Tesis Biopolimeros

I

MEZCLA SINRGICA ENTRE POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) Y CAUCHO

NATURAL (LATEX) PARA OBTENER UN COPOLIMERO

ALEXANDER ENRIQUE ELLES MONTERO

CESAR AUGUSTO GARCA ECHEVERRY

Trabajo de grado para optar el ttulo

De ingeniero qumico

UNIVERSIDAD DE CARTAGENA

FACULTAD DE INGENIERAS

PROGRAMA DE INGENIERA QUMICA

CARTAGENA DE INDIAS D.T. Y C.

2012

II

MEZCLA SINRGICA ENTRE POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) Y CAUCHO

NATURAL (LATEX) PARA OBTENER UN COPOLIMERO

ALEXANDER ENRIQUE ELLES MONTERO

CESAR AUGUSTO GARCA ECHEVERRY

TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR EL TTULO

DE INGENIERO QUMICO

DIRECTORA DE TESIS

ING. GESIRA DE AVILA MONTIEL

UNIVERSIDAD DE CARTAGENA

FACULTAD DE INGENIERAS

PROGRAMA DE INGENIERA QUMICA

CARTAGENA DE INDIAS D.T. Y C.

2012

III

NOTA DE ACEPTACIN

---------------------------------------------

Presidente del Jurado

----------------------------------------------

Jurado

----------------------------------------------

Jurado

IV

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos inicialmente a Dios por darnos la fuerza, paciencia y sabidura para poder

elaborar este documento y alcanzar los logros propuestos.

A nuestra tutora Gesira De vila Montiel MSc., por su asesora, confianza y colaboracin

durante todo el proceso.

A nuestros padres por su apoyo a lo largo de la carrera y del desarrollo de este trabajo.

Agradecemos a la facultad de medicina, la colaboracin, disposicin y prstamo de las

instalaciones, de manera especial, al Sr. Gregorio, la seora Mara, docentes y jvenes

investigadores del rea de postgrado en la Facultad de Medicina.

Al Programa de Ingeniera de Alimentos por brindarnos un espacio de trabajo, asesora y

capacitaciones brindadas, especialmente a los Ingenieros: Germn, ngel y Santiago.

Finalmente al programa de Ingeniera Qumica y a las docentes Lesly Patricia Tejeda y

Mara Teresa Acevedo, por su apoyo incondicional, sus sugerencias y apreciaciones. As

mismo, al Dr. lvaro Realpe por permitirnos el espacio de trabajo en los laboratorios del

Programa.

V

CONTENIDO

Pg.

RESUMEN 4

ABSTRACT 5

INTRODUCCIN 6

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 8

2. JUSTIFICACIN 10

3. OBJETIVOS 11

3.1 OBJETIVO GENERAL 11

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 11

4. MARCO DE REFERENCIA 12

4.1 ESTADO DEL ARTE 12

4.2 ANTECEDENTES 17

4.3 MARCO TERICO 24

4.3.1 POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA`S) ........................................................................ 24

4.3.2. POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) ................................................................................ 26

4.3.3 PRODUCCIN DE PHB CON MICROORGANISMOS ....................................................... 26

4.3.3.1 GENERALIDADES DEL GNERO AZOTOBACTER SP. ................................................. 27

4.3.3.2 AZOTOBACTER VINELANDII .................................................................................. 30

4.3.4 EL CAUCHO NATURAL (LTEX) ................................................................................ 31

4.3.5 MEZCLAS DE PHB-CAUCHO NATURAL...................................................................... 33

5. METODOLOGA 34

5.1 TIPO DE INVESTIGACION 34

5.2 TECNICAS DE RECOLECCION DE INFORMACION 34

5.2.1 FUENTES DE INFORMACIN PRIMARIA ...................................................................... 34

5.2.2 FUENTES DE INFORMACIN SECUNDARIA ................................................................. 34

5.3 POBLACIN .................................................................................................................. 35

5.4 MUESTRA .................................................................................................................... 35

5.5 HIPTESIS .................................................................................................................... 35

5.6 VARIABLES .................................................................................................................. 36

5.7 OPERACIONALIZACIN DE VARIABLES ....................................................................... 36

5.8 DISEO DE EXPERIMENTOS ......................................................................................... 37

VI

5.9 DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO ...................................................... 38

5.10 CARACTERIZACIN DEL POLMERO ............................................................................ 39

5.11 TEXTURMETRO (PRUEBA DE TRACCIN MECNICA)............................................... 39

5.12 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIN ..................................................................... 40

6. RESULTADOS 41

6.1 DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO 41

6.1.1 MATERIALES Y EQUIPOS ........................................................................................... 42

6.1.2 PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO ..................................................................... 43

6.1.3 CARACTERIZACIN BACTERIANA .............................................................................. 44

6.2 FERMENTACIN Y OBTENCIN DEL PHB ................................................................ 44

6.3 DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO ...................................................... 45

6.4 EXTRACCIN DE LA BIOMASA Y DEL POLMERO ..................................................... 48

6.5 CARACTERIZACIN DEL POLMERO ......................................................................... 49

6.6 RENDIMIENTO Y PRODUCTIVIDAD TOTAL DE BIOMASA Y PRODUCTO (PHB) ........... 51

6.7 PREPARACIN DE LAS MEZCLAS DE PHB-LTEX ................................................... 53

6.8 CARACTERIZACIN DE LAS MEZCLAS DE PHB-LTEX ........................................... 54

6.9 PROCESAMIENTO Y ANLISIS DE DATOS ............................................................... 54

7 ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS 55

7.1 DETERMINACIN DE PROPIEDADES TRMICAS POR DSC ............................................. 55

7.2 TEXTURMETRO (PRUEBA DE TRACCIN MECNICA) ............................................. 69

8 CONCLUSIONES 75

9 RECOMENDACIONES 77

BIBLIOGRAFA 78

ANEXOS 84

1

NDICE DE TABLAS

Pg.

TABLA 1. BACTERIAS QUE ACUMULAN PHA. .......................................................... 27

TABLA 2. DEFINICIN DE VARIABLES PARA PROCESO DE FERMENTACIN. 36

TABLA 3. RELACIONES DE CONCENTRACIN DE LA MEZCLA ........................... 38

TABLA 4. PROPIEDADES A EVALUAR ........................................................................ 38

TABLA 5. CARACTERSTICAS DE LAS COLONIAS DE CULTIVO [39] .................. 44

TABLA 6. RESULTADOS D.O. PARA LA BIOMASA ................................................... 46

TABLA 7. COMPARATIVO CONCENTRACIN DE PHB. ........................................... 51

TABLA 8. CLCULO DE LA RELACIN DE LAS VARIABLES PARA EL PROCESO

DE FERMENTACIN. ....................................................................................................... 52

TABLA 9. PROPIEDADES TRMICAS OBTENIDAS POR DSC. ................................. 60

TABLA 10. COMPARATIVO MEZCLAS PHB-LTEX VS. MCL-PHA: CAUCHO

NATURAL ........................................................................................................................... 62

TABLA 11. INTERACCIONES MOLECULARES Y SUS RANGOS DE ABSORCIN.

.............................................................................................................................................. 64

TABLA 12. CUADRO COMPARATIVO ESPECTROS IR PARA MEZCLA PHB-

LATEZ Y PHB/P (HB-IPN-AAM) ..................................................................................... 68

TABLA 13. RESULTADOS PRUEBA DE TRACCIN PARA LTEX. ........................ 69

TABLA 14. RESULTADOS PRUEBA DE TRACCIN PARA LTEX-PHB (10:10 P/V)

.............................................................................................................................................. 70

TABLA 15. PROPIEDADES MECNICAS OBTENIDAS POR PRUEBA DE

TRACCIN. ........................................................................................................................ 74

2

NDICE DE FIGURAS

Pg.

FIGURA 1. HISTORIA DE PHA`S. ................................................................................... 18

FIGURA 2. ESTRUCTURA QUMICA DEL POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) .......... 26

FIGURA 3. A) COLONIAS DE AZOTOBACTER SP. EN MEDIO LIBRE DE

NITRGENO. B) MORFOLOGA DE LAS CLULAS DE AZOTOBACTER SP. ......... 28

FIGURA 4. ESQUEMA DE LA SNTESIS DE PHB EN AZOTOBACTER SP. ............. 29

FIGURA 5. IZQUIERDA: GRNULOS DE PHB (COLOR CLARO) EN CEPA NO

MUTANTE DE LA BACTERIA AZOTOBACTER. DERECHA: CEPA MUTANTE DE

LA MISMA BACTERIA. .................................................................................................... 30

FIGURA 6. PIGMENTACIN VERDE-AMARILLO CARACTERSTICA DE

AZOTOBACTER VINELANDII. ....................................................................................... 31

FIGURA 7. ESTRUCTURA DEL LTEX (CIS- 1,4POLIISOPRENO) ........................... 32

FIGURA 8. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO DE OBTENCIN DEL

COPOLMERO LTEX-PHB. ........................................................................................... 41

FIGURA 9. CURVA DE CRECIMIENTO PARA LA CINTICA CON AZOTOBACTER

VINELANDII. ..................................................................................................................... 46

FIGURA 10. CURVA AJUSTADA CINTICA DE CRECIMIENTO AZOTOBACTER V.

OD VS. TIEMPO. ................................................................................................................ 47

FIGURA 11. PRODUCCIN DE POLMERO Y BIOMASA A DISTINTAS

CONCENTRACIONES DE INOCULO.............................................................................. 49

FIGURA 12. CURVA PATRN DE CARACTERIZACIN DE PHB, MTODO LAW

AND SLEPECKY. ............................................................................................................... 50

FIGURA 13. PRUEBA DSC PARA MUESTRA DE LTEX. .......................................... 55

FIGURA 14. PRUEBA DSC PARA MUESTRA DE PHB- LTEX (5:10 P/V) ............... 57

FIGURA 15. PRUEBA DSC PARA MUESTRA DE PHB- LTEX (10:10 P/V) ............ 58

FIGURA 16. PRUEBAS DSC SUPERPUESTAS .............................................................. 59

FIGURA 17. TERMOGRAMA POR DSC PARA MUESTRAS DE PHA EN DISTINTAS

MEZCLAS DE CAUCHO: A. MCL-PHA EXTRADA DE C. TESTOSTERONI; B.

MEZCLA DE MCL-PHA: CAUCHO NATURAL (15:85 % P/P); C. MEZCLA DE MCL-

3

PHA: CAUCHO NITRILO (15:85% P/P); D. MEZCLA MCL-PHA: CAUCHO DE

BUTADIENO (15:85 %P/P) ................................................................................................ 61

FIGURA 18. ESPECTRO INFRARROJO DE LA MEZCLA PHB-LTEX (5:10 %P/V) 65

FIGURA 19. ESPECTRO INFRARROJO PARA MEZCLA PHB-LTEX (10:10 %P/V).

