UNIVERSIDADE DE SO PAULO

INSTITUTO DE QUMICA Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas (Bioqumica)

GRAZIELLA ELIZA RONSEIN

Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no

estado singlete [O2 (1g)]: estudos mecansticos

envolvendo marcao isotpica, espectrometria de

massa e quimiluminescncia

So Paulo

Data do Depsito na SPG: 31/03/2008

GRAZIELLA ELIZA RONSEIN

Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no

estado singlete [O2 (1g)]: estudos mecansticos

envolvendo marcao isotpica, espectrometria de

massa e quimiluminescncia

Tese apresentada ao Instituto de Qumica da

Universidade de So Paulo para obteno do

Ttulo de Doutor em Cincias (Bioqumica)

Orientador: Prof. Dr. Paolo Di Mascio

So Paulo 2008

Graziella Eliza Ronsein

Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no estado singlete

[O2(1g)]: estudos mecansticos envolvendo marcao isotpica,

espectrometria de massa e quimiluminescncia

Tese apresentada ao Instituto de Qumica da

Universidade de So Paulo para obteno do

Ttulo de Doutor em Cincias (Bioqumica).

Aprovado em: ____________ Banca Examinadora Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituio: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituio: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituio: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituio: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituio: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Aos meus pais, pelo exemplo

de integridade, perseverana e trabalho.

Pelo apoio incondicional e dedicao constante.

Ao Mau, pelas discusses cientficas, incentivo, apoio,

experimentos at tarde da noite e nos fins de semana,

pelas corridas, mergulhos, viagens e trilhas.

Por me fazer mais feliz.

AGRADECIMENTOS

vida, pelas oportunidades constantes de crescimento e aprendizado.

Ao Prof. Dr. Paolo Di Mascio pela oportunidade oferecida, respeito,

confiana depositada, pacincia, pelas brincadeiras e pela amizade.

Profa. Dra. Sayurinha, o lrio que no sabe dizer no.

Profa. Dra. Marisa pelas crticas construtivas e apoio.

Aos Professores Dr. Josef Wilhelm Baader e Dr. Luiz Henrique

Catalani por me aceitarem em suas disciplinas, as quais foram essenciais

para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Etelvino Bechara pelo exemplo de competncia profissional.

Aos colegas de laboratrios Agda, Izaura, Ivone, Thas, Lys, Kerolyn,

Flvia, Z, Fernando (o monstro da Bioqumica), Miriam, Janice, Lydia,

Patrcia, Tatiana, Camila, Lvea, Osmar, Rafael e Ale pela convivncia e

pelos momentos agradveis de descontrao.

F, pela competncia como tcnica do espectrmetro de massa e pela

grande amizade.

Fef, pela amizade e companheirismo nesta paulicia desvairada.

Aos meus irmos, Juanna e Giovanni pelo apoio, carinho, cumplicidade e

amizade.

APOIO FINANCEIRO

FAPESP Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo.

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico.

CNPq Instituto do Milnio Redoxoma.

Agradecimento especial FAPESP pela bolsa concedida e pelo financiamento do

projeto de pesquisa.

" De tudo ficam trs coisas:

a certeza de que estou apenas comeando,

a certeza de que preciso continuar e

a certeza de que podemos ser interrompidos

antes de terminar.

Fazer da interrupo um caminho novo,

fazer da queda um passo de dana,

do medo uma escola,

do sonho uma ponte e

da procura um encontro.

E assim...ter valido a

pena existir"

Fernando Sabino

Resumo

RESUMO

Ronsein, G.E. Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no estado singlete [O2 (1g)]: estudos mecansticos envolvendo marcao isotpica, espectrometria de massa e quimiluminescncia. 2008. 141p. Tese Programa de Ps Graduao em Bioqumica, Instituto de Qumica, Universidade de So Paulo, So Paulo.

As protenas so consideradas importantes alvos para os oxidantes, devido abundncia em sistemas biolgicos e s altas constantes de reaes com estas espcies. Adicionalmente, tm-se demonstrado que o triptofano (W) um aminocido extremamente susceptvel a oxidao, inclusive pelo oxignio singlete (1O2). A reao do W com o 1O2 tem despertado o interesse de diversos pesquisadores. Recentemente, esta reao tem atrado mais ateno, uma vez que produtos de oxidao do W tais como N-formilquinurenina (FMK) e quinurenina (kn) tm sido associados com algumas condies patolgicas, tais como o desenvolvimento de catarata e a formao de agregados covalentes da superxido dismutase envolvidos na esclerose lateral amiotrfica. Entretanto, h poucos trabalhos enfocando detalhadamente as reaes, com estudos de estabilidade, identificao de subprodutos e propostas mecansticas. Desta forma, pretendemos com este trabalho contribuir no esclarecimento do mecanismo de oxidao do triptofano pelo 1O2, atravs da anlise e caracterizao de produtos de oxidao gerados. Com este intuito, dois hidroperxidos de triptofano ismeros (WOOH cis e trans, em relao ao grupamento carboxila) foram completamente caracterizados por anlises de HPLC/espectrometria de massa e RMN como os principais produtos de oxidao do W pelo 1O2. Estes hidroperxidos demonstraram ser relativamente estveis s temperaturas ambiente e fisiolgica, decompondo lentamente para os alcois correspondentes. O aumento do pH e/ou o aquecimento das solues contendo os WOOH leva a decomposio quimiluminescente dos WOOH FMK. Utilizando hidroperxidos isotopicamente marcados com [18O] (W18O18OH) foi possvel confirmar que a FMK formada durante esta decomposio era marcada com dois tomos de oxignio. Este resultado demonstra que os dois tomos da FMK so derivados do grupamento hidroperxido. Em adio, estas reaes so quimiluminescentes, sugerindo o envolvimento de um intermedirio dioxetano. Este mecanismo foi confirmado uma vez que o espectro de quimiluminescncia da decomposio dos WOOH pode ser sobreposto ao espectro de fluorescncia da FMK, inequivocamente identificado a FMK como a espcie emissora. Dioxindoilalaninas diastereoisomricas tambm foram caracterizadas como produtos de oxidao do triptofano pelo 1O2; uma possvel via radicalar foi excluda. Em suma, este estudo contribuiu na elucidao das bases qumicas envolvidas na oxidao do triptofano por 1O2, atravs da caracterizao dos produtos formados e da investigao detalhada dos mecanismos de decomposio destes produtos.

