canal (161). El potencial de reversión de -5 mV indica que la permeabilidad del canal

es similar a la previamente descrita para los nAChRs procedentes tanto de ADNc

como de ARNm de Tbrpedo en ovocitos (165, 166), confirmando que la mayor parte

de la corriente parece debida al paso de iones sodio y potasio. Podría tambien tener

cierta permeabilidad a iones calcio pero ésta parece ser menor que la que describen

Mishina y cols. (187) quienes activaban una corriente nativa de cloruro dependiente

de calcio y aumentaban el potencial de reversión a valores más negativos.

La relación I/V obtenida durante la meseta de la corriente inducida por una

baja dosis de ACh (Figura 20B) muestra un potencial de reversión similar al obtenido

en el pico de la corriente, indicando una selectividad iónica similar en ambas fases de

la respuesta. Por otra parte, es de destacar la marcada rectificación de los canales delos nAChRs a potenciales más negativos de -60 mV, hecho que no se ha descritopreviamente en los nAChRs expresados en ovocitos a partir det ADNc de Tbrpedo,que presentan una relación casi lineal (164). Sin embargo, una rectificación similar seha descrito para los nAChRs procedentes de músculo cuando se expresan en ovocitos.Este hecho ha sido adscrito a una dependencia de voltaje del tiempo medio de aperturadel canal (160, t64). La razón por la que se presenta una alta variabilidad en larelación I/V esüí aún por determinar. No obstante, es muy sugerente especular que

esta diferencia funcional entre los nAChRs sintetizados en el ovocito a partir delADNo y aquellos directamente "transplantados" de la electroplaca pudiera deberse a ladistinta glicosilación que posean ambos (176, 188).

La rápída desensibiliz.ación de los nAChRs de Tbrpedo (168) ha sido asimismoobservada en los nAChRs incorporados vía vesicular. De manera interesante, losefectos de los antibióticos como Gentamicina o Penicilina-Estreptomicina en lascorrientes inducidas por ACh, fueron similares a las descritas en el caso de losreceptores procedentes de ADNc (169). Este hecho podía deberse a una directa

107



Discusión

acción sobre el mismo nAChR, o sobre un efector que regule al receptor, en lugar de

alguna alteración en el procesamiento del receptor por parte del ovocito.

El efecto delatrehalosa en la desensibtlización de la corriente se observó sólo

en aquellos ovocitos incubados con Penicilina-Estreptomicina. Puesto que la trehalosa

sin la presencia de antibióticos no produjo ningún efecto en la desensibilización,'se

sugiere que el crioprotector podría actuar sobre el mismo mecanismo por el cual

Penicilina-Estreptomicina inducen u na rápida desensibili zación.

Finalmente, el sistema de incorporación de proteínas de membrana a través de

sistemas vesiculares admite el uso de muestras recién procesadas y muestras

congeladas, ya que no se han observado diferencias significativas entre las respuestas

obtenidas cuando la muestra se inyectó recién obtenida y cuando se inyectó después de

ser congelada en nitrogeno líquido en presencia de un crioprotector (trehalosa). Así, apartir de varias alícuotas de una misma muestra se pueden rcalizar un gran número de

ensayos sin la incomodidad de tener que inyectar material recién procesado.

Los resultados obtenidos con el nAChR de Tbrydo inyectado vía vesicular en

ovocitos posibilita el estudio de la función y regulación de proteínas de membrana(enzimas, canales o receptores) en un sistema celular distinto del nativo. Como

ejemplo de ello, en la presente Memoria, se recogen los estudios funcionales

efectuados con la Glicoproteína-P, proteína involucrada en el fenotipo de resistencia a

múltiples fármacos que presentan las células tumorales.

r08



Capltulo I

2- PURIFICACION DE LA P-sp.

Los diversos grupos de investigación dedicados a la purificación de la P-gp se

han encontrado con numerosas dificultades para su consecución: desde la formación

de agregados y unión irreversible (en el caso de columnas de intercambio iónico (77,

78)); a una pobre eficacia (cromatografía de inmunoafinídad (77)); heterogeneidad en

la glicosilación (cromatografía de afinidad con lectinas (2)). Por todo ello, se escogió

como estrategia de purificación una solubilízación secuencial con dos detergentes

distintos.

Se utilizó como material de partida la fracción microsomal de las células

Ll2l0/160 resistentes a Ia antraciclina Daunomicina en lugar de la fracción de

membrana plasmática para minimizar tanto las pérdidas en proteína como el tiempo de

experimentación. I¿ elección de los detergentes empleados se basó en estudios previos

de purificación de la P-gp por otros grupos (2,70,71,72,76), en los que se concluyeque los detergentes que mejor preservan la función ATP-ásica de la P-gp son CHAPS,

Colato de sodio, Tritón x-100, Lubrol PX, c12E8, Zwittergent 3-lZ, quedando

controvertida la acción de N-octilglucósido (71). Por nuestra pafie, los detergentes

utilizados fueron CHAPS, Colato de sodio y Zwittergent 3-12 cuya acción sobre la

actividad transportadora de la proteína es desconocida. Zwittergent 3-12 aparcce comoun detergente prometedor, dado que se ha determinado su gran eficacia solubilizadora

de P-gp en membranas de células CHRB3O (76).

Los resultados de la solubilización de Ia P-gp por CHAPS a partir de fracción

microsomal coinciden con los obtenidos por ei grupo de Doige y cols. (70) en cuanto

a que no se consigue la solubilización total de la P-gp (Figura 26A), a pesar deutilizar altas concentraciones de detergente. Los datos de solubilización con Colato desodio discrepan de los obtenidos por Hamada y Tsuruo (77) en cuanto a que esrosautores logtan una cierta solubilización de la P-gp, hecho no reproducido en nuestro

caso. Del mismo modo, Zwittergent3-12 que parece solubilizar totalmente a la P-gp apartir de membranas de células CHRB3O, sólo consigue solubilizarla parcíalmente dela fracción microsomal de las células Ll2l0lt60 (Figura 268). Estas diferencias en la

109



Discusión

solubilización de la P-gp son probablemente debidas a la diferente composición

lipídica de las membranas de las células empleadas como material biológico de

partida.

De todo el proceso de purificación, cabe reseñar que:

il Se ha obtenido en dos etapas sucesivas de solubilización una muestra

enriquecida =10 veces en P-gp, lo que supone un notable avance debido al hecho de

que se trata de una proteína minoritana y fuertemente anclada en la membrana

(recuérdese que presenta en su estructura 12 segmentos transmembrana).

iil Se dispone de tres fracciones con distinto grado de riqueza en P-gp, con las

que se puede estudiar la funcionalidad de la misma mediante la nueva técnica de

incorporación funcional de proteínas en ovocitos.

iu) EI coste de la purificación no es elevado, puesto que se reaJíza en poco

tiempo y económicamente resulüa apropiado comparativamente al empleo de, por

ejemplo, anticuerpos monoclonales.

v) La fracción 52 se presenta como un buen material de partida para lapurificación de la P-gp mediante cromatografía de inmunoafinidad: la proteína esüí

solubilizada en presencia de un detergente tipo zwitter y se ha eliminado gran parte de

la proteína inicial.

110



Capítulo I

ovocrTo.

3.1- TNCORPORACTÓN nn LA p-gp EN LA MEMBRANA DEL OVOCITO.

':' Antes de realizar cualquier estudio funcional de la P-gp, se procedió a

demostrar que la membrana de los ovocitos no inyectados no contiene la P-gp y que

su presencia es debida a la microinyección en los ovocitos de membranas que la

contienen.

Para la detección de la P-gp, las membranas aisladas del ovocito se aislaron

manualmente en lugar de utilizar procesos de centrifugación diferencial. El método si

bien es más tedioso, supone una garantía con respecto al aislamiento de la membrana

por centrifugación en gradientes de densidad, dado que en este último caso, la

fracción de membrana aislada pudiera verse conüaminada con las vesículas utilizadas

en la inyección, dando falsos resultados positivos respecto de la presencia de la P-gp.

3.2- ACTIVIDAD DE LA P-gP COMO TRANSPORTAD{OR DE FIíRMACOS.

Una vez demostrada la incorporación de la P-gp en la membrana de losovocitos, se procedió a La comprobación de la funcionalidad de la misma mediante

estudios de acumulación intracelular de ffumacos.

En nuestro caso, y considerando que el acceso del f¿írmaco al citoplasma del

ovocito no se ve alterado por el trpo de muestra inyectada, y que además se produce

por difusión pasiva (190), como se ha descrito en otros sistemas celulares (191), la

asignación de que la proteína responsable del eflujo de DNM en los ovocitos es la

P-gp, se ha fundamentado en las siguientes observaciones:

Ii l



Discusión

i) La acumulación de DNM es menor en aquellos ovocitos que fueron

inyectados con la P-gp, incrementándose la actividad transportadora de DNM a

medida que las muestras con las que se inyectaban los ovocitos se enriquecían en P-gp

No obstante, el incremento de la actividad de transporte de fármacos no

siempre se corresponde con el incremento en los niveles de la P-gp en dichas

muestras: mientras que en el segundo paso de la purificación, la fracción SZ es 2

veces más concentrada en P-gp y presenta una actividad transportadora 2 veces

superior que la fracción Pl, en el primer paso, la fracción Pl presenta 5 veces más

P-gp que fm, pero su actividad de transporte es sólo 3 veces superior. Esta falta de

correlación:i podría deberse fundamentalmente a procesos de desnaturalizacíón ylo

hidrólisis parcial de la bomba por parte de Colato de sodio, acontecimientos que en

presencia de Zwittergent 3-12 quedarían más preservados por la naturaleza del

detergente. A pesar de una pérdida en la actividad transportadora durante el primer

paso de purificación, ésta es inferior a la descrita por Sharon y cols. quienes

estimaron una pérdida del 60% durante la solubilización de la P-gp por CHAPS y la

reconstitución de la misma en proteoliposomas (72).

Aunque en principio se pudiera pensar en diferencias debidas a una distinta

cinética de incorporación de la P-gp en la membrana del ovocito, bien por las

características de las vesícuias, bien por presentar una distinta composición lipídica, la

hipótesis o parece sustentarse con mucha fuerza. Primero porque los tiempos

escogidos para el estudio de la actividad transportadora de la P-gp se situaron

alrededor de las 24 horas tras la inyección (en base al estudio reaiizado con el nAChR

cuya respuesta máxima se situó alrededor de las 16-24 horas, independientemente del

tipo de muestra inyectada: membrana alcalina, vesículas de asolectina). Esta premisa

sugiere que la incorporación de las distintas muestras enriquecidas en P-gp van apresentar una cinética parecida de inco¡poración. Segundo, se ha podido comprobar,

en una serie de experimentos con el nAChR reconstituído en vesículas con distinta

composición lipídica, la incorporación funcional del receptor en la membrana del

ovocito, sin que se observasen diferencias en las amplitudes de las respuestas (192).

ii) gt empleo de VRP, un reversor de acumulación de antraciclinas en células

con fenotipo MDR, incrementa la acumulación de DNM en los ovocitos invectados

con P-gp.

Si bien en estos estudios de reversión, se ha observado una disminución en los

niveles de DNM en todos los ovocitos inyectados, tanto con P-gp como con muesm

t12



Canftulo I

controi, la acumulación intracelular de DNM en presencia de VRP resultó menor en

los primeros. [,a explicación a este hecho no es clara si bien es posible que

alteraciones en la dinámica de las bicapas inducidas por VRP pudieran dar cuenta de

las modificaciones en la permeabilidad de las membranas de los ovocitos a DNM

(1e3).

l,os resultados ponen de manifiesto que tanto en los procesos de purificación

como en los de fusión con ia membrana del ovocito, se preserva en alto grado, la

actividad de la P-gp, pudiendo demostrarse que se ha producido una incorporación

funcional de la mismaren la membrana del ovocito. Por ello, no se puede descartar la

existencia en la membrana de las células Ll2l0ll60 de otras moléculas con actividad

extrusora de fármacos que además pudieran copurificar con P-gp, si bien por el

momento no hay evidencias de la existencia de tales bombas. No obstante, la

asignación inequívoca de que la función transportadora observada en el ovocito

inyectado es específica de P-gp, requiere de la purificación a homogeneidad de la

proteína y su posterior reconstitución funcional.

113



Discusión

4- ACTIVIDAD DE LA P-ep COMO CANAL DE CLORURO.

4.L. CORRIENTE NATIVA DE LOS OVOCITOS ACTIVADA FOR

VOLUMEN.

Una vez demostrada la incorporación funcional de la P-gp en la membrana del

ovocito, se procedió al análisis de su controvertida actividad como canal de cloruro

activado por volumen (128). Para ello, se inició el estudio de la corriente nativa

activada por volumen en el ovocito.

Los folículos de Xenopus presentan una corriente nativa activada por volumen

cuyas características hemos podid<l comprobar que concuerdan con las descritas en la

bibliografía (115, 116). Esta corriente fue someramente descrita en los folículos de

Xenopus por primera vez en 1993 por Arellano y Miledi (116), quienes observaron

corrientes de cloruro y potasio inducidas en folículos superfundidos con medios

hipotónicos, cuyas propiedades fueron detalladas en 7994, por Ackerman y cols.(115). En nuestros experimentos, iniciados previamene a la aparición de los trabajos

antes mencionados, (Figura 30) se observan dos fases en la corriente inducida por

hipotonicidad. La primera fase la constituye una corriente de salida, que sólo puede

deberse a iones potasio debido a que es el único ión cuyo potencial de reversión esmás negativo que -70 mV (valor al que se fijó el potencial de membrana del ovocito).La segunda fase, que no siempre aparece, es una corriente de entrada que suele ser demayor amplitud que la primera y se debe a tanto a la entrada de iones cloruro como ala salida de iones potasio, debido a que el potencial de reversión de la corriente enesta segunda fase, alrededor de -50 mV, se sitúa entre los potenciales de reversión depotasio (-105 mV) y cloruro (-25 mV determinado experimentalmente en nuestros

ovocitos), y lejos del potencial de reversión de sodio.

Curiosamente, el potencial de reversión en lugar de desplazarse hacia valoresmenos negativos a medida que disminuye la concentración de cloruro, lo hizo desde-48 mV a -54 mV al pasar desde el medio RH-75 at RH-45. Este cambio en elpotencial de reversión sugiere la existencia de una diferente contribución de las

114



eapífrilo I

conductancias a los iones potasio y cloruro en los dos medios hipotónicos, en el

sentido de que permean proporcionalmente más iones potasio que cloruro en RH-45

respecto a RH-75. Ello supone la activación por choque hipotónico de al menos dos

tipos de canales, uno de ellos para iones potasio y otro para cloruro, cuyo grado de

activación variaría en función de la osmolaridad del medio.

La corriente se pudo evocar tanto en folículos como en ovocitos desfoliculados

mediante colagenasa, aunque tanto el porcentaje de aparición como la amplitud de la

corriente disminuyó con la desfoliculación. Esta última observación discrepa en cierto

modo con la descrita por otros grupos (115, 1,16) quienes dicen abolir completamente

la corriente con el tratamiento enzimático, si bien las diferencias se puedan deber

posiblemente a una baja eficacia en la eliminación de las células foliculares por la

enzima.

El hecho de que la corriente activada por volúmen dependa del tratamiento de

desfoliculación (manual o por colagenasa) así como del tiempo transcurrido después

de la obtención de los ovocitos (suele desaparecer a los 2-3 días), sugiere que su

actividad est¿í relacionada con la presencia de las células foliculares. Este hecho

parece confirmarse con los resultados obtenidos en el amplio estudio realizado por

Arellano y Miledi (116, 194) quienes inhibieron mayoritariamente la corriente

activada por volumen mediante ei empleo de un bloqueante de las uniones de tipo gap.

A pesar de estas evidencias, todavía se desconoce si los canales estín localizados enlas células foliculares o en la membrana del ovocito, puesto que existe ta posibitidad

de que laproteína que conforma el canal y la que constituiría el sensor osmótico sean

diferentes y estén localizadas en compartimientos separados.

Las identidades moleculares, tanto de los canales que intervienen en la

regulación del volumen intracelular como las de algunas proteínas reguladoras de los

mismos, se desconocen hasüa el momento. Se ha propuesto por diversos autores que

un homólogo de la proteína de mamífero plcm podría intervenir en el proceso de

regulación del volúmen intracelular. pI6¡,, es una proteína de pequeño tamaño (235

aminoácidos) que se clonó a partir de las células de hígado de perro Madin Darby(MDCK), cuyos primeros estudios se realizaron mediante su expresión en ovocitos de

knopus (195) y a la que se le ha propuesto una estructura de cuatro hojas B sin que

se le haya podido predecir la presencia de hélices transmembrana. El papel que

I6



Discusüq

tendría esta proteína dentro de los procesos de regulación de volírmen está siendo

debatido en la actualidad. Así, Krapivinski y cols. (196) proponen que pI.6 es un

regulador, basándose en los hechos de que la proteína se localiza en el citoplasma y

forma cornplejos con otras proteínas citosólicas, incluyendo la actina y que además, la

sobreexpresión de dicha proteína en células Sf9 no proporciona una actividad de canal

de cloruro. En cambio, Gschwentner y cols. (197) apoyan el papel de pl6¡n como

canal de cloruro, basándose en consiguen abolir las corrientes de cloruro inducidas

por hinchamiento celular mediante el empleo de oligonucleótidos antisentido.

