Tesi 21 marzo

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PAVIA

DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA E BIOTECNOLOGIE

“L. Spallanzani”

VINO SPUMANTE CRUASÈ DOCG:

studio dei fenomeni di adsorbimento degli antociani

da parte di lieviti vinari

Relatore: Prof. Rino Cella

Correlatore: Prof. Roberto Foschino

Correlatore: Dott.ssa Daglia Maria

Tesi Sperimentale di Laurea in Scienze Biologiche

di Alessandra Baldi

Anno Accademico 2011-2012

INTRODUZIONE

Indagini di mercato condotte in questi ultimi anni indicano che il consumo pro-capite di vino

è in lenta ma continua diminuzione. Recenti dati pubblicati dall’Istituto Nazionale di Statistica

(ISTAT) stimano che la quota della popolazione che consuma vino è leggermente diminuita

negli ultimi anni ed è soprattutto cambiato “lo stile nel bere”. Nel 2012 l’ISTAT ha riportato

che il 53,3 % della popolazione italiana beve vino e che, tra i consumatori, quelli abituali

stanno leggermente calando, a favore di un consumo più sporadico. In effetti, si beve molto

meno di un tempo, e questa è la vera ragione del calo del volume consumato, inoltre il

consumo di vino si sta spostando sempre più verso i vini di qualità (1).

Il vino rosato, che un tempo era ritenuto un vino di scarsa qualità, associato ai periodi caldi

dell’anno e al consumo femminile, negli ultimi anni è stato giustamente riscoperto e il suo

consumo è aumentato. Oggi il vino rosato costituisce l’8,5 % della produzione mondiale di

vino (1). L’Europa ne produce il 73,1 % e, al suo interno, la Francia è il primo produttore

mondiale con una quota del 29 %, seguita dall’Italia (21 %) e dalla Spagna (18 %). Il

Continente americano concorre al volume totale del vino rosato prodotto a livello mondiale,

con il 23 % della produzione totale, con il contributo maggiore da parte degli Stati Uniti (18

%). Pur essendo il consumo di vino rosato inferiore rispetto a quello degli altri vini, dal 2003

al 2007 il segmento dei vini rosati ha registrato un incremento dei consumi sia a livello

mondiale che a livello italiano, in controtendenza rispetto ai vini rossi e bianchi (2). In Italia,

nel triennio 2006-2009, il consumo di vino rosato è cresciuto del 6 % in valore e del 5 % in

volume. Inoltre, in base ai risultati di un’indagine condotta nel 2008 dall’Istituto di Servizi per

il Mercato Agricolo (ISMEA) sugli acquisti in Italia, la ripartizione percentuale in quantità dei

vini DOC/DOCG per categoria era del 2,04 % per i rosati (nel 2007 era 1,80 %) contro quella

del 62,59 % dei rossi e del 35,37 % dei bianchi. I vini rosati DOC/DOCG sono acquistati

maggiormente nel Nord-Ovest mentre i rosati da tavola sono acquistati maggiormente nel Sud

d’Italia. Il primato nella produzione spetta al Veneto (2.480.000 bottiglie) seguito dalla

Lombardia (1.267.000 bottiglie), tuttavia una lunga tradizione riguarda anche altre regioni

italiane quali la Puglia, l’Abruzzo, la Calabria, e la Campania (3).

In questo contesto di crescente rilevanza del vino rosato, l’Oltrepò Pavese ha proposto il vino

spumante “Cruasè”, un vino rosé naturale DOCG ottenuto da uve Pinot Nero attraverso il

metodo classico (4).

1

PROCESSO DI VINIFICAZIONE DEL VINO SPUMANTE ROSATO

CRUASE’

L’uvaggio del vino base utilizzato per la rifermentazione è ottenuto, come da disciplinare di

produzione, da un minimo di 85 % di uve Pinot Nero fino al l00 %. I grappoli d’uva, prelevati

in vigna in cassette, vengono introdotti nella pigia-diraspatrice. Il pigiato ottenuto è posto in

una pressa a polmone in cui viene immesso ghiaccio secco, per inibire gli enzimi ossidanti

che possono influire negativamente sul colore. All’interno della pressa vengono aggiunti

anche enzimi pectolitici di macerazione per favorire la degradazione delle pectine presenti

nella buccia dell’uva. Le pectine chimicamente sono polisaccaridi che svolgono un'azione

strutturale all'interno della cellula vegetale. Una volta liberate durante le operazioni di

pigiatura e pressatura, provocano un aumento della viscosità del mosto, rendendo le

operazioni di chiarifica difficoltose. L'obiettivo principale dell'aggiunta di enzimi è pertanto

quello di aumentare la velocità di degradazione delle pectine, riducendo, già dopo poche ore,

la viscosità del mosto. La miscela viene lasciata macerare per tre ore nella pressa al fine di

estrarre le antocianine contenute nelle bucce, azione che è anche favorita dall’utilizzo degli

enzimi di macerazione e estrazione del colore, che svolgono un'azione di disgregazione delle

strutture cellulari dell'uva interferendo nella dinamica dell'estrazione stessa.

L’operazione di pressatura è graduale e si arriva a un valore di 0,8 bar di pressione; ciò

permette di ottenere il mosto di prima pressatura. Il succo ottenuto è fatto decantare in vasca a

freddo, al fine di ottenere l’illimpidimento del vino. All’interno della vasca viene introdotta

anidride solforosa, nella dose di circa 5 g per quintale di mosto d’uva. L’aggiunta

dell’anidride solforosa ha lo scopo di inibire l’azione dei lieviti e dei batteri, poiché la

fermentazione nello stadio di illimpidimento non deve attuarsi. Quando il sedimento è

decantato sul fondo della vasca viene compiuta la sfecciatura, che consiste nel separare il

mosto limpido dal sedimento. Ora il mosto d’uva è pronto per la fermentazione e in tale fase

in esso viene inoculato il lievito Saccharomyces bayanus, lievito del genere Saccharomyces,

ampiamente utilizzato per le fermentazioni di mosti con elevato contenuto di zuccheri e per la

produzione di spumanti con metodo classico. La fermentazione avviene a una temperatura

costante di 18 °C.