Palavras-chave: Oxignio singlete, oxidao do triptofano, marcao isotpica, espectrometria de massa, quimiluminescncia.

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Abstract

ABSTRACT

Ronsein, G.E. Tryptophan oxidation by singlet molecular oxygen [(O2 (1g): Mechanistic studies using isotopic labelling, mass spectrometry analysis and chemiluminescence. 2008. 141p. PhD Thesis - Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Qumica, Universidade de So Paulo, So Paulo.

Proteins have been considered important targets for reactive oxygen species. Indeed, tryptophan (W) has been shown to be a highly susceptible amino acid to many oxidizing agents, including singlet molecular oxygen (1O2). The reaction of 1O2 with W has long been a matter of concern, and has recently attracted considerably more attention because W-derived oxidation products such as N-formylkynurenine (FMK) and kynurenine (kn) have been associated with some pathological conditions such as the development of cataracts and the formation of covalent aggregates of superoxide dismutase, which has been implicated in amyotrophic lateral sclerosis. Despite the intense interest in the mechanism of W oxidation, there are a lot of gaps that remains to be elucidated. In this context, the current study was undertaken to investigate the chemical basis involved in W oxidation by 1O2. We are concerned about the chemistry of the initially formed hydroperoxides, their stability, further reactions and the mechanism leading to FMK conversion. With this purpose, two cis and trans tryptophan hydroperoxide (WOOH) isomers were completely characterized by HPLC/mass spectrometry and NMR analyses as the major W-oxidation photoproducts. Also, they were shown to be relatively stable at ambient and physiological temperatures, leading to a slow decomposition to the corresponding alcohols. Increasing the pH or heating the solutions gives rise to a luminescent decomposition of the WOOH to FMK. Using 18O-labeled hydroperoxides (W18O18OH), it was possible to confirm the formation of a two-oxygen-labeled FMK molecule derived from W18O18OH decomposition. This result shows that both oxygen atoms in FMK are derived from the hydroperoxide group. In addition, these reactions are chemiluminescent (CL), indicating a dioxetane cleavage pathway. This mechanism was confirmed since the CL spectrum of the WOOH decomposition matched the FMK fluorescence spectrum, unequivocally identifying FMK as the emitting species. Diastereoisomeric dioxindoyalanine were also characterized as oxidation products derived from the reaction of W with 1O2. The involvement of radicals in this reaction was excluded. In summary, this work offers further insights into the chemistry involved in W-oxidation, through the characterization of photoproducts and the detailed investigation about the decomposition mechanism of these products.

Keywords: Singlet oxygen, tryptophan oxidation, isotopic labelling, mass spectrometry, chemiluminescence.

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Abreviaturas e Siglas

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1g primeiro estado excitado do oxignio molecular (delta)1g+ segundo estado excitado do oxignio molecular (sigma) 18O istopo 18 do tomo de oxignio

3g- estado triplete do oxignio molecular (sigma) 5-OOH 3-hidroxi-5-colestano-6-ene-5-hidroperxido 6-OOH 3-hidroxicolestano-4-ene-6-hidroperxido 6-OOH 3-hidroxicolestano-4-ene-6-hidroperxido 7-OOH 3-hidroxicolestano-5-ene-7- hidroperxido 7-OOH 3-hidroxicolestano-5-ene-7-hidroperxido 8-oxodGuo 8-oxo-7,8-dihidro-2-desoxiguanosina

CI converso interna

CIEEL luminescncia induzida quimicamente pela troca de eltron (chemically

initiated electron exchange luminescence)

CIS cruzamento intersistemas

COSY Correlation Spectroscopy

D2O gua deuterada

DBA 9,10-dibromoantraceno

DHPN N,N-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3-(1,4-naftilideno)dipropanamida

DHPNO2 endoperxido do N,N-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3-(1,4-naftilideno)

dipropanamida

DiOia dioxindoilalanina - (R,S e R,R -amino-2,3-dihidro-3-hidroxi-2-oxo-1H-indol 3-cido propanico

DMN 1,4-dimetilnaftaleno

DMNO2 endoperxido do 1,4-dimetilnaftaleno

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Abreviaturas e Siglas

DMSO dimetilsulfxido

dOxa cido oxalrico

dOz 2,2-diamino-4[-(2-desoxi--eritro-pentafuranosil)amina]-5-(2H)-oxazolona DPA 9,10-difenilantraceno

DPAO2 endoperxido do 9,10-difenilantraceno

dSp espiroiminodihidantonas

EAS 9,10-dietilantraceno disulfonato

EASO2 endoperxido do 9,10-dietilantraceno disulfonato

ESI+ electrospray positivo

F0 fotossensibilizador no estado fundamental

F1* fotossensibilizador no estado singlete excitado

F3* fotossensibilizador no estado triplete excitado

FMK N-formilquinurenina

HETCORR Heteronuclear Correlation

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HOHICA 3-hidroxi-6-oxo-2,3,3,6,7,7-hexahidro-1H-indol-2-cido carboxilco HOMO orbital molecular ocupado mais alto (highest occupied molecular orbital)

HPLC cromatografia lquida de alta eficincia (high performance liquid

chromatography)

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

k constante de velocidade

kn quinurenina

LUMO orbital desocupado mais baixo (lowest unocuppied molecular orbital)

MRM modo de monitoramento de reaes mltiplas (multiple reaction monitoring)