La falta de efecto bloqueante de sustratos transportados por la P-gp

(daunomicina, verapamil, forskolina o quinidina) sobre la corriente activada por

hipotonicidad, es consistente con lo descrito en varios tipos celulares: folículos de

knopus, fibroblastos y en células epiteliales de intestino delgado de humanos,

independientemente de la presencia de la P-gp (115, 1 16, 197 , lg9, Z0I, ZI7).

4.2. ACTIVIDAD DE CANAL DE CLORURO DE I,OS OVOCITOS

INYECTADOS CON LA P-gp.

Los resultados presentados son concluyentes respecto de que la P-gp NOpresenta actividad de canal de cloruro activada por volumen, en base a que:

i) No se ha observado la aparición de una nueva corriente en los ovocitos

inyectados con la P-gp.

iil No hay un incremento en la amplitud de la corriente nativa al inyectar a la

P-gp (Tabla 5).

iii) Cuando aparece, la corriente detectada en ovocitos inyectados con la P-gppresenta idénticas características a las observadas en ovocitos sin inyectar y en los

ovocitos inyectados con membranas control desprovistas de la p-gp.

Si la P-gp fuese un canal de cloruro, hubiera sido esperable que el aumento enel número de canales activados por volumen en la membrana del ovocito tras laincorporación de la P-gp, se hubiera correspondido con un incremento en la amplitudde la corriente macroscópica en medio hipotónico y modificación del potencial deinversión de la corriente desplaz¡índose a un valor más próximo al de cloruro.

El bajo porcentaje de los ovocitos Pgp+ que presentan la corriente activadapor volumen no parece debido a que la proteína hubiera perdido su funcionalidad

IT6



CapítuIo I

durante los procesos de purificación, inyección y fusión en la membrana del ovocito,

puesto que la actividad transportadora de la P-gp se mantiene. De hecho, de ser un

canal de cloruro, la actividad del mismo se hubiera puesto de manifiesto con mayor

nitidez que la actividad como bomba, pues debido a los gradientes iónicos a un lado y

otro de la membrana, el número de iones/s que pueden atravesar la membrana a través

de canaies es muy superior al eflujo de f:írmacos. Además, se dispone de técnicas

electrofisiológicas de excepcional sensibilidad (nuestro sistema posiblemente sea capaz

de detectar la actividad sincrónica de 103 moléculas (canales), asumiendo una

conductancia unitaria de 20-40 pS).

En relación con la discrepancia entre nuestros resultados y los obtenidos por

Valverde y cols. (128), es interesante indicar que Mastrocola y cols. (200)

demostraron la activación de una corriente de potasio y cloruro por shock hipotónico

en fibroblastos de humanos mediante la superfusión de sus células con un medio de la

misma osmolaridad que el utilizado por Valverde y cols. (128). Posteriormente, en

1994, Ehring y cols. (201) registraron una corriente de cloruro activada por

hipotonicidad tanto en los fibroblastos MH3T3 transfectados con MDR-1 como en no

transfectados (control), empleando la mismas condiciones experimentales que otros

autores (728, 129, 198). Recientemente Gschwentner y cols (197) también describen

en sus experimentos la presencia de una corriente endógena inducida por cambio de

volumen en las mismas células. Estas observaciones indican la existencia de una

corriente nativa en los fibroblastos y por tanto oscurecen el papel de la P-gp como

canal de cloruro tras la transfección de los mismos con el gen mdrl.

Por otro lado, nuestros resultados concuerdan con otros estudios que han sido

realizados de modo simultiíneo al tiempo de realización de esta Tesis. Así, Rasola y

cols. (202), no encontraron diferencias entre las corrientes de cloruro activadas por

hipotonicidad en cuatro líneas distintas de células de epitelio que presentaban distintos

niveles de P-gp. McEwan y cols. (130) mostraron valores similares de secreción

transepitelial de vinblastina, fármaco transportable por la P-gp, independientemente de

la activación o no del canal de cloruro activado por volumen en células de

adenocarcinoma de colon T84, que expresan la P-gp (203). Altenberg y cols, (204) no

encontraron canales de cloruro activados por volumen en fibroblastos de hamster

Chino con fenotipo MDR y altos niveles de P-gp. [,os mismos autores describen que

en células humanas de cáncer de mama transfectadas con el gen MDR1 se evoca una

corriente en respuesta a un choque hipotónico, pero concluyen que su presencia no

117



Discusión

puede contribuir de forma significativa ala regulación del volumen celular (205). En

células de eritroleucemia sensibles y resistentes a vinbiastina tampoco se ha observado

una correlación directa entre los niveles de expresión de la P-gp y la corriente de

cloruro activada por volumen (206,207,208). Recientemente Morin y cols. (209),

concluyen resultados similares utilizando ovocitos de Xenopus para estudiar la

funcionalidad de la P-gp, pero a diferencia del presente estudio, la expresión de la P-

gp se llevó a cabo vía la correspondiente inyección del ARNc.

Kirk y Kirk Qrc) sugieren que sería la existencia de proteínas como

calmodulina o componentes celulares que presentan características similares a ésta y

no la P-gp tal como se había sugerido por otros grupos (128, 2lI, 212, 213), las que

interaccionarían con inhibidores de la P-gp controlando la actividad de canal de

cloruro regulador de volumen.

Quizás el paralelismo (homología estructural, localización, etc.) entre la

proteína producto del gen de la Fibrosis Cística (CFTR) y la Glicoproteína-P, ambos

miembros de la superfamilia de transportadores ABC (214), haya contribuído a ia

adscripción de ciertas funciones a esta última sin el suficiente apoyo experimental.

En la actualidad, la evidencia experimental de diversos grupos apoya la

conclusión recogida en la presente Memoria en cuanto a que la Glicoproteína-P no es

por sí misma un canal de cloruro regulador del volumen celular. Su posible papel

como regulador de tales canales mediante la fosforilación de la P-gp vía proteína

quinasa C (2L5,216) resuita más controverfido, si bien nuestros estudios indican que

üampoco la P-gp modulaía los canales nativos del ovocito implicados en la regulación

de volumen. No obstante, dada la inherente dificultad experimental para elucidar

dicha actividad que razonablemente implicaría interacciones proteína-proteína,

posiblemente interacciones con proteínas de citoesqueleto, etc., la adscripción de una

función reguladora de canales de cloruro a la P-gp necesita un estudio más detallado.

Aunque, los resultados obtenidos por Tominaga y cols. (199) descartan también esta

posibilidad, puesto que la utilización de activadores de la proteína quinasa C no tuvo

ningún efecto sobre la corriente activada por hipotonicidad.

Finalmente, señalar que recientemente, durante la redacción de esta Memoria,

nuestro grupo ha conseguido incorporar funcionalmente en la membrana del ovocito el

canal de cloruro de Tbrpedo CIC-0 (284), mediante microinyección con vesículas

lipídicas. El hecho de que tres proteínas distintas tanto estructural como

funcionalmente se incorporen eficazmente a la membrana del ovocito, confirma la

1r8



CaoítuIo I

potencialidad de esta nueva metodología en el estudio de proteínas de membrana en

ovocitos de Xenopus.

119



CAPITULO II

REerrBRril{rENTos Er\ERcÉrrcos DE LAScÉr,ur,As p3gg.



RESI]LTADOS



Caoiútlo II

CONDICIONES BASALEü

El estudio de los requerimientos energéticos de las células de la línea P388 se

ha realizado mediante el an¿flisis de los niveles de ATP, consumo de oxígeno y niveles

de lactato. [,os experimentos se realizaron en un medio salino isotónico, en ausencia

de sustratos metabólicos como glucosa y glutamina presentes en RPMI-1640 (medio

habitual de cultivo). [,os resultados se presentan a continuación:

Figura 37: Medidas de los niveles de ATP, lactato y consumo de oxígeno de la línea P388 encondiciones Basales. [¿s barr¿s de error representan la e. s. m. de 1l ( n ( 79.

De esta figura se deduce que:

i) Las células que sobrexpresan P-gp, P388/100, manifiestan niveles de ATP

mayores que las células sensibles indicando que poseen una mayor disponibilidad de

esta molécula, suministradora de la energía necesaria para el eflujo activo de

fármacos. (Recordemos que P-gp tiene dos centros de unión de ATP). Además, los

niveles de ATP de las células resistentes P388/20 son indistinguibles de las células

P388/100 y significativamente mayores que los de las células sensibles.

a 400091

q 3000x

E 2ooo--: 10007.

U

0-05O

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0,00

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^5 1,25

= l,ooto¡ u_/J* -v o 5 0119 0,2s

0.00

P388/S P388/20 P388/100

P388/S P388/20 P388/100

P388/S P388/20 P388/100

122



Rer,ulá.dos

ii) El patrón de consumo de oxígeno entre las distintas sublíneas celulares es

paralelo al de los niveles de ATP: las células resistentes consumen más oxígeno que

las células sensibles mientras que no se aprecian diferencias significativas entre las dos

sublíneas resistentes. En ensayos realizados en presencia de azída, se comprobó que se

reducía drásticamente el consumo de oxígeno en todas las sublíneas.

iiil No existen diferencias significativas en los niveles de lactato entre las

células resistentes y sensibles, con 1o que se desprende que la víaanaeróbica no parece

influir de modo relevante en las diferencias establecidas en los niveles de ATP entre la

sublínea sensible y las sublíneas resistentes.

Inicialmente se realizaron una serie de experimentos dirigidos a monitonzar el

efecto aislado del fármaco VRP sobre los niveles energéticos de las células P388. Para

ello, las células P388 se incubaron con VRP 5 ¡rM a37oC y transcurridos 120 min se

extrajeron diversas alícuotas en los que se estudiaron los parámetros energéticos antes

mencionados. Los resultados se presentan en la siguiente figura:

a

e8

vá

xVx

a

9i

Y

l<oo:L

fj

<l

3000

o

Itv-

Y!ac)7^

2000

1000

, 0

0,05

0,04

0,03

0,02

0,0r

q00

1,501 ) S

1,00

0,75q50

0,25

0,00

figura 38: Niveles de ATP, lactato y consumo de oxígeno de la línea P388 en condiciones Basales(barras blancas) y tras incubación con VRP 5 ¡rM durante 120 min. (barras grises). Las barras de errorrepresentan la e- s. m. de 11 1 n 1 79.

PRESENCIA DE DNM Y/O VRP.

P388/S P388,20 P388/100

P388/20

123



Capítulo II

De la Figura 38 se desprende que:

il La incubación de las células sensibles con VRP durante 120 min no produce

alteraciones significativas en el metabolismo energético de las mismas. En cambio,

altera los correspondientes a las células resistentes: incrementa los niveles de lactato y

disminuye los niveles de ATP y consumo de oxígeno.

ii) VRP anula las diferencias en los niveles de ATP y consumo de oxígeno

entre las sublíneas resistentes, que de este modo se igualan además a los niveles

mostrados por las células sensibles.

888/5

---r-DNM---¡-vf,P+

Hts8/100

ü ¡oooI

.9 zooo

k rO{n

0,04

l------L.t. +

\ \-j

J--- Tt --t-i-l

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¡-l----l-------¡-_-1-.-¡-¡

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Figura 39: Niveles de ATP, lactaúo y consumo de oxígeno de las células P388 en función del tiempo deincubación con DNM 3 pM, en presencia o no de VRP 5 ¡rM preincubado durante 120 min.(4<n< 16). Los símbolos que representan los diferentes grados de signiñcancia colocados encima de unpunüo de la gnifica denota diferencias entre ese valor y el correspondienüs a t=0, mientras que lossituados en el eje de abcisas indican diferencias entre los valores en presencia o no de VRP.

121



Rer,ultudos

Después de haber determinado los parámetros energéticos mencionados en

presencia de VRP, se procedió al an:ílisis de los requerimientos energéticos de las

células P388 en presencia de DNM en las mismas condiciones en las que se realizan

los ensayos de acumulación de fármacos (131).

De los resultados representados en la Figura 39, se deduce que:

i) La incubación con DNM no afecta de forma significativa, al menos en los

primeros 90 minutos, el nivel de ATP en las células sensibles ni en las células

P388/20,1o que hace suponer que DNM no activa ningún proceso que requiera gasto

energético. En la sublínea más resistente (P388/100) la incubación con DNM reduce

de forma significativa, a partir de los 60 min, los niveles de ATp, 1o que

tazonablemente podría asignarse a la actividad extrusora de fármacos por parte de

P-gp.

d) DNM no altera significativamente el consumo de oxígeno en ninguna de las

líneas celulares. No obstante, los valores en los distintos intervalos de tiempopertenecientes a las células P388/100 presentan una p:0,08 con lo que posiblemente

un incremento en el número de casos estudiados hubiera permitido obtener una

disminución significativa del consumo de oxígeno con el tiempo de incubación.

iii)ta' incubación con DNM tampoco afecta de forma significativa los niveles

de lactato en las células sensibles ni en 1as resistentes. Sólo aparece una disminución

estadisticamente significativa (p< 0,01) en las células P388/100 a los 90 min.

Tras determinar los requerimientos energéticos de las células P388 enpresencia de DNM, se estudió a continuación el efecto de una preincubación con VRPen los mismos. l,os resultados se presentan en la Figura 39, ftazo tojo, e indican que

la presencia de DNM tras la preincubación con VRP durante t20 min, no modificólos niveles de ATP, consumo de oxígeno y niveles de lactato en ninguna de las líneascelulares. Las diferencias entre la preincubación o no con VRP se centranfundamentalmente en las células resistentes, que salvo ciertas excepciones, seproducen durante los primeros minutos en las células p3B8/20 y durante 60 min en lasP388/100.

Como resumen de los resultados obtenidos, se ha confeccionado la siguientetabla donde se esquematízan los efectos aislados de DNM (60 min), VRP (120 min) yDNM (60 min) tras preincubación con VRP (120 min):

r2s



CapítuIo II

BASAL

DNM

VRP

DNM + VRP

BASAL

DNM

VRP

DNNI + VRP

BASAL

DNM

YRP

DNM + VRP

NIVELES

ATP

CONSUMO

DE'Az

NTvELES

LACTATO

P388/S

r tr l ¡rT I I I

r I I I I

I I I I I

oaaooaottaaaaaaaa,oaa

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{}{}{} tl{} üü

P388/20

I I I I I I I

t r l l t l tI IT I I

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P388/r00

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tlrlrttlt

¡$*txttt{}

üc{t$ct{ t

Tabla 7: Esquema de los resultados obtenidos durante el estudio los niveles energéticos de las célulasP388, en condiciones basales, en presencia de DNM (60 min), VRP (120 min) y DNM (60 min) haspreincubación con VRP (120 min).

I-a tabla pone de manifiesto que:

i) La incubación con DNM disminuyó de forma significativa los niveles de

ATP en las células P388/100 manteniendo inalterables tanto el consumo de oxígeno

como los niveles de lactato. Por otro lado, produjo una disminución del consumo de

oxígeno en las células P388/20 que no se refleja en los niveles de ATP y que tampoco

se ve compensado por un incremento en el nivel de lactato.

ü) L'a incubación con VRP disminuyó los niveles de ATP sólo en las células

resistentes, no observándose variaciones en dichos niveles cuando se realizó

posteriormente una incubación con DNM. L¿ disminución del consumo de oxígeno

por VRP en las células resistentes se acompaña de un incremento del metabolismo

anaeróbico.

iii) L'as células sensibles sólo sufren una alteración en el nivel de lactato

cuando se incuban con DNM después de haber sido preincubadas con vRP.

126



DISCUSIÓN



Capítulo II

El estudio de los requerimientos energéticos de las distintas sublíneas de las

células P388 va a permitir profundizar en el conocimiento de los mecanismos de

resitencia a múltiples fármacos. El estudio se ha realizado mediante el an¿ílisis de los

niveles de ATP, consumo de oxígeno y niveles de lactato de las células P388/1@ y su

valor se ha contrastado con el obtenido tanto en las células P388/S (células tumorales

que no presentan el fenotipo MDR) como en las células P388/20 (células resistentes

que no sobreeexpresan en su membrana la P-gp).

1- NTVELES ENERGÉTTCOS DE LAS CÉr,rN¡.S P388/S.

La incubación de las células de la sublínea parental sensible con los diversos

efectores antitumorales no ocasiona variaciones en los niveles basales energéticos

estudiados (AT?, consumo de oxígeno y lactato), lo que indica que esias células no

present¿n mecanismos activos de destoxificación de fármacos.

2- NTVELES ENERGÉTTCOS DE LAS CÉr,UI,NS P3E8/1OO.

Las células P388/100 requieren de un mayor aporte energético que las

parentales sensibles, lo que significa que estas células presentan procesos activos (que

requieren energía) para eliminar a los fiírmacos antitumorales como DNM. Ia

principal fuente suministradora de este aporte extra de energía va a ser la vía aeróbica

del metabolismo energético, de igual forma como se ha establecido en otros tipos

celulares con fenotipo MDR (218, 219, 22A, 221, 222).