Il processo di produzione dello spumante con il metodo classico prevede che al vino base

venga addizionata una soluzione costituita da lieviti selezionati e zucchero di canna,

comunemente definita liqueur du tirage. Successivamente a tale fase si procede

2

all’imbottigliamento, per cui la seconda fermentazione ha luogo nella bottiglia, all’interno

della quale i lieviti consumano lo zucchero provocando la rifermentazione, detta presa di

spuma, con sviluppo di anidride carbonica che forma le classiche bollicine, e genera una

pressione di 5-6 atm.

L’invecchiamento richiede nel caso del Cruasè almeno 24 mesi, nei quali le cellule di lievito

dopo circa 120 giorni muoiono per autolisi, formando la feccia che si deposita in bottiglia. Al

fine di rimuovere tali fecce, si effettua il remuage, che consiste nella messa in punta della

bottiglia per permettere alle fecce di scivolare verso il collo della bottiglia ed essere più

facilmente eliminabili. L’operazione successiva viene definita sboccatura o degorgement, e

consiste nell’immergere i colli delle bottiglie in una soluzione refrigerata a -20 °C, in modo

tale che la feccia si ghiacci. Ciò permette di eliminare facilmente il sedimento, divenuto

solido, quando viene fatto saltare il tappo, riducendo al minimo la perdita del prodotto.

SELEZIONE DEI CEPPI DI LIEVITO UTILIZZATI NELLA

RIFERMENTAZIONE PER LA PRODUZIONE DI VINI SPUMANTI

La selezione di ceppi di lievito per la seconda fermentazione in bottiglia si basa sulle proprietà

fisiologiche e tecnologiche (5) quali l’attitudine a iniziare una seconda fermentazione in

ambiente alcolico, la capacità fermentativa a basse temperature, la formazione di schiuma, la

buona capacità di aggregazione e flocculenza, che differiscono considerevolmente da lievito a

lievito a seconda delle caratteristiche strutturali e della composizione chimica della parete

cellulare del lievito selezionato. È stato dimostrato che i lieviti diminuiscono il contenuto di

composti fenolici presenti nel vino in quanto le mannoproteine, componenti delle pareti

cellulari, assorbono i polifenoli liberi mediante interazioni deboli e reversibili (6). La

differente polarità e la contemporanea natura idrofobica e idrofilica delle mannoproteine

definisce la capacità dei lieviti di adsorbire i differenti composti del vino, come le molecole

volatili o i pigmenti. Durante il processo di vinificazione, i differenti ceppi di lievito possono

avere una differente influenza sul profilo antocianico, poiché la composizione della parete

cellulare varia in base al ceppo di lievito d’appartenenza e poiché le differenti antocianine, a

seconda della struttura chimica possono essere assorbite in modo differente dai lieviti. È stato

infatti dimostrato che antociani con più sostituenti metossilici sono assorbiti in quantità

maggiore rispetto a quelli con più sostituenti idrossilici. Questo dato conferma che

l’adsorbimento degli antociani è causato prevalentemente da interazioni idrofobiche.

In particolare, in questo lavoro di tesi sono stati considerati gli antociani, molecole

idrosolubili che conferiscono il caratteristico colore al vino. Tali composti polifenolici 3

appartenenti alla classe dei flavonoidi, si trovano nella buccia degli acini d’uva dove

ricoprono un importante ruolo antiossidante, proteggendoli dai danni provocati dalle

radiazioni solari UV. In particolare gli antociani sono in grado di reagire con gli ossidanti,

quali ossigeno molecolare e specie reattive all’ossigeno (ROS), riducendo i danni che queste

molecole possono provocare alle cellule e ai tessuti vegetali.

Presenti sotto forma di singole molecole nell'uva e nel mosto, nel corso della vinificazione e

della maturazione i polifenoli tendono ad aggregarsi, assumendo una struttura polimerica

poco solubile, e in parte precipitano, provocando una diminuzione del colore rosso o rosato

del vino e la comparsa di un colore più scuro tendente all’arancione/bruno (7).

Nel campo enologico il fenomeno dell’adsorbimento delle antocianine da parte dei lieviti è

stato recentemente proposto come criterio per la selezione dei lieviti stessi che possono essere

responsabili dell’incremento o della riduzione del colore del vino. Pertanto ceppi di lievito

con elevato potere adsorbente possono essere utilizzati nella correzione di colore dei vini

bianchi. Mentre, per quanto riguarda i vini rossi, potrebbe essere possibile potenziare il

colore, indice di qualità del vino, attuando una selezione di lieviti caratterizzati da un basso

profilo di adsorbimento nei confronti delle antocianine (8).

ANTOCIANIDINE E ANTOCIANINE

Le antocianine, sono flavonoidi idrosolubili che, in base al pH e, in molti casi, alla presenza di

agenti complessati, possono assumere diverse colorazioni come il rosso, il viola e il blu. Per

idrolisi del legame glicosidico, le antocianine liberano il corrispondente aglicone, detto

antocianidina. Esse sono ampiamente diffuse nel regno vegetale, possono trovarsi nella

maggior parte dei tessuti degli organismi vegetali superiori, incluse radici, fusti, foglie e frutti:

per questo motivo possono essere considerati il gruppo più rilevante dei pigmenti naturali

presenti negli alimenti derivati dai vegetali, incluso il vino rosso.

Durante la fermentazione che avviene nella produzione del vino, specialmente nel primo anno

di maturazione, le antocianine monometriche coinvolte in diverse reazioni, portano alla sintesi

di vari derivati antocianici di natura polimerica e quindi a nuovi pigmenti, il cui ruolo è

fondamentale per la stabilità del colore.

Antocianine. Nei vini rossi giovani, le antocianine, caratterizzate da una particolare

instabilità chimica, sono la componente principale responsabile del colore del vino. Durante il

periodo d’invecchiamento del vino, gli antociani monomerici sono gradualmente incorporati

in nuovi pigmenti derivati da altri fenoli; questo processo è evidenziato dal progressivo

4

viraggio di colore dal rosso-violaceo, caratteristico dei vini rossi giovani, al rosso-aranciato

tipico dei vini rossi invecchiati.

I vini rossi prodotti con uve provenienti da Vitis vinifera L., sono composti per la maggior

parte da antocianine monomeriche 3-O-monoglucoside, che comprendono: pelargonidina-3-

O-glucoside, cianidina-3-O-glucoside, delfidina-3-O-glucoside, petunidina-3-O-glucoside e

malvidina-3-O-glucoside. Le sei antocianine differiscono fra loro nella struttura chimica, per

il numero e la posizione dei gruppi sostituenti idrossilici e metossilici dell’anello B della

molecola. L’idrossilazione dell’anello B delle antocianine può avere un effetto diretto sulla

stabilità del colore, determinata dall’effetto della delocalizzazione degli elettroni all’interno

della struttura della molecola. Per esempio, le antocianine con più sostituenti idrossilici

sull’anello B possono contribuire allo sviluppo del colore blu, mentre una maggior

metossilazione dell’anello B favorisce il prevalere del colore rosso. (9-13).