MS espectrometria de massa

NDP 3,3-(1,4-naftilideno)dipropanoato de sdio

Abreviaturas e Siglas

NDPO2 endoperxido do 3,3-(1,4-naftilideno)dipropanoato de sdio

RMN ressonncia magntica nuclear

RO radical alcoxila

ROO radical peroxila

ROOH perxido orgnico

RV relaxao vibracional

S nmero quntico total de spin

S0 estado fundamental singlete

S1 estado excitado singlete

T1 estado triplete excitado

U.A. unidades arbitrrias

V0 velocidade inicial

W triptofano

WOH 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol

WOOH hidroperxido de triptofano - 2-carboxi-3a-hidroperoxi-1,2,3,3a,8,8a-

hexahidropirrolo[2,3-b]indol

ativao trmica coeficiente de absortividade molar comprimento de onda

Sumrio

SUMRIO

1 INTRODUO....................................................................................................................19

1.1 Oxignio ............................................................................................................................19

1.2 Oxignio singlete...............................................................................................................20

1.2.1 Estratgias para a identificao e deteco do 1O2 .........................................................21

1.2.2 Fontes de 1O2 ..................................................................................................................24

1.2.3 Alvos biolgicos do 1O2 .................................................................................................28

1.2.3.1 Reaes do 1O2 com o DNA........................................................................................29

1.2.3.2 Reaes do 1O2 com lipdeos .......................................................................................31

1.2.3.2.1 Oxidao dos cidos linolico e araquidnico .........................................................31

1.2.3.2.2 Oxidao do colesterol .............................................................................................31

1.2.3.3 Aminocidos e peptdeos como alvos para o 1O2 ........................................................33

1.2.3.3.1 Reao com resduos de tirosina ..............................................................................33

1.2.3.3.2 Reao com resduos de histidina.............................................................................34

1.2.3.3.3 Reao com resduos de metionina ..........................................................................35

1.2.3.3.4 Reao com resduos de cistena ..............................................................................36

1.2.3.3.5 Reao com resduos de triptofano...........................................................................37

1.3 Estudos envolvendo o mecanismo de decomposio do triptofano oxidado FMK........37

1.4 Estados excitados, dioxetanos e reaes quimiluminescentes...........................................39

1.4.1 Estados excitados............................................................................................................39

1.4.2 Decomposio unimolecular de 1,2-dioxetanos.............................................................40

1.4.3 Classificao das reaes quimiluminescentes ..............................................................41

1.4.4 Decomposio catalisada de perxidos ..........................................................................42

1.4.4.1 Catlise Intermolecular................................................................................................42

1.4.4.2 Catlise Intramolecular................................................................................................43

1.5 Propagao do dano e conseqncias biolgicas da oxidao de resduos de aminocidos

em protenas.............................................................................................................................43

1.5.1 Modificaes oxidativas em protenas: um enfoque em resduos de triptofano.............45

2 OBJETIVOS.........................................................................................................................47

2.1 Objetivo geral ....................................................................................................................47

2.2 Metas .................................................................................................................................47

3 MATERIAIS E MTODOS.................................................................................................48

___________________________________________________________________________

Sumrio

3.1 Materiais ............................................................................................................................48

3.2 Equipamentos ....................................................................................................................49

3.3 Sntese dos foto-produtos do triptofano (W) .....................................................................49

3.4 Sntese dos foto-produtos do W marcados com 18O2 ........................................................50

3.5 Quantificao dos hidroperxidos (WOOH) gerados na foto-oxidao do W..................50

3.6 Anlise da formao dos foto-produtos do W por HPLC .................................................50

3.7 Anlise dos foto-produtos do W por HPLC/MS/MS ........................................................51

3.8 Anlise dos foto-produtos do W por RMN .......................................................................51

3.9 Purificao dos foto-produtos do W por HPLC ................................................................51

3.10 Avaliao da decomposio dos WOOH por um agente redutor....................................52

3.11 Avaliao da estabilidade trmica dos WOOH ...............................................................52

3.12 Avaliao da decomposio dos WOOH por metais ......................................................52

3.13 Avaliao da estabilidade dos WOOH em diferentes pHs..............................................52

3.14 Experimentos de espectrometria de massa e marcao isotpica para caracterizar a FMK

suas fragmentaes..................................................................................................................53

3.15 Estudo do mecanismo de decomposio dos WOOH N-formilquinurenina (FMK)....54

3.15.1 Estudos envolvendo marcao isotpica da FMK........................................................54

3.15.1.1 Anlise da decomposio dos W18O18OH para FMK por HPLC/MS/MS ................54

3.15.1.2 Estudos das trocas envolvendo a FMK e a gua .......................................................54

3.15.1.3 Anlise da decomposio dos W18O18OH para FMK em etanol seco.......................54

3.15.2 Estudos envolvendo quimiluminescncia obtida pela decomposio dos WOOH ......55

3.15.2.1 Avaliao da quimiluminescncia gerada na decomposio dos WOOH por adio de

base ..........................................................................................................................................55

3.15.2.2 Avaliao da quimiluminescncia gerada na decomposio dos WOOH por

aquecimento.............................................................................................................................55

3.15.2.3 Avaliao da quimiluminescncia gerada na decomposio de cada WOOH isolado e

em solvente orgnico...............................................................................................................56

3.15.2.4 Determinao da velocidade inicial de converso de cada WOOH FMK..............56

3.15.2.5 Determinao da natureza da espcie excitada..........................................................56

3.15.2.6 Determinao dos espectros de emisso de luminescncia para a decomposio de

ada WOOH isolado..................................................................................................................57

3.16 Medidas do espectro de fluorescncia da FMK...............................................................58

Sumrio

3.17 Identificao de dois novos produtos da reao de oxidao do W pelo 1O2..................58

3.17.1 Elucidao estrutural dos fotoprodutos ........................................................................58

3.17.2 Investigao da origem dos novos fotoprodutos ..........................................................58

4 RESULTADOS ....................................................................................................................59