Al contrario de 1o observado en las células sensibles, la presencia de DNM

disminuyó de forma significativa los niveles de ATP, indicando que el fi{rmaco

promueve la activación de procesos que requieren energía. Teniendo en cuenta que

esta sublínea es la que presenta una menor acumulación intracelular del fármaco y una

sobreexpresión en su membrana de la P-gp, parece razonable suponer que al menos

128



Discusión

parte del aporte energético extra de estas células se deba al bombeo extracelular de

DNM Wr parte de la P-gp con la hidrólisis concomi¿ante de ATP.

[¿s vías aeróbica y anaeróbica del metabolismo energético no presentan

variaciones significativas con la incubación de DNM. El consumo de oxígeno presenta

ligeras variaciones tendentes a diminuir, al igual que las otras dos sublíneas,

mimetizando un efecto "veneno" de la vía aeróbica. Tal disminución, sin embargo, no

parece compensarse por la formación de ATP vía lactato cuyos niveles permanecen

prácticamente inalterados. No parece fácilmente explicable el mayor gasto de ATP en

estas células, sin que exisüa un incremento en la actividad de las vías aeróbica o

anaeróbica. Es posible que las sensibilidades de los métodos empleados en el an:ílisis

del contenido de lactato o consumo de oxígeno sean menores que la correspondiente a

la medida de ATP por bioluminiscencia.

El incremento observado del consumo de ATP por parte de VRP descrito en

varias líneas celulares humanas con el fenotipo MDR (223,224), confirma su papel

de sustrato de la bomba (225). No obstante, a diferencia de recientes observaciones

realizadas por Spoelstra y cols (93), nuestros resultados sugieren que VRP representa

un sustrato competitivo de DNM para su transporte por P-gp, ya que su coincubación

con DNM no incrementa significativamente el consumo de ATp.

La disminución de los niveles de ATP por parte de VRP se acompañó de una

reducción en el consumo de oxígeno, esto es, de la actividad de la vía aeróbica, de

igual forma como se ha descrito en células P388 resistentes a Adriamicina (218) y enmicrosomas de hígado de rata (226). El aporte energético para el transporte de VRPpor P-gp parece suministrarse por vía anaeróbica, que compensaría así la disminución

del metabolismo energético oxidativo al igual que se ha descrito va¡ias líneas celulares

humanas MDR (223, 227, 228).

Aunque la adscripción del principal mecanismo de resistencia celular se deba ala sobreexpresión de la P-gp en la membrana de estas células, no se puede descartar lapresencia de otras proteínas extrusoras de fiírmacos antitumorales, como pudieran serlas proteínas MRP descritas recientemente en células pequeñas de pulmón (229,23q.

129



Caoítulo II

3- NIVELES ENERGÉTTCOS DE LAS CÉLULAS P3E8I2O.

El mayor nivel de ATP determinado en las células P388/20 sugiere que éstas

han desarrollado, al igual que las células P388/100, unos sistemas de resistencia a los

fármacos que no presentan las células sensibles, y para los cuales requieren de un

aporte extra de energía.

El empleo del reversor de resistencia a múltiples fármacos VRP, disminuyó en

estas células los niveles de ATP, cuya reposición parece implicar la formación extra

de lactato, al igual que sucedía con la sublínea más resistente P388/100.

A diferencia de 1o que ocurre en las células P388/1m, h presencia de DNM

no alteró de forma significativa los niveles de ATP, aspecto interesante puesto que

estas células no sobreexpresan en su membrana al transportador P-gp.

El hecho de que las células P388/20 no sobreexpresen P-gp en su membrana,

conlleva a plantear que el requerimiento extra de ATP con respecto 1as células

sensibles deberá asignarse a mecanismos de resistencia distintos de la expresión del

transportador. Nuestro grupo ha descrito modificaciones del pH intracelular (pHi)

(103) en estas células, habiendo est¿blecido que éstas tienen un pHi más alcalino que

las P388/S (103), alteración observada asimismo en otras líneas celulares (231, 232,

233,234). Roepe y cols. investigando los mecanismos que causan la alcalinización del

pHi, observaron que la actividad del intercambiador Na*/H* era mayor en las células

resistentes que en las células parentales sensibles, lo que en un principio jusüficaría el

mayor pHi de las primeras. Sin embargo, la expresión de este intercambiador no se

correlacionaba con el incremento del pHi, que a su vez parecía hacerlo con la

expresión de la P-gp (235), indicando que esta última podía actuar también como

bomba extrusora de H+. Posteriormente, observaron que la sobreexpresión de los

genes que codifican estas proteínas dependía del grado de resistencia de las células:

cuando el nivel de resistencia era bajo, se sobreexpresaba principalmente el gen de

Na*/H* y en células con mayores riiveles de resistencia, el correspondiente a P-gp

(235). Estos datos apuntan a que parte de los requerimientos extra de ATP que

presentan las células P388/20 se dediquen a una mayor actividad biosintética por parte

de las células resistentes entre los que se puede encontrar, entre otros, la expresión

acentuada del intercambiador Na*/H*.

1"30



Discusi6n _

La trascendencia del incremento del pHi sobre la actividad farmacológica deDNM se pone de manifiesto al analizar que DNM presenta en su estructura un grupo

amino ianizable con un pKa entre 7,6 y 8,2 (236), con lo que variaciones en el pH

pueden alterar la proporción entre las especies cargadas y neutras del fármaco. De este

modo, la alcalinización del pHi podía favorecer la menor acumulación de DNM en

las células resistentes mediante:

i) Disminución del influjo de los fármacos: L¿s antraciclinas permean la

membrana por difusión pasiva (236). Habida cuenta de que el gradiente

electroquímico de DNM va a ser la fuerza motriz para la entrada del fármaco en las

células, y puesto que los experimentos de acumulación de DNM realizados por

nuestro grupo en las células P388 se establecen en condiciones de gradiente de

aproximadamente 0,3 unidades de pH en el caso de las células sensibles (P388/S), 0,1unidades de pH en las P388/20 y practicamente 0 en las P388/100 (103), es de

esperar que la facilidad de captación de DNM por las células sensibles resulte mayorque la que presenten las células resistentes. Estas consideraciones concuerdan con lasaportadas por Skovsgaard y Nissen (236) quienes señalan que un incremento en el pH

del medio extracelular con relación al del citoplasma, favorecería el influjo de DNM,incrementándose la acumulación de f¿írmaco, un hecho que ha sido observado envesículas lipídicas artificiales que presentan un gradiente transmembrana de pH(interior acídico) (237). Aunque controvertido, se ha descrito que VRp puede

disminuir el pHi (234) en una línea resistente de células de cáncer de pulmon humanoSw-1573, provocando un aumento en el influjo de los fármacos, y por tanto unincremento intracelular del fármaco antineoplásico.

ü) Aumento del eflujo de los fármacos: Se ha establecido que lasantraciclinas se acumulan en el interior de organelas acídicas (238, 239), un eventoque se vería favorecido en las células resistentes por el mayor gradiente de pH entre elcitoplasma y dichas organelas. También se ha descrito que los compartimentosendosomales acídicos de las células P388 resistentes son mayores que los de lascélulas P388 sensibles (240). Como consecuencia, se favorecería el mecanismo dereducción de fármaco intracelular propuesto por Sehested y cols. (24I), por el cual losfármacos atrapados en el complejo endosomal-lisosomal seían expulsados al exteriorcelular mediante exocitosis, reduciendo el nivel intracelular del mismo, pudiendo sereste último proceso dependiente de energía. Por otra parte, se ha descrito en células

T3I



Capítulo II

MDR que VRP inhibe de forma significativa la exocitosis (242),1o que disminuiría el

eflujo de los fármacos, por tanto, incrementando su concentración intracelular.

iii) Menor unión de DNM en las distintas organelas: Se ha descrito que la

afinidad de unión de los f¡írmacos a las organelas intracelulares es mayor en las

especies protonadas de los mismos. En las células que presentan un mayor pHi, el

equilibrio entre las formas protonada y neutra de DNM se ve desplazado hacia la

formación de especies neutras, con 1o que el fármaco ve disminuída su afinidad de

unión en estas células.

Nuestras observaciones de que la incubación de las células P388/20 con VRP

incremente la hidrólisis de ATP, implicarían mecanismos distintos a la sobreexpresión

de la P-gp. Entre ellos podríamos citar: inhibición del tráfico vesicular intracelular

(ver iÍi ), implicación de otras proteínas extrusoras de fármacos antitumorales (MRP),

incremento en los procesos de destoxificación mediados por el sistema del Glutation

(243,244,245), procesos de reparación de DNA por Topoisomerasas (246,247), etc.

r32



CONCLUSIONES



Canclusions

1- l,a microinyección de vesículas de membrana de Tbrpedo marmorata conteniendo

el receptor nicotínico de acetilcolina en ovocitos de knopus laevis, conduce a la

incorporación funcional del mismo en la membrana del ovocito. Tal aproximación

experimental supone una alternativa original y eficaz a la expresión de proteínas de

membrana en el ovocito mediada por los correspondientes ADNc o ARNm.

2'Ia metodología anterior es extensiva a la microinyección de proteínas de membrana

reconstituídas en vesículas lipídicas de composición controlada, como vehículos de

incorporación ala membrana del ovocito.

3- El número de receptores nicotínicos de acetilcolina incorporados por esta vía

resulta lo suficientemente grande así como su estabilidad en la membrana del ovocito,

como para poder realizar estudios detallados de sus propiedades funcionales.

4 Ins receptores se distribuyen por toda la superficie del ovocito, agrupiíndose en

"parches" y orientándose correctamente en Ia membrana, si bien parece existir una

tendencia a localizarre preferentemente en lugares próximos aI sitio de

microinvección.

5- IA microinyección en ovocitos de vesículas conteniendo proteínas de membrana

minoritarias resulta asimismo útil en estudios funcionales de las mismas. Esta

posibilidad se ha explorado utilizando membranas de células tumorales con fenotiporesistente a antineoplásicos, que expresan Glicoproteína-P, proteína ausente en la

membrana del ovocito.

6La incorporación via vesicular de la Glicoproteína-P en la membrana del ovocito seha llevado a cabo con fracciones de membrana progresivamente enriquecidas en laproteína. I¿ actividad transportadora de f¡írmacos de la Gticoproteína-P en el ovocito

se incrementa con el nivel de enriquecimiento de la proteína en las muestras

inyectadas y es modulada por el reversor de resistencia verapamil.

t34



Canclusionx

7-Los folículos de Xenopus laevis poseen canales de potasio y cloruro que se activanpor hipotonicidad. La desfoliculación de los mismos con colagenasa disminuye o

elimina estas corrientes.

8- En los ovocitos que no responden ante un medio hipotónico con la activación de

una conductancia iónica, la incorporación de la Glicoproteína-P no supone un cambio

en la respuesta silente del mismo a condiciones que promueven el hinchamiento

celular.

I En los casos en los que el ovocito presenta actividad iónica de cloruro y potasio en

medios hipotónicos, la posterior presencia de la Glicoproteína-P en el mismo, no

altera en absoluto las propiedades nativas de las mencionadas conductancias.

10'De las conclusiones anteriores se deduce que la Glicoproteína-P no representa un

canal de cloruro regulador del volumen celular.

II- Las sublíneas de la cepa P388 con fenotipo de resistencia a múltiples fármacospresentan unos requerimientos energéticos superiores a los de la sublínea parental

sensible. El hecho de que la presencia de daunomicina promueva una disminución delos niveles energéticos en las células más resistentes (P388/100), resulta compatible

con: i) el bombeo del ftírmaco al exterior celular por la Glicoproteína-P con lahidrólisis concomitante de ATP; ii) Ia disminución intracelular de daunomicina conrespecto al nivel presentado por las células sensibles.

135



npÉworcES



ANnüca;

I- ELECTRODO-DE CLARK

El electrodo de Clark es uno de los electrodos más selectivos que existen.

Como se muestra en la Figura 40, el conjunto del electrodo está compuesto de: los

elementos del electrodo moldeados en un tapón de epóxido y cubierto por una

+-membrana de teflón, un

soporte de lucita que ajusta

cómodamente en una cámara

de muestras de vidrio. la

cámara de muestras de vidrio y

un agitador magnético de

forma de disco plano que se

ajusta al fondo de la cámara de

muestra. El mismo electrodo

posee un cátodo de platino y

dos ánodos de plata, bañados

BURBUJAS

SOPORTE DE LUCITA

BLOQUE DE EPO)O

CANAL DE ESCAPE

CAMARA DE VIDzuOPARA LA MUESTRA

KCI

MEMBRANA DE TEFLON

MUESTAA

AGITADOR MAGNÉTICO

por una disolución

semisaturada de cloruro de

potasio. Una delgada

Figura 40: Electrodo de clark y montaje de la cámara de membrana de teflón se sujeta

muestra. (Modificado de Brown y Mebine (248)). tensamente sobre el final del

electrodo por una junta tórica

de goma, que aísla así la disolución de cloruro de potasio del electrodo de la muestra

y sirve como dispositivo de selectividad. El teflón es permeable a algunos gases,

permítiéndoles pasar a través y tomar contacto con el cátodo de platino.

137



AÉndics

Si un potencial polarizador de 0,8 V se aplica a través de los elementos del

electrodo, el oxígeno reacciona con el cátodo de acuerdo con la siguiente reacción:

02 + 2e- + 2H3O+ <> [H2O2] + 2H2O

[HzOz] *2€ +2H3O+e 4HrO

suma: 02 + 4e- + 4H3O- <f 6H2O

El circuito se completa por la siguiente reacción que ocurre en el ¿ínodo de

plata:

4Ago + 4Cl-e 4AgCl * 4e-

total: 4Ag0 + 4Cl- + 4H+ + Oz <> 4AgCl + 2:HzO

El flujo de corriente es, por tanto, directamente proporcional a la cantidad de

oxígeno que difunde a través de la membrana de teflón, dependiendo de la

temperatura de la membrana de teflón y de la presión parcial de oxígeno en la cámara

de muestra.

138



Apénücq

II- OYOCITQS DE Xenopts laevis.

2.1-- GENERALIDADES.

Xenopus laeuis (Daudin) es un sapo sudafricano de la familia Pipidae y de la

subfamilia Xenopiae, que se caractenza. a diferencia del resto de anuros criados en

laboratorio, por ser capaz de iniciar ciclos reproductores en cualquier época del año y

mediante la administración de gonadotrofina coriónica (HCG) a hembras adultas

prov@ar la ovulación y ovoposición sin dependencia esüacional. Ofra característica esque posee un desarrollo asíncrono de ovocitos por lo que se pueden encontrar en un

sóLo Xenopus ovocitos en distintos estadios del desarrollo. Estas características han

hecho que los ovocitos de knopus sean, desde hace varias décadas, muy utilizados

por embriólogos pues a partir de ovocitos de una sola hembra se pueden investigar la

Fgura 41: Fotografía de un sapo hembra knopus laeuis.

139



Aúndics;

morfología y cambios citológicos que ocurren durante el crecimiento, maduración y

ferttlización del ovocito y posterior desarrollo del embrión (249).

En la década de los 60 y 70 se utilizaron como células para estudiar los

mecanismos de regulación de división celular (250,25I). A partir de los estudios dereiniciación meiótica, maduración de los ovocitos y su fertllización se descubrió que

tanto el potencial de membrana, como las concentraciones iónicas intracelulares y

ciertas características de la membrana del ovocito cambian con el desarrollo de éste.El conocimiento de estos fenómenos estimuló a los electrofisiólogos a realízarregistros en ovocitos para conocer sus propiedades de membrana y el tipo de canalesiónicos responsables de estos cambios durante el desarrollo. Esto llevó a conocer que

los ovocitos además de canales dependientes de voltaje, poseen en su membrana otrosactivados por neurotransmisores (252). De esta forma el ovocito se convirtió en un

excelente modelo donde estudiar los mecanismos celulares en respuesta aneurotransmisores y entre ellos los mediados por segundos mensajeros.

Con el enorme desarrollo de la biología molecular de los últimos años, losovocitos se comenzaron a utilizar en los estudios de expresión genética. Eldescubrimiento de que el ovocito es capaz de sintetizar adecuadamente proteínas

exógenas a partir de la inyección de ARNm foráneo (253) abnó las puertas a suutilización, fundamentalmente en neurociencias, en la década siguiente. Así, aprincipios de los años 80 se demostró en ovocitos eI ensamblaje correcto de lasdistintas subunidades del nAChR (188) y la expresión funcional de receptores aneurotransmisores y a canales iónicos (165,255).

En la actualidad el ovocito de knopus laeuis es un modelo experimentalampliamente utilizado para estudiar canales dependientes de voltaje o activados porligandos bien propios de su membrana o bien incorporados a ella tras la inyección dematerial genético exógeno (tanto ARNm como ADI.[). La proliferación en los últimosaños de grupos que utilizan el ovocito como modelo para el estudio de lascaracterísticas de canales iónicos se debe a sus ventajas experimentales: fáciladquisición, manejabilidad, célula eléctricamente compacta, interrelación con otrascélulas de su entorno, etc. Además los ovocitos son células grandes (hasta 1,3 mm dediámetro), y su gran tamaño permite utilizar distintas técnicas en una célula única:microdisección de ovocitos aislados; penetración con diversos microelectrodos tantopara registro electrofisiológico (fijación de voltaje con dos microelectrodos) comopara inyectar distintas sustancias y de esta forma controlar la concentración

140



Aúndics

intracelular de diversos componentes celulares o de fármacos; utilización de técnicas

bioquímicas así como registros ópticos en célula aislada.