.............................................................................................................................................. 66

FIGURA 20. ESPECTRO IR DEL PHB Y P (HB-IPN-AAM)........................................... 67

FIGURA 21. PRUEBA DE TRACCIN. A) LTEX Y B) LTEX-PHB (10:10 P/V) .... 71

FIGURA 22. PRUEBA DE TRACCIN MECNICA MEZCLA PHB-MADERA ......... 72

FIGURA 23. PRUEBA DE TRACCIN MECNICA MEZCLA PHB-ALMIDN (TIPO

III). ....................................................................................................................................... 73

FIGURA 24. MORFOLOGA AZOTOBACTER VINELANDII. FOTOGRAFA EN

MICROSCOPIO. ................................................................................................................. 88

FIGURA 25. MORFOLOGA EN CRECIMIENTO DE AZOTOBACTER VINELANDII.

.............................................................................................................................................. 88

FIGURA 26. METODOLOGA DE EXTRACCIN DE PHB POR EL MTODO DE

DIGESTIN CLOROFORMO-HIPOCLORITO (70-30 V/V) RESPECTIVAMENTE. ... 89

FIGURA 27. MOLDE DE PHB-LTEX (10:10 %P/V) ..................................................... 90

FIGURA 28. MOLDE DE LTEX ..................................................................................... 90

FIGURA 29. PRUEBA DE TRACCIN MECNICA EN TEXTURMETRO A) INICIO

DE LA TRACCIN B) ESTIRAMIENTO C) FRACTURA DE LA MUESTRA. ............ 91

4

RESUMEN

En este trabajo de grado se presenta el proceso para la produccin de Polihidroxibutirato

(PHB) por fermentacin con Azotobacter vinelandii y posterior mezcla con caucho natural

(Ltex) para la obtencin de un copolmero; Para la fermentacin primero se activ la cepa

liofilizada, seguido de una etapa de incubacin para luego inocular con 10% del volumen

total del medio precrecido (20 ml) el cual contena 0.662 g/L de biomasa; al mismo tiempo

se prepar un medio Norris modificado e inocul con los 0.662 g/L de biomasa, dejando en

un proceso de fermentacin a condiciones de pH 7.5, Temperatura de 30C, 225 rpm por 48

horas. Concluido el proceso de fermentacin, se extrajo una biomasa total de 8.2 g/L y

procedi a separar la biomasa del PHB por el mtodo de digestin con cloroformo-

hipoclorito en relacin (70-30 %v/v) respectivamente; luego por los procesos de

centrifugacin, filtracin y evaporacin se obtuvo PHB. Se caracteriz el polmero por

espectrofotometra y el mtodo de Law and Slepecky y as se determin una concentracin

de PHB obtenida de 5,57 g/ml. Finalmente, se procedi a realizar mezclas sinrgicas con

Ltex por mtodo de dilucin en proporcin 5:10 y 10:10 P/V. Se evaluaron propiedades

fsicas y mecnicas a travs de Anlisis DSC y Traccin Mecnica. Los resultados del

anlisis trmico mostraron que a mayor dilucin con PHB, el ndice de cristalinidad

disminuy, producto de la diferencia aritmtica entre la temperatura de transicin vtrea y la

temperatura de cristalizacin. A su vez, el rango de estabilidad trmica se expandi entre

valores de 150-280C; En los ensayos de traccin mecnica, el modulo de Young

disminuy, mostrando una reduccin en la rigidez del copolmero, evidenciando mayor

elasticidad y maleabilidad, proyectando su uso en aplicaciones plsticas.

Palabras claves: PHB, Azotobacter vinelandii, Mezcla sinrgica, copolmero.

5

ABSTRACT

This grade paper shows the process for the production of polyhydroxybutyrate (PHB) by

fermentation with Azotobacter vinelandii and further mixed with natural rubber (latex) to obtain a

copolymer; At first for fermentation, lyophilized strain was activated, followed by an incubation

step and then inoculated with 10% of the total volume of the pregrown media (20 ml) which

contained 0.662 g / L of biomass; at the same time was prepared and inoculated Norris modified

media with 0.662 g / L of biomass, leaving in a fermentation process conditions of pH 7.5,

temperature 30 C, 225 rpm for 48 hours. Finishing that step, it was extracted a total biomass of 8.2

g / L and proceeded to separate the biomass of PHB by the method of digestion with hypochlorite in

relation chloroform (70-30% v / v) respectively, then by the processes centrifugation, filtration and

evaporation gave PHB. Polymer was characterized by spectrophotometry and the method of Law

and Slepecky, and thus determined a concentration of PHB obtained from 5.57 g / ml. Finally, it

proceeded to make Latex synergistic blendings by dilution in 5:10 and 10:10 ratio P / V. We

assessed physical and mechanical properties by DSC Analysis and Mechanical Traction. Thermal

analysis results showed that greater dilution with PHB, the crystallinity index decreased, resulting

from the arithmetic difference between the glass transition temperature and the crystallization

temperature. In turn, the thermal stability range was expanded between values of 150-280 C; In

the mechanical tensile tests, the Young's modulus decreased, showing a reduction in the stiffness of

the copolymer, showing greater elasticity and pliability, projecting its use in plastic applications.

Keywords: PHB, Azotobacter vinelandii, synergistic blending, copolymer.

6

INTRODUCCIN

La innovacin, ciencia y tecnologas del siglo XXI, se han encaminado a brindar un sin

nmero de soluciones a las principales limitaciones de la industria a temas ambientales,

tcnicos y de costos. La contaminacin producida por el uso excesivo de combustibles

fsiles y sus derivados y la mala disposicin y tratamiento de residuos industriales, han

contribuido a la bsqueda de nuevas alternativas, en especial el rea de la biotecnologa y

biomateriales para generar posibles soluciones.

El uso de materiales plsticos en la industria, ha generado un alto grado de desarrollo

petroqumico, debido a la gran variedad de propiedades y aplicaciones de estos materiales,

de all, su gran injerencia y uso general en las necesidades de la cotidianidad de la

sociedad. Pero, las propiedades que los hacen muy buenos materiales, son las mismas, que

les brindan gran resistencia a la degradacin biolgica, porque las cadenas de monmeros

principales son muy difciles de romper por distintos medios, ya sean fsicos o qumicos,

por tanto, estos materiales plsticos se acumulan en los distintos ecosistemas.

La biotecnologa presenta una posible solucin a esta problemtica, mediante el

procesamiento de biomateriales como la sntesis de Polihidroxialcanoatos (PHA`s) y

mezclas de los mismos con plsticos y cauchos naturales. Los PHA`s son polmeros

naturales producidos por bacterias, las cuales los utilizan como reservas de nutrientes.

Presentan gran variabilidad de propiedades fsicas y qumicas comparables a los plsticos

derivados del petrleo y propiedades biolgicas, llegando a ser biodegradables. Una de las

posibles soluciones presentada por el rea de la biotecnologa, est encaminada a la sntesis

de Polihidroxialcanoato (PHA) a partir de distintos microorganismos, donde cada uno usa

su propia ruta metablica de sntesis, diferencindose del hecho que cada bacteria puede ser

aislada de medios acuticos y/o terrestres, y cada especie bacteriana usa un sustrato

propio para la fermentacin del PHA, siendo el sustrato el factor econmico limitante del

proceso.

7

Una bacteria que emplea un sustrato econmico como bagazo de caa y glucosa, y es

aislada de un medio terrestre es la Azotobacter vinelandii, la cual puede sintetizar hasta el

90% en base seca de Polihidroxibutirato (PHB) en condiciones ptimas de crecimiento a

temperatura y pH adecuado. El proceso posterior a la sntesis es la bioseparacin donde se

retira el PHB intracelular, para lo cual se debe escoger la forma ms correcta de hacerlo sin

contaminar la muestra deseada.

Los PHA`s se caracterizan porque se pueden obtener mezclas de copolmeros de tipo

Polihidroxibutirato (PHB)/Polihidroxivalerato (PHV), las cuales, presentan mejores

propiedades plsticas; de igual forma, se pueden realizar mezclas de estos copolmeros

con plsticos o cauchos naturales, obteniendo nuevos materiales biodegradables, y con

propiedades mecnicas y plsticas mejoradas.

La propuesta de esta investigacin consiste en obtener PHB a partir de la Azotobacter

vinelandii para luego realizar la mezcla con caucho natural y de esta manera, obtener un

material con excelentes propiedades mecnicas y qumicas, de carcter biodegradable, es

decir, no bioacumulable, a condiciones de tratamiento bacteriano.

Adems, la propuesta incluye un diseo experimental para la sntesis y obtencin del

material biolgico polimrico a travs de la fermentacin con la bacteria Azotobacter

vinelandii, tomando en cuenta las condiciones y factores ambientales.

La investigacin, de antemano, supone que la mezcla obtenida, constituir un material

estable no solo qumica sino tambin fsicamente, premisa, con la cual, se le otorgara las

propiedades ptimas y necesarias para entrar en competencia con los materiales

convencionales y bien posicionados de la industria petroqumica e industrial.

8

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El deterioro ambiental del planeta debido a la industrializacin y uso excesivo de recursos

de origen fsil y subproductos petroqumicos, es una problemtica que ha impulsado en

gran medida el estudio de fuentes energticas alternativas, para mantener un equilibrio

entre lo ambiental y lo econmico, por tal razn, la ciencia est en la bsqueda de nuevos

materiales como forma de desarrollo tecnolgico, industrial y ambiental, pues brindan la

oportunidad de ser materiales biodegradables a distintas aplicaciones.

Los plsticos y cauchos sintticos constituyen la base principal de la industria

petroqumica, debido a su gran variedad de propiedades fsicas y qumicas, permitindoles

ser aplicados a mltiples procesos; pero el uso intensivo de estos plsticos y cauchos

sintticos (obtenidos mediante procesos de polimerizacin de productos derivados del

petrleo); De hecho, constituyen entre el 60% y 80% de los desechos marinos de todo el

mundo [49], por su alta estabilidad tanto fsica como qumica, traducida en su gran

resistencia a la degradacin contribuyen al fortalecimiento de la problemtica ambiental,

por su alta estabilidad tanto fsica como qumica, traducida en su gran resistencia a la

degradacin.