4.1 Anlise da formao dos fotoprodutos do triptofano (W).................................................59

4.2 Reduo dos foto-produtos formados................................................................................60

4.3 Caracterizao por marcao isotpica e HPLC/MS/MS dos foto-produtos formados ....61

4.3.1 Anlise da fragmentao dos WOOH por HPLC/MS/MS utilizando 18O2 ....................61

4.3.2 Anlise da fragmentao dos WOH por HPLC/MS utilizando 18O2 ..............................62

4.4 Caracterizao dos foto-produtos por RMN......................................................................63

4.4.1 Anlise dos WOH por RMN (1H; COSY e HMBC) ......................................................63

4.4.2 Anlise dos WOOH por RMN (1H; 13C; COSY; HETCORR).......................................64

4.5 Avaliao da estabilidade dos WOOH ..............................................................................66

4.5.1 Avaliao da estabilidade tmica dos WOOH ...............................................................66

4.5.2 Avaliao da decomposio dos WOOH por metais......................................................67

4.5.3 Avaliao da estabilidade dos WOOH em diferentes pHs ............................................69

4.6 Espectrometria de massa e marcao isotpica como ferramentas para caracterizar a FMK

e suas fragmentaes ...............................................................................................................71

4.7 Estudo do mecanismo de decomposio dos WOOH FMK...........................................76

4.7.1 Experimentos envolvendo marcao isotpica da FMK ................................................76

4.7.2 Estudos envolvendo quimiluminescncia dos WOOH...................................................81

4.7.2.1 Determinao da velocidade inicial de converso de cada WOOH FMK................83

4.7.2.2 Determinao da natureza da espcie excitada............................................................86

4.7.3 Comparao entre a fluorescncia da FMK e o espectro de quimiluminescncia gerado

na decomposio dos WOOH .................................................................................................87

4.8. Identificao de dois novos produtos da reao de oxidao do W pelo 1O2...................88

4.8.1 Anlise por HPLC/MS/MS e marcao isotpica ..........................................................88

4.8.2 Anlise dos novos produtos de oxidao do W pelo 1O2 por RMN..............................91

4.8.3 Investigao da origem dos novos produtos de oxidao do W pelo 1O2 ......................92

5 DISCUSSO........................................................................................................................95

Sumrio

5.1 Caracterizao dos produtos de oxidao do W por HPLC/MS/MS utilizando produtos

com [18O] incorporado e por RMN..........................................................................................95

5.2 Avaliao da estabilidade trmica, em diferentes pHs e da decomposio por metais dos

WOOH.....................................................................................................................................96

5.3 Estudo do mecanismo de decomposio dos WOOH FMK...........................................97

5.3.1 Experimentos envolvendo marcao isotpica da FMK ................................................97

5.3.2 Estudos envolvendo a decomposio quimiluminescente dos WOOH..........................99

5.4 Identificao de dois novos produtos da reao de oxidao do W pelo 1O2..................104

6 CONCLUSES..................................................................................................................109

7 PERSPECTIVAS ...............................................................................................................110

8 REFERNCIAS .................................................................................................................111

Apndices ..............................................................................................................................123

Apndice A - Espectros de RMN (1H; COSY; HMBC) do WOH trans ...............................123

Apndice B - Espectros de RMN (1H; COSY; HMBC) do WOH cis ...................................126

Apndice C - Espectros de RMN (1H; 13C; COSY; HETCORR) do WOOH trans ..............129

Apndice D - Espectros de RMN (1H; 13C; COSY; HETCORR) do WOOH cis .................133

Apndice E - Espectro de RMN (1H) da FMK......................................................................137

Apndice F - Espectros de RMN (1H; 13C; HSQC) da R,S DiOia ........................................138

Apndice G - Espectros de RMN (1H; 13C; HSQC) da R,R DiOia .......................................140

Introduo - 19

1 INTRODUO

1.1 Oxignio

O elemento oxignio uma molcula diatmica que constitui 21 % da atmosfera atual.

Em 1929, Giauque e Johnston descobriram que o oxignio consiste em trs istopos de pesos

atmicos 16, 17 e 18 (Giauque e Johnston, 1929). Em 1952, Dole considerava que a

demonstrao da existncia dos diferentes istopos, a inveno de mtodos que

possibilitassem medir suas massa e abundncias, e a descoberta dos mtodos de separao dos

istopos constituam um dos maiores campos da descoberta cientfica da primeira metade do

sculo vinte (Dole, 1952). Alm disso, este mesmo autor j demonstrava aplicaes desta

descoberta, tais como o uso dos istopos de oxignio no estudo dos mecanismos de reaes

orgnicas e inorgnicas, e estudo das trocas dos istopos de oxignio entre compostos

orgnicos e a gua. Os istopos de oxignio com suas abundncias relativas e pesos atmicos

esto resumidos na Tabela 1.1.

Tabela 1.1 Istopos do oxignio molecular

Istopo Porcentagem no ar Peso atmico 16O 99,7587 15,99555 17O 0,0374 16,99977 18O 0,2039 17,99980

Exceto para algumas espcies anaerbicas e aero tolerantes, todos os organismos

precisam do O2 para uma produo eficiente de energia. Entretanto, esta necessidade de

oxignio mascara o fato que esta molcula um gs txico, mutagnico e inflamvel, sendo

que os aerbios sobrevivem nesta atmosfera apenas porque desenvolveram defesas

antioxidantes (Hallliwell e Gutteridge, 2007).

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Introduo - 20

1.2 Oxignio singlete

O oxignio molecular, no estado fundamental, possui dois eltrons com spins paralelos

ocupando dois orbitais de mesma energia, chamados de degenerados, caracterizando, portanto, um estado triplete (3g-). Conseqentemente, a reduo direta do oxignio por dois eltrons proibida pela regra de conservao do spin. Uma forma mais reativa do oxignio,

conhecida como oxignio singlete, pode ser gerada por um acrscimo de energia. Nela, a

restrio da regra de conservao do spin removida. Sendo assim, o oxignio singlete

muito mais oxidante do que o oxignio molecular no seu estado fundamental. Existem dois

estados singlete do oxignio: (i) o primeiro estado excitado, 1g, tem dois eltrons com spins opostos no mesmo orbital, possui uma energia de 22,5 kcal acima do estado fundamental e

tempo de meia vida em solvente aquoso de aproximadamente 10-6 s; (ii) o segundo estado

excitado, 1g+, tem um eltron em cada orbital degenerado, com spins opostos, e possui uma energia de 37,5 kcal acima do estado fundamental. O estado 1g+ tem um tempo de vida muito curto (10-11 s) em meio aquoso, sendo rapidamente desativado para o estado 1g (Kasha, 1985; Monroe, 1985). Portanto, apenas o primeiro estado apresenta interesse em sistemas

biolgicos e ser denotado por 1O2 (Tabela 1.2).