Struttura ed equilibi fra le differenti antocianine. Nei vini giovani, in cui le antocianine

monomeriche sono ancora presenti, queste risultano in equilibrio dinamico tra cinque diverse

strutture molecolari, a cui corrispondono altrettante differenti colorazioni: il composto flavene

addizionato a bisolfito (incolore), la base chinoidale (blu-violetto), il catione flavilio (rosso-

arancio), l’emichetale, detto carbinolo pseudobase (incolore), e il calcone nelle forme cis- e

trans- (di colore giallo tenue).

La forma corrispondente al catione flavilio può andare incontro a due tipi di reazioni, una

reazione di idratazione oppure una reazione acido-base. Attraverso la prima il catione flavilio

si trasforma nell’emichetale corrispondente, mentre la seconda reazione porta alla conversione

del catione flavilio nella base chinoidale.

L’apertura dell’eterociclo e il riarrangiamento dell’emichetale portano alla formazione del

calcone.

Diversamente se il catione flavilio viene fatto reagire con HSO3- si forma il composto flavene,

per cui l’antociano diventa incolore.

I fattori che influiscono sull’equilibrio che si instaura fra queste diverse forme della molecola

e sul suo colore sono il valore del pH, la temperatura e la quantità di anidride solforosa libera

all’interno del vino. In condizioni acide prevale la forma cationica flavilio, mentre a un

incremento del pH segue un incremento della porzione di antocianine in forma chinoidale, di

colore blu violetto. (14-17).

Degradazione delle antocianine. Come sopra riportato, le antocianine nei vini rossi non sono

particolarmente stabili, e la loro concentrazione spesso diminuisce drasticamente nei vini

5

invecchiati in bottiglia o in barrique. Dopo alcuni anni d’invecchiamento, nonostante il colore

del vino rimanga di tonalità rossa, le antocianine monomeriche non sono più presenti. Tale

fenomeno è dovuto alle reazioni di polimerizzazione o ad altre reazioni che modificano le

antocianine monomeriche che si trasformano in composti diversi da quelli originariamente

presenti nel vino.

Generalmente la stabilità delle antocianine monomeriche dipende da vari fattori, quali: la loro

concentrazione all’interno del vino, la struttura, il pH del vino, il tempo e la temperatura a cui

il vino è sottoposto durante il periodo d’invecchiamento, lo stato di ossidazione, l’esposizione

alla luce, la presenza di altre sostanze all’interno del vino (come acido ascorbico, zucchero,

solfiti, cofattori e ioni metallici).

Normalmente, le antocianine sono più stabili in mezzo acido che in un mezzo alcalino. Il vino

giovane ha un pH basso, per questo motivo gli antociani gli conferiscono un colore rosso

vivace. Quando il vino invecchia, la diminuzione dell’acidità e la contemporanea ossidazione

degli antociani fanno emergere tonalità grigie, che combinandosi con il rosso chiaro danno

origine a sfumature aranciate; la tendenza al colore aranciato è un fenomeno caratteristico del

vino spumante Cruasè. Inoltre la stabilità delle antocianine è elevata a basse temperature,

l’esposizione alla luce promuove il loro processo di degradazione e la presenza di acido

ascorbico e zuccheri produce un decremento di stabilità della struttura antocianica. (18-20).

Influenza delle pratiche enologiche sugli antociani del vino. La concentrazione delle

antocianine monomeriche presenti all’interno del vino dipende da diversi fattori derivanti dal

metodo di vinificazione, quali la varietà dell’uvaggio impiegato, le condizioni di macerazione,

l’uso di enzimi, la temperatura di macerazione e di fermentazione.

La macerazione a basse temperature (comprese tra 5 e 15 °C) permette l’estrazione di

pigmenti, tannini e aromi che passano dalla buccia dell’uva al vino. L’estrazione di questi

composti avviene in assenza di etanolo, poiché le basse temperature causano l’inibizione

dell’azione dei lieviti vinari, impedendo l’inizio della fermentazione alcolica. L’estrazione

degli antociani dalle bucce dell’uva durante la macerazione dipende pertanto dalla

temperatura, dal grado alcolico e dai livelli di anidride solforosa.(21-22)

L’aggiunta di enzimi pectolitici durante la macerazione può facilitare l’estrazione degli

antociani, con un conseguente incremento del colore. Gli enzimi provocano la rottura delle

pectine presenti nella parete cellulare dell’uva, questo processo libera gli antociani e altri

composti fenolici, anch’essi inclusi nella parete cellulare (7, 23)

6

VINO SPUMANTE CRUASE’

Il termine Cruasé è un neologismo formato dalla fusione delle due parole “cru” (selezione) e

“rosé” con l’interposizione di una “a” che funge da congiunzione. Il termine “Cruà” era

l’antico nome del vitigno/vino prodotto di eccellenza in Oltrepò Pavese nel XVIII secolo.

Unendo le due espressioni “Cruà” oppure “cru” e “rosé” è stato coniato il termine “Cruasé”. Il

marchio è di proprietà del Consorzio dell’Oltrepò Pavese e la produzione del vino Cruasè è

regolamentata da un disciplinare di produzione che 1) prevede l’uso di un minimo pari all’85

% di uve di Pinot Nero a denominazione di origine controllata, 2) indica che il vino è ottenuto

mediante metodo classico e 3) vi deve essere un affinamento sui lieviti della durata di almeno

24 mesi (8).

Poiché, come sopra riportato, i dati di mercato suggeriscono che il vino di qualità è quello che

nel futuro verrà maggiormente consumato, l’ottenimento di vini di qualità dovrebbe essere il

principale obiettivo delle aziende vitivinicole, indipendentemente dalle dimensioni, dal

prodotto lavorato, dalla fascia di mercato occupato e dalla localizzazione geografica. Per

produrre vino di qualità tutte le fasi del processo produttivo, dalla coltura della vite alla

vendita, dovrebbero essere attentamente monitorate, con il fine di ottimizzare le proprietà

sensoriali e quindi aumentare l’affezione dei consumatori nei confronti del prodotto vino.