Por otro lado, se encuentran los Polihidroxialcanoatos (PHAs), polisteres biolgicos

sintetizados por un gran nmero de microorganismos y especies vegetales, en especial

bacterias; adems, existen consorcios microbianos capaces de consumir las cadenas

carbonadas principales de estos polmeros, rompiendo sus estructuras fundamentales,

convirtindolas a dixido de carbono y agua, dndole as el carcter de materiales

biodegradables. Los PHA`s de ms inters para la ciencia son los PHB

(Polihidroxibutirato), PHV (polihidroxivalerato) y PHB/PHV; estos son polmeros de

mezclas entre los PHB y PHV. Estos han ganado gran importancia dentro de la nueva

generacin de materiales, ya que pueden obtener mezclas entre ellos y con otros materiales

dando como resultado un material con propiedades de biodegradabilidad y de gran

resistencia mecnica [2].

9

Dentro de los materiales de uso comn en la industria se destaca el caucho natural (cis-1,4-

polisopreno), un producto vegetal procesado obtenido de la savia de varios centenares de

especies de rboles, en especial de la familia Hevea Brasiliensis y plantas existentes en

distintas partes del mundo, por ejemplo en el frica ecuatorial, el sudeste asitico y

Sudamrica. La savia de aspecto lechoso o ltex extrada de estos rboles es usada de forma

intensiva en procesos industriales como la produccin de neumticos, suelas de zapato y

muchos componentes aislantes de uso industrial [7].

Existe una problemtica relacionada con el uso de materiales sintticos, con su

acumulacin en ambientes naturales y contaminacin de los mismos, en gran medida por

su naturaleza y sus buenas propiedades mecnicas y qumicas, como los cauchos (las llantas

son fabricadas en este material, y es uno de los residuos ms representativos por su gran

generacin, para todo tipo de vehculos); Por esta razn, estos materiales no son amigables

con el ambiente, incurriendo en costos de disposicin y tratamiento final de dichos

materiales. En la literatura hay muy poca informacin relacionada respecto al estudio

sinrgico de mezclas de PHA`s con cauchos naturales, lo cual dificulta la implementacin

de estos procesos a escala industrial.

10

2. JUSTIFICACIN

El inters despertado por la sntesis y obtencin de nuevos materiales, tipo biolgico

(biomateriales), ha contribuido a generar ideas en bioprocesos y biosntesis de productos

polimricos, los cuales, al ser mezclados con productos sintticos de uso en la industria,

como los cauchos, produzcan un nuevo material con una mejora en sus propiedades

mecnicas, reolgicas, fsicas, qumicas y biolgicas.

En vista de la importancia y necesidad del uso de biomateriales econmicos y viables para

la industria, como los PHA`s y sus mezclas tales como las de poli [(R)-hidroxibutirato-co-

(R)-hidroxivalerato)] con cis-1,4-polisopreno (caucho natural) entre otros, se hace

necesario una investigacin orientada al desarrollo y sntesis de Polihidroxibutirato (PHB) a

partir de microorganismos con el fin de realizar una mezcla con caucho natural a distintas

concentraciones de PHB y, poder analizar mediante caracterizacin y pruebas de resistencia

de materiales el comportamiento de la mezcla; as mismo, se busca comparar como variar

el rendimiento del PHB en el caucho natural, es decir, en qu relacin de concentraciones

se obtendrn mejores resultados de propiedades mecnicas en la mezcla.

Este tipo de investigacin brinda la oportunidad de suministrar informacin til respecto al

rendimiento de la mezcla de PHB con caucho natural; pues, aun no ha sido desarrollada

plenamente y en particular se conocen ciertas tendencias del comportamiento final de la

mezcla, aunque, se espera como resultado una mezcla con alto rendimiento mecnico, con

bajo ndice de cristalinidad, y alta resistencia fsica y qumica, y como resultado un

material til en los distintos procesos y aplicaciones del caucho.

Esta investigacin busca incentivar al desarrollo biotecnolgico con miras a la proteccin y

cuidado ambiental, de modo que el material resultante de la mezcla sea un material

biodegradable en presencia de ciertos microorganismos selectos.

11

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Obtener un copolimero a partir de una mezcla sinrgica entre Polihidroxibutirato

(PHB) y caucho natural (ltex) determinando sus propiedades mecnicas y

reolgicas.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Sintetizar PHB por fermentacin con Azotobacter vinelandii.

Aplicar un procedimiento adecuado de bioseparacin para la obtencin del PHB.

Preparar Mezclas sinrgicas de Polihidroxibutirato/Ltex.

Evaluar las concentraciones de los componentes de la mezcla PHB-Caucho natural

mediante caracterizacin de las propiedades mecnicas.

12

4. MARCO DE REFERENCIA

4.1 ESTADO DEL ARTE

Muchas investigaciones han surgido desde el final del siglo XX hasta la primera dcada del

siglo XXI en torno a biomateriales, en especial, PHA`s. Entre los factores motivadores para

la comunidad cientfica, est el deterioro ambiental, el aumento de las demandas de

materias primas y la bsqueda de energas alternativas.

Los biomateriales, tiene su origen debido a la necesidad principal de fabricar productos con

alta competitividad en materia de propiedades mecnicas frente a los derivados de la

industria petroqumica, con ciertas caractersticas: no txicos, sin problemas de desecho y

permitan una disposicin final adecuada de estos residuos. El estudio y sntesis de nuevos

plsticos es la necesidad prioritaria referente a los biomateriales. Criterios como la

biocompatibilidad y biodegradabilidad los definen con ms propiedad [3].

Los estudios de los PHA ms recientes, han buscado mejorar los biomateriales ya

obtenidos, realizando combinaciones y mezclas entre distintos Polihidroxialcanoatos e

incluso sustancias petroqumicas, y de origen natural como el ltex, y aqu se mencionan

los ms destacados:

Las mezclas de diferentes tipos de polisteres han cautivado la atencin de la comunidad

cientfica y se han obtenido buenos resultados. Ejemplo de ello, es la caracterizacin

realizada a la mezcla de policarbonato de propileno (PPC) con copolmero de poli (-

hidroxibutirato-co- -hidroxivalerato) en diferentes proporciones. Caractersticas trmicas y

anlisis estructurales fueron estudiados a travs de tcnicas de DSC (escaneo de

calorimetra diferencial) y TGA (termogravimetra); HNMR (espectroscopia de resonancia

nuclear magntica) y SEM (microscopia de escaneo electrn). Esto permiti un

mejoramiento en la degradacin del PPC del 65%, no solo comparando su estado sino

tambin con respecto al copolmero [4].

13

Por otro lado, la mezcla de poli [(R)-hidroxibutirato-co-(R)-hidroxivalerato)] con poli [(R)-

hidroxibutirato-alt-poli (oxido de etileno)] (HE) fue ensayada (Xu Li et al.). Se parti de la

idea de mejorar la miscibilidad del poli (oxido de etileno) mediante la inclusin de

segmentos de PHB con segmentos dentro de la matriz de PHBV y as optimizar las

propiedades mecnicas del copolmero.

Un estudio de calorimetra de barrido diferencial mostr que la interferencia de la

cristalizacin del PHBV permitira la alta miscibilidad del Oxido de Etileno (OE) en los

segmentos de HE. Tambin, se report la existencia de partculas hidrofbicas tanto en la

superficie como en el seno volumtrico del material, lo cual se puede mejorar con la mezcla

de HE.

En Colombia, tambin se han llevado a cabo investigaciones con respecto a los

Polihidroxialcanoatos. A travs de un grupo de investigacin de la Universidad Javeriana,

Marcela Franco- y colaboradores [5] aislaron 10 tipos de actinomicetos a travs de varias

muestras de suelo de la regin de Boyac. Estas cepas se cultivaron en dos tipos de medio;

la muestra que a travs del cultivo gener mas PHA (27.48% de rendimiento en peso seco)

fue la muestra o cepa 7F (que luego de pruebas bioqumicas se logr identificar como

Streptomyces subrutilus). Este estudio permiti mostrar que a pesar de que en los

actinomicetos las condiciones limitantes de nitrgeno no favorecen el crecimiento y la

produccin de PHA, en especies bacterianas como la identificada anteriormente, hay un

gran potencial, disponible en nuestros suelos. Solo requerira de un manejo diferente de los

factores nutricionales con respecto a los establecidos para la produccin de PHA en otras

bacterias para obtener resultados similares.

Al comparar las pruebas de tensin entre PHBV hidratado y PHBV/HE el primero se

mostr frgil mientras que el segundo, fue dctil. De hecho el esfuerzo a la ruptura se

increment en un 394 % con un contenido de HE del 15% en peso. Las conclusiones de

este estudio mostraron la excelente afinidad de las mezclas PHBV/HE con agua y se le

atribuy a la afinidad mostrada entre el PHB y HE en la matriz del PHBV. En la misma

14

investigacin se ensay la adicin de plaquetas de oxido de etileno, para ensartar en la

superficie de la pelcula segmentos de oxido de Polietileno (PEO) del HE [6].

Nano compuestos de polmeros entre el biodegradable Poli (3-hidroxibutirato) (PHB) y la

montmorillonita orgnica modificada Cloisite30B (30B) fueron sintetizados por la tcnica

de fundicin de disolvente; y degradados isotrmicamente a 230, 235, 240 y 245 C (Matko

Erceg, Tonka Kovacic, Ivka Klaric). De hecho la inclusin de 30B mejora la estabilidad

trmica del PHB y el efecto ms pronunciado se obtuvo en concentracin de 30B al 1% en

peso. De acuerdo a los resultados obtenidos la degradacin del PHB solo y la mezcla

PHB/30B se puede describir en dos regiones: la primera en donde aparece una prdida de

peso pequea, y la segunda, asignada como la etapa principal del mecanismo de

degradacin, donde la ms notoria prdida de peso tiene lugar. Los parmetros empricos

cinticos (E, A y g ()) del mecanismo de la degradacin fue objeto de esta investigacin

[7].

Es bien conocida la gran variedad de alternativas para cultivar y sintetizar

polihidroxialcanoatos a partir de un gran nmero de microorganismos. Aunque, es

pertinente anotar el gran impacto de las condiciones de cultivo y medio liquido en el tipo de

PHA sintetizado. Dentro del gran numero de estudios desarrollados recientemente

alrededor del mundo, cabe mencionar el realizado en Malasia con cidos orgnicos de

POME, sus siglas en ingls (Efluentes del Molino de Aceite de Palma) con el cual se han

hecho estudios donde perfilan a la digestin anaerobia de estos productos como potencial

fuente de Carbono que contribuira con la sntesis y produccin de polihidroxialcanoatos

(PHAs) [8].