2.2- MORFOLOGÍA DEL FOLÍCUIJO OVÁRICO.

El ovario de una rana se halla constituido por diversos lobulillos o sacos

ováricos (ver Figura 42), los cuales se hallan unidos por diversos tejidos,

principalmente conectivo. En estos lobulillos se encuentran las células germinales

femeninas. Estas células entran en meiosis cuando la rana se encuentra en estadío

larvario tardío, pero la meiosis queda intemrmpida en la primera profase (arresto de

la primera meiosis) y es cuando estas células germinales femeninas pasan a llamarse

ovocitos u ovocitos inmaduros. Cuando la rana se hace adulta estos ovocitos

comienzan a crecer y en ese crecimiento se pueden diferenciar diversos estadíos.

Figura 42: Fotografía de un lobulillo procedenüe del ovario de vn Xenopus taevis (Adzptado de Ivorra(14e)).

Como se ha comentado previamente y se puede observar en la Figura 42 en

knopus laevis es posible encontrar ovocitos en distintos estadíos de crecimiento.

Existen diversos estadiajes realizados por varios autores pero en &nopus laeuis el más

utilizado es el de Dumont (146) que clasifica a los ovocitos inmaduros en seis estadíos

según su morfología, relación con otras capas celulares o acelulares, tamaño y

captación de distintas tinciones o substancias. Para la mayor parte de los estudios de

141



Apénücu

expresión de proteínas exógenas se utilizan ovocitos inmaduros que han alcanzado su

mayor grado de crecimiento, estadíos V y VI de Dumont. En eslas etapas los ovocitos

(Figura 43A) tienen un tamaño de I a 1,3 mm y su superficie se halla recubierta por

un gran número de microvellosidades; se caracteizan por tener dos mitades o

hemisferios bien diferenciados y separados por una banda central clara que se

denomina ecuador. El hemisferio llamado animal posee un color marrón oscuro

debido a la gran concentración de melanosomas justo por debajo de la superficie del

ovocito, debajo de una zona submembranosa y agranular; en este hemisferio se halla

su gran núcleo o vesícula germinal. Además es la zona del ovocito en la cual los

lípidos de membrana poseen mayor movilidad, exigten mayor número de estructuras

contráctiles y, cuando el ovocito ha madurado es el lugar donde el espermatozoide

puede introducirse. El hemisferio vegetal, de color amarillento, carece o posee un

escaso número de vesículas con vitelo (que confieren al ovocito energía sufi.ciente para

su maduración); en este hemisferio existe una mayor concentración de ARN que en el

animal. Estas diferencias estructurales confieren al ovocito una polaridad funcionalque se manifiesta en una distribución espacial irregular de los canales iónicos y

receptores de membrana nativos.

Ftgura 43: (A) Foüograffa de un folículo ovárico de Xenopus laevis. (B) Esquema de las diversas capas

que componen un folículo ovárico (Adaptado de Ivorra (149).

Es importante mencionar, sin embargo, que los ovocitos tanto en el ovariocomo cuando son separados manualmente del tejido ovárico no son células aisladas

sino que se hallan conformando los folículos ováricos. El folículo ovárico cuando elovocito está en su estadío V-VI se halla formado por diversas capas (véase Figura

B

he¡riefsr*¿o

4nirmI

hecicfecí1o

YEgetat

BeEbrs¡lávitr¡1ir¡a

E@bÉf¡n¡plÉ€.r{tica

cé!"ula iolicular

142



AÉaüces

43B) que conviene tener en cuenta tanto por su importancia en el desarrollo del

ovocito como experimentalmente.

Estas capas son:

i) Membrana Vitelina: es una capa acelular fibrosa que se halla unida a la

membrana plasmática del ovocito y recubre toda su superficie.

ii) Capa de células foliculares: estas células, que son nucleadas y poseen gran

número de nucleolos, present¿n numerosos contactos con la membrana del ovocito. A

través de la membrana vitelina, los microvilli de estas células contactan con los

microvilli del ovocito estableciendo uniones comunicantes tipo gap (254, 256) que

permiten el paso de moléculas de hastá 1000 Da y por supuesto la conexión eléctrica

directa con el ovocito. Estas uniones "gap" se hallan controladas hormonalmente, su

permeabilidad y número aumentan al ser estimulado el folículo ovárico con hormona

luteinizante o con gonadotrofina coriónica que sirve al ovocito para reiniciar su

proceso meiótico (254,256). Además las células foliculares poseen en su membrana

una gran variedad de canales y receptores a neurotransmisores y hormonas asociados a

dichos canales. Gracias a las uniones tipo "gap", que permiten el paso a través de

ellas de segundos mensajeros, la información recibida por las células foliculares va a

ser transmitida al ovocito.

iii)ta, Teca: es una capa de tejido conectivo que posee colágeno, fibroblastos,

células musculares lisas, vasos sanguíneos y fibras nerviosas. Además en su interior

pueden estar embebidas células germinales que no han iniciado su división meiótica(2s7).

iu) Capa epitelial o tejido ovárico interno: cubriendo todas las capas anteriores,

es una continuación del resto del epitelio ovárico que constituye el lobulillo ovárico(2s7).

[¿ existencia de estas capas envolventes del ovocito, en ocasiones supone un

doble problema para el estudio de canales iónicos en ovocitos, por una parte va a

dificultar la aplicación de algunas técnicas de registro electrofisiológico y por otro

lado pueden "contaminar" con sus corrientes nativas aquellas originadas en la

membrana del ovocito. Por ello, (véase en el apartado II-3 de kíateriales y Métodos)

se utilizan métodos enzimáticos (colagenasa) o mec¿ínicos u osmóticos para aislar el

ovocito del resto de las capas envolventes.

143



ANndices

los canales mediados por ligandos están especializados en mediar las nípidas

transmisiones en las sinapsis químicas. Estos canales se activan por un

neurotransmisor químico específico, como puede ser la acetilcolina, glutamato, glicina

o ácido y-aminobutírico, siendo los activados por acetilcolina los mejor estudiados.

Existen dos tipos básicos de receptores de acetilcolina: Nicotínicos y

Muscarínicos. Ambos unen acetilcolina, pero los dos receptores se pueden distinguir

farmacológicamente mediante el empleo de agonistas (fármacos que imitan las

acciones de la acetilcolina, p.e. nicotina o muscarina) que se unen de forma exclusiva

a un tipo de receptor (258). Asimismo, los canales nicotínicos se pueden clasificar

según su localización en: muscular y neuronal. El tipo muscular se encuentra en la

placa neuromuscular de vertebrados o en el órgano eléctrico de ciertos peces, mientras

que el neuronal se localiza en ganglios del sistema simpático o parasimpático y en

varios tipos de neuronas del cerebro.

Los receptores nicotínicos de acetilcolina fueron los primeros en ser descritos

en términos moleculares, solubilizados a partir de sus membranas, purificados hasta

casi homogeneidad molecular (259, 260) y reconstituídos mediante la reinserción de la

macromolécula purificada en membranas lipídicas (261). También fueron los primeros

canales en los que se determinó las secuencias de aminoácidos y nucleótidos (262), y

en ser expresados en células foráneas mediante inyección de los ARNm en ovocitos(186, 188). Finalmente fueron los primeros en los cuales se analizó su corriente

unitaria mediante la técnica de análisis de canal único (patch-clamp) (189).

El hecho de que el nAChR sea el receptor de membrana mejor conocido se

debe fundamentalmente a dos factores que han facilitado su caracterizacíón:

i/ El nAChR se encuentra en abundancia en las electroplacas de diversas

especies de peces eléctricos (Tbrpedo marmorata, Tbrpdo californica, Electrophorus

electricus).

lrÍ4



Apénüces

ii) La presencia de cr-neurotoxinas en venenos de serpientes, que resultan ser

ligandos muy específicos del nAChR y que aportan un modo fácil de realizar

determinaciones cuantitativas mediante ensayos de unión a equilibrio.

3.1. DESCRIPCION.

El receptor nicotínico de acetilcolina es una glicoproteína transmembrana de

peso molecular de 294 kD, compuesto de cuatro distintas subunidades ensambladas en

un pentiímero heterólogo a2py6. Las cuatro cadenas polipeptídicas tienen unos pesos

moleculares aparentes de 40 kD (a), 48 kD (P), 58 kD (6) y 64 kD (6). Só1o la

subunidad ct, une ACh con alta afinidad. Las cuatro subunidades del AChR estiín

glicosiladas, presentando restos de manosa, galactosa, glucosa, n-acetilgalactosamina

y ácido n-acetilsi:ílico en un total de sesenta y cinco residuos de hidratos de carbono

por molécula de receptor (260). La inhibición de la glicosilación durante la

biosíntesis, así como la mutagénesis dirigida del Asn-141 de la cadena a, posible sitio

de glicosilación, hacen que el AChR pierda su funcionalidad. I¿s cinco subunidades

del AChR se encuentran fosforiladas en distintas regiones, pero principalmente en el

dominio intracitoplasmástico. Hay un total de siete grupos fosfato en la molécula del

AChR (263).

Citoplasma

Figura 44: A) Estructura tridimensional del receptor de ACh, donde se mueshan las 5 subunidades. B)Imagen reconstruída de la sección tranversal a través del tubo. C) Imagen a gran ampliación del nAChR,mostrando su posición y tamario respecto a la bicapa lipídica. (Adaptado de Toyoshima y Unwin (264).

145



Aúndices

El nAChR posee dos sitios de unión para la ACh que pueden ser ocupados por

agonistas, antagonistas y c{,-neurotoxinas. los agonistas y antagonistas se unen al

nAChR de forma reversible y mutuamente excluyente, mientras que las

c¿-neurotoxinas se unen de forma prácticamente irreversible (265). Mediante

experimentos de mutagénesis dirigida y marcaje químico se han determinado que los

sitios de unión de ACh se encuentran cerca de dos residuos de cisteína localizados en

la región hidrofóbica de la subunidad a expuesta al espacio extracelular (266).

Las reconstrucciones de las imágenes obtenidas mediante microscopía

electrónica a una resolución de 1,7 nm por Toyoshima y Unwin (264) confirmaron

que el canal consta de un poro central cuyas paredes estarían formadas por las

distintas subunidades del receptor. El complejo canal-receptor esÍí dividido en 3

regiones: una gran región de entrada en la superficie externa de la membrana, una

región estrecha trartsmembrana que puede determinar la selectividad catiónica y una

gran región de salida en la superficie de la membrana interna.

Figura 45: Cada una de las subunidades que configuran el nAChR contienen 4 fragmentostransmembrana, Ml, M2, M3 y M4. (Adaptado de Kandel y Siegelbaum (267)).

146



Aúndics

Examinando la distribución de los aminoácidos polares y no polares, se han

obtenido irnportantes pistas sobre la unión de las distintas subunidades en la bicapa

Lipídica. Cada una de las cuatro subunidades presenta cuatro regiones hidrofóbicas de

20 aminoácidos denominadas Ml, M2, M3 y M4. Sus secuencias aminoacídicas

sugieren que las subunidades están simétricamente unidas de tal forma que crean un

canal central. Numa y cols. (268) propusieron que cada una de las cuatro regiones

hidrofóbicas formaban una hélice cr que atravesara Ia membrana. Posteriores análisis

realizados por Numa y Sakmann (269) índícaron que las paredes del poro del canal

están formadas por las regiones M2 y los segmentos que conectan M2 con M3. Se

piensa que la selectividad catiónica del canal deriva de 3 anillos de carga negativa que

flanquean la región M2. Un primer anillo, cerca de la boca interna, formado por

aminoácidos en la región citoplasmática que conecta los segmentos M1 y M2; un

anillo central formado por aminoácidos dentro del segmento transmembrana M2; un

tercer anillo pertenecieiite a la cara externa de la membrana, formado por aminoácidos

enlarcgión extracelular que conecta los segmentos M2 y M3 (270).

3.2. ASPECTOS Ft.]NCIONALES.

Cuando un potencial de acción actúa sobre los terminales nerviosos de una

placa neuromuscular, libera ACh al espacio sináptico a una concentración local de

0,1-1 mM.

Para abrir el canal es necesaria la unión de dos moléculas de ACh (27I), de

hecho, una molécula de ACh se debe unir a cada una de las dos subunidades cr para

que el canal se abra eftcazmente. Si bien la unión de los ligandos no es cooperativa, silo es la apertura del canal, como 1o indica el valor del coeficiente de Hill,

aproximadamente igual a 2 (272). En cada subunidad cr se encuentra un lugar de

unión de agonistas, que une ACh con relativa baja afinidad (KD : 0,1-l mM) (273).

Ambos lugares de unión no presentan propiedades simétricas, diferenciándose en las

cinéticas de unión de agonistas Q7Q y antagonistas (275). La presencia continuada de

agonista modifica la consüante de afinidad para el mismo, disminuyendo la Kp de 3 a

5 órdenes de magnirud (276).

La unión de ACh al receptor produce pequeñas rotaciones de las subunidades

en el dominio extracelular que dispara un cambio en la configuración de las hélices a

147



Aúnüces

que constituyen el poro (217). La apertura ocurre en unos 2A ps (278) y está

provocada por la unión cooperativa de dos moléculas de ACh al receptor. La apertura

del canal es un fenómeno que parece responder a la ley del todo o nada, con lo que

sólo se deberían observar estados abiertos o cerrados. Sin embargo se han observado

algunos subestados de conductancia Q4AD. La duración media de apertura depende del

potencial de membrana, de 1a temperatura y, sobre todo, del tipo de agonista

utilizado: 1 ms para carbamilcolina, 2,4 ms paÍa acetilcolina y 5,6 ms para

suberildicolina. Las aperturas se ven interrumpidas por cierres muy breves de 50 ¡rsque son transiciones a estados no conductivos (164). A través del canal tiene lugar un

influjo neto de cargas positivas que despolartza la fibra muscular produciéndose

finalmente la contracción del músculo (162). La translocación de los cationes es un

fenómeno puramente pasivo: Na*, K* y algo de Caz* fluyen a través del poro acuoso

de acuerdo a su gradiente de potencial electroquímico.Ia conducüancia del canal en la

disolución de Ringer es de 40 pS, lo que, a un potencial de membrana de -60 mV,

corresponde a unos 1,45 x 104 iones transportados por ms, asumiendo un potencial de

reversión de -2 mV. El cierre del canal es esponláneo y está producido por la

disociación de una de las dos (o las dos) moléculas de ACh. El neurotransmisor se

elimina por difusión o por la acción de la acetilcoiinesrerasa (266).

La presencia continua de agonistas induce el fenómeno conocido como

desensibilización, que es un estado no conductor del nAChR donde no hay respuesta

para los agonistas. El proceso de desensibilización se acompaña por un incremento de

la afinidad hacia el ligando, probablemente producido por un cambio conformacional

del receptor (desensibilización específica). Este fenómeno es reversible,

recuperándose la actividad completa del receptor cuando se elimina el agonista. El

fenómeno de la desensibilización se observa tanto en membranas nativas enriquecidas

en nAChR (279) como extraído de su ambiente nativo (280), o si se expresa mediante

ingeniería genética, inyectando en ovocitos los diferentes ARNm de las subunidades(281), indicando que la desensibilizaciún es una propiedad intrínseca del AChR, así

como de otros receptores de membrana activados por ligando, como el nAChR

neuronal, AChR muscarínico, receptores de GABA, glutamato, etc. (282). El

significado fisiológico del estado desensibilizado es desconocido: se propone que es un

mecanismo defensivo de las células o tejidos frente a una sobreexposición del agonista(283).

I4¿t



Apéndices

IV. PROPTEDADES DE LOS DETERGENTES UTILIZADOS.

En la siguiente tabla se resumen las propiedades más importantes de los

diversos detergentes empleados en los estudios de purificación de la P-gp:

Detergente Tipo CMC Mw Número de Estruchrra(mM) Agregación

CHAPS zrvitteriónico 4 614.9 4-14*-1,,^.J,2.,-,-..[_o

Colato iónico 10 430.6 2-4.8

Zwittergent iónico3 - t2

3.6 335.6 55

cH-l * " ?

\,-\_..\_,z\-r\..^\-4\__^._ i - o

CTL U

6o --'\./\''-'-.

Nonidet P-40 no iónico 0.25 606 t40

N-octil no iónicoglucósido

t4.5 292.4 20-25

Tabla 7: Propiedades de los detergentes utilizados (285).

149



BIBLIOGRAFIA



Bibliogr¿fía

1- Juliano, R. L. y Ling, V. (1976).A surface glycoprdein modulating drug permeability in Chinesehamsúer ovary cells mutants. Biochim Biophys. Acta 455, 152-162.

2- Riordan, J. R. y Lfutg, V. (1979).Purification of P-glycoprotein from plasma membrane vesicles ofChinese hamster ovary cells mutants with reduced colchicine permeability J. Biol. Chem. 254, 127}1:-t2705.

3- Karther, N. y Ling, V. (1989). Resistencia oncológica a múltiples drogas. Inuest. y Cieacia 152, 16-24.

4- Gros, P., Croop, J. y Housmffi, D. E. (1986). Mammalian multidrug resistance gene: completecDNA sequence indicates strong homology to bacterial transport proteins. Cell 47, 371-380.