Il presente lavoro di tesi si colloca nell’ambito degli studi volti a migliorare una delle più

importanti caratteristiche sensoriali del vino spumante Cruasè DOCG, che è rappresentata dal

colore. In particolare, è noto che i diversi ceppi di lievito, utilizzati per la seconda

fermentazione, finalizzata alla produzione del vino spumate, presentano caratteristiche

genetiche eterogenee, che si ripercuotono per esempio a livello della struttura della parete

cellulare del lievito, influenzando le loro caratteristiche adsorbenti nei confronti delle

antocianine responsabili del colore rosato del prodotto finito. Pertanto lo scopo della presente

ricerca è monitorare, durante rifermentazioni in provetta, il potere adsorbente esercitato dai

lieviti vinari sugli antociani presenti nel vino con la finalità di scegliere i lieviti che

permettono, alla fine del processo di vinificazione, di ottenere un vino caratterizzato dal

colore tipico del Cruasè.

7

MATERIALI E METODI

Lieviti. In questa sperimentazione sono stati presi in considerazione tre lieviti starter

commerciali (S1, S2 e S3) comunemente impiegati nelle rifermentazioni vinarie per la

produzione dello spumate metodo classico. I ceppi, appartenenti alla specie Saccharomyces

cerevisiae, provengono dal laboratorio di microbiologia dell’Università di Milano presenti

nella collezione del Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente.

Rivitalizzazione dei ceppi starter selezionati. I tre ceppi di Saccharomyces cerevisiae,

conservati alla temperatura di -80°C, una volta scongelati e portati a temperatura ambiente,

sono stati coltivati in piastre Petri contenenti terreno Wallister’s Laboratory Oxoid (WL) e

messe a incubare per 48 h a 25 °C (tabella 1). Le colonie di lievito cresciute in piastra

vengono prelevate in condizioni sterili e poste in 20 ml di brodo (YEPD) (tabella 2). Il terreno

di crescita inoculato con il microrganismo viene posto in termostato a 25 °C per due giorni.

Al termine dell’incubazione, l’inoculo è sottoposto a misura della densità ottica (OD) a 660

nm, per valutarne la densità di popolazione iniziale.

Tabella 1. Composizione del terreno Wallister’s Laboratory Oxoid (WL) e valore di pH.

Composizione terreno colturale WL (mg/l)

Estratto di lievito

Caseina idrolizzata

Glucosio

Potassio diidrogenofosfato

Cloruro di potassio

Cloruro di calcio

Solfato di magnesio

Cloruro di ferro

Verde di bromo cresolo

Agar

pH 5,5

4000,0

5000,0

50000,0

550,0

425,0

125,0

125,0

2,5

22,0

17000,0

8

Tabella 2. Composizione mezzo colturale Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD) e

valore di pH.

Composizione mezzo colturale YEPD (g/l)Estratto di lievito Peptone Glucosio Cloramfenicolo Acqua distillata.pH 5,5

1020200,1q.b

Aggiunta di elementi nutritivi al vino base e filtrazione. Per la micro-rifermentazione è

stato utilizzato un vino base per la produzione di spumante Cruasè, prodotto a seguito della

vendemmia 2012 presso la cantina di micro-vinificazione del Centro di ricerca, formazione e

servizi della vite e del vino Riccagioia S.C.p.A. Per favorire l’avvio della rifermentazione, al

vino base è stato addizionato, quale sostanza nutritiva necessaria alla crescita dei lieviti,

zucchero, aggiunto in quantità tale da permettere il raggiungimento all’interno delle provette

di una pressione di 5-6 atmosfere (24g/l di zucchero). Per prevenire contaminazioni

batteriche, il campione di vino è stato sottoposto a filtrazione su membrana di nitrocellulosa

Whatman con pori del diametro di 0,45 µm, posizionata all’interno di un dispositivo di

filtrazione a vuoto (Sartotius Sartolab RF/BT).

Successivamente, sono state aggiunte al campione di vino: 1) una miscela di vitamine,

appartenenti principalmente ai gruppi D e B, nella quantità di 1 ml/l; e 2) 3 g/l di ammonio

solfato.

La miscela di vitamine ha la seguente composizione:

D-biotina 0,05 g/l,

Ca-D-pantotenato 1,00 g/l,

acido nicotinico 1,00 g/l,

mio-inositolo 25,00 g/l,

tiamina cloridrato 1,00 g/l,

piridossale cloridrato 1,00 g/l,

acido p-aminobenzoico 0,20 g/l.

Preparazione della miscela di vitamine. La biotina è sciolta in 10 ml di NaOH 0,1 M e

diluita con acqua distillata fino a un volume pari 0,75 l. Il pH deve avere un valore di 6,5. A

questo punto vengono aggiunte tutte le altre componenti della miscela sopra citate. Viene

aggiunta ulteriormente acqua fino ad arrivare al volume di 1l. La soluzione è filtrata mediante

filtri sterili, infine la soluzione risultante viene conservata alla temperatura di 4°C.

9

Inoculo dei ceppi starter di lievito nel campione di vino. 400 ml di vino base,

precedentemente addizionati di zucchero, vitamine e ammonio solfato, come sopra riportato,

sono stati suddivisi in quattro aliquote: alla prima aliquota, a sua volta ripartita in quattro

provette di vetro Pirex con tappo a vite, non è stato addizionato lievito (controllo negativo),

mentre alle restanti tre aliquote (anch’esse suddivise in 4 provette) sono stati inoculati i tre

differenti ceppi di lievito selezionati (106 UFC/ml). Tutti i campioni così preparati sono stati

posti in termostato a 18 °C al riparo dalla luce per 9 giorni. Le analisi microbiologiche

(determinazione della densità ottica a 660 nm, conta diretta al microscopio ottico e conta in

piastra) e le analisi chimiche (determinazione degli antociani totali e analisi del colore)

finalizzate alla determinazione dell’adsorbimento da parte dei lieviti delle antocianine, sono

state eseguite ai tempi t0= 0 giorni, t1= 1giorno t2= 3 giorni, t3= 6 giorni e t4= 9 giorni.