Tabela 1.2 Distribuio eletrnica nos orbitais moleculares (*) do oxignio no estado excitado singlete (1g+, 1g) e no estado fundamental triplete (3 g-).

Estado Orbitais * Energia (kcal / mol) Tempo de vida (s)

1g+ 37,5 10-11

1g 22,5 10-6

3 g-

Estado Orbitais * Energia (kcal / mol) Tempo de vida (s)

1g+ 37,5 10-11

1g 22,5 10-6

3 g-

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Introduo - 21

1.2.1 Estratgias para a identificao e deteco do 1O2

Talvez as formas mais simples de se avaliar o envolvimento do 1O2 em uma

determinada reao sejam o uso de supressores fsicos e/ou a substituio do solvente pelo

equivalente deuterado. Os supressores fsicos podem atuar por dois mecansimos: transferncia

de energia ou de carga. O mecanismo de transferncia de energia foi primeiramente sugerido

para a supresso do 1O2 pelo -caroteno (Foote e Denny, 1968). Este mecanismo envolve a formao do supressor no estado triplete e oxignio no estado fundamental. Para ser eficiente,

necessita que o estado triplete do supressor esteja bem prximo ou abaixo da energia do 1O2

(22,5 Kcal/mol) (Foote et al., 1970a, 1970b). O mecanismo por transferncia de carga

envolve a interao do 1O2 (pobre em eltrons) com espcies doadoras de eltrons, para

formar um complexo de transferncia de carga (ou em alguns casos, uma transferncia

completa de eltrons). Compostos que provavelmente suprimem ou reagem por este

mecanismo incluem azida, aminas e fenis (Foote, 1979).

Outra estratgia muito comumente utilizada o uso de solventes deuterados, uma vez

que estes aumentam o tempo de vida do 1O2. Mekel e Kearns sugeriram que as vibraes das

ligaes C-H e O-H so importantes na relaxao do 1O2 (Merkel e Kearns, 1972a, 1972b).

Dessa forma explicaram o efeito dos solventes deuterados no tempo de vida do 1O2. Estes

autores sugerem que a constante de velocidade para a transferncia de energia do 1O2

diretamente correlacionada com a densidade tica do solvente em regies que correspondem

s transies do oxignio (por exemplo, 1270 nm). Entretanto, Ogilby e Foote sugerem que

apesar de uma tendncia qualitativa dos efeitos de absoro do solvente ser evidente, ainda

falta uma correlao quantitativa entre o tempo de vida calculado e experimentalmente

determinado (Ogilby e Foote, 1981, 1983). Estas ponderaes podem ser melhor observadas

ao analisarmos a Tabela 1.3, que trs a absorbncia de vrios solventes no comprimento de

onda de emisso monomolecular do 1O2 (1270 nm) e compara com o tempo de meia-vida () obtido experimentalmente para esta molcula em cada solvente.

___________________________________________________________________________

Introduo - 22

Tabela 1.3 Correlao do do 1O2 com a absorbncia de cada solvente a 1270 nm Solvente (1O2) s Abs1270

acetona-h6 46,5 2,0 7,3

acetona-d6 690 20 0,24

CH3CN 54,4 1,3 6,1

CD3CN 600 33 ---

benzeno-h6 26,7 1,3 3,9

benzeno-d6 550 11 0,72

H2O 4 166

D2O 68,1 2,5 21 adaptada da referncia (Ogilby e Foote, 1983).

O uso de supressores fsicos e solventes deuterados uma boa maneira para indicar a

presena do 1O2. Entretanto, no h especificidade no uso destes mtodos. Uma forma de

deteco que sofre menos interferncias a deteco da luminescncia do 1O2. Por se tratar de

uma espcie eletronicamente excitada, o 1O2 decai para o estado fundamental emitindo luz. A

investigao espectroscpica da luminescncia vermelha que acompanha a decomposio de

perxido de hidrognio (H2O2) na presena de hipoclorito (OCl-) realizada por Khan e Kasha

revelou a existncia de duas bandas de emisso centradas em 634 e 703 nm, atribudas ao

decaimento para o estado fundamental do 1O2 gerado na reao (Equao 1.1) (Khan e Kasha,

1963).

OCl- + H2O2 Cl- + H2O + 1O2 (Equao 1.1) Atualmente, est bem estabelecido que essas bandas correspondem transio

simultnea de duas molculas de 1O2 ao estado fundamental triplete, tambm conhecida como

emisso bimolecular (Equao 1.2). Esta emisso pode ser monitorada por meio de uma

fotomultiplicadora sensvel regio do vermelho do espectro visvel, termoeletricamente

resfriada, conectada a um sistema discriminador e amplificador (Boveris et al., 1981). Um

problema apresentado na deteco da emisso bimolecular do 1O2 que outras espcies

___________________________________________________________________________

Introduo - 23

tambm podem emitir nesta regio do espectro, como por exemplo, as carbonilas excitadas.

Estas espcies sero discutidas em uma seo posterior.

Alm do decaimento bimolecular do 1O2, tambm existe a transio monomolecular

do 1O2, que ocorre na regio do infravermelho prximo, sofrendo menos interferncias

(Equao 1.3). A luminescncia desta transio pode ser detectada por um espectrmetro

acoplado a um fotodetector constitudo de um fotodiodo de germnio resfriado com

nitrognio lquido (Browne e Ogryzlo, 1964). A intensidade da emisso monomolecular

diretamente proporcional concentrao do 1O2 e, portanto fornece uma medida direta da

quantidade produzida (Khan, 1981).