5- chen, c., chin, J. E., ueda, K., clark, D., Pastan, I. y cols. (1986).Internal duplication andhomology with bacterial transport proteins tn the mdrl (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistanthuman cells. Cell 47, 38 1-389.

6- Gottesmatr, M. M. y Pastan, I. (1993). Biochemistry of multidrug resistance mediated by themultidrug transporter. Annu. Rev. Biochem 62, 385-427.

7- Chen, C. J., Clark, D., Ueda, K., Pastan, L, Gottesman, M. M. y Roninson, I. B. (1990).Genomic organization of the human multidrug resisúance (MDRI) gene and origin of P-glycoprotein. ,I.Biol. Chen 265, 5A6-514.

8- Raymond, M. y Gros, P. (1989). Mamm¿¡¿¡ multidrug-resistance gene: correlation of exonorganization with structural domains and duplication of an ancestral gene. Proc. Natl. ,Acad. Sci. U. S.A 86.6488-6492.

9- Hughes' A. L. (1994). Evolution of the ATP-Binding-Casseüe transmembrane transporters ofvertebrates. Mol. BioI. Euol. 11. 899-910.

lG Higgirs, c. F., Hiles, r. D., salmonel, G. P. c., Gill, D. R., Downie, J. A. y cors. (19g6). Afamily of related ATP-binding subunits coupled to many biological processes in bacüeria. Nature(Inndon) 3?3, 448-450.

11- Monaco' J. J. Q992). A molecular model of MHC class-I-restricted antigen processing. Immunol.Today13, ll3-178.

12- Kamiio, K., Taketani, s., Yokoto, s., osumi, T. y Hashimoto, T. (1990). The TGkDaperoxisomal membrane protein is a member of the Mdr (P-glycoprotein)-related ATP-binding proteinsuperfamily. I. Biol. Chem.265, 453+4540.

151



Biltliosmfia

13- Gros, P., Dhir, R., Croop, J. y Talbot, F. (1991). A single amino acid substitution stronglymodulates the activif and subskate specificify of the mousemdrl and mdr3 drug efflux pumps. Proc.l,{atl. Acad. Scí. U..t A. 88, 7289-7293.

14- KajÜi, S.o Talbot, F., Grizzuti, K., Van Dyke-Ptrillips, V., Agresti y cols. (1993). Functionalanalysis of P-glycoprotein mutants identifies predicted transmembrane domain I I as a puiative drugbinding site. Biochemistry 32, 4185-4194.

15- Dhir' R., Grizzuti, K., Kaji¡i, S. y Gros, P. (1993). Modulatory effects on substrate specificify ofindependent muüations at the serine 9391941 position in predicted kansmembrane domain 11 of P-glycoproteins. Biochemistry 32, 9 492-9 499.

16- Cornwell, M. M., Safa, A., Felsted, R. L., Gottesman, M. M. y Pastan, I. (1986). Membranevesicles from multidrug-resistant human cancer cells contain a specific 150- to 170-kDa protein detectedby photoaffinity labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83, 3847-3850.

17- Busche, R., Tiimmler, 8., Riordan, J. y Cano-Gauci, D. F'. (1989) Preparation and utility of aradioiodinated analogue of daunomycin in the study of multidrug resistance. MoL. Pharmacol. 35, 414-421.

18- Mechetner, E. B. y Roninson, I. B. (1992). Efficient inhibition of P-glycoprotein-mediatedmultidrug resistance with a monoclonal antibody. Proc. Natl. ,4cad. Sci. U. S. A 89, 5824-5828.

19- Rittmann-Grauer, L. S., Yong, M. A., Sanders, v. y Mackensen, D. G. (rggz). Reversal ofVinca alkaloid resistance by anti-P-glycoprotein monoclonal antibody HYB-241 in a human hrmorxenograft. Cancer Res. 52, 1 810-1816.

20- Georges, E., Tsuruo, T. y Ling, V. (1993). Topology of P-glycoprotein as determined by epitopemappurg of MRK-16 monoclonal antibody. I. BioI. Chem 268, 1792-1798.

21- Ilorio, M., Gottesman, M. M. y Pastan, I. (1983). ATP-dependent transport of vinblastine invesicles from human multidrug-resistant cells. Proc. Natl- ,&ad. Sci. U. S. A 85, 358G3584.

22- Ueda, K., Cardarelli, C., Gottesman, M. M. y Pastan, I. (1987). Expresion of a full-lengthcDNA for the human "MDRI" gene confers resistance to colchicine, doxorubicin, and vinblastine.Proc. Natl. ,Acad. Sci. U. S. A 84. 3004-3008.

23- Gros, P., Neriah, Y. 8., Croop, J. M. y Housman, D. E. (1986). Isolation and expressiou of acDNA (dr) that confers multidrug resistance. Na&tre (London)323,728-731.

24- Yan der Bliek, A. M., Baas, f,'., Ten Houte de Lange, T., Kooiman, p. M., van der verdeKoerts, T. y Borct, P. (1987). The human mdr3 gene encodes a novel P-glycoprotein homologue andgives rise to alternatively spliced mRNAs in liver. EMBO I. 6, 3325-3331.

152



BíHíoen.fút

25- van der Bliek, A. iví., Kooiman, P. M., Schneider, C. y Borst, P. (igs8). Sequence of mdr3cDNA cncoding a human P-glycoprotein. GeneTL 4}1-4ll.

26- Devault, A. y Gros, P. (1990). Two members of the mouse mdr gene family confer multidrugresisüance with overlapping but distinct drug specificittes. Mol. Cell. Biol. L0, 1652-1663.

27- Gros, P, Raymond, M., Bell. J. y Housman, D. (1988). Cloning and characterization of a secondmember of the mouse dr gene family. tufol. CeII. Biol.8,277o-2ii8.

28- Goldstein, L. J., Galski, H., Fojo, A. T., Willingham, M. C., Lai, S. L. y cots. (1989).Expression of a multidrug resistance genes in human cancers. I. Natl. Cancer Inst. 8t, 116-124.

29- Linke, c. R., van der Bliek, A. M., schuurhuis, G. J., van der velde.Koerts, T., smit, J. J.M. y Borst, P. (1990). Multidrug resistance phenotype of human BRO melanoma cells transfected witha wild-type human mdrl complementary DNA. Cancer Res. S0, 1719-1785.

3G Devine' S. E., Lfoi8, V. y Melera, P. W. (1992). Amino acid substitutions in the sixthtransmembrane domain of P-glycoprotein alter multidrug resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U- S. ,L 89,4564-4568.

31- f,'ojo, A. T., ueda, IL, slamon, D. J., Poplack, D. G., Gottesman, M. lu. y pastan, r. (1997).Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tiszues. proc. Natl, ,bad. Sci. U S. Au.265-269.

32- Kakehi, Y., Kanamam, H., Yoshida, o., ohkubo, H., Nakanishi, s. y cols. (1999).Measurement of multidrug-resistance messenger RNA in urogenital cancer: elevated expression in renalcell carcinoma associaüed with inkinsic drug resistance. J. (Jrol. 139, 862-865.

33- Fojo, A. T., Shen, D. -w., Pastan, I. y Gottesman, M. M. (1987). tnkinsic drug resistance inh'man kidney cancer is associated with expression of a human multidrug-resistance gene- I. Clin.Oncol. 5, 1922-1927.

3a- Kanana4r, H., I&k€hi, Y., Yoshida, o., Nakanbhi, s., Fastan, I. y Gottesman, M. M.(1989). MDR1 RNA levels in human renal cell carcinomas: correlation with grade and prediction ofreversal of doxorubicin resistance by quinidine in tumor explants. I. Natt. &ncer Inst.8l, B4+84g.

35- Ilerweiier, H., Sonneveld, P., Baas, F. y Nooter, K- (1990). Expression of mdrl and mdr3multidrug-resistance genes in human acuüe and chronic leukemias and association with stimulation ofdrug accumulation by cyclosporine. J. Natl. Cancer.82, 1133-1140.

36- GoldsteinrL. J., Fojo, A. T., ueda, Ic, crist, w., Green, A. y cols. (1990). Expression of themultidrug resistance, MDRI, gene in neuroblasüomas. J. clin. oncol.8. 12g-136.

153



Biltliosrafía

37- Pirker, R., Goldstein, L. J., Ludwig, H., Linkesch, W., Lechner, C. y cols. (1989). Expressionof a multidrug resistance gene in blast crisis of chronic myelogenous leukemia. Cancer Cctmmun. 1,t4I-144.

38- Sato, H., Gottesman, M. M., Goldsteh, L. J., Pastan, I., Block, A., M. y cols. (1990).

Expression of the multidrug resistance gene in myeloid leukemias. Leukemia Res. 14, ll-21.

39- Sato, H., PreislerrH.rDay, R., Raza, A., Larson, R. y cols. (1990). MDRI transcript levels asan indication of resistant disease in acute myelogenous leukemia. Br. J. Haenqtol.75, 340-345.

4G Bourhis, J., Benard, J., Hartmann, O., Boccon-Gibod, L., Lemerle, J. y Riou, G. (1939).

Correlation of MDR1 gene expression with chemotherapy in neuroblastoma. J. Natl. Cancer Inst. 81,1401-1405.

41- Ma, D. D. F., Davey, R. A., Ilarman, D. A., kbistero J. P. Scurr, R. D. y cols. (1989).Detection of a multidrug resistant phenotype in acuüe non-lymphoblastic leukemia. Iancetl, 135-137.

42- RothenberB, M. L., Mickey, L. a., Cole, D. E. y Fojoo A. T. (1989). Expression of the mdr-1/P-170 gene in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood 74, 1388-1395.

43- Pirker, R., Wallner, J., Geissler, K., Linkesch, W., Haas, O. A. y cols. (1991). MDRI geneexpression and treahnent ouücome in acuüe myeloid leukemia. L Natl. Cancer Inst.83,7O8-7I2.

M- L^i, S. L., Goldstein, L. J., Gottesman, M. M., pastan, I. Tsai, C. M. y cols. (1989). MDR1gene expression in lung cancer. J. Natl. Cancer Inst.8l,1144-1150.

45- BeIl, D. R., Gerlach, J. H., Kartner, N., Buick, R. N, y Ling, V. (1935). Detection of p-

glycoprotein in ovarian cancer: a molecular m4rker associated with multidrug resistance. J. Clin. Oncol.3 , 3 1 1 - 3 1 5 .

46- Bourhis, J., Goldstein, L. J., Riou, G,, Pastan, I., Gottesmil, M. M. y Benard, J. (1939).Expression of a human multidrug resistance gene in ovarian carcinomas. Cancer Res. 49, 5A62-5065.

47- Schneider, J., Bak, M., Efferth, T. H.o Kaufmann, M., Mattern, J. y Votm, M. (1999). p-

glycoprotein expression in treated and untreated human breast cancer. Br. I. Cancer 60,815-818.

48- Dalton, w. s., Grogan, T. M., Meltzer, P. S., scheper, R. J., Durie, B. G. y cols. (1999).Drug-resistance in multiple myeloma and non-Hodgkin's lymphoma: detection of P-glycoproüein andpotenüal circumvention by addition of verapamil to chemotherapy . I. Clin. Oncol. 7, 415-424.

49- Gerlach, J. H., BelI, D. R., Kavabouser, C. y Ling, V. (1987). P-glycoprotein in ovarian cancer:a molecular marker associated with mulüdrug resistance. r. clin. oncol. s, 1452-1460.

r54



BiHiogmfía

5G Ro, J., Sahin, A., Ro, J. Y., Fritscheo H., Hortobagyi, G. y Blick, M. (1990).Immunohistochemical analysis of P-glycoprotein expression correlated with chemotherapy resistance inlocally advanced breast cancer. Hum. Pathol. 21, 787-791.

51- verrelle, P., Meissonnier, F., Fonck, Y., Feillel, v., Dionet, c. y cols. (ggr). clinicalrelevance of immuuohistochemical detection of multidrug resistance P-glycoprotein in breast carcinoma.J. Natl. Cancer l¿sf.83. ll l-116.

52- Thiebaut, F'., Tsuruo, T., Hamada, H., Gottesman, M. M., pastan, I. y wilüngham, M. c.(1987). Cellular localization of the multidrug-resistance gene product P-glycoprotein in normal humantissues- Proc. Natl. ,&ad. Sci. LI. S. A U.7735-1738.

53- Thiebaut, F., Tsuruo, T., Iramada, H., Gottesman, M. M., pastan, I. y willingham, M. c.(1989). Immrrnohisüochemical localization in normal tissues of different epitopes in the multidrughansport protein P170: evidenes fe¡ lssalization in brain capillaries and crossreactivity of one antibodywith a muscle proúein. J- Hiskrchem. Cytochem 37, 159-164.

54- Cordon-Cardo, C., O'Brien, J. P., Boccia, J., Casals, D., Bertino, J. R., Melamed, M. R.(1990). Expression of the multidrug resistance gene product (P-glycoprotein) in human normal andtumor tiszues. l. Histochem Cvtachem. 38. In7-Ll2S7 -

55- Van der Valk, P., Van Kalken, C. IL, Keúelaars, II,, Broxterman, H. J., Scheffer, G. y cols.(1990). Dishibution of multi-drug resistance-associated P-glycoprotein in normal and neoplastic humantissues. Analysis with 3 monoclonal antibodies recognizing different eprüop"r of the P-glycoproteinmolecule. ,4nn. Oncol 1.56-64.

56- Arceci, R. J., Croop, J. M., Harwitz, S. B. y llousrnan, D. (19s8). The gene encodingmultidrug resistance is induced and expressed at high levels during pregnancy in the secretory epitheliumof the uterus. Proc. NatI. ,&ad. Scí. U.,9. A 58. 4i5G.4354.

57- Yang, c. P., DePinho, S. G.o Greenberger, L. M., arceci, R. J., Horwitz, s. B. (19g9).Progesüerone interacts wiü P-glycoprotein in multidrug-resistant cells and in the endomekium of graviduterus. J. Biol. Chenn [email protected].

58- Arceci, R. J., Baas, F., Raponi, R., Horwitz, S. 8., Houwnan, D. y Croop, J. M. (1990).Multidrug resistance gene expression is controlled by steroid hormones in the secretory epithelium of theuterus. Mol. Reprod. Dev.25, 101-109.

59- Yang, C. P., Cohen, D., Greenberger, L. M., IIsu, S. I. y llorwitz, S. B. (1990). Differentialtransport properties of two mdr gene products are distinguished by progesterone. r. Biot. chem 26s,Lm82-1m88.

6G ueda' IC, okamuf,L N., Hirai, M., Tanigawarfl, y., saeki, T. y cob. (lgg2). Hgman p-glycoprotein transports cortisol, aldosterone, and dexamethasone, but not progesterone. ,I. Biol. Chem.267,24248-24252.

$5



Biblioemfía

61- Wolf, D. C. y Horwitz, S. B. (1992). P-glycoprotein transports corticosterone and is photoaffinity-labeled by the steroid. Int. J. Cancer52, 14l-146.

62- Smith, J. J. M., Schinkel, A. H., Oude Elf'erink, R. P. J., Grouden, A. K., Wagenaar, E. ycols. (1993). Homozygous disruption of the murine mLr2 P-glycoprotein gene leads to a completeabsence of phospholipid from bile and üo liver disease. Cel175, 451-M2.

63- Myers, C., Cowan, K., Sinha, B. y Chabner, B. (1987). The phenomenon of pleiotropic drugresistiance. En: Inprtant.Muancesia Oncology(De Vita, V. T.. Hellnan, S. y Rosenberg, S. A. eds).J. B. Lippincott Co. Philadelphia, n48.

64- Ilayes, J. D. y Wolf, R. (t990). Molecular mecanisms of resistance. Biochem. 1.272, Z8l-295.

65- Arcamone, f,'. (1985). Properties c¡f antinnnor anthracyclines and new developments in theirapplicaüons, Cain Memorial Award I-ech¡re. Cancer ftes. 45, t427-1432.

66- Powis, G. (1987). .Anthracycline metabolism and free radical formation. En Metabolism and acüonof anücancer drags. (Powis, G..v Prough, R. A., eds.). Taylor& Francis, London, 2rl-260.

67- Cilnaves, J. M. (1993)- Papel de la membrana plasmática en el desarrollo y reversión de resistenciacelul¿r a antraciclinas. Tuis Doctoral.

68- Tsumo, T, rida, H., Yamashiro, M., Tsukagoshi, s. y sakurai, Y. (1982). Enhancement ofvi¡cristine- and adriamycin-induced cytotoxicity by verapamil in P388 leukemia and its sublines resistantüo vincristine and adriamycm- Biochem- Pharnmcol.31, 3138-3140.

69- Zamora, J. M., Pearce, H. L. y Beck, W. T. (1983). Physical-chemical prcryrerties shared bycompunds that modulate multidrug resisüance in human leukemic cells. Mol. Pharmcol. 33, 45+462.

70- Doige' C. A., Yu, X. y Sharom, F. J, (1992). ATPase activig of partialty purified P-glycoproteinfrom multidrug-resistant Chinese hamster ovary cells. Biochim Biophys. tuta LÍtg, 149-160.

71- Ambudkar, A. Y., Lelongr I. H., Zbang, J., Cardarelli, C. O., Gottesman, M. M. y pastan,

l. (L992). Partial purification and reconstitution of the human multidrug-resistant pump: Characterizationof the drug-stimulable ATP hydrolisis. Biochemisty 89, 8472-8476.