E’ stata quindi condotta una successiva prova in cui al vino base è stato addizionato il ceppo

di Saccharomyces cerevisiae (S2), che nelle prove precedenti presentava il minor potere

adsorbente nei confronti delle antocianine. In questa seconda fase della sperimentazione le

analisi microbiologiche (determinazione della densità ottica a 660 nm, conta diretta al

microscopio ottico e conta in piastra) e le analisi chimiche (determinazione delle antocianine

mediante metodo RP-HPLC-UV-Vis, come riportato nel Compendium of International

Methods of Analysis-OIV (25), e analisi del colore) sono state eseguite ai tempi t0= 0 giorni,

t1= 7 giorni, t2= 14 giorni, t3= 21 giorni, t4= 28 giorni, t5= 61 giorni, t6= 91 giorni.

SAGGI MICROBIOLOGICI

Misura della vitalità. La vitalità dei lieviti è stata valutata tramite conta al microscopio. Il

vetrino viene preparato con soluzioni coloranti a base di blu di metilene. 1ml di campione è

stato risospeso in 1ml di soluzione colorante, la cui composizione è riportata in tabella 3.

Dopo 10 minuti, 10 µl di tale soluzione sono stati posti nella camera di conta di Thoma. Al

microscopio ottico, con ingrandimento 40x , vengono contate le cellule di lievito vive,

bianche, distinguendole da quelle morte, blu.

Tabella 3. Composizione della soluzione di blu di metilene.

Soluzione blu di metilene (g/l)Blu di metilene KH2PO4

NA2HPO4 Acqua distillata q.b.

0,20027,2000,071

10

Conta della concentrazione cellulare

I campioni vengono diluiti opportunamente dapprima con acqua peptonata (la cui

composizione è descritta in tabella 4) e in seguito distribuiti uniformemente per spatolamento

su terreno WL .

Per il calcolo della concentrazione cellulare si contano sulle piastre, incubate per tre giorni a

25°C, le unità formanti colonie (UFC) e viene applicata la seguente formula:

UFC/ml= ΣC / (1*n1 + 0.1 *n2) d

Dove:

ΣC = somma del numero di colonie delle piastre contabili

n1 = numero di piastre contabili nella prima diluizione

n2 = numero di piastre contabili nella seconda diluizione

d = rappresenta la prima diluizione in cui si riscontra la prima piastra contabile.

Si considerano contabili le piastre che hanno un numero di colonie compreso tra 10 e 300.

Tabella 4. Composizione dell’acqua peptonata e relativo valore di pH.

Composizione del mezzo acqua peptonata

(g/l)

Triptone NaCl Acqua distillata .pH 7,2

105q.b.

Densità ottica

È stata effettuata una misurazione della densità ottica a λ 660 nm, per valutare la densità di

popolazione dei lieviti.

Questa misura è effettuata mediante Spettrofotometro UV/VIS Lambda 35 PerkinEImer.

Il campione viene posizionato in cuvette di plastica con camino ottico da 1cm.

Al fine di effettuare le analisi chimiche ad ogni tempo di monitoraggio i campioni sono stati

centrifugati a 4000 rpm per 20 min (centrifuga Sigma D-37520); in questo modo i lieviti

precipitano sul fondo sotto forma di pellet cellulare, per cui si ha la possibilità di separare i

lieviti dal resto del vino (surnatante).

ANALISI CHIMICHE

Analisi del colore del vino. Tutti i campioni preparati nella prima e seconda fase della

sperimentazione sono stati sottoposti alla determinazione del colore che è stata effettuata

mediante misura spettrofotometrica (Spettrofotometro UV/VIS Lambda 35 PerkinEImer), con

il programma Wine Color Analysis in dotazione allo strumento. Tale programma misura

11

l’assorbanza a 420 nm, 520 nm, 620 nm, corrispondenti rispettivamente ai colori

complementari giallo, rosso e blu. I campioni di vino sono stati analizzati in cuvette con

cammino ottico da 1 cm effettuando una scansione da 780 nm a 380 nm. Sono stati analizzati

sia i campioni di vino a cui non erano stati addizionati lieviti (controlli negativi) sia i

campioni di vino inoculati con i tre ceppi di lievito utilizzati nel progetto. Le analisi sono state

condotte sul surnatante ottenuto dopo centrifugazione del campione.

Analisi del colore dei lieviti. I campioni ottenuti nella seconda fase di sperimentazione, al

termine del rispettivo periodo di monitoraggio, sono stati sottoposti a centrifugazione a 4000

rpm per 20 min. Il precipitato, separato dal surnatante, è costituito dai lieviti. Tale precipitato

è stato ripreso con 1 ml di soluzione tampone a pH 7 (sale triptone) e la sospensione così

ottenuta è stata posta su un disco di carta da filtro Whatman. Il filtro è asciugato parzialmente

a t.a. fino a quando il campione raggiunge una compattezza pastosa che permette di effettuare

le analisi colorimetriche utilizzando la sfera integratrice del colore associata allo

spettrofotometro Lambda 35. La sfera è un apparato che consente di misurare la trasmittanza

(definita riflettanza) della luce su materiali opachi e si compone di un volume sferico, bianco

internamente e altamente riflettente, che ha la funzione di riflettere e moltiplicare il raggio

luminoso riflesso da un corpo opaco e ne permette la misura del colore.

Determinazione degli antociani totali. Tutti i campioni derivanti dalla prima fase della

sperimentazione sono stati sottoposti ad analisi per la determinazione del contenuto di

antociani totali. L’analisi è stata effettuata mediante l’analizzatore enologico automatico

multiparametrico Wineflow (Gibertini s.r.l., Novate Milanese), che permette la

determinazione degli antociani totali (espressi in mg/l), presenti nel vino, mediante analisi

spettrofotometrica secondo il metodo ufficiale OIV (25). Le prove sono state effettuate sia sul

vino tal quale sia su campioni di vino addizionati con antociani commerciali utilizzati nelle

pratiche di cantina.

Analisi RP-HPLC-UV-Vis. L’analisi cromatografica è stata eseguita sui surnatanti ottenuti

dai campioni preparati nella seconda fase della sperimentazione dopo centrifugazione a 4000

rpm per 20 minuti. Le analisi sono state condotte impiegando un sistema HPLC MERCK

HITACHI serie L, modulare, con pompa L-6200 e detector UV-Visibile L-4200, fornita di

integratore D-2500. La separazione cromatografica è stata condotta su colonna Purospher Star

RP-18 encapped 5μm, mediante eluizione in gradiente, come riportato in Tabella 5, a flusso

pari a 0,8 ml/min e utilizzando una fase mobile binaria costituita da una soluzione acquosa di

12

acido formico al 10% e da acetonitrile. I cromatogrammi sono stati registrati a λ 516 nm. Il

volume di campione iniettato è pari a 20 µl.