Por otro lado, se encontraron investigaciones orientadas al comportamiento y

biodegradabilidad de los PHA`s: un polmero del acido 3-polihidroxibutrico y un

copolmero de PHA, especficamente de los cidos 3-polihidroxibutirico y 3-

polihidroxivalrico en ambientes costeros. Este hecho tuvo lugar en las costas del mar del

sur de China (Nha Trang, Vietnam), y segn los resultados arrojados por dicha

investigacin, factores como la forma del polmero, la tcnica de preparacin del PHA,

15

entre otros, afectan la biodegradabilidad ms en comparacin con la composicin de los

materiales. El ambiente salino favoreci a la degradacin de los mismos. Sin embargo, el

grado de cristalinidad se mantuvo invariable, es decir, tanto la fase amorfa como la

cristalina se desintegraron. Las especies degradadoras fueron identificadas y se destacaron

a Enterobacter sp. (4 cepas), Bacillus sp. y Gracilibacillus sp [9].

Llegando a una revisin ms particular, encontramos estudios con respecto al PHB

(Polihidroxibutirato), del cual hay un gran repertorio y se menciona la caracterizacin de

mezclas con PHA, y la correlacin con el transporte del agua a travs de la hidrofobicidad

de varios productos [BDPE (polietileno de baja densidad) y PA(poliamida)] (Yu.N.et al.).

Dicha investigacin comprendi el anlisis de la relacin PHB/BDPE para regular la

resistencia a la hidrolisis o biodegradacin a travs del control de la permeabilidad del

agua. La relacin entre el transporte de agua y la morfologa mostrara el impacto del

componente del polmero sobre la regulacin del flujo de agua en la matriz hidrofbica. El

estudio concluy que el uso de mezclas PHB/PA pueden constituir soluciones para el

diseo de matrices en el transporte de drogas en medicina [10].

De forma particular, existen estudios bien detallados con relacin al acido poli lctico

(PLA), uno de los polisteres naturales ms abordado en la actualidad. Con

modificaciones especificas de tipo superficial y volumtrica, se pueden precisar mejoras

considerables, en las propiedades mecnicas, fsicas y qumicas. Esta ltima resea marca

una lnea ms de investigacin con respecto a los polihidroxialcanoatos [11].

Redireccionando la idea de las mezclas con PHB, aqu se puede observar lo siguiente:

Se han hecho intentos fructferos para combinar al PHB con la celulosa acetato

butirato. Mediante una caracterizacin de la mezcla, se utilizan tcnicas de

calorimetra, espectroscopia, rayos X, entre otras para investigar el efecto de la

composicin (fraccin en peso de Celulosa Acetato Butirato (CAB)) y la

temperatura en comparacin con las relaciones intermoleculares, para definir las

propiedades mecnicas de tal mezcla. La cristalinidad es el factor que se modifica y

desarrolla a travs de los anlisis por espectroscopia con IR [12].

16

Una combinacin entre poli (-caprolactona) (PCL) y poli (3-hidroxibutirato-co-3-

hidroxivalerato) por tcnicas de fundicin de disolvente o electroespining.

(Costantino Del Gaudio et al.) mostr una gran superioridad en propiedades

mecnicas, especficamente, el modulo de elasticidad y resistencia a la traccin. As

mismo, el producto present una menor segregacin entre los dominios cristalinos

que se tradujo en las mejoras significativas [13].

Sin embargo, la mezcla de PHA`s no ha sido la nica opcin postulada. Una

alternativa para desarrollar las potencialidades de los biomateriales ha consistido en

la adicin de plastificantes, la gran mayora del tipo natural, y se han incorporado

en las tcnicas de preparacin por su baja toxicidad y buena compatibilidad. Todo

esto para solucionar una de las dificultades propias con los Polihidroxialcanoatos: la

fragilidad exhibida durante su termoformacin siendo las resinas ftlicas uno de

los plastificantes ms usados para esta aplicacin [14].

La necesidad de generar alternativas y soluciones a los problemas causados por

acumulacin y contaminacin por residuos, especficamente, del tipo plstico ha

llevado a explorar y encontrar nuevos materiales. Las enormes opciones de

investigacin y desarrollo con los Polihidroxialcanoatos, dentro de los biomateriales,

constituye un tema de investigacin e innovacin que cada vez siembra ms

expectativa.

17

4.2 ANTECEDENTES

La presencia de inclusiones sudonoflicas, al igual que del tipo lpidos, las cuales fueron

insolubles en cloroformo se observaron por primera vez en Azotobacter chrooccocum, en el

ltimo siglo. De igual manera en la bacteria Bacillus megaterium se presenciaron

inclusiones de composicin qumica similar y luego seran identificadas como poli (3-acido

hidroxibutrico) P (3-HB) por Lemoigne [15].

Para finales de 1950, ya se haban recopilado suficientes evidencias acerca de estudios del

gen Bacillus para poder sugerir que el P (3-HB) funcionaba como una fuente de reserva

intracelular de carbono y de energa de ese tipo de bacteria. En una revisin del rol y

regulacin de las reservas de energa en los polmeros obtenidos por microorganismos

publicados en 1973 P (3-HB), recibi su primera cobertura amplia como material de

almacenamiento bacteriano similar al almidn y el glucgeno.

Sin embargo, para este propsito las unidades de 3-hidroxibutirato se estimaban como el

nico constituyente hidroxialcanoato (HA) que formaba este polmero de reserva

microbiana. En 1974, Wallen and Rohwedder reportaron la identificacin de otro tipo de

hidroxialcanoatos distintos del 3HB. Entre las unidades de HA que se observaron en los

extractos de cloroformo de lodos activados, se encontraron 3 hidroxivalerato (3HV) y 3

hidroxihexanoato (3HHx), siendo estos los principales componentes en mayor y menor

proporcin, respectivamente. La siguiente dcada, tras la identificacin de heteropolmeros

en el anlisis de sedimentos marinos por cromatografa de gas capilar se revel la presencia

de 3HB y 3HV como componentes predominantes de las otras 11 unidades de HA [15].

Estos microorganismos son capaces de acumular polmeros distintivos como fuentes y/o

reservas futuras de carbn, nitrgeno y fosforo, en forma de inclusiones intracelulares. En

la figura 1, se muestra el recorrido histrico de los PHA`s [15].

18

Figura 1. Historia de PHA`s.

Fuente: Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters [16]

En 1995, segn estudios de Mas-Castelli et al. [16] se simularon a travs de Microcosmos

(herramienta computacional), las condiciones medioambientales encontradas en los

1900 Identificacin de

inclusiones sudonoflicas

1926 Identificacin de P (3HB)

1960 Determinacin de las

funciones de P (3HB)

Determinacin de las propiedades

de los grnulos nativos de P (3HB)

1974 Identificacin de 3-hidroxialcanoatos

1980 Produccin de PHA conteniendo unidades

de 3, 4,5-hidroxialcanoato

Produccin industrial de P (3HB-co-3HV)

1988 Clonacin de la biosntesis de genes de PHA

Produccin de PHA con bacteria recombinante

Produccin de PHA en plantas transgnicas

Biosntesis de PHA in VITRO

2000 Identificacin de las vas de conexin de la

biosntesis de PHA con las vas centrales

metablicas

1ra Etapa

2da Etapa

3ra Etapa

19

residuos plsticos; microorganismos fueron modelados para simular ecosistemas

microbianos, tal como el de la sulfureta (sedimentos anaerobios), los cuales, fueron

estudiados para accesar al potencial de degradacin de los PHA en condiciones naturales.

Este tipo de investigacin si bien mostr resultados favorables y comparables frente a

pruebas estndares realizadas con PHB, HB-HV (7%) y HB-HV (14%), los ambientes

anaerbicos y aerbicos son de especial cuidado e involucran condiciones de gran

incertidumbre y que a travs de mtodos estandarizados para evaluar el proceso de

degradacin, tales como, prdida de peso, crecimiento microbiano, distribucin de pesos

moleculares, entre otros garantizan mayor precisin y aproximacin de la capacidad de

degradacin de los PHA`s bajo condiciones ordinarias.

Asimismo, en 1998, Bernd H.A y sus colaboradores se interesaron en estudiar las enzimas

claves en la sntesis de PHA. Gracias a ello, en la actualidad 42 genes estructurales de

sintetasa de PHA de 38 bacterias diferentes han sido clonados, y se obtuvieran 30 genes de

secuencias de nucletidos. Las estructuras primarias de las 30 sintasas de PHA fueron

alineadas y analizadas con respecto a la alta conservacin de amino cido y caractersticas

bioqumicas [17].

La fiebre por los nuevos materiales ha tomado y arrojado nuevos mbitos de investigacin.

En 2001, inician la caracterizacin de PHA`s con mezclas; Se supona que el

comportamiento de cristalizacin, propiedades fsicas, y comportamiento de

biodegradabilidad de los polisteres microbianos en mezclas, eran significativamente

afectados por la naturaleza del conjunto de las mismas y dependan en s de su

biodegradabilidad [18].

Al mismo tiempo, pero de manera ms particular se evaluaron las correlaciones entre el

grado de cristalinidad, morfologa, temperatura vtrea, propiedades mecnicas y

biodegradacin de poli (3-hidroxialcanoato) PHA`s y sus mezclas. En gran medida, por ser

frgiles el homopolimero puro, PHB, y el copolimero puro (3-HBP-Co-HV) (88:12) se

busca mezclarlos con otros materiales para incrementar sus propiedades. La idea principal

fue desarrollar polmeros biodegradables de base PHB para mejorar propiedades

20

mecnicas, tales como fractura al stress (27-18 MPa), tensin (400-660%), resistencia al

impacto y estabilidad a largo plazo para as compararlos con PE, PP y PET [19].

De igual manera, se llev a cabo un trabajo encaminado al desarrollo y caracterizacin de

pelculas de mezclas de PHA con soportes. Estas pelculas elaboradas de mezclas de

polisteres mostraron que la elongacin a la fractura de las pelculas de la mezcla

PHBHHx/PHB se increment del 15% al 106% cuando el contenido de PHBHHx en la

mezcla se ampli del 40% al 60%. Los soportes hechos de PHBHHx/PHB consistan en un

60%p/p de PHBHHx mostrando un fuerte crecimiento y proliferacin de condrocitos

(clulas especializadas para el intercambio de nutrientes) en los materiales de fusin

escaneados bajo microscopio electrnico de barrido [20].

No slo, la identificacin de genes es suficiente para hablar con propiedad de los PHA`s.