72- Sharom, F. J., Yu, X. Y Dorge, C. A. (1993). Frmctional reconstitution of drug transport andATPase acüvif in proteoliposomes containing partially purified P-glycoprotein. I. BioI. Chem 32,24197-24202-

73- Meyers, M. 8., Rittman-Grauer, L., O'Brien, J. P. y Safa, A. R. (1989). Characterization ofmonoclonal antibodies recognizing a Mr 180,000 P-glycoprotein: Differential expression of the Mr180,000 and Mr 170,000 P-glycoproteins in multidrug-resistant h¡mor cells. Cancer Res. 49, 32A9-3214.

r56



Bíiliosafía

74- Shimabuku, A. M., Nishimoto, T., Ueda, K. y Komano, T. (1991). P-glycoprotein. ATphydrolysis by the N-terminal nucleotide-binding domain. I. Biol. Chem 267,4308-4311.

75- Lotan, R., Beattie, G., Hubbell, W. y Nieolson, G. L. (1977). Activities of lectins and theirimmobilized derivatives in detergent solutions. Implications on the use of lectin affinity chromatographyfor the purification of membrane glycoproteins. Biochemistryt6, 1787-1794.

76- Ling, V. y Shapiro, A. B. (1994). ATPase activity of purified and reconstituted P-glycoproteinfrom Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. ,Acad. Sci. U. S. A" 269, 3745-3754.

77- Hamad&, H. y Tsuruo, T. (1988). Puritication ot the 170- to lsGkilodalton membraneglycoprotein associate<l with multidrug resistance. J. BioI. Chem Xi3, I454-L458.

78- Van der Blieck, A. M., Meyers, M. 8., Biedler, J. L., Hes, E. y Borst, p. (1936). A 22 kDaprotein (Sorcin/Vl9) encode<I by an amplified gene in multidrug-resist¿nt cells is homologous to thecalcium-binding hght chain of calpain. EWO l. 5, 32}l.3l}g.

79- Kartner, N., Evernden-Porelle, D., Bradley, G. y Ling, V. (19S5). Deúection of P-glycoproteinin multidrug-resistant cells by monoclonal antibodies. Nature (Inndon)316, B2a-823.

80- flamada, H. y Truruo, T. (1986). Functional role for the 17G to l8GkDa glycoprotein specific todrug-resistant ü¡mor cells as revealed by monoclonal antibodies. Proc. ItiatL. ,bad, Sci. U. .t ¿. 83.7785-7789-

81- Broxtermrn, H. J., Pinedo, H. M., Kuiper, c. M., van der Hoeven, J. J., De Lange, p. ycols. (1989). Inmunohistochemical detection of P-glycoprotein in human tumo¡ cells with a Iow degreeof drug resistance. Int. J. Cancer 43, 340-343.

82- Lathan 8., Edwards, D. R, Dressler, L. G., von Hoff, D. D. y McGuire, w. L. (1995).Inmusologisal detection of Chinese hamster ovary cells expressing a multidrug resistance phenofpe.Cancer Res. 45, 50É.4-50619.

83- Meyers, M. 8., Rittmann-Grauer, L., O'Brien, J. B. y Safa, A. R. (1989). Characterization ofmonoclon¿l antibodies recognizing a Mr 180,000 P-glycoprotein: differential expression of the Mr180'000 and Mr 170,000 P-glycoproúeins in multidrug resistant human tumor cells. Cancer Res. 49,389-394.

84- cenciareüi, c., currier, s. J., willingham, M. c., Thiebaut, F., Gerrnann, u. A. y cols.(1991). Úaracterizartiorr by somatic cell genetics of a monoclonal antibody to the MDRI gene product(P-glycoprotein): deüerminaüon of P-glycoprotein expression in multi-drug-resistant KB and CEM cellvariants. Int. J. Cancer 47. 533-543.

r57



Bibliastafía

85- Aihara, M., Aihara, Y., Schmidt-Wolf, G., Schimidt-Wolf, I., Sikic, B. t. y cols. (1991). Acombined approach for purging mulüdrug-resistant leukemic cell lines in bone marrow using a

monoclonal antibody and chemotherapy . Blood 77, ZO19-2A85.

86- Inaba, M., Kobayashi, H., Sakurai, Y. y Johnson, R. K. (1.979) Active efllux of daunorubicinand adriamycin in sensitive and resistant sublines of P388 leukemia. Cancer Res. 39, 22W22O3.

87- Ling, V., Juranka, P. F., Endicott, J. A., Deuchars, K. L. y Gerlach, J. H. (1988): "Multidrug

resistance and P-glycoprotein expression", n luíechanism of drug resistance in neoplastic cells.(Woolley, P. V. y Tew, K. D. eds.). Academic Press, New York, 197-209.

88- Gerlach, J. J., Endicott, J. A., Juranka, P. F., Henderson, G., Sarangi, F. y cols. (1936).

Homology between P-glycoprotein and a bacterial haemolysin transport protein suggests a model formultidrug resistance. Nahre (London) 3U, 485-489.

89- Sarkadi, 8., Price, E. M,, Boucher, R. C., German, U. A. y Scarborough, G. A. (Ig9Z).Expression of the human multidrug resisüance cDNA in insect cells generates a high activity drugs-sfimulated membrane ATPase. l. BioI. Chem 267. 485+4858.

9G Germann, U. A., Willingham, M. C., Pastan, L y Gottesman, M. M. (1990). Expression of thehuman multidrug transporter in insect cells by a recombinant baculovi¡us. Biochemistry2g, 2295-2303.

91- LelorE, I. H., Padmanabhan, R., Lovelace, E., Pastan, I. y Gotternan, M. M. (1992). ATpand GTP as altemative energy sources for vinblastine transport by P-fiA in KB-VI plasma membranevesicles. FEBS Leü. 304.. 256-260.

92- Horio, M., Loveplace, 8., Pastano r. y Gottesman, M. M. (1991). Agents which reversemultidrug-resistance are inhi$i¡s¡s of l3H]-vinblastine kansport by isolated vesicles. Biochim Biophys.,eb 1061, 106-110.

93- Spoelstra, E. C., Westerhoff, H. V., Pinedo, H. M., Dekker, H. y Lankelrna, J. (1994). Themultidrug-resistance.reverser verapamil interferes with cellular P-glycoprotein-mediated pumping ofdaunorubicin as a non-competing substraüe. Eur. J. Birchem" 221, 363-373.

94- Roninson, I. B. (1991). P-glycoprotein-mediated drug resistance: puzzlez and perspectives. En:Molecular and cellular biology of multidrug resistance in tumor cells. (Roninson, I. B. ed.). PlenumPress, New York, 395-391.

95- Skovsgaardr T. (1978). Mechanism of cross resistance between vincristine and daunorubicin inEh¡lich ascites brmor cells. Cancer Res. 38. 4722-4727.

96- Skovsgaard, T. (1978). Mechanisms of resistance to daunorubicin by sensitive and anthracyclinerosistant sublines of P388 leukemia. C¿ ncer Res.38" 1735-1791.

15E



Biilioenfía

97- Nogai, [., Kohno, K., Kikuchi, J., Kuwano, M., Akiyama, S. y cols. (1989).Analysis ofstructural features of dihydropyridine analogs needed to reverse multidrug resistance and to inhibitphotoaffinity labeling of P-glycoprotetn. Biochem Pharnncol. 38, 519-527.

98- Neyf'akh, A. A. (1983). Use of fluorescent dyes as molecular probes fbr the study of multidrugresistance. Ery. Cell. Res.I74, 168-176.

99- Kessel, D. (1989). Exploring multidrug resistance using rhodamine 123 published err¿tum appearsin Cancer Commun 1989 Nov;1(5):335. Cancet Comrwn.I, 145-149.

10G Raviv, Y., Poüard, H. 8., Bruggemann, E. P., Pastan I., Gottesman, M. M. (1990).Phoüosensitized labeling of a functional multidrug transporter in living drug resistent tumor cells. I. Biol.Chem. 265,3975-3980.

101- Higgins, C. F. y Gottesman, M. M. (1992). Is the multidrug transporter a flippase?. TrendsBiochem Sci.17" t8-2L.

102- Roepe, P. D., Wei, L. Y., Crus, J. y Carlson, D. (1993). f.ower electrical membrane potentialand altered pHi homzustasis in multidrug-resistant (MDR) cells: futher characterization of a series ofMDR cell lines expressing different levels of P-Glycoprotein. Biochemistry4I, lLO42-ltO56.

103- Soto, F., Ptanells-Caseso R., Cánaves, J. M., f,'errer-Montiel, A- v., Aler, J. y cols. (1993)-Possible coexistence of two independent mechanisms contributing to anthracycline resistance inleukaemia P388 cells. Eur. l. CaacerL5.214+2150.

1O4- AbrahamrE.H., kat, A. G., Gerweck, L., Seneveratne, T., Arceci, R. J. y cots. (1993). Themultidrug resistance (mdrl) gene product functions as an ATP channel. Proc. Natl. Acad. ki. U. S. A90,312-3t6-

105- Zimmermann, H. (1994). Signalling via ATP in the nervous system. Tiends Neurosci. !7, 42A-425.

106- Clairmont, C. A., DelVfaio, A. y Hirschberg, C. B. (1992). Translocation of ATP inúo the lumenof rough endoplasmic reüculum-derived vesicles and its binding to luminal proteins including Bip (GRp78) and cRP 94. I. Biol. Chem 267,3983-3990.

107- Winklern H., Apps, D. K. y fiscer-Colbrie, R. (1986). The molecular function of adrenalchromaffin granules: established facts and unresolved topics. NeurosciencelS,26l-290.

108- Cala, P. (1990). Principles of cell vohrme regulation: ion flux pathways and the roles of anions.En: Chloride channels and carriers in nerve, mnscle, and gtial cells. (Alvarez-kefmans, F. J. andRussell, J. M. eds.), Plenum Press, New York and Loudon, 67-84-

109- lloffrnann, E. K. y Simonsen, L. O. (1989). Membrane mechanisms in volume and pHregulation in vertebraúe cells. Physiol. Rev. 69,3L5-382.

159



Bibliusnfu

110- Estacion, M. (1991). Characterization of ion channels seen tn subconfluent human clermalfibroblasts. J. Plrysiol. 436, 197 -218.

lll- Falke, L. C. y Misler, S, (1989). Activity of ion channels during volume regulation by clonalNIEl15 rreuroblastorna cells. Proc. Natl. kad. Sci. U. S. A 86.3919-3923.

112- Lewis, R. S., Ross, P. E. y Cahalan, M. D. (1993). Chloride channels activated by osmoticstress in lymphocyúes. I. Gen. Phyciol.101, 801-826.

113- Doroshenko, P. y Nelrer, E. (1992). Volume-sensitive chloride conductance in bovine chromaffincell membrane. I. Physiol. 4/;9, L97-218.

114- Nilius, 8., Oike, M., Zahradnik, I. y Droogmam, G. (1994). Activation of a Cl- current byhypotonic volume increase in human endothelial cells. ,f. Gen. Physiol.103, 787-805.

I 15- Ackerman, M. J., Wickrnan, K. D. y Clapham, D. E. (1994). Hypotonicity activates a nativechloride current n Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. lW, 153-179.

116^ Arellano, R. O. y Miledi, R. (1993). Novel Cl currents elicited by follicle stimulating hormoneand acetylcholine in fbllicle-enclosed xenopus oocytes. L Gen. Physiol. 102, 833-857.

117- Anderson, M. P., Gregory, R. J., Thompson, S., Souza, D. W., paul, S. y cols. (f 991).Demostration th¿t CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science 253, 202-205.

I 18- Katner, N., Hanrahan, J. W., Jensen, T. J., Naismith, A. L., Sun, S. y cols. (1991).Expression of the cystic fíbrosis gene in non-epithelial invertebrate cells procluces a regulated anionconductance . Cell G, 68I-692.

I 19- Tabcharani, J. A., Chang, x-B., Riordan, J.R. y Hanrahan, J. w. (r99t). phosphorylarion-

regulated Cf channel in CHO cells stably expressing the cystic fibrosis gene. I{ature (I-ondon) 352,628-63t.

120- Anderson, J. A., Hupr:ikar, S. S., Kochian, L. V., Lucas, W. J. y Gaber, R. F. (1992).Functional expression of a probable Arabidopsis thaliana potassium channel in Saccharomycescerevisiae. Proc. Natl. ,&ad. Sci. U. S. A 89.3736-3740.

l2l- Reisin, I. L., Prat, A. G., Abraham, E. H., Amara, J. F., Gregory, R. J. y cors. (1994). Thecystic fibrosis transmernbrane conductiance regulaúor is a dual ATP and chloride channel. I. BioI. Chem269,20584-2059t.

122- Knowles, M. R., Clarke, L. L. y Boucher, R. C. (1991). Activation by extracellular nucleotidesof clrloride secretion in the airway epithelia of patiens with cystic fibrosis. N. Engl- I. Med. 325, S3i-538,

160



123- Boucher, R. C., Cotfon, C. U., Gatzy, J. T., Knowles, M. R. y Yankaskas, J. R. (1983).

Evidence for reduced Cl- and increasctl Na+ permeability in cystic fibrosis human primary cell cultures.J. Physiol. Innd. 405,77-1O3.

124- Hyde, S. C., Emsley, P., Hartshom, M. J., Mimmack, M. M,, Gileadi, U. y cols. (1990).Struch¡ral model of ATP-binding proteins associated with cystic fibrosis, multidrug resistance andbacterial transport. Nature (Inndon) 346, 362-365.

125- Riordan J. R., Rornrnens, J. M., Kerem, 8., Alono N., Rozmahel, R. y cols. (1989).Identification of the cystic fibr<rsis gene: cloning and char¿ctenzation of complementary DNA. Science2A¡5, to66-to73.

126- Trezise, A. E. O., Romano, R R.n GiU, D. R., Hyde, S. C., Sepúlveda, F. V., y cols.(1992).The multidrug resistance and cystic fibrosis genes bave complementary patterns of epithelialexpresion. EMBO J. LL, 429L-43A3.

127- Brener, W., Slotki, I. N., Ausiello, D. A., Cabantchik, I. Z. (L993). lnduction of multidrugresistance (MDR) dow-regulates the expression of the cystic fibrosis hansmembrane conductanceregulaúor (CFTR) in colon epithelial cells. Am. J- Physiol.265, CITLL-C1715.

128- Valverde, M. A., Díaz, M, Seprilveda, F. V., Gill, D. R., Hyde, S. C. y tliggins, C. F.(1992>. Volume-regulaúed chloride channels associaüed with the hum¿ur mulüdrug-resisúance P-glycoproúein. Nature (Iondon) 355, 830-833.

L29- Gill, D. R., Hyde, S. C., Higgins, C. F., Valverde, M. A., Minteniry. G. M. y SeprÍtveda, F.V. (1993). Separation of drug transport and chlo¡ide channel function of the hrm¿¡ multidrug resistqnceP-glycoprotein . CeIl 7 L, 23-32.

13G McEwan' G. T. A., Hunter, J., Hirst, B. H. y Simmors, N. L. (1992). Volume-activated Cl-secretion and transepithelial vinblastine secretion mediated by P-glycoprotein are not correlated incultured human T84 inüestinal epithelial layers. FEBS Leü.3M,233-236.

131- Escriba, P. V., tr'errer-Montiel, A. V., Ferragut, J. A. y Gonzalez-Ros, J. M. (1990). Role ofmembrane üpi<ls in the interaction of daunomycin with plasma membranes from tumor cells: implicationsin drug-resisüance phenomena. Biochemisty 29, 727 5-7282.

132- Jamali, M. A. A., Yin, M.-b., Mannnl, a., Bankusli, I., y Rustum, Y. M. (19s9).Relationship between cytotoxicity, drug accumulation, DNA damage and repair of hum¿¡n ovarian cancercells treated with doxon¡bicin: modulation by the tiapamil analog ROll-2933. Cancer Chemther.Phartmcol. 25, 77-83.

133- Chaires, J. 8., Dattagupta, N. y Crothers, D. M. (1982). Self-association of daunomycin.Biochemisky 21, 3927 -3932.

161



Bibliosmfía

134- Krishatr, A., Sauerteig, A. y Stein, J. H. (1983). Comparison of three commercially available

antibodies for flow cytometric monitoring of P-glycoprotein expression in tumor cells. Cytonretry 12,73t-737.

135- Martinu Carri6n, M., González-Ros, J. M., Mattingly, J. R., Ferragut, J. A., Farach, M.

C. y Donelly, D. (i984). Fluorescence probes for the shrdy of acetylcholine recepüor function. Biophys.J. 45, t41-143.

136- Neubig, R. R., Krodel, E. K., Boyd, N. D. y Cohen, J. B. (1979). Acetylcholine and localanesthetic binding to Tbrpedo nicotinic postsynaptic membranes after removal of noncepüor peptides.

Proc. Nad. .*-ad. Sci. U. S. A.76.69U694.

137- Jones, O. T., Earnest, J. P. y McNamee, M. G. (1987). Solubilization and reconstih¡tion of

membrane proteins. En: Biological lulentbranes. A Pracücal Approach. (Finlay, J. B. C. y Evans, W.