Tabella 5. Programma di eluizione in gradiente.

Tempo (min) Solvente A % Solvente B %

0 94 6

15 70 30

30 50 50

35 40 60

41 94 6

soluzione A = miscela di acqua,acido formico e acetonitrile in proporzione 87:10:3 (v/v/v)

soluzione B = miscela di acqua, acido formico e acetonitrile in proporzione 40:10:50 (v/v/v).

13

RISULTATI E DISCUSSIONE

Nella fase iniziale della ricerca il vino base, comunemente utilizzato per la preparazione dello

spumante Cruasè DOCG mediante metodo classico, è stato inoculato con tre differenti ceppi

di Saccharomices cerevisiae, scelti tra quelli maggiormente impiegati in enologia nella fase di

rifermentazione. I campioni ottenuti come riportato in Materiali e Metodi sono stati sottoposti

ad analisi microbiologiche e chimiche a intervalli di tempo definiti, al fine di monitorare

l’adsorbimento da parte dei lieviti delle antocianine, responsabili del colore rosato del vino

oggetto di studio.

Nelle prove preliminari la rifermentazione è stata monitorata per un periodo di nove giorni e

le analisi sono state eseguite all’inizio della rifermentazione (cioè all’atto dell’inoculazione

della coltura starter), dopo 1, 3, 6 e 9 giorni (t0, t1, t2, t3, t4 ).

Per quanto riguarda le analisi microbiologiche, volte alla valutazione della concentrazione

microbica e della vitalità del lievito, sono stati eseguiti tre differenti saggi: determinazione

della densità ottica a 660 nm, conta diretta al microscopio ottico e conta in piastra.

La densità ottica dei campioni analizzati, riportata in tabella 6 e in figura 1, aumenta

all’aumentare della durata della rifermentazione, a indicare un aumento della concentrazione

microbica.

Poiché tale saggio non permette di discriminare le cellule vive da quelle morte, la ricerca è

proseguita con la conta diretta al microscopio ottico e la conta in piastra. I dati ottenuti sono

riportati nelle tabelle 7 e 8 e nelle figure 2 e 3. I risultati della conta diretta al microscopio

indicano un decremento della vitalità cellulare al termine del monitoraggio (9 giorni) del 20%

circa con un concentrazione microbica media, calcolata mediante conta in piastra, pari a circa

7,9 105 UFC/ml.

Tabella 6. Densità ottica misurata a λ 660 nm.

S. cerevisiae Densità ottica (OD/ml) 660nm

Ceppo t0 t1 t2 t3 t4

S1 0,5 0,9 1,0 2 2,9

S2 0,5 0,9 1,9 2,7 4,5

S3 0,5 1,2 1,6 2,2 3,8

14

Figura 1. Densità ottica misurata a λ 660 nm.

DENSITA' OTTICA

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

t0 t1 t2 t3 t4

TEMPO

OD

66

0 n

m S1

S2

S3

Tabella 7. Vitalità cellulare, espressa in valore percentuale.

S. cerevisiae Vitalità cellulare (%)

ceppo t0 t1 t2 t3 t4

S1 100 81,8 84,0 81,7 77,5

S2 100 91,3 84,5 87,0 83,0

S3 100 89,8 86,2 86,0 81,0

Figura 2. Vitalità cellulare, espressa in valore percentuale.

VITALITA'

50556065707580859095

100

t0 t1 t2 t3 t4

TEMPO

% D

I V

ITA

LIT

A'

S1

S2

S3

15

Tabella 8. Concentrazione cellulare, espressa in unità formanti colonie/ml.

S. cerevisiae Concentrazione cellulare (UFC/ml)

Ceppo t0 t1 t2 t3 t4

S1 7,0 106 9,8 105 6,3 105 8,0 105 7,3 105

S2 7,0 106 2,5 105 1,6 105 1,2 106 6,9 105

S3 7,0 106 2,1 105 1,1 105 8,3 105 9,5 105

Figura 3. Concentrazione cellulare, espressa in unità formanti colonie/ml.

CONCENTRAZIONE CELLULARE

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

t0 t1 t2 t3 t4

TEMPO

UF

C/m

l S1

S2

S3

Per quanto riguarda le analisi chimiche, relativamente alla determinazione degli antociani

totali (tabella 9 e figura 4), la loro concentrazione, espressa in mg/l, decresce all’aumentare

del tempo di rifermentazione già nel controllo negativo, nonostante l’assenza di lievito.

Questo fenomeno può essere spiegato con la nota instabilità chimica delle antocianine.

In presenza dei tre ceppi di lievito il contenuto di antociani totali decresce ulteriormente a

conferma dell’effetto adsorbente da questi esercitato sulla componente antocianica, con i

ceppi S1 e S3 che presentano la maggiore attività adsorbente.

Relativamente alla determinazione del colore, effettuata mediante misura spettrofotometrica

tramite il programma Wine Color Analysis, i risultati, riportati in tabella 10 e figura 5 e

corrispondenti alla media delle assorbanze determinate a 420 nm, 520 nm, 620 nm, indicano

che l’intensità del colore rosso del vino rifermentato diminuisce in presenza di tutti i tre ceppi

selezionati con una maggiore diminuzione per i ceppi S1 e S3, che avevano già nella 16

precedente prova dimostrato il maggior potere adsorbente. Per quanto riguarda il colore blu e

giallo non si evidenziano differenze significative né in relazione alla presenza del lievito né in

funzione del tempo di rifermentazione.

Tabella 9. Misura degli antociani totali, espressa in mg/l.