Estos polmeros en general se construyen de hidroxi-acil-CoA derivados por diferentes vas

metablicas. Dependiendo de su origen microbiano, los bioplsticos difieren en la

composicin de sus monmeros, estructura macromolecular y propiedades fsicas. Un

estudio precedente (2003) se llev a cabo, el cual se enfoc en la descripcin metablica en

el paso a paso de los genes en la biosntesis de determinados PHA`s, as como la

caracterizacin de los mismos (scl [cadena de longitud corta]-PHA; mcl [cadena de

longitud media]-PHA; lcl [cadena de longitud larga]-PHA) [21].

En contraste con, la sntesis de PHA en microorganismos, se desarrollaron ensayos

correspondientes a produccin de caucho (2003). El elastmero ms importante es el

caucho natural (cis-1,4-polisopreno). El caucho del rbol Hevea brasiliensis es hasta ahora

una fuente comercial relevante de este polmero, aunque hay muchas plantas capaces de

sintetizarlo. Los recientes avances en el anlisis de las vas de biosntesis de isoprenoides y

poli-isopreno han alentado a establecer estudios de obtencin de cauchos naturales en

bacterias. Estableciendo la funcionalidad de la biosntesis del cis-1,4-polisopreno en

bacterias, la cual, depende en primer lugar de las vas biosnteticas de isopreno, y en

segundo lugar, la polimerizacin del isopreno por un proceso de alto peso molecular de

preniltransferasa polisoprenoides. Luego, un amplio estudio se realiz para estimar la ruta

21

metablica para conseguir tal propsito. En conclusin, se demostr que a travs de fuentes

renovables de la agricultura, por fermentacin, es posible alcanzar la produccin de caucho

natural en otras especies de plantas modificadas genticamente, como Arabidopsis thaliana

[22].

A continuacin, en 2004, un estudio enfocado en el comportamiento trmico y mecnico

de algunos agro-materiales se llev a cabo. Varias formulaciones basadas en matriz de

almidn plastificado, variando la formulacin de la matriz, el contenido de relleno, longitud

de las fibras y la naturaleza de las mismas. A dichas mezclas se les someti a procesos de

moldeo por inyeccin y extrusin para luego ser caracterizadas. Finalmente, estos estudios

mostraron que la adicin de fibras de celulosa mejora la resistencia trmica de los nanos

compuestos.

Por otro lado, encontramos una investigacin que incluy la ingeniera del proceso de

biosntesis de PHA en la Escherichia coli recombinante, prestando mucha atencin a los

genes intervinientes en la biosntesis para la produccin de distintos tipos de PHA y

mejorar los rendimientos de obtencin. Adems, las vas metablicas inherentes a la E. coli

se disearon para proveer de manera eficiente monmeros de PHA a partir de fuentes

renovables de carbono, tales como los azcares y los cidos grasos. Los resultados

mostraron que para scl-PHA la biosntesis con E.coli fue satisfactoria con niveles de

produccin de 5 g/l*h. En cambio para los mcl-PHA e incluso otros copolmeros de PHA

la historia fue diferente, gracias a la esquematizacin y trazado de los precursores (genes)

de PHA en las rutas metablicas de los cidos grasos [23].

Los Polihidroxialcanoatos son biodegradables y termo procesables, y debido a este hecho,

exhiben oportunidades en el campo de los dispositivos mdicos convencionales y en la

ingeniera de tejidos (Biomdica). Los PHA`s mas destacados, PHB, copolmeros de poli

3-hidroxibutirato-co-3-valerato (PHBV), 4-hidroxibutirato (P4HB), 3-hidroxibutirato-3-

hidroxihexanoato (PHBHHx) y poli 3-hidroxioctanato (OPS) y sus compuestos se han

utilizado para desarrollar dispositivos como suturas, los dispositivos de reparacin, parches

de reparacin, cabestrillos, parches cardiovasculares, clavos ortopdicos, las barreras de

22

adhesin, dispositivos de regeneracin/ reparacin tisular guiada, de reparacin del

cartlago articular, las guas de los nervios, dispositivos de reparacin de tendones, los

andamios de la mdula sea, y vendas para heridas [24].

De modo que, materiales compuestos se prepararon con almidn de maz granular (CS) o

fcula de potasa (PS) con la resina de poli (ster amida) (PEA) con distintas fracciones

volumtricas hasta del 40%. Las propiedades de rendimiento de tensin fueron medidas a

velocidades de formacin entre 0.0017-0.05 s-1

. Los resultados mostraron un aumento en el

lmite de elasticidad de la mezcla CS-PEA conforme lo haca velocidad de deformacin y el

contenido en almidn. La velocidad de deformacin fue ms pronunciada con el

incremento en contenido de almidn. Efectos mixtos se distinguieron en las mezclas de PS-

PEA: a velocidades de deformacin bajas, el rendimiento a la tensin disminuy con el

aumento de la fraccin de almidn, mientras, aument a velocidades de deformacin altas.

Con esto, la inclusin de CS y/o PS en PEA genera mximos en la curva deformacin-

tensin. Demostrndose la efectividad de las inclusiones de PEA en PHA, de forma

particular, para mejorar sus caractersticas [25].

En consecuencia, se desarroll una preparacin de un nanocompuesto de caucho

natural/slica (NR/SiO2) mediante tcnicas de auto-montaje y de composicin de ltex. Los

resultados de tales estudios mostraron lo siguiente: SiO2 se distribua de manera

homognea en la matriz del NR en pequeos grupos de tamao mediano. Los

nanocompuestos, especficamente cuando la slica se encuentra distribuida de manera

uniforme, poseen una mayor resistencia trmica y propiedades mecnicas. Adems, este

tipo de productos polimricos representan un potencial para la fabricacin de productos

mdicos con altos rendimientos [26].

Seguidamente, se han hecho observaciones importantes acerca de las diferentes bacterias

productoras de PHA. Es el caso especfico de la Azotobacter sp. , quien, puede acumular

hasta un 90% en peso de PHA. Sin embargo, presenta una dificultad y es la produccin de

subproductos y microorganismos (alginato) los cuales disminuyen el rendimiento de

produccin. Para tal problema se han propuesto alternativas, una concreta, que cita la

23

manipulacin de especies para acomodar las rutas metablicas y conseguir resultados

ptimos. Una especie mutante para tal propsito, es la Azotobacter ps.mutante [27].

Por esta razn, en bsqueda de obtener ms perspectivas con respecto a los

Polihidroxialcanoatos se han realizado ensayos para analizar la trascendencia de la

exposicin a radiacin de dichos materiales frente al peso molecular, la biodegradacin y

cristalinidad. Tres especies de PHA fueron utilizadas: poli (- hidroxibutirato) y poli (-

hidroxibutirato-co--hidroxivalerato), y una mezcla comercial de poli (- hidroxibutirato) y

poli (-caprolactona). Las muestras se irradiaron en aire a diferentes dosis, con tasa de dosis

constante de 10 kGy/h (medida de irradiacin). El peso molecular se determin por

cromatografa lquida de alta resolucin, el porcentaje de cristalinidad mediante difraccin

de rayos X de gran ngulo y por espectroscopia infrarroja por reflectancia total atenuada, y

la biodegradacin por prdida de peso relativa de muestras dispuestas en medio basal con

sales minerales, inoculado con Streptomyces s. El aumento de la dosis absorbida produjo

desplazamiento de la distribucin de pesos moleculares hacia pesos menores, increment

del porcentaje de prdida de peso relativo durante la biodegradacin, y escasa variacin del

porcentaje de cristalinidad [28].

Hasta 2008, ya se haban ensayado varias mezclas de PHA con otro tipo de materiales y

entre ellos para estudiar el comportamiento de las propiedades mecnicas, qumicas y

elctricas. Dentro de esos intentos, se hace mencin de las mezclas de polihidroxibutirato-

hidroxivalerato (PHB-HV) con almidn de maz en los contenidos en almidn de 0%, 20%,

30%, 40% y 50% se prepararon por colada. En consecuencia, los valores del modulo de

Young, esfuerzo, deformacin a la ruptura por deformacin a la traccin y fuerza de

puncin disminuyeron al aumentar el contenido de almidn. En conclusin, se lleg a

afirmar que las mezclas eran incompatibles a nivel molecular debido a la ausencia de

interacciones, segn medidas de infrarrojo (IR) [29].

24

4.3 MARCO TERICO

4.3.1 Polihidroxialcanoatos (PHA`s)

Los PHA son polmeros naturales producidos por bacterias utilizados como reserva de

nutrientes. Los PHA han atrado la atencin de la comunidad cientfica debido a su fuerte

tendencia a ser biodegradables, sus propiedades fsicas y mecnicas, comparables, a las de

los plsticos derivados del petrleo (estos polmeros presentan propiedades desde plsticos

rgidos y quebradizos, hasta los semejantes al hule) y por ser producidos a partir de recursos

renovables [1].

Los polihidroxialcanoatos (PHA`s) son una familia de polisteres biolgicos pticamente

activos con unidades de monmero (R)-3HA. Los cidos 3-hidroxialcanoatos estn todos

en la configuracin R debido a la estereoespecificidad de la enzima polimrica, PHA

sintetasa [30].

Con respecto a los PHA`s, se puede destacar el carcter termoplstico y/o elastmero de

estos materiales. De acuerdo, a la longitud de cadena se pueden organizar en tres grandes

grupos: scl (siglas en ingls, Longitud de corto alcance)-PHA, mcl (siglas en ingls,

Longitud de medio alcance)-PHA y hcl (siglas en ingls, Longitud de largo alcance)-PHA

[31].

Son polmeros lineales en los cuales el grupo carboxilo de un monmero forma un enlace

tipo ster con el grupo hidroxilo del monmero siguiente. Los PHA se depositan de forma

intracelular como cuerpos de inclusin, por medio de sustratos compatibles y pueden llegar

a representar ms del 90% del peso seco celular [32]. De estos tres se destacan por su

mayor uso y aplicabilidad en la industria los scl-PHA, los cuales son clasificados como

termoplsticos, poseen un elongamiento a la ruptura menor a un 5% pero incorporndoles

unidades de 3HV al P3HB permite aumentar la maleabilidad y resistencia, alcanzndose

valores de elongamiento para ruptura cerca del 50% y estn tambin los mcl-PHA, los

cuales por tener menor cristalinidad y puntos de fusin menores son reconocidos como

elastmeros y poseen elongamiento a la ruptura mayor al 100% [33].

25

Los copolmeros de PHA, segn, algunas investigaciones son estructuras con las cuales se

obtienen mejores propiedades mecnicas, mejora la cristalinidad y temperatura de fusin.

Se pueden encontrar mezclas de copolmeros de PHB-PHB/V y HV (hidroxivalerato),

que al incorporarse a las cadenas principales de PHA`s les brinda mejor rendimiento en

propiedades como la maleabilidad y les da un carcter ms biodegradable.