Emisso bimolecular:

O2 (1g) + O2 (1g) 2 O2 (3g-) + h (= 634 nm e 703 nm) (Equao 1.2) Emisso monomolecular:

O2 (1g) O2 (3g-) + h (=1270 nm) (Equao 1.3) Outra forma de se detectar a presena do 1O2 utilizando captadores qumicos. Esta

forma de deteco pode ser aplicada tanto em meio biolgico como em reaes in vitro, e

considerada a forma mais sensvel de deteco e quantificao do 1O2 (Nardello e Aubry,

2000). Os captadores qumicos mais seletivos pertencem a uma srie de compostos

policclicos aromticos, que reagem com o 1O2 atravs de uma cicloadio [4 + 2], resultando

em um endoperxido altamente especfico para o 1O2 (Nardello e Aubry, 2000). Por exemplo,

pode-se utilizar a reao de 1O2 com o 9,10-difenilantraceno (DPA) (Turro e Chow, 1981) ou

com derivados de antraceno solveis em gua, como o 9,10-dietilantraceno disulfonato (EAS)

(McCall, 1984; Di Mascio e Sies, 1989; Pierlot et al., 2000) (Figura 1.1). Este composto

interessante uma vez que reage com o 1O2 para formar o endoperxido correspondente,

EASO2. Alm disso, sua solubilidade independe do pH e maior que o valor (concentrao na qual 50 % do 1O2 disponvel ser capturado) para todos os valores de pH. Outras

___________________________________________________________________________

Introduo - 24

caractersticas favorveis so a alta estabilidade (at 120 C) e a facilidade de deteco por

HPLC (McCall, 1984; Di Mascio e Sies, 1989).

R

R

R

R

OO

C6H5

OSO3-

+ 1O2

DPA

EAS

DPAO2

EASO2

R

Figura 1.1 Reao do 1O2 com seus captadores. 9,10-difenilantraceno (DPA) e 9,10-dietilantraceno disulfonato

(EAS), gerando os respectivos endoperxidos (DPAO2 e EASO2).

1.2.2 Fontes de 1O2

Em laboratrio, o 1O2 geralmente gerado por reaes de fotossensibilizao. Nestas

reaes, so utilizadas molculas conhecidas como fotossensibilizadores (tais como azul de

metileno e rosa bengala). Alguns dos fotossensibilizadores mais comuns esto listados na

Tabela 1.4, juntamente com alguns parmetros foto-fsicos relevantes (Kochevar e Redmond,

2000).

Quando um fotossensibilizador (F) irradiado com luz ultravioleta ou visvel em

determinados comprimentos de onda, esta molcula absorve energia e passa a um estado

excitado singlete (F1*). Este estado F1* pode decair para o estado fundamental singlete (F0)

com emisso de fluorescncia, ou decair para um estado triplete excitado (F3*) por inverso

espontnea do spin do eltron excitado (cruzamento intersistemas). Uma vez formado o F3*,

esta espcie pode participar em vrias reaes: pode decair ao estado F0 com emisso de

fosforescncia, ou reagir por mecanismos fotoqumicos do tipo I ou II. Na reao do tipo I, o

F3* pode reagir com um substrato orgnico ou uma segunda molcula fotossensibilizadora,

por transferncia de eltrons ou hidrognio. No tipo II, o fotossensibilizador F3* pode

transferir energia para o oxignio molecular, gerando F0 e 1O2. Estes processos podem ocorrer

___________________________________________________________________________

Introduo - 25

simultaneamente e a importncia de cada um depende da molcula alvo, da eficincia da

transferncia de energia do sensibilizador para o O2 e da concentrao de O2 (Foote, 1968;

Straight e Spikes, 1985; Foote, 1991) (Figura 1.2).

Tabela 1.4 Fotossensibilizadores utilizados na gerao de 1O2

Fotossensibilizador Faixa de absoro (nm) Rendimento quntico

() de 1O2 Solvente Rosa Bengala

O

I

-O

I

I

O

I

COO-Cl

Cl

Cl

Cl

450-580 0,76 gua, alcois

Azul de Metileno

S

N

N N+

550-700 0,52

gua, alcois

Fenalenona O

< 400 0,95 Solventes orgnicos

adaptada da referncia (Kochevar e Redmond, 2000).

___________________________________________________________________________

Introduo - 26

Figura 1.2 Representao esquemtica dos mecanismos fotoqumicos do tipo I e do tipo II. Abreviaturas: h1: radiao incidente; h2: emisso de fluorescncia; h3: emisso de fosforescncia; F0: fotossensibilizador no estado fundamental; F1*: fotossensibilizador no estado singlete excitado; F3*: fotossensibilizador no estado

triplete excitado; F-: radical nion do fotossensibilizador; F+: radical ction do fotossensibilizador; R: substrato

orgnico; R-: radical nion do substrato orgnico; R+: radical ction do substrato orgnico; ISC: cruzamento

intersistemas.

Como exemplos de gerao qumica de 1O2 podem ser citadas as reaes de H2O2 com

OCl- ou peroxinitrito (ONOO-), respectivamente demonstradas nas Equaes 1.1 e 1.4 (Held

et al., 1978; Di Mascio et al., 1994; Martinez et al., 2000).

H2O2 + ONOO- H2O + NO2- + 1O2 (Equao 1.4) O 1O2 pode ainda ser formado atravs da termlise de endoperxidos. Estes

compostos so qumicamente inertes e, portanto apropriados para o uso em sistemas

biolgicos. Alguns exemplos destes geradores so o endoperxido do 1,4-dimetilnaftaleno

(DMNO2), o endoperxido aninico do 3,3-(1,4-naftilideno)dipropanoato de sdio (NDPO2)

e o endoperxido no inico do N,N-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3-(1,4-

naftilideno)dipropanamida (DHPNO2) (Pierlot et al., 1996; Pierlot et al., 2000) (Figura 1.3).

F0h 1

h 2 F1* F3*

h3

+ R oxidante R- + F+

+ R redutor R+ + F- Processo do tipo I (Anaerbico)

+ F0 F+ + F-

F0 + 1O2 + 3O2 Processo do tipo II (Aerbico)

ISC

___________________________________________________________________________

Introduo - 27

R

OO

R R

R

ONa

O

NH

OH

O

OH

DMNO2

2

NDP

2 + 3O2 + 1O2

R

DHPN

NDPO2

DHPNO2

DMNO2 CH3

Figura 1.3 Exemplos de endoperxidos geradores de 1O2; DMNO2, NDPO2 e DHPNO2, os quais sob

aquecimento moderado liberam 1O2, 3O2 e DMN, NDP ou DHPN, respectivamente.