Durata

monitoraggio

S. cerevisiae

Ceppo

Antociani totali

(mg/l*)

t1 S1 122,2

S2 139,1

S3 115,1

Controllo negativo 144,9

t2 S1 116,0

S2 130,9

S3 107,8


t3 S1 108,1

S2 123,3

S3 99,3


t4 S1 106,2

S2 121,0

S3 101,1


(* = deviazione standard inferiore al 3%)

Figura 4. Misura degli antociani totali, espressa in mg/l.17

ANTOCIANI TOTALI

020406080

100120140160

S1 S2 S3 S1 S2 S3 S1 S2 S3 S1 S2 S3

t1 t2 t3 t4

TEMPO

CO

NC

. (m

g/l

)

c.negativi

surnatanti (vino)

Tabella 10. Determinazione del colore del vino, assorbanze misurate a nm

Durata

monitoraggio

S. cerevisiae

Ceppo

420nm* 520nm* 620nm

t1 S1 6,4862 12,0473 1,1338

S2 7,1756 13,5520 1,2659

S3 6,2284 11,1851 0,9840

controllo negativo 7,6180 15,7400 0,9400

t2 S1 7,0794 12,3293 1,6507

S2 7,7538 13,6326 1,6851

S3 7,1578 11,8899 1,7270


t3 S1 6,9245 11,8679 1,3135

S2 7,5456 12,9121 1,4596

S3 6,9713 11,2733 1,5262


t4 S1 7,0060 11,4983 1,3302

S2 7,5621 12,4269 1,4759

S3 6,6805 10,6630 1,1950


( * = deviazione standard inferiore al 3%)

Figura 5. Determinazione del colore del vino, assorbanze misurate a

nm.

18

COLORE

02468

1012141618

cont

r. n

eg S1

S2

S3

cont

r. n

eg S1

S2

S3

cont

r. n

eg S1

S2

S3

cont

r. n

eg S1

S2

S3

t1 t2 t3 t4

TEMPO

AS

SO

RB

AN

ZE

(n

m)

420

520

620

Nella seconda fase della sperimentazione è stato selezionato il ceppo di lievito che nelle prove

preliminari aveva presentato il minor potere adsorbente. In questo caso la durata della

rifermentazione è stata pari 91giorni.

Per quanto riguarda le analisi microbiologiche sono stati eseguiti, anche in questa fase i tre

differenti saggi di determinazione della densità ottica a 660 nm, conta diretta al microscopio

ottico e conta in piastra.

La densità ottica dei campioni analizzati, riportata in tabella 11 e in figura 6, aumenta

all’aumentare della durata della rifermentazione, a indicare un aumento della concentrazione

microbica.

Tabella 11. Densità ottica misurata a λ 660 nm.

Densità ottica (OD/ml) 660 nm

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

0,25 0,40 0,33 0,30 0,40 0,43 0,44

Figura 6. Densità ottica misurata a λ 660 nm.

19

DENSITA' OTTICA

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

TEMPO

OD

660

nm

La ricerca è proseguita con la conta diretta al microscopio ottico e la conta in piastra. I dati

ottenuti sono riportati nelle tabelle 12 e 13 e nelle figure 7 e 8. I risultati della conta diretta al

microscopio indicano un decremento della vitalità cellulare al termine del monitoraggio (91

giorni) del 40% circa con un concentrazione microbica media, calcolata mediante conta in

piastra, pari a circa 1,5 104 UFC/ml.

Tabella 12. Vitalità cellulare, espressa in valore percentuale.

Vitalità cellulare (%)

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

100 92 85 82 81 72 63

Per quanto riguarda le analisi chimiche, relativamente alla determinazione del colore (tabella

9 e figura 9), i risultati corrispondenti alle assorbanze medie determinate a 420 nm, 520 nm,

620 nm indicano che l’intensità del colore rosso del vino rifermentato diminuisce all’atto

dell’inoculo del lievito, quindi rimane costante per i primi 21 giorni di incubazione per poi

tornare a decrescere con una diminuzione alla fine del processo del 27 % circa. Per quanto

riguarda il colore giallo non si evidenziano differenze significative tra il controllo negativo e

il campione fino al tempo t3 pari a 21 giorni di incubazione, dopodichè il colore giallo

decresce del 22 % circa al termine del monitoraggio. Infine, per quanto riguarda il colore blu,

non si evidenziano differenze significative tra i valori di assorbanza registrati tra i controlli

negativi e quelli registrati per i campioni di vino rifermentati, a suggerire che la presenza di

lievito non influenza questo colore.

20

Figura 7. Vitalità cellulare, espressa in valore percentuale.

VITALITA'

0

20

40

60

80

100

120

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

TEMPO

% D

I V

ITA

LIT

A'

Tabella 13. Concentrazione cellulare, espressa in unità formanti colonie/ml.

Concentrazione cellulare (UFC/ml)

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

1,06 106 1,50 106 6,8 105 1,6 104 1,59 104 1,53 104 1,50 104

Relativamente alle prove condotte mediante la sfera integratrice, dal grafico riportato in figura

10, si evince che i lieviti isolati nel precipitato e quindi risospesi mostrano uno spettro di

assorbimento nel visibile in cui il massimo di riflettanza è spostato verso λ più elevate

corrispondenti al colore blu-violetto, a dimostrazione del fatto che i lieviti modificano la

composizione antocianica del vino durante la fermentazione.

I campioni ottenuti nella seconda fase della sperimentazione sono stati analizzati anche

mediante metodo cromatografico HPLC. Il cromatogramma del vino base presenta i picchi

corrispondenti ai tre principali antociani presenti nel vino: malvidina-3-O-glucoside,

peonidina-3-O-glucoside, cianidina-3-O-glucoside, riconosciuti mediante confronto dei tempi

di ritenzione dei corrispondenti composti standard e utilizzando il metodo delle aggiunte

standard (figura11).

Figura 8. Concentrazione cellulare, espressa in unità formanti colonie/ml.

21

CONCENTRAZIONE CELLULARE

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

TEMPO

UF

C/m

l

Tabella 14. Determinazione del colore del vino, assorbanze misurate a

Durata

monitoraggio campione 420nm* 520nm* 620nm*

t0

c.neg 7,86 14,00 1,51

camp 7,59 11,40 1,48

t1

c.neg 7,55 13,84 1,33

camp 7,55 11,51 1,14

t2 c.neg 7,49 13,01 1,35

camp 7,43 11,50 1,10

t3 c.neg 7,42 12,56 1,30

camp 7,37 11,30 1,10

t4 c.neg 7,32 12,50 1,42

camp 6,56 10,39 1,20

t5 c.neg 7,24 12,33 1,40

camp 6,25 10,35 1,20

t6 c.neg 5,64 8,99 1,11

camp 5,90 8,26 1,05


Figura 9. Determinazione del colore del vino, assorbanze misurate a

22

COLORE

02468

10121416

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

TEMPO

AS

SO

RB

AN

ZE

(n

m)

420

520

620

Il dosaggio delle singole antocianine dei campioni di vino rifermentati è stato effettuato

mediante il metodo dello standard esterno, utilizzando soluzioni a titolo noto di antociani

standard e costruendo rette di taratura per ciascuno degli antociani analizzati.