Se han podido determinar aproximadamente 150 cidos hidroxialcanoicos, saturados,

insaturados, halgenos, aromticos, etc., incorporados a las cadenas principales de PHA

cambiando a su vez las propiedades fsicas del polmero. Estos cambios dependen en gran

medida a los tipos de sustratos suministrados, especificidad en la polimerizacin y las

diferentes rutas metablicas para la formacin de los monmeros [33].

Dentro del amplio grupo de polisteres biolgicos, el ms comn es P (3HB) Poli-3-

hidroxibutirato, con su produccin bien referenciada para un gran nmero de

microorganismos. No slo, es importante destacar la estructura isotctica perfecta con solo

la configuracin- (R), sino, tambin la orientacin de las fibras de la estructura cristalina

del P (3-HB) que han sido determinadas con rayos X [30].

Existe un amplio rango de aplicabilidad para los PHA y se pueden clasificar en dos grupos

principales:

Envases desechables biodegradables

rea farmacutica

Donde en cada rea se aprovecha las propiedades mecnicas y bajos costos de produccin.

Existe tambin un rea de investigacin en bioprocesos donde se realizan trabajos

investigativos con PHA y mezclas con materiales naturales como el caucho natural o Ltex.

Los materiales de PHA`s, exhiben propiedades similares a varios materiales elastmericos

y termoplsticos sintticos comnmente usados en la industria, como por ejemplo el

polipropileno y el caucho sinttico [34].

26

4.3.2. Polihidroxibutirato (PHB)

El Polihidroxibutirato es el primer miembro conocido de esta familia, tiene propiedades

mecnicas semejantes al polipropileno con la ventaja agregada de la biodegradabilidad. Sin

embargo, en la actualidad no es un material que pueda desplazar al polipropileno, pues su

diferencia de precio es muy grande [35]. A continuacin, en la figura 2 se exhibe la

estructura molecular del primer miembro de la familia de los Polihidroxialcanoatos. Se

puede observar la presencia del grupo ster del cido carboxlico en la cadena principal.

Figura 2. Estructura qumica del Polihidroxibutirato (PHB)

Fuente: Miscibilidad de Mezclas Polimricas de Polihidroxialcanoatos [35].

4.3.3 Produccin de PHB con microorganismos

Se han realizado investigaciones en busca de obtener un buen rendimiento de PHA a partir

de cepas bacterianas, los primeros procesos desarrollados para la produccin de PHA con

microorganismos se realizaron mediante procesos de fermentacin utilizando la bacteria

Ralstonia eutropha, la cual es capaz de producir Polihidroxibutirato (PHB) a partir de

glucosa, o Polihidroxibutirato-Valerato (PHBV) a partir de glucosa y propionato, sustratos

cuyo alto costo incida en el precio final del polmero obtenido [32].

A continuacin en la Tabla 1, se presenta un listado de los microorganismos existentes y su

rendimiento de sntesis de PHA, destacando

27

Tabla 1. Bacterias que acumulan PHA.

Bacteria % en peso seco

Ralstonia Eutropha 96

Rhodobacter 80

Azospirillum 75

Azotobacter 73

Methylocitis 70

Leptothrix 67

Pseudomonas 67

Baggiatoa 57

Rhizobium 57

Fuente: http/www.biopolymer.net

La produccin de PHA`s con microorganismos depende principalmente del tipo de factores

externos o ambientales en exposicin de las cepas, como temperatura, pH, cantidad de

oxgeno y nutrientes, entre otros. De los microorganismos referenciados existentes para

poder sintetizar PHA`s, la bacteria Azotobacter sp. Es la que despierta ms inters debido

a su alto rendimiento de conversin y bajo costo de cultivo.

4.3.3.1 Generalidades del gnero Azotobacter sp.

Los microorganismos de este gnero comprenden bacterias con forma bacilar, reaccionan a

la tincin de Gram como Gram negativos (-), las clulas son ovoides, y miden

aproximadamente de 2m a 4m de dimetro, son aerobios pero algunos pueden vivir a

tensiones bajas de oxigeno [36].

En medios libres de nitrgeno con glucosa como nica fuente de carbono, las clulas

jvenes de diferentes especies presentan una forma bacilar con extremos redondeados. Las

colonias jvenes de estos microorganismos son generalmente lisas, opacas, poco convexas

y viscosas, tal como se ilustra a continuacin en la figura 3: en a) cultivo de azotobacter y

b) morfologa de la cepa.

28

Figura 3. A) Colonias de Azotobacter sp. en medio libre de nitrgeno. B) Morfologa de las

clulas de Azotobacter sp.

Fuente: Caracterizacin molecular de cepas nativas colombianas de Azotobacter spp. Mediante Anlisis de

restriccin del DNA Ribosomal 16S [36].

Bioqumicamente son catalasas y oxidasa positivos, reducen el nitrato, producen el sulfuro

de hidrogeno e hidrolizan almidn, las bacterias de este gnero fijan asimbiticamente

nitrgeno y son solubizadoras de fosfatos, adems, realizan procesos de biodegradacin de

plaguicidas como el endosulfan. Son quimio-organotrficas, utilizan para su crecimiento

azcares, alcoholes y sales inorgnicas. Son fijadoras de nitrgeno en vida libre, fijan al

menos 10 mg de N2 por gramo de carbohidrato consumido [36].

Requieren molibdeno para fijar nitrgeno que puede ser parcialmente reemplazado por

vanadio. La bacteria Azotobacter sp. es quimio-hetertrofo, utiliza como fuente de carbono

y energa una gran variedad de cidos orgnicos, azcares o sus derivados alcohlicos,

dentro de las sustancias que utilizan como fuente de carbono y energa se encuentra la

glucosa, fructosa, sucrosa, acetato, fumarato, piruvato, succinato, acetilmetilcarbinol y -

Oxoglutarato. Respecto a la fuente de nitrgeno pueden utilizar nitrato, sales de amonio y

aminocidos, sin embargo la adiccin de nitrato de potasio mejora la produccin de

biomasa. Su crecimiento es normal cuando se encuentra entre pH de 7.0-7.5, requiere una

29

temperatura ptima de 30C, susceptibles a pH cidos, altas concentraciones de NaCl y

temperaturas mayores a 35C [36].

Este tipo de bacteria aislada del suelo, puede utilizar sustratos econmicos y viables como

la sacarosa o melazas de caa, para producir PHB. En esta bacteria el polmero se obtiene

mediante un proceso de sntesis donde actan tres enzimas: una b-cetotiolasa, encargada de

condensar dos molculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, una acetoacetil- CoA

reductasa, para convertir este compuesto en 3-hidroxibutiril-CoA, y una polimerasa, para

polimerizar los monmeros. Este camino metablico lo utilizan la mayora de las bacterias

productoras de PHB, tales como R. eutropha [32].

A continuacin se ilustra el proceso de la ruta metablica para la sntesis de PHB en la

Azotobacter sp. Figura 4.

Figura 4. Esquema de la sntesis de PHB en Azotobacter sp.

Fuente: Bioplsticos: una alternativa ecolgica.

La obtencin de PHB con Azotobacter sp. presenta problemas debido a la produccin de

alginatos, y de tal forma provoca dificultad en la bioseparacin de las clulas para obtener

PHB; adems se genera un cultivo ms viscoso y espeso; y este, a su vez, compite con la

sntesis de PHB por el sustrato suministrado al medio, afectando as el rendimiento de

obtencin de bioplstico.

30

4.3.3.2 Azotobacter vinelandii

Una posible solucin a esto sera conseguir una modificacin gentica de la Azotobacter sp.

tal como la Azotobacter vinelandii la cual puede acumular PHB hasta un 90% de su peso

seco, adems, puede sintetizar copolimero de PHB y PHV con sustratos de bajos costos y

es incapaz de producir alginato. En la Figura 5 se puede observar la diferencia de

produccin de PHB en una cepa no mutante y otra mutante de Azotobacter, donde se puede

observar una mayor produccin de grnulos de PHB y ms grandes, en comparacin con la

cepa original [1].

Fuente: Tomada de Contaminacin ambiental y bacterias productoras de plsticos biodegradables [1].

Azotobacter vinelandii es una bacteria polipoloide, es decir posee varias copias de su

cromosoma, es de tamao muy grande de 2 a 5 m, su morfologa caracterstica se

identifica a continuacin:

Figura 5. Izquierda: Grnulos de PHB (color claro) en cepa no mutante de la bacteria

Azotobacter. Derecha: Cepa mutante de la misma bacteria.

31

Figura 6. Pigmentacin verde-amarillo caracterstica de Azotobacter vinelandii.

Fuente:

4.3.4 El caucho natural (Ltex)

El ltex es una sustancia con un composicin de gran complejidad, puesto que entre sus

elementos constituyentes se encuentran gomas, aceites, azucares, sales minerales, protenas,

alcaloides, terpenos ceras, hidrocarburos, almidn, resinas, taninos y blsamos. Adems, la

cantidad de cada uno de estos compuestos que existe en el ltex vara ostensiblemente lo

que depende de una serie de factores, como la especie vegetal, la parte de la planta en la

que se encuentra, la poca del ao y el tipo de suelo sobre el que crece la planta [37].

Se puede definir al ltex de caucho como una suspensin coloidal acuosa, generalmente de

color blanquecino, segregada por la corteza de rboles laticferos al sufrir una herida en su

tronco, en esta sustancia el polmero se mantiene disperso en la fase acuosa continua de

forma relativamente estable [37].

El caucho natural (cis-1,4-polisopreno) es un producto vegetal procesado obtenido de la

savia de varios centenares de especies de rboles y plantas existentes en distintas partes del

mundo, en especial en el frica ecuatorial, el sudeste asitico y Sudamrica.

32

Figura 7. Estructura del ltex (cis- 1,4poliisopreno)

Fuente: Obtencin de un Material Compuesto de Matriz Elastomrica y de Fibra de Coco [37].

El ltex se obtiene practicando en la corteza del rbol del caucho una incisin en espiral. El

ltex se recoge en vasos colgados del rbol, bajo la incisin, y a continuacin se transfiere a

cubos transportados a las estaciones de procesamiento. Por lo general, se aade amonaco

como conservante. El amonaco rompe las partculas de caucho y produce un producto con

dos fases de aproximadamente un 30 - 40 % de parte slida. Este producto se concentra

hasta obtener un 60% de parte slida, obtenindose as un concentrado de ltex amoniacal

con un 1,6% de amonaco en peso. Con el fin de, evitar la coagulacin y la contaminacin,

se aade a este concentrado un conservante secundario, como el pentaclorofenato sdico, el

disulfuro de tetrametiltiuram, el dimetilditiocarbamato sdico o el xido de zinc.