O NDPO2 foi utilizado em um ensaio mutagnico com cepas de Escherichia coli para

avaliar o aparecimento de leses mutagnicas. Contrastando com o DHPNO2, que pode

ultrapassar a barreira das membranas devido a seu carter no-inico, o NDPO2, um

endoperxido aninico, libera o 1O2 fora das clulas bacterianas. Apesar desta caracterstica,

os autores sugeriram que a interao do 1O2 com as membranas celulares gera produtos

secundrios que podem reagir com o DNA, levando a dano e leses mutagnicas (Cavalcante

et al., 2002).

A gerao de 1O2 tambm tem sido evidenciada em meio biolgico por reaes que

envolvem enzimas como as peroxidases, tais como lactoperoxidase (Kanofsky, 1983),

mieloperoxidase (Kanofsky et al., 1984; Kanofsky et al., 1985), cloroperoxidase (Kanofsky,

1984) e peroxidase de raiz forte (Kanofsky, 1988). Da mesma forma, tambm foram relatadas

evidncias da gerao de 1O2 na fagocitose (Steinbeck et al., 1992), na reao de oznio (O3)

com biomolculas (Kanofsky e Sima, 1991) e no processo de lipoperoxidao (Russell, 1957;

Howard e Ingold, 1968; Miyamoto et al., 2003). A formao de 1O2 na lipoperoxidao ocorre

principalmente por meio do mecanismo discutido por Russell, no qual radicais peroxila

interagem entre si, gerando um tetraxido intermedirio linear que se decompe via um

___________________________________________________________________________

Introduo - 28

mecanismo cclico, gerando como produtos um lcool, uma cetona e 1O2 (Russell, 1957)

(Figura 1.4).

2

ROO

O O

O* OH

OO O

OOH

CH

R1

R2

C

H

H

ROOOOR R=O R-OH O2

C 3O2+ +CH

or

C CH OH 1O2+ +R1

R2

R1

R2

R1

R2

R1

R2

C

Figura 1.4 Formao de 1O2 atravs do processo de lipoperoxidao.

1.2.3 Alvos biolgicos do 1O2

O 1O2 pode interagir com outras molculas de duas maneiras: atravs de reaes

qumicas ou transferindo sua energia de excitao para estas molculas e retornando ao estado

fundamental. O ltimo processo conhecido como supresso fsica do 1O2 e pode ser

realizado por carotenides, bilirrubina, tocoferis, fenis e azida (Foote, 1979). Algumas

reaes qumicas do 1O2 podem ser destacadas: adio a dienos conjugados (cicloadio do

tipo Diels-Alder, 4 + 2) geralmente resultando na formao de endoperxidos (Bloodworth e

Eggelte, 1985); adio 1,3 a uma dupla ligao, formando ene hidroperxidos (Foote e

Denny, 1971); e com alcenos substitudos por grupos contendo tomos de nitrognio ou

enxofre, formando 1,2-dioxetanos (adio do tipo 2+ 2) (Baumstark, 1985) (Figura 1.5). O

1O2 pode ainda reagir com compostos fenlicos para formar hidroperoxidienonas (Foote et al.,

1976) e com sulfetos formando sulfxidos (Ando e Takata, 1985).

CH

CH2H

CH2CH

CH2

CH2

O

OH

O2 O

O CH

CH

H

R H

RCH

CH

CHCH

R

R

O2 CH

CHN

R R

R

O2CH O

OCHN

R R

R

dioxetano

CBA

hidroperxido

ene

1 1

endoperxido

[4 + 2]

1

[2 + 2]

Figura 1.5 Reao do 1O2 com biomolculas. (A) Reao do tipo ene. (B) Reao do tipo [4+2]; (C) Reao do

tipo [2+2].

___________________________________________________________________________

Introduo - 29

1.2.3.1 Reaes do 1O2 com o DNA

Dentre as bases do DNA, a guanina a nica que reage significativamente com o 1O2

em pH neutro (Steenken e Jovanovic, 1997). Postula-se que a reao principal envolva a

formao de um 4,8-endoperxido instvel, atravs de uma cicloadio do tipo Dies-Alder

[4+2] na ligao 4,8 do anel imidazlico (Figura 1.6 A). O endoperxido formado decompe-

se formando 8-hidroperoxi-2-desoxiguanosina, a qual atravs de intermedirios instveis d

origem a duas espiroiminodihidantonas diastereoisomricas (dSp, Figura 1.6 A2). Estes

produtos finais foram atribudos por experimentos de RMN (Niles et al., 2001; Adam et al.,

2002). A 8-oxo-7,8-dihidro-2-desoxiguanosina (8-oxodGuo) foi detectada com um baixo

rendimento, quando comparada as dSp (Cadet et al., 1997) (Figura 1.6 A1).

Contrastando com a oxidao da base guanina isolada, a 8-oxodGuo o nico produto

detectado na oxidao de DNA dupla fita pelo 1O2 (Ravanat et al., 2001) (Figura 1.6 A1).

Tm-se postulado que os 4,8 endoperxidos diastereoisomricos iniciais rearranjam em 8-

hidroperoxi-2-desoxiguanosina antes de serem reduzidos a 8-oxodGuo (Sheu e Foote, 1993;

Kang e Foote, 2002).