Il coefficiente di correlazione delle tre rette di taratura, superiore 0,98 per i tre gli antociani

considerati indica che, nell’intervallo di concentrazioni saggiato, l’andamento della curva è

lineare (tabella 15).

I risultati delle analisi cromatografiche sono riportati in tabella 16 e in figura 12-13-14. La

concentrazione delle tre antocianine determinate nei campioni di vino rifermentati diminuisce

all’aumentare del tempo di incubazione del lievito.

E’ interessante osservare che in assenza di lievito (controllo negativo) la concentrazione delle

tre antocianine rimane costante per circa due mesi di monitoraggio (t5= 61 giorni) per poi

diminuire di oltre il 60%. Questo risultato oltre a confermare la nota instabilità chimica delle

antocianine libere, indica che nei primi due mesi di incubazione la diminuzione della

concentrazione delle antocianine è attribuibile esclusivamente all’effetto adsorbente esercitato

dal lievito. Comparando le concentrazioni delle tre antocianine rilevate al tempo t5 pari a 61

giorni di incubazione, si evince che le tre antocianine, indipendentemente dalla loro struttura

chimica sono ugualmente assorbite dalla parete del lievito.

Figura 10. Andamento del colore adsorbito dai lieviti analizzati con sfera integratrice

del colore, durante la rifermentazione dal tempo t0 fino al tempo t4.

23

Diversamente, dal confronto delle concentrazioni rilevate al termine del periodo di

incubazione, si evince che l’antocianina che viene meno assorbita dalla parete cellulare del

lievito è la peonidina-3-O-glucoside (3,5,7,4’-tetraidrossi-3’-metossiflavilio), con perdita pari

al 66 %, che presenta una idrofobia intermedia rispetto alla cianidina-3-O-glucoside

(3,5,7,3’,4’-pentaidrossiflavilio), che è quella maggiormente idrofila, e alla malvidina-3-O-

glucoside (3,5,7,4’-tetraidrossi-3’,5’-dimetossiflavilio) che è la molecala dotata di maggior

idrofobia.

Figura 11. Cromatogramma relativo al vino base ottenuto con RP-HPLC-UV-Vis.

24

450 780500 550 600 650 700 75010-3

5

-4-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

nm

%R

Verde= t0

Nero = t1

Blu = t2

Rosa = t3

Rosso= t4

25

min

Malvidina 3-O-glucoside

Cianidina

3-O-glucoside

Peonidina

3-O-glucoside

mAU

Tabella 15. Intervallo di concentrazione, equazioni delle rette di taratura e coefficienti di

correlazione calcolati per: malvidina-3-O-glucoside, peonidina-3-O-glucoside e

cianidina-3-O-glucoside.

Std Malvidina tempo ritenzione

(min)

int. di conc.

(mg/l)

equazione curve R2

1:100 29,49 5 Y=43015x+64837 0,9819

1:50 29,51 10 Y=43015x+64837 0,9819

1:20 29,49 25 Y=43015x+64837 0,9819

1:10 29,60 50 Y=43015x+64837 0,9819

Std. Peonidina tempo ritenzione

(min)

int. di conc.

(mg/l)

equazione curve R2

1:1000 28,94 0,25 y=54558x-1630 0,9998

1:150 28,88 1,67 y=54558x-1630 0,9998

1:100 28,83 2,50 y=54558x-1630 0,9998

1:10 28,92 25 y=54558x-1630 0,9998

Std. Cianidina tempo ritenzione

(min)

int. di conc.

(mg/l)

equazione curve R2

1:1000 22,51 0,1 Y=56852x+3447,2 0,9956

1:100 22,65 1 Y=56852x+3447,2 0,9956

1:50 22,81 2 Y=56852x+3447,2 0,9956

1:10 22,69 10 Y=56852x+3447,2 0,9956

26

Tabella 16. Concentrazione delle antocianine durante la rifermentazione e perdita

percentuale rispetto al controllo negativo.

Durata monitoraggio Concentrazione (mg/l)

Malvidina

(*)

perdita

%

Peonidina

(*)

perdita % Cianidina

(*)

perdita %

t0 23,71 13 1,70 10 0,69 9

Controllo negativo t0 27,22 1,88 0,76

t1 21,42 20 1,42 10 0,61 21


t2 19,56 28 1,30 30 0,55 26


t3 18,93 30 1,27 32 0,49 34


t4 16,79 34 1,15 36 0,44 38


t5 11,90 53 0,88 53 0,33 52


t6 0,28 97 0,23 66 0,00 100



27

Figura 12. Concentrazioni dell’antocianina malvidina-3-O-glucoside.

MALVDINA

05

1015202530

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

TEMPO

CO

NC

. (m

g/l

)

MALV

Figura 13. Concentrazioni dell’antocianina peonidina-3-O-glucoside.

PEONIDINA

0

0,5

1

1,5

2

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

TEMPO

CO

NC

. (m

g/l

)

PEO

Figura 14. Concentrazioni dell’antocianina cianidina-3-O-glucoside.

CIANIDINA

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

neg

cam

p

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

TEMPO

CO

NC

. (m

g/l

)

CIAN

28

CONCLUSIONI

In conclusione, il presente lavoro di tesi ha permesso di dimostrare che il colore del vino

spumante Cruasè DOCG è influenzato dal ceppo di lievito impiegato durante la fase di

rifermentazione.

In particolare, mentre il colore blu, registrato a 620 nm, rimane pressoché inalterato, il colore

rosso e il colore giallo diminuiscono. Tale risultato è confermato dall’analisi cromatografica

delle principali antocianine del vino spumante Cruasè, che indica che la concentrazione di

malvidina-3-O-glucoside, peonidina-3-O-glucoside e cianidina-3-O-glucoside diminuisce di

oltre il 60 % alla fine del monitoraggio.

Indagini sono attualmente in corso sia per identificare le sostanze che si formano a partire

dalle antocianine che si degradano durante la rifermentazione, sia per caratterizzare a livello

molecolare i tre lieviti impiegati.

29

BIBLIOGRAFIA1) http://www3.istat.it/istat/eventi/2010/DOP/relazione_FabioDelBravo.pdf 2) Galletto L., Boatto V. “La conoscenza, il consumo e l’acquisto di vino rosato: i risultati di un’ indagine

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Tesi 21 marzo

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