Entre los diferentes tipos de caucho natural producidos en la actualidad se encuentran: Las

planchas estriadas ahumadas, el caucho de especificacin tcnica, los creps, el ltex, el

caucho natural epoxidizado y el caucho natural termoplstico. De estos, el de mayor

relevancia en la industria es el ltex de caucho natural, a causa de la mayor demanda de

productos para proteccin frente al virus del SIDA y a otros agentes patgenos transmitidos

por la sangre. Los concentrados de ltex se utilizan para la produccin de pegamentos,

tejidos de fondo de alfombras, espumas y productos como globos, guantes y preservativos.

El caucho natural epoxidizado se obtiene tratando el caucho natural con percidos y se

utiliza como alternativa a algunos cauchos sintticos [2].

33

4.3.5 Mezclas de PHB-caucho natural

El caucho natural es otra clase de polmero, el cual, en estado natural es elastmerico y

biodegradable. Las distintas clases de caucho pueden ser mezcladas con sustancias

polimricas tales como los PHB, PHB/V y sus copolmeros, para mejorar las propiedades

fsicas del caucho destacando el incremento en la temperatura de fusin (Tm) y mejora en

la propiedad de traccin mecnica, lo que le brinda la ductibilidad y dureza requeridas para

muchas aplicaciones plsticas [31].

Los cauchos como el ltex, epoxidizados y termoplsticos pueden ser mezclados en

distintas proporciones con PHA`s con el fin de obtener distintos tipos de biomateriales que

brindan propiedades nicas, las cuales pueden ser aprovechadas para aplicaciones de tipo

industrial, medicas y farmacuticas como por ejemplo, guantes de ltex ms duraderos y

resistentes, hule ms flexible y biodegradable, entre otras.

El uso de diferentes tipos de cauchos para ser mezclados con PHA`s pueden ayudar a

mitigar el impacto de dichos cauchos sobre el ambiente, pues una cadena de PHA unida a

la cadena principal de un caucho, brinda la ventaja de hacer al material biodegradable y

abre una puerta de posibilidades a nuevos materiales, con aplicaciones desde elastmeros

rellenos de PHA hasta caucho termoplstico reforzado [31].

34

5. METODOLOGA

5.1 TIPO DE INVESTIGACION

El presente proyecto es una investigacin cuantitativa de tipo experimental; puesto que se

establecen y analizan las relaciones causales con sus respectivos efectos entre variables, lo

cual arrojar xito o no de la misma. De igual forma, se adopta un diseo experimental lo

cual permiti relacionar las variables de pH, concentracin de producto, sustrato y biomasa

contra tiempo y concentracin de ltex y PHB para de esta manera obtener un nuevo

copolmero.

5.2 TECNICAS DE RECOLECCION DE INFORMACION

5.2.1 Fuentes de Informacin Primaria

Las fuentes primarias de este proyecto son los datos obtenidos por las pruebas

experimentales que se realizaron en los laboratorios de la Universidad de Cartagena, en el

edificio de Ingenieras en la dependencia de Tecnologas y Plantas pilotos partiendo de la

activacin del microorganismo, preparacin del inoculo, toma del tiempo de inhibicin y

por ltimo ensayo de fermentacin. Posteriormente se aplicaron mtodos analticos tales

como determinacin de la biomasa por centrifugacin, determinacin del crecimiento

celular, medicin del pH, mezcla con ltex y cuantificacin del copolmero.

5.2.2 Fuentes de Informacin Secundaria

La informacin suministrada para la sntesis de PHB y la mezcla ltex para la elaboracin

del copolmero ha sido a travs de artculos obtenidos de las bases de datos llamadas

35

Science Direct, EBSCOhost y del artculo PHArubber blends: Synthesis, characterization

and biodegradation.

5.3 Poblacin

En este proyecto la poblacin es infinita porque el crecimiento bacteriano se realiza por

fisin binaria (2n; n = ) por lo que, el cultivo bacteriano estar en crecimiento continuo.

Respecto al ltex, se toma como poblacin 4 kilogramos de ese mismo.

5.4 Muestra

El tamao del inculo debe ser el 10% del volumen de trabajo para la sntesis del PHB. La

muestra correspondiente al ltex es de 10 ml. se hace de acuerdo al rendimiento que

aproximadamente es del 90%.

5.5 Hiptesis

Si se adiciona PHB al ltex, se obtendr un copolmero.

Hiptesis Alternativa:

Si se adiciona PHB al ltex, no se obtendr un copolmero.

36

5.6 Variables

Variables dependientes: Concentracin de PHB, biomasa y sustrato (en el proceso de

obtencin del PHB), concentracin de copolmero, % (p/v) de copolmero, Yx/s, Y p/s,

productividad Biomasa, productividad PHB y productividad polmero extracelular.

Variables Independientes: Tiempo y concentracin del PHB en Ltex.

Variables intervinientes: pH y temperatura.

5.7 Operacionalizacin De Variables

Tabla 2. Definicin de Variables para Proceso de Fermentacin.

VARIABLE DEFINICION INDICADOR

Va

riab

les

Dep

end

ien

tes

Concentracin de PHB Cantidad de PHB por

litro de solucin. Gramos/Litro

Concentracin de Biomasa Cantidad de Biomasa

por litro de solucin. Gramos/Litro

Concentracin de

Bioplstico

Peso del Bioplstico

respecto al volumen

del ltex

Gramos Bioplstico/Litro

de ltex

% (p/v) de Bioplstico

Peso del Polmero

respecto al volumen de

ltex

Gramos Polmero/Litros

de ltex

Y x/s Rendimiento de

Biomasa

Gramos Biomasa/Gramos

Sustrato

Yi p/s Rendimiento

intracelular del PHB

Gramos PHB/Gramos

Sustrato

37

qp Velocidad de consumo

de Sustrato (h

-1)

Productividad Biomasa

Productividad de la

Biomasa por hora en

litro de solucin

(Gramos/Lh)

Productividad PHB

Productividad de PHA

por hora en litro de

solucin

(Gramos/Lh)

Clulas que se

producen durante la

fase exponencial

(h-1

)

Vari

ab

les

Ind

epen

die

nte

s Concentracin de PHB en

ltex

Cantidad de PHB por

ml de solucin. mg/ml

Tiempo Lapso necesario para

completar un volumen. Horas

Vari

ab

les

Inte

rvin

ien

tes Ph

Nivel de acidez y

alcalinidad pH

Temperatura

Contenido de la

energa interna de las

molculas.

C

Fuente: Mezcla Sinrgica entre Polihidroxibutirato (PHB) y Caucho Natural (Ltex) para obtener un

copolmero [48].

5.8 Diseo De Experimentos

Se plantea un diseo unifactorial en el cual el nico factor de inters es la proporcin de la

mezcla de PHB con caucho natural. Se realizaron 3 mezclas variando la concentracin de

38

PHB, en solucin de caucho natural. Las variables de respuesta que se evaluarn en las

muestras son las que se presentan en la tabla 2. La tabla 3, referencia los anlisis aplicados

a las mezclas sinrgicas preparadas.

Tabla 3. Relaciones de concentracin de la mezcla


copolmero [48].

Tabla 4. Propiedades a evaluar


copolmero [48].

5.9 Determinacin del Crecimiento Bacteriano

Se tom una muestra de 2000 l en una celda de vidrio y se midi como blanco en un

espectrofotmetro (Lobomedic UV-Vis Scanning Spectrophotometer Spectro UV-265) a

500 nm, arrojando una densidad ptica (OD) de 0.73, luego se inoculo con el 10% del

volumen inicial que era de 200 ml (20 ml) de medio pre crecido por 24 h y as evitar la

fase de latencia, el cual presentaba una concentracin de biomasa de 0.6625 g/l (peso

Prueba (mg) Polihidroxibutirato (PHB) (ml) CAUCHO NATURAL (Ltex)

1 0 10

2 5 10

3 10 10

Ensayo Mtodo Equipo

Estabilidad trmica. RAMPA DSC

Traccin Mecnica. ESTIRAMIENTO TEXTURMETRO

Espectrometra IR. ATR NICOLET MAGNA 50

39

hmedo), una vez inoculado, se toma otra muestra de 2000 l en una celda de vidrio y se

mide de nuevo el OD, el cual fue de 0.75 por lo que la diferencia con el OD del blanco

refleja la concentracin en ese tiempo 0. Luego, el medio se dejo fermentando en una

plancha automtica con agitacin constante de 225 rpm, temperatura constante de 30C por

48 h. Se tomaban muestras de 2000 l y se media el OD para as poder realizar la curva de

fermentacin y determinar el tiempo ptimo de mayor produccin de PHB. En la siguiente

grfica se reflejan esos resultados [40].

5.10 Caracterizacin del polmero

El polmero se caracteriz por espectrofotometra de UV a 235 nm en una solucin de 1.5

ml de H2SO4 [98%], siguiendo la tcnica de Law and Slepecky [40] tal como se describe a

continuacin:

Se tomo como blanco H2SO4 concentrado, y luego se diluyo el polmero en el cido, y se le

calculo su OD, que fue de 0.9984.

Siguiendo la ecuacin 1:

(Ec. 1)[42]

Para obtener la concentracin en g/ml se divide entre 100 puesto Law y Slepecky

realizan el anlisis a 235 m

5.11 Texturmetro (Prueba de Traccin Mecnica)

Para esta prueba se elaboraron moldes con dimensiones de 0.04 m de ancho, 0,053 m de

largo y un espesor de 0,003 m, que luego se sometieron a una fuerza de jalonamiento, que

40

permiti calcular las magnitudes, para una muestra de ltex y la mezcla ltex-PHB (10:10

P/V).

5.12 Procesamiento De La Informacin

El procesamiento de la informacin de este proyecto, se llev a cabo durante 1 ao, en

donde se encontr informacin que sirvi para la mejor eleccin de los mtodos a utilizar

en la obtencin del copolmero, de igual manera, se cont con la colaboracin de expertos,

los cuales ofrecieron su apoyo incondicional.

41

6. RESULTADOS

6.1 Diagrama de flujo del proceso

Figura 8. Diagrama de flujo del proceso de obtencin del copolmero Ltex-PHB.

Fuente: Mezcla Sinrgica entre Polihidroxibutirato y Caucho Natural para obtener un copolmero [48].