H. eds.), IRL Press, Oxford. 139-177.

138- Wriggleswoorth, J. M., Woodster, M. S., Elsden, J. y Danneet, H. J. (1987). Dynamics ofproteoliposome formation. lntermediaüe stales during detergent dialysis. Biochem I. U6,737-744.

139- Paternostre, M. T., Roux, M. y Rigaud, J. L. (1988). Mechanisms of membrane proteininsertion into liposomes during reconstitt¡tion procedures involving the use of detergents. 1.Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100,octyl-glucoside and sodium cholate. Biochemistry 27, 2668-2688 -

140- Riquelme, G., L6puz,, E., Garcfa Segura, L. M. Ferragut, J. A. y González-Ros, J. M.(1990). Giant üposomes: A model in which 0o obtain patch-clamp recordings of ionic channels.B iochemistry 29, I lZlS - I 1222.

141- Gonzátez-Ros, J, M., Parasctros, A. y Martínez Carión, M. (1930). Reconstitution offrrnctional membrane-bound acetylcholine recepúor from isolated Torpedo caübrnica receptor proteinand electroplax üpids. Proc. NatI. ,4cad. Sci. U" S. A 77,1796-1800.

142- Fernández-Ballester, G. (1992). Estudios estructurales del receptor nicotínico de acetilcolinamediante espechoscopía de infrarrojo por transformada de Fourier. Tesis Doctoral.

143- Peterson, G. L. (1977). A simplification of the protein assay method of towry et al. which ismore generally applicable. AnaI. Biochem 83, 346-356.

144- I'owryr 0. H., Rosebrough, N. J., Am, A. L. y Randalt, R. J. (1951). Protein measurementwith the Folin Phenol reagent. I. BioI. Chem 193,265-275.

145- Barth' L.G. y Barth, L.J. (1959). Differentrtion of cells of the Rana Pipiens gastrula inunconditioned medium. I. Embyol- Ory. tutorphol. 7, 21G222.

162



Bíbliosmfía

146- Dumont, J. N. (1912). Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development inlaboratory mantained animals. I. Morphol.136, 153-179.

147- Kusano, K., Miledi, R. y Stinnakre, J. (1982). Cholinergic and catecholaminergic receptors inthe Xenopus oocyte membrane. I. Physiol. (London)328, L43-11e.

148- Miledi' R. y Woodward, R. M. (1939). Effects of defolliculation on membrane current responsesof Xenopus oocytes. l. Physiol416,6Al-621.

149- Ivorra, I. (1993). Propiedades de membrana nativas y efectos de los fosfoinositoles en ovocitos deXenopus laeuis. Tesis Doctonl.

150- Ramu, A., Glaubiger, D. y Weintraub, H. (1984). Differences in lipid composition ofdoxorubicin-sensitive and -resistant P388 cells. cancer Treat" Rep. 6t, 637-641.

151- Bradford, M. (1976). Rapid and sensitive method for the quantification of microgram quanfifies ofproteins utilizi¡g the principle of proüein dye binding. AnaI. Biochem 72,248-254.

152- Laernmli, U. K. (1970). Cleavage of skuctural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature (Inndoa) 277, 68G685.

153- Towbirl, H', Staehelin, T. y Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proüeins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. NatI. kad. Sci. U.s. A 76, 4350-4354-

154- I{etmeland, L. M. (1990). Solubilization of native membrane proüeins. En: Guide to proteinpurifrcation. MethodsipFnzirnlogy. (Deutscher, M. P. ed.). AcademicPress, SanDiego, Z5j-264.

155- Sadler, S. E. y Maller, J. L. (1931). Progesterone inhibits adenylaüe cyclase in Xenopus oocyres.Action on the guanine nucleotide regulatory protein. l. Biol. chem 2s6, 636g-6373.

156- Marbach, E. P., Weil, M. H. (1967). Rapid enzrymatic measurement of blood lactate andpyruvate. Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. CIin Chem 13, 3l+325.

157- Deluca, M., Wannlund, J. y McBlroy, W. D. (1979\. Factors affecting the kinetics of lightemission from crude and purified frefly luciferase. Anar. Biochem 9s, 19+199.

158- Kusano, IC, Miledi, R. y Stinnakre, J. (1977). Acetylcholine receptors in the oocyte membrane.Na ture (Loadon) 27 0, 739-7 41.

159- Parker, I., Gundersen, C.B. y Miledi, R. (1985). A transient inward current eücited byhyperpolarization during serotonin activation in Xenopus oocyúes. Proc- R bc. Lod. S. (B) 223, Z7g-292.

r63



Bibliosnfía

160- Miledi, R., Parker, I. y Sumikawa, K. (1982) Properties of acetylcholine receptors translated by

cat muscle mRNA n Xen<tpus oocytes.EMBO J. l, l3O7-13L2.

161- Changeaux, J. P., Galzi, J. L., Devillers-Thiery, A. y Bertrand, D. (1992). The functional

architecture of the acetylcholine nicotinic receptor explored by affiniq' labelling and site-directed

mutagenesis. Quarterly Reuiews of Biophysics 25, 395-432.

162- Katz, B. (1966). Nerve, Muscle and Synapses. McGraw and Hill Book Co., New York, 194págs.

163- Tank, D.W., Huganir, R. L., Greengard, P. y Webb, W. W. (1983). Patch-recorded single-'channel currents of the purified and reconstituted Torpedo acefflcholine receptor. Proc. Natl Acad. Sci.

u. s. A 80,5129-sr33.

164- Saclanann, 8., Methfessel, C., Mishina, M., Takahashi, T., Takai, T. y cols. (1985). Role of

acetylcholine recepüor subunits in gating of the channel. Nature (Inndon) 318, 538-543.

165- Barnard, E. A., Miledi, R. y Sumikawa, K. (1982). Translation of exogenous messenger RNAcoding for nicotinic acetylcholine receptors in Xenopus oocytes. Proc. R Soc. London.ger. (B) 215,24t-246.

16G Mishina, M., Takai, T., Imoto, K., Noda, M., Talflhashi, T. y cots. (198ó). Moleculardistinction between fetal and adult forms of muscle acetylcholine receptor Nature (London) 321, 4CÉ.-411.

167- Sumikawa, K. y Miledi, R. (1989). Change in desensitization of cat muscle acetylcholine recepüorcaused by coexpression of To¡pedo acetylcholine receptor subunits in Xenopus oocytes. Proc. Natl.,&ad. Sci. U. S. A 86,367-371.

168- Morales, A. y Sumikawa, K. (1992). Desensitization of junctional and extrajunctional nicotinicACh receptors expressed'rn Xeaopus oocytes. lulal. Bnin ftes. 16, 323-329.

169- Okamoto, T. y Sumikawa, K. (1991) Antibiotics cause changes in the desensitization of AChreceptors expressed rn knopus oocytes.lúol Brain Ra..9, 165-168.

17G Thomas C. T. y McNamee M. G.(1990) Purification of Membrane Proteins. Methods inEnzimology, vol 182, 499-520.

171- KurosaH, T., Flrkuda, K., Konno, T., Mori, Y., Tanaka, K. y cols. (1987). Functionalproperties of nicotinic acet¡rlcholine receptor subunits expressed in various combinations. FEBS LetL214,253-258.

172- Buller' A. L. y White, M. M. (1990). Functional acetylcholine receptors expressed in Xenopusoocytes after injection of Torpedo beta, gamma and delüa subunits RNAs are a consequence ofendogenous oocyte gene expression. Mol. Phanmcol. 37, 423-428.

1.64



Biblioenfía

173- Gibb' A. J., Kojimz, H., Carr, J. A. y Colquhoun, D. (1990). Expression of cloned receptorsubunits produces multiple receptors. Proc. R Sac. Ltndon Ser. BM\ 108-t 12.

fTzl- Kullberg, R., Owens, J. L., Camacho, P., Mandel, G. y Brehm, P. (t990). Muttipleconducf¡nce classes of mouse nicotinic acetylcholine receptors expressed

'n Xercpus oocytes. Proc.

Natl. ,Acad. Sci. U. S. A87.2M7-2O71.

175- Miledi' R., Parker, I. y Sumikawa, K. (1989) Transplanting receptors fonn brains into oocytes.En: Fidia Research Foundation Neuroscience Lecfires. Vol 3, Raven Press Ltd. New York. 57-90.

176- Buller' A. L. y White, M. M. (1990). Altered patterns of N-glycosylation of the TorpetoAcetylcholine receptor expressed 1n Xenopus oocytes. J. Menbrane Biol. llÍ, 179-LBg.

177- Thornhill, W. B. y Levinson, S. R. (1937) Biosynthesis of electroplax sodium channels inelectrophonrs electrocytes and Xenopusoocytes. Biochemistry2í, 438I-4388.

178- Auld, V. J., Goldin, A. L., Krafte, D. S., Marsha[, J., Dunn, J. M. y cols. (19g8). A ratbrain Na+ channel alpha subunit with novel gating properties. Neuront, 449-61.

179- Moorman, J. R., Kirsch, G. E., VanDongen, A. M. J., Joho, R. H. y Brown, A. M. (1990).Fast and slow gating of sodium channels encoded by a single mRNA. Neuron*, z4j-252.

180- Trimmer, J. s., cooperman, s. s., Tomiko, s. A., zhou, J., crean, s. M. y cors. (19s9).Primary structure and frurctional expression of a mammalian skeletal muscle sodium channel. Neuron3,33-49.

181- Popot, J. L., Cartaud, J. y Changeaux, J.p. (l9Sl) Reconstitution of a functional acetylcholinereceptor. Eur. J. Biochem ll8,2O3-2L4.

182- Huganir, R.L., Schell, M.A. y Racker, E. (1979). Reconstitution of the purified acetylcholinerecepüor from Torpedo californica. FEBS Leü.108, 155-160.

183- Lindstrum, J., Anholt, R., Einarsotr, 8., Engel, A., Osame, M. y Montd, M. (19g0)Purification of acetylcholine receptors, reconstitution into lipid vesicles, and shrdy of agonist-inducedcation channel regulation. I. Biol. Chem. ?.55,8340-8350.

184- Marsal, J., Tigyi, G. y Miledi. R. (1995). lncorporation of acetylcholine receptors and Cl-channels tn Xenopus oocytes injected with Torpdo elechoplaque membranes. Proc. Naü. kad. Sci. U.s. A 92,5224-5228.

185- Neubig, R. R., Boyd, N. D. y Cohen, J. B. (1982) Conformations of Tb@o acetylcholinereceptor associated with ion transport and desensitiz¿tton. Biochemistry2l, 3MO-3467.

165



Bibliosnfía

186- Miledi, R. y Sumikawa, K. (1982) Synthesis of cat muscle acetylcholine receptors by knopusoocytes.Bionred. Res. 3, 390-399.

187- Mishint, M., Tobimatsu, T., Imoto, K., Tanaka, K., Fujita, y cols. (1985) Location offunctional regions of acetylcholine receptor ct-subunit by site-directed mutagenesis.Nature (Ipndon)

3L3,364-369.

188- Sumikawa, K., Houghton, M., Emtage, J. S., Richards, B. M. y Barnard, E. A. (1981).

Active multisubunit Ach receptor assembled by translation of heterologous nRNA in Xenopus oocytes.Na ture (Lotñon) 92, 862-864.

189- Neher, E. y Satanann, B. (1976). Single-channel currents recorded from membrane of clenervatedfrog muscle fibres. Nature (London) 260, 799-80?,.

19G Castillo, G., Vera, J. C., Yarg, C. H., Ilorwitz, S. B. y Rosen, O. M. (1990). Functionalexpression of murine multidrug resistance in Xenopus laeüs oocytes. Proc. Naü. ,bad. Sci. tl. S. A87, 4737-4741.

191- Ilammond, J., Johrstone, R. y Gross, P. (1989). Enhanced efflux of [3H] vinblastine fromChinese hamster ovary cells transfected with a full-length complementary DNA clone for the drl gl.rre.Cancer Res. 49, 3867 -387 t.

192- Gal,B., Aleu, J., Gonzálu-Ros, J. M., lvorr&, I., Feragut, J. A. y Morales, A. (1995).Secuencia Temporal de la incorporación del recepüor nicotínico purificado en la membrana de ovocitos yefecto del entorno lipídico de reconstitución. ,Rev. Neurol.23, 599.

193- Drori' S., E¡rtan, G. D. y Assaraf, Y. G. (1995). Potentiation of anticancer-drug cytotoxicity bymultidrug-resistance chemosensitizers involves alüerations in membrane fluidity leading to increasedmembrane permeability. Eur. J. Biochem,2?3, LO2O-|OZ9.

194- Arellano, R. O. y Miledi, R. (1995). Functional role of follicular cells in the generation ofosmolarity-dependent Cl- currents n Xenopus follicles. ,r. Physiol. Affi, 3Sl-357.

195- Pauknichl, M., Li, Y., wiclanatr, K., ackerman, M., Peralta, E. y clapham, D. (1992). Newmammalian chloride channel identified by expression cloning. Nature (I-ondoa)356,238-241.

196- Krapivinsky, G. 8., Ackerman, M., Gordon, E. A., Krapivinsky, L. D. y Clapham, D.(1994). Molecular characterization of a swelling-induced chloride conductance regulatory protein, pICn.CeL|76,439-448.

197- Gschwentner, M., Nagl, u. o., wóll, 8., Schamarda, A., Ritter, M. y pauhnictrl, M. (1995).Antisense oligonucleotides suppress cell-volume-induced activation of chloride channels. Pflügers Arch.430- 46+470.

T6



Bibliosafla

198- Diaz, M., Valverde, M. A., Higgins, C. F., Rucárenau, C. y Sepútveda, F. V. (1993).

Volume-activated chloride channels in Hel¿ cells are blocked by verapamil and dideoxyforskolin.Pflügers Archiv. 422, 347 -353.

199- Tominagi, M., Tominaga, T., Miwa, A. y Okada, Y. (1995). Volume-sensitive chloride

channel activity does not depend on endogenous P-glycoprotun. I. Bíol. Chem 270,27887-77893.

20G Mastrocola, T., Flamigni, A. y Rugolo, M. (1991). Hypotonic shock activated Cl- and K+pathways in huntan fibroblasts. Biochim Biophys. futa l0úig,2A1-2O8.

201- Ehring, G. R., Osipchuk, Y. V. y Cahalan, M. D. (1994). Swelling-activated chloride channelsin multidrug-sensitive and -resistant cells. I. Gen. Physiol. 104, tl29-ll6l.

202- Rasola, A., GaliettarL. J. V., Gruenert, D. C. y Romeo, G. (1994). Volume-sensiúve chloridecuffents in four epithelial cell lines are not directly correlaúed üo the expression of ttre MDR-I gene. J.Biol. Chem 269, 1432-1436.

203- Worrell, R. T., Butt, A. G., Cliff, W. H. y Ftizzell, R. A. (1939). A volume-sensitive chlorideconductance in human colonic cell line Tg4. ,4m I. Physiol. 256, CLlll-Cl119.

2Oz1- Aftenberg, G. A., Vanoye, C. G., Han,

Relaüonships between rhodamine 123 transporfglycoprotein. J. Biol. Chem 269,7145-7149-

E. S., Deitmer, J. W. y Rzuss, L. (1994).

cell volume, and ion-channel ftmction of P-

205- Altenberg, G. A., Deitmer, J. W., Glass, D. C. y Reuss, L. (1994). P-glycoprotein-associatedCf currents are activated by cell swelling but do not contribute üo cell volume regulation. Cancer Res.54,618-622.

206- De Greef, C., Van der Heyden, S., Viana, F., Í'ggermofr, J., De Bruijn, E. A. y cols. (1995).Lack of correlation between mdr-l expression and volume-activation of chloride-currents in rat coloncancer cc,lls. Pflügers Arch. 430, 296-298.

2o7-Yiana, F., van Acker, K., De Greef, c., Eggermont, J., Raeymaeckers,L. y cols. (1995).Drug-hansport and volume-activated chloride sfiannel ñrnctions in human eryth¡oleukemia cells: relationto expression level of P-glycoproten. J. Menb. Biol. 145,87-98.

208- De Greef, C., Sehrer, J., Viana, F., Van Acker, IL, Eggermont, J., y cols. (1995). Volumq.acüvated chloride currents are not cor¡elated with P-glycoprotein expression. Biochem I. 3W, 713-718.

209- Morin, X. K., Bond, T. D., Loo, T. W., Clarke, D. M. y B€ar, C. E. (1995). Failure of p-

glycoproüein (MDRI) expressed in Xenopus oocyúes üo produce swelling-activaüed chloride channelactivity. J. Physiol. 4W, 707-7 L4.

2lG Kirk' J. y Kirk' K. (1994).Inhibition of vohmre-activated I- and Taurine Efflux from HeI-a cellsby P-glycoproúein blockers correlates with cahnodulin inhibition. J. Biol. Chem 269, 29389-29394.

167



Bililiasr¿fía

211- Valverde, M. 4., Mintening, G. M. y Sepúlveda, F. V. (1993). Differential effects of tamoxifen

and I- on three distinguishable chloride currents activated in T84 intestinal cells. Pflügers Arch. 425,552^554.

ZI2- Zhang, J. J. y Jacob, T. J. C. (1994). ATP-activated chloride channel inhibiüed by an anübody toP-glycoproten. An I. Physiol. 267, ClOgí-Cl 102.