42

La figura 8 presenta esquemticamente, las etapas llevadas a cabo para el cumplimiento de

los objetivos del proyecto, iniciando desde la activacin de la cepa, hasta la caracterizacin

de las mezclas sinrgicas (anlisis DSC y Texturmetro), destacando Preparacin del medio

de cultivo, del precrecido, del medio de fermentacin, la extraccin de biomasa, extraccin

del PHB, preparacin de las mezclas PHB-ltex y caracterizacin de las muestras.

Se establecieron las condiciones ptimas del proceso para la extraccin del

Polihidroxibutirato, adems se fijaron parmetros de pH, temperatura, fuentes de

hidrogeno, fsforo, potasio, nitrgeno y oxigeno, a concentracin homognea

mediante agitacin, todo esto para el mantenimiento y crecimiento adecuado de la

bacteria Azotobacter vinelandii utilizada en la sntesis del PHB; as mismo se llev

a cabo la extraccin e implementacin de las operaciones unitarias de secado y

preservacin del ltex en amoniaco a temperatura inferior a 17C.

6.1.1 Materiales y equipos

En el desarrollo del proyecto se utilizaron los siguientes equipos:

Cmara de flujo laminar (Forma Scientific).

Incubadora (Memmert 854 Schwabach).

Autoclave. (GEMM Sturdy SA-300 H)

Plancha con control de agitacin magntica y temperatura (Thomson Itester IT-09)

Texturometro (Shimadzu EZ-S)

Calormetro diferencial de barrido DSC (Q200 V24.4 Build 116)

Espectrofotmetro (Lobomedic UV-Vis Scanning Spectrophotometer Spectro UV-

265)

Bao trmico (Water Batch GEMMY Co. Modelo YCW-010E)

Microscopio (Leica M205 A).

pH-metro (CG 840 B SCHOTT).

Balanza analtica (Explorer-OHaus Corporation SN E0341119042329).

Refrigerador (Refrigerador whirlpool 13 p3 nuevo).

43

Centrifuga (Universal Modelo PLC-012 E).

De igual manera se utilizaron los materiales listados a continuacin:

Erlenmeyer.

Cajas de petri.

Tubos de ensayo.

Pipetas graduadas y no graduadas.

Beakers.

Agitador magntico.

Mechero de alcohol.

6.1.2 Preparacin del medio de cultivo

Se realiz la activacin de la cepa liofilizada segn indicaciones del CECT (Centro Espaol

de Cultivos Tipo) (Anexo A). Se re-suspende el lifilo con ayuda de una pipeta Pasteur en

el medio liquido esterilizado anteriormente en autoclave a 121C. El medio Norris, fue el

medio adecuado para la conservacin de la cepa, con pH 7.2 ajustado con HCl [0.25 M] y

por recomendaciones del CECT debe estar libre de nitrgeno. Se prepar un medio de 200

ml y su contenido se detalla a continuacin:

K2HPO4 0.2 g

MgSO4.7H2O 0.04 g

CaCO3 0.2 g

NaCl 0.04 g

FeSO4.7H2O 0.02 g

Na2MoO4.2H2O 1.00 mg

Agar en polvo (solo para medio slido) 3.00 g

Glucosa anhidra 2.00 g

Agua para medio 200 ml [38]

44

Despus, se procede a inocular en medio slido y lquido todo el contenido de la muestra,

finalmente, se ajusta el pH a 7.2 con HCl [0.25 M], se realiz la incubacin por 72 horas de

cada uno de los medios a temperatura de 30C.

6.1.3 Caracterizacin bacteriana

Para la identificacin de las paredes bacterianas, se aplic la tcnica de tincin de Gram y

de esta manera se comprob que la cepa es Gram (-), la morfologa observada de la cepa es

en forma de bacilo (Anexo B). En la tabla 4, se detallan las condiciones de crecimiento, y

las propiedades fsicas del cultivo con Azotobacter vinelandii.

Tabla 5. Caractersticas de las colonias de cultivo [39]

Medio Medio libre de nitrgeno (Medio Norris)

pH 7.2

Tiempo de

Cultivo 72 horas

Temperatura 30

Superficie Cerosa

Densidad Opaca

Consistencia Mucoide

Forma Fusiforme

Elevacin Convexa

Borde Entero

Pigmentacin Verde-Amarillo

6.2 Fermentacin y obtencin del PHB

Se prepar el medio Norris con un volumen de trabajo de 200 ml para el pre-crecido o

semilla, con esterilizacin previa e incubacin por 24 horas, tomando un inoculo de

bacteria activada previamente en medio Norris slido y aadindole dos fuentes extra de

45

nitrgeno, 0.1 g de extracto de levadura y 0.2 g de peptona, con el fin de obtener un mayor

rendimiento.

Para determinar el tiempo adecuado de produccin de polmero se realizaron 6 ensayos

para describir la cintica de crecimiento en el proceso de fermentacin, para lo cual se

prepara medio Norris Modificado de 400 ml con los siguientes componentes:

1.2 g Glucosa,

0.46 g Acetato de amonio,

0.04 g peptona,

0.08 g MgSO4.2H2O,

5.2 mg citrato frrico,

1 mg Na2MoO4

Agua para medio 400 ml [38]

Se prepar un buffer de sales de fosfato (9.2 mg K2HPO4-0.024 g KH2PO4) con el

objetivo de mantener el pH a 7.5, el cual se ajust con una solucin de NaOH 1 M y

se esteriliz en autoclave a 121C a 15 lbf/ cm2

por 15 min [40].

6.3 Determinacin del Crecimiento Bacteriano

En la tabla 6, se reflejan los resultados de Densidad ptica (D.O.) aplicados en el proceso

de fermentacin. Se observ un aumento de esta variable, conforme pas el tiempo,

obedeciendo este comportamiento al crecimiento de la bacteria, como resultado de los

nutrientes en el caldo de cultivo.

46

Tabla 6. Resultados D.O. para la Biomasa

Luego de tener los datos dentro del rango requerido, se procede a graficar:

Figura 9. Curva de Crecimiento para la Cintica con Azotobacter vinelandii.

y = -1E-05x3 + 0,0002x2 + 0,0428xR = 0,9903

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 10 20 30 40 50

OD

t(h)

Cinetica Azotovacter v.

Datos experimentales

Polinmica (Datos experimentales)

47


copolmero [48].

La Figura 9 muestra, que cuando se realiza la fermentacin con previa inoculacin, la fase

de adaptacin, donde los microorganismos comienzan adaptarse al medio (fase de

latencia) se minimiza, mantenindose el crecimiento exponencial, hasta aproximadamente

las 45 h, tiempo en el cual se da la mayor produccin de PHB, considerndose el producto

obtenido como el metabolito secundario.

Para tener datos ms claros, se realiz un ajuste polinomial de grado 3 que describe muy

bien el comportamiento de la cintica, el cual se describe en la Figura 10:

Figura 10. Curva ajustada Cintica de Crecimiento Azotobacter v. OD vs. Tiempo.


copolmero [48].

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

OD

t(h)

Grafica ajustada Azotobacter v

Datos de cinetica

48

Esto demuestra que el tiempo de mayor produccin de PHB, a las condiciones de trabajo de

pH 7.5, agitacin a 225 rpm es de 45 a 48 horas.

6.4 Extraccin de la Biomasa y del Polmero

Una vez determinado el tiempo ptimo de fermentacin, se realiza la extraccin del PHB,

y se procede de la siguiente manera: Cumplidas las 48 h de fermentacin, se centrifugaron

los 400 ml a 3200 rpm por 15 min en tubos de ensayo con muestras de 10 ml; despus, se

calcul la concentracin en base hmeda de biomasa, la cual fue de 8.2 g/l.

Luego se realiz un proceso de digestin (Anexo C) con solucin hipoclorito de sodio-

cloroformo (30-70%, respectivamente) por una (1) hora y 30 min sin agitacin, para cada

muestra de 1 mg se adicion 4.5 ml de solucin. Una vez completado el proceso, se

centrifugaron las muestras a 3200 rpm por 15 min, formndose tres fases: la superior, de

hipoclorito; la intermedia, restos celulares; y la inferior, solucin de cloroformo y PHB

[40].

La fase superior se retir con pipeta; la fase media y la fase inferior se filtraron, separando

los restos celulares de la solucin de cloroformo-PHB; recolectando esta solucin en cajas

de petri. Una vez se recoga el volumen total de la solucin cloroformo-PHB, se calentaba

la caja de petri a temperatura constante (70C) en una plancha de calentamiento para

evaporar el cloroformo y concentrar el PHB. Secado el polmero, se pes y obtuvo una

masa total de 110.2 mg de polmero [40].

Este procedimiento se repiti para distintas concentraciones de inoculo, del 1%, 2% y 10 %

del volumen total de 200 ml del medio precrecido por 24 horas, (0.027 g/L, 0.053 g/L y

0.6625 g/L) obtenindose distintas cantidades de polmero (0.044 g/L, 0.055 g/L y 0.28

g/L) respectivamente, tal como se muestra en la siguiente grafica:

49

Figura 11. Produccin de polmero y Biomasa a distintas concentraciones de inoculo.


copolmero [48].

De la Figura 11, se determina que la mxima cantidad de polmero (110.2 mg) se obtiene

con una concentracin de inoculo de 0.6625 g/L

6.5 Caracterizacin del polmero

Siguiendo la ecuacin 1, se calcula la concentracin de PHB:

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0,027 0,053 0,6625

g/L

Inculo g/L

PHB (g/L)

Biomasa (g/L)

50

(Ec. 1)[42]

Para obtener la concentracin en g/ml se divide entre 100 puesto Law y Slepecky

realizan el anlisis a 235 m

Constante o Coeficiente de extincin de cido crtonico: 5.21

Densidad del polmero: 1250 mg/ml

Volumen del polmero: 0.014 ml

Volumen de Solucin: 1.5 ml

OD235 nm : 0.9984

[PHB]=5.57 g/ml

Lo cual est muy cercano a los valores dados por Law y Slepecky para caracterizacin de

PHB por espectrofotometra UV.

Figura 12. Curva Patrn de caracterizacin de PHB, mtodo Law and Slepecky.

Fuente: Assay of Poly--Hydroxybutyric Acid [41].

Utilizando la figura 12, la cual, corresponde a la curva de calibracin para la relacin de la

absorbancia con la concentracin de PHB, se ilustra que para un OD de 0.998 a 235nm y

51

extrapolando se tiene que la funcin que describe la grafica es: Y=0.19X. Para Y=0.9984, se

obtiene una concentracin de 5.25 g/ml dato muy cercano al valor obtenido de 5.57 g/ml, por

ende se demuestra que efectivamente se ha obtenido PHB, como se observa en la Tabla 7.

Tabla 7. Comparativo Concentracin de PHB.

Concentracin de Polmero Obt

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