213- Bear, C. E. (1994). Drugs hansported by P-glycoprotein inhibit a 4O pS outwardly rectifiying

chloride channel. Biochem Biophys. Res. Con¡m. 2M, 513-521.

zla- Htggings, C. F. (1992). ABC transporters: from microorganisms to man. ,4nnu. Rev. CelI. Biol.8 :67-113.

215- Ilardy, S. P., Goodfellow, H. R., Valverde, M. A., Gilt, D. R., Sepúlveda, F. V. y Higgins,

C. F. (1995). Protein kinase C-mediated phosphorylation of the human multidrug resistance P-glycoprotein regulates cell volume-activaüed chloride channels. EWO J. 14, 68-75.

216- Higgins, C. F. (1995). Volume.activated chloride currents associated with the multidrug resistanceP-glycoproten. I. Physiol. 482P, 315-365.

217- Dory, Y., Chen, G., Durán, G. 8., Kouyama, K., Chao, A: C., et al. (1994). Volume-activated chloride current is not related to P-glycoprotein overexpression. C¿¡ce¡ ̂ Res. 54, 5V29-2O32.

218- Bossa, R., DasdÍa, T., Galatulas, Y. y Zunino, F. (1986) Sensitivity in P388/dx leukaemia cells.Aaticancer Research 6, 1037-1040.

219- Lyon, R.C., Cohen, J.S., Faustino, P.J., M€gnh F., y Myers C.E. (1983). Glucosemetabolism in drug-sensiüve and drug-resistant h'man breast cancer cells monitored by magneücresonance spectroscopy . Cancer Research 48, 870=877 .

220- Wright, L. C:, Dyne, M., Holrnes, trL T. Romeo, T. y Mountford, C. E. (1986). Cellularresisüance to vinblastine is associated with altered respiraüory function. Biochemistry Int.l3(2),295-305.

221- l(aplan, O., Navon, G., Lyon, R. C., Faustino, P. J., Straka, E. J. y Cohen, J. S. (1990).Effects of 2-deoxyglucose on drug-sensitive and drug-resistant human breast cancer cells: toxicity andmagnetic resonance spechoscopy shrdies of metabolism. Cancer Res. 50, 54+55L.

222- wilder, P. J., overman, D. K, Tenenholz, T. c. y Gutierrez, P. L. (1990). Differences inmyristic acid synthesis and in meüabolic rate for P388 cells resistant to doxorubicn- J. üpid ftes. 31,r973-1982.

223- Braxtennan, H.J., Plnedo, H.M., Kuiper, C.M., Schuurhuis, G.J. y Lankelma, J. (1989).Glycolysis in P-glycoprotein-overexpressing human tumor cell lines. Effects of resistance modifoingagents. FEBS Letbrs WI, 2, 405-410.

168



BiNiosrafía

224- Broxtennan, H.J., Plnedo, H.M., Kuiper, C.M., Kaptein, L. C. M., Schuurhuis, G.J. yLankelma, J. (1988). lnduction by verapamil of a rapid increase in ATP consumption in multidrug-resistant tumor cells. FA,SEB J. 2.2278-2282.

225- Yusa, K. y Tsuruo, T. (1989). Reversal of multidrug resistance by verapamil: direct binding ofverapamil to P-glycoprotein on specific si¡es and transport of verapamil outwards across the plasmamembrane of K562lADM cells. Cancer Res. 49.5002-5006.

226- Enginerr, F. N., y Sridhar, R. (1991). Atteuuation of daunorubicin-augmenüed rnicrosomal lipidperoxidation and oxygen consumption by calcium channel antagonists. B.B.P-C. 179, N2:1101-l106.

227- Plulnrl&., J. A., Milroy, R. y Kaye, S. B. (1989). Activity of resistance modifiers in hrng cancercell lines. Proc- ,4m ,4ssoc. Cancer Res.30. 572.

228- Broxtermü, H. J. y Ptnedo, H. M. (L991). Energy metabolism in multidrug resistant h¡morcells: a review. I. CeIl Pharmcol.2.239-241.

229- Cole, S. P. C., Bhardwaj, G., Gerlach, J. H., Mackie, J. E., Grant, C. E., y cols. (1992).Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant lung cancer cell line. Science 258, 1650-1654.

23G- Zaman, G. J. R., Versantvoort, C. H. M., Smit, J. J. M., Eiiderns, E. W. H. M., De Haas,M. y cols. (1993). Analysis of the expression of MRP, the gene for a new putative hansmembrane drughans¡rorter, in human multidrug resistant lung cancer cell lines. Cancer Res. 53, 1747-1750.

231- Roepe' P. D. (I992).Analysis of the steady-state and initial rate of doxorubicin efflux from a seriesof multidrug-resistant cells expressing different levels of P-glycoprotein Biochemistry3l, 12555-12564.

232- Boxoboinik' D.' Gupta, R. S. y Epand, R. M. (1990). Investigation of the relation-shipbetween altered intracellular pH and mulüdrug resisüance in mammalian cells. B¡. J. Cancer 61, 568-572.

233- Thiebaut, F'., currier, s, J., whitaker, J., Haugland, R. p., Gottesman, M. M. y cols.(1990). l. Histochem Cytochem 38, 685-690.

234- Keizer' H. G. y Joe4je, H. (1989). Increased cytosolic pH in multidrug-resistant human lungh¡mor cells: effect of verapamil. J. Natl. Cancer Iast. 8L, 7O6-7W.

235- Roepe' P. D., Wei, L. Y., Cnrz, J. y Cartson, D. (1993). l¡wer eleckical membrane potentialand altered pHi homeostasis in multidrug-resistant (MDR) cells: Futher characterization of a series ofMDR cell lines expressing different levels of P-glycoproten. Biochemistry3z, IIO42-11056.

236- Skovsgaard, T. y Nissen, N. I. (1986). Membrane transport of anthracyclines. En Membranetransport ofantineoplastic agents. (Goldman, I-D., ed.) Pergamon Press, oxford, lg5-213.

169



BiHioer¿fía

237- Mayer, L. D., Bally, M. 8., Cullis, P. R. (1986). Uptake of adriamycin into large unilamellarvesicles in response to a pH gradient. Biochim. Biophys. kta 857, 123-126.

238- Sehested, M., Skovsgaard, T., Van Danrs, B. y Winther-Nielsen, H. (1987). lncreased plasmamembrane traffic in daunorubicin resistant P388 leukaemic cells. Effect of daunorubicin and verapamil.Br. J. Cancer 56, 747-751.

239- Willingham, M. C., Cornwell, M. N., Cardarelli, C. O., Gottesman, M. M. y Pastan, I.(1986). Single cell analysis of daunomycin uptake and efflux in multidrug-resistant and sensitive KBcells: effects of verapamil and other drugs. Cancer Res. 46, 594I-5946.

24G Hamiil' O. P. y Sackmann, B. (1981). Multiple conductance states of single acetylcholinereceptor channels in embrionic muscle cells. Nafure (landon)2A, 462-464.

241- Sehested, M., Skovsgaard, T., Van Deurs, B. y Winther-Nielsen, H. (1987). Increase in a non-sp€cific adsorptive endocytosis in anthracycline and vinca alkaloid resistant Ehrüch asciües tumor cells.J. Natl. Cancer Inst.78, 17l-776-

242- CanuGntci, D. F. y Riordan, J. R. (1937). Acüon of calcium anüagonists on multidrug resistantcells. Biochem Pharwcol. 36. 2ll5-2I23.

243- Ye}¡, G. C., Occhipint, S. J., Cowan, K. H., Chabner, B. A. y Myers, C. E. (1937).Adriamycin resist¿nce in human hrmor cells associaüed with marked alüerations in the regulation of thehexose monophosphate shunt and its response to oxidant shess. Ch¡cer Res. 47 , 5994-5999.

2zt4- Hosking, L. K., Whelan, R. D. H., Shellard, S. A., Bedford, p. y Hill, B. T. (1990). Anevaluation of the role of glutathione and its associaled enzymes in the expression of differentialsensitivities to antitumour agents shown by a range of human tumor cell lines. Biochem Pharrmcol. 40,1833-1842.

245- Gessner, T., Vaughan, L. A., Beehler, B. C., Bartels, C. J., y Baker, R. M. (1990). ElevatedPenüose Cycle and Glucuronyltransferase in daunorubicin-resistant P388 cells. Cancer Research SA.3921-3927.

246- Defrte, a. M., McPherson, J. P., Gupta, R. s., Hedley, D. w. y Goldenberg, G. J. (1992).Multifactorial resisüance úo antineoplastic agents in drug-resistant P388 murine leukemia, Chinesehamster ovary, and hr¡man HeLa cells, with emphasis on the role of DNA topoisomerase II. Biocheu.CeIl Biol.70 (5), 35+364-

247- Chou, T. H. y Yost, C. (1985). Adriamycin resistance in murine leukemia P388 cells andincreased DNA repair. Proc. Natl. ,4ssoc- Cancer Rs.26, 855-860.

248- Brown, W. D. y Mebine, L. B. (1969)- Autooxidation of oxymyoglobns. I. Bíol. Chem ?A,6696-670r.

170



Bibliogr¿fía

249- BalinskY, B.[. (1960). An introduction to Embriology. W.B. Saunders, Philadelphia, 562 págs.

250- Mxui, Y. y Clarke, H.G. (1979). Oocyüe maturation. Int. Rev. Cytot. 57, lB5-ZgZ.

251- Morrill, G.A., Zieg;le4 D. y Kostellow, A.B. (1981). The role of CaZ+ and cyclic nucleorides inprogesterone maturation of the meiotic divisions in amphibian oocytes. üft Sci. 29, L82l-L835.

252- Kusano' K., Miledi, R. y Stinnakte, J. (1977). Acetylcholine receptors in the oocyte membrane.Nature (Inndon) 270, 7 39:7 41.

253- Gurdon, J. 8., Lane, c. D., woodland, H, R. y Marbaix, G. (197r). use of frog eggs andoocytes for the study of messenger RNA and its translation of heterologous mRNA in Xenopus oocytes.Na ture (London) ?33, 177 -L82.

25zl- Brorme, C. L., Wiley, H. S. y Dumont, J. N. (1978). Oocyüe-follicle cell gap junctions inXenopus laevis and the effects of gonadotropin on their perrneabiüty. Science2V3, 1-82-ft3.

255- Gundersen' C. 8., Miledi, R. y Parker, I. (1984). Messenger RNA from human brain inducesdrug- and voltage-activated channels in Xenopus oocytes. Nature3üS, 4Zl-424.

256- Browne, C.L. y Werrrer, W. (1984). Intracellularjuuctions between the follicle cells and oocyüesof Xenopus laevis. ,I. Ery. hol. 230, l3L-135.

257- Dumont, J. N. y Brumnrett, A. R. (1978). Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V.Relationships between developing oocytes and their unvesting follicular tissues. I. lulorphol. lSS,73-98.

258- Hille, B. (1992). Ligand-gated channels of fast chemical synaps€s. Chapter 6.En: Ionie channels ofexcita ble npnbra nes. 2nd Edition. Sinauer Associates Inc., Massachussets, 1 4G. 1 69.

259- Weill' C. L., McNamee, M. G. y Karlin, A. (1974). Affinity labeling of purified acerylcholinereceptor frcm Torpedo Caübrnica. Biochem Bioph¡,s. Res. Comnun.6l,997-1Cf/3.

260- Raftery, M. a., rrunkapiller, M. w., Strader, c. D. y Hood, L. E. (1990). Acetylcholinerecepüor: Complex of homologous subunits. Science2DS, 1454-1457.

261- McNamee, M. G., Weill, C. L. y Karlin, A. (1975). Purification of acetylcholine receptor fromTorpedo califomica and its incorporation inüo phospholipid vesicles. ADn. N Y. kad. Sci. Z&, l7S-r82.

262- Noda, M., F\rrutani, Y., Takahashi, fr., Toyosato, M., Tanabe, y cols. (1983). cloning andsequence analysis of calf cDNA and hnman genomic DNA encoding o-subunit precursor of muscleacetylcholine receptor. Nature (London) 305, 818-823.

T7T



Biblioonfía

263- Huganir, R. L. y Racker, E. (|'982). Properties of proteoliposomes reconstin¡ted with

acetylcholine receptor from Torpedo californica. J. Bk l. Chem 257, 9312-9378.

264- Toyoshima, C. y Unwin, N. (1988). Ion channel of acetylcholine receptor reconstructed from

images of postsynaptic membranes. Nature (l,ondon) 336, 247-250.

265- Changeaux, J. P., Devillers-Thiéry, A. y Chemouillio P. (1984). Acefylcholine receptor: an

allosteric protein. Science 225, 1335-1345.

266- Popt, J. L. y Changeaux, J. P. (1984) Nicotinic receptor of acetylcholine: Structure of anoligomeric integral membrane protein. Physiol. Rev. @, 1162-1239.

267- l(andel, E. R. y Siegelbaum, S. A. (1991). Directly gated transmission at the nerve-musclesynapse. Chapter 10. En: Principles of neural science.3rd Edition. (Kandel, E. R., Schwartz, J. H. yJessell, T. M. eds.), Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, 135-t52.

268- Numa, S., Noda, M., Takahashi, H., Tanabe, T., Toyosafo, IVI. y co¡s. (1983). Molecularstruchrre of the nicotinic acetylcholine receptor. Molec. Neurobiol. 156, 57-69.

269- lmoto, K., Methfessel, C., Saclcnan, 8., Mishina, M., Mori, Y. y cols. (1986). Location of adelta-subunit region dsfsrmining ion transport through the acetylcholine receptor channel. Nature(London)3U, 67G674.

270- Imoto, K., Busdr, C., Sackmann, 8., Mishina, M., Konno, T., y cols. (1988) Rings ofnegatively charged amino acids determine the acetylcholine receptor channel conductance. Nature(London) 335, 645-ó48.

271- Sineo S. M. y Taylor, P. (1980). The relationship between agonist occupation and the permeabilityresponse of the cholinergic recepüor revealed by bound cobra oc-toxin. J. Biol. Chem 255, 10144-r0156.

272- Natbig, R. R. y Cohen, J. B. (1980). Permeability control by cholinergic receptors n Torpedopostsynaptic membranes; agonist dose-response relations measured at second and millisecond times.Biochemistry 19, 27 7 0-2779.

273- Hess, G. P., Pasquale, E. 8., Karpen, J. W., Sachs, A. 8., Takeyasu, K. y Cash, D. J.(1982). Acetylcholine receptor-controlled ion translocation. A comparison of the eff'ects ofsuberildycholine, carbamylcholine, and acetylcholine. Biochem Biophys. Res. Co¡¡¡mun 107, 1583-1588.

274- Damle, V. N.' Mclauglin, M y Karlin, A. (1978). Bromoacetylcholine as an affinity label of theacetylcholine receptor from Tbrpedo calibrnica. Biochen Biophys. Res. Conmtn 84, 845-851.

172



Biblioemfía

275- Neubig, R. R., Krodel, E. K., Boyd, N. D. y Cohen, J. B. (1979). AceSlcholine and localanesthetic binding to Torped<t calift¡rnica aceflcholine receptor deduced from cDNA sequence. Nature(Inndon) 299, 793-797 .

276- McCarúhy, M. P., Earnest, J. P., Young, E. F., Choe, S. y Stroud, R. M. (1936). Themolecular neurobiology of the acefylcholine receptor. Ann. Rev. Neurosei. g, 383-413.

277- Unwin, N. (1995). Acef lcholine recepüor channel imaged in the open statB. Nature (London) 373,37-43.

278- Colquhoun' D. y Sackmann, B. (1985). Fast-events in single-channel currents activated byacetylcholine and its analogues at the frog muscle endplate. I. Physiol.36g, 501-557.

279- González-Ros, J. M., Sator, V., Calvo-F,ernándu, p. y Martínez-Carrión, M. (lg7g).

$renesulfonyl azide: A covalent probe permitng in vitro desensltization of labeled acetytcholine richmembranefragmentsfcrrm Z calibrnica. Biochem Biophys. Res. Co¡¡mrun.97,21+220.

280- McName, M. G. y Ochoa, E. L. M. (1982). Reconstitution of acetylcholine recepüor function inmodel menbranes. hleuroscience 7 . Z3O5-23I9.

281- Mishiria, M., Kurosaki, T., Tobimatsu, T., Morimoto, y., Noda, y cots. (1994). Expresion offunctional acetylcholine receptor from cloned cDNAs. Nature e,ondon) 302, 60+60g.

282- Stroud, R.M., McCarthy, M. P. y S*ruster, M. (1990). Nicotinic acetylcholine recepüorsuperfamily of ügand-gated ion channels. Biochemistrylg, lIWg-tlO23.

283- Ochoa, E. L. M., Chattopadhyay, A. y McNamee, M. G. (1939). Desensitiz¿rion of thenicotinic acetylcholine receptor: Molecular mechanisms and effect of modulators. CelI. Molec.Neurobiol.9, l4L-178.

284- rvorra, r., Gal, 8., Aleu, J., González-Ros, J. M., f,'erragut, J. A. y Morales, A. (1995).Functional inco¡poration of Torpedo CIC-O channels inüo the Xenopus laevis oocyte membrane. ,lsf.Portuguese-Spa nish Biophysícs Congress, P87 .

285- Boehringer Mannheim.Detergents for membrane Research. 25 págs.

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