A oxidao da 8-oxodGuo pelo 1O2 tambm tm sido estudada. Prope-se que ocorra

uma cicloadio do tipo [2+2] do 1O2 na ligao entre os carbonos 4 e 5 da 8-oxodGuo

gerando um hidroperxido no C4, via um dioxetano transitrio (Sheu e Foote, 1995b). O

hidroperxido formado d origem ao cido cianrico, juntamente com 2,2-diamino-4[-(2-

desoxi--eritro-pentafuranosil)amina]-5-(2H)-oxazolona (dOz) e as dSp diastereoisomricas (Raoul e Cadet, 1996; Martinez et al., 2002) (Figura 1.6 B1 e B2). Quando a 8-oxodGuo

inserida em um DNA de fita simples, tm-se demonstrado que o hidroperxido d origem a

um derivado da dehidroguanidinohidantoina. Este composto posteriormente hidratado na

base de Schiff, levando a mais uma hidrlise, liberao da guanidina e formao do cido

oxalrico (Figura 1.6 B1). Apenas o nucleosdeo do cido oxalrico (dOxa) observado no

DNA de fita simples (Duarte et al., 2000). Cabe ressaltar que a 8-oxodGuo um substrato

___________________________________________________________________________

Introduo - 30

muito melhor que a dGuo para a oxidao pelo 1O2 (Sheu e Foote, 1995a; Sheu e Foote,

1995b).

NN

NNH

O

NH2dR

NN

NNH

O

NH2

HO

OdR

NN

NNH

O

NH2dR

O

OH

NN

NH

NH

O

NH2

O

dR

O

O

N

NH

NH

NH

O

dR

N

O

NH

NH2O

NH2dR

NH

N

NH

NH

O

NH

O

OdR

NH

N

N

NNH2

O

O

O

dR

OH

NH

N

N

NNH2

O

O

OH

dR

OHNH

NH

O

O O

dR

NH

N

NH

NNH2

O

O

dR

NN

NH

NH

O

NH2dR

O

NN

NNH

O

NHdR

ONN

NH

N

O

NH2dR

O

OH

NH

N

NH

NH

O

NH

O

OdR

NN

NNH

O

NH2dR

OHNN

NH

NH

O

NH2dR

O

1O2

dGuo

A1

A2

1O2

dOzdSp

H2O

5-OOH-8-oxodGuo

5-OH-8-oxodGuo

dOxa

8-oxodGuo

B1

B2dR = 2' - desoxiribose

- H2O

+ H2O

dSp

8-oxodGuo

(nucleosdeo isolado)

(DNA e nucleosdeo)

12

3 4

56

98

7

12

3 4

56 78

9

(nucleosdeo isolado)

(DNA e nucleosdeo)

B

A

Figura 1.6 Principais produtos da oxidao do DNA pelo 1O2 DNA. (A) Oxidao da dGuo: (A1) Oxidao da

dGuo isolada e inserida no DNA; (A2) Oxidao da dGuo isolada. (B) Oxidao da 8-oxodGuo: (B1) Oxidao

da 8-oxodGuo isolada e inserida no DNA fita simples; (B2) Oxidao da 8-oxodGuo isolada.

___________________________________________________________________________

Introduo - 31

1.2.3.2 Reaes do 1O2 com lipdeos

Sabe-se que o 1O2 adiciona-se aos lipdeos insaturados atravs de uma reao do tipo

ene produzindo hidroperxidos isomricos (Foote, 1968; Foote e Denny, 1971). Estes

hidroperxidos esto muito bem caracterizados para uma srie de lipdeos, e apenas alguns

exemplos sero discutidos abaixo.

1.2.3.2.1 Oxidao dos cidos linolico e araquidnico

A reao do 1O2 com o cido linolico gera quatro hidroperxidos nas posies 9, 13

(ismeros contendo dienos conjugados), 10 e 12 (Terao e Matsushita, 1977; Frankel et al.,

1979) (Figura 1.7 A 1 e 2). Em contraste, a oxidao do cido linolico por radicais gera

apenas os ismeros nas posies 9 e 13 (Figura 1.7 A2). Desta forma, a identificao dos

hidroperxidos no conjugados uma evidncia da oxidao mediada pelo 1O2. De uma

maneira similar, a reao do 1O2 com o cido araquidnico, d origem a oito hidroperxidos,

sendo que apenas dois so no conjugados (Frankel et al., 1979; Terao et al., 1981).

1.2.3.2.2 Oxidao do colesterol

A reao do 1O2 com o colesterol tambm j foi investigada e postula-se que a mesma

ocorra atravs de um mecanismo do tipo ene, gerando trs hidroperxidos: 3-hidroxi-5-colestano-6-ene-5-hidroperxido (5-OOH), 3-hidroxicolestano-4-ene-6-hidroperxido (6-OOH) e 3-hidroxicolestano-4-ene-6-hidroperxido (6-OOH) (Kulig e Smith, 1973) (Figura 1.7 B1). O rendimento da gerao em membranas fotooxidadas do ismero 5-OOH pelo menos cinco vezes mais alto do que a gerao dos ismeros 6-OOH e 6-OOH (Korytowski e Girotti, 1999). A oxidao por 1O2 no gera o 3-hidroxicolestano-5-ene-7-hidroperxido (7-OOH) nem o 3-hidroxicolestano-5-ene-7- hidroperxido (7-OOH) diretamente, mas estes hidroperxidos podem derivar de um rearranjo allico do

hidroperxido 5-OOH (Beckwith et al., 1989). Por outro lado, reaes radicalares envolvendo o colesterol levam apenas a formao dos hidroperxidos 7-OOH e 7-OOH,

___________________________________________________________________________

Introduo - 32

sendo que a deteco dos hidroperxidos 5-OOH ou 6-OOH/6-OOH tm sido usada como um marcador para a oxidao mediada pelo 1O2 (Figura 1.7 B2) (Yamazaki et al., 1999).

OH R2R1

OH

R1R2

OHOOH

R1 R2

6-OOH OOH H6-OOH H OOH

R1 R2

7-OOH OOH H7-OOH H OOH

R1: (CH2)4CH3R2: (CH2)7COOH

OH

OOH HOO

HOO OOH

X.

XH

X.

XH

5-OOH

912

cido linolico

R1 R2 1O2

R1

R2

9-OOH

R1 R2

13-OOH

R1 R210-OOH

R1 R2

12-OOH

1O2

colesterol

A1

B2

1

34

5 6

2

7

8910

1112

3O2

A2

B1

(mediada pelo 1O2)

(mediada pelo 1O2 e por radicais)

(mediada pelo 1O2)

(mediada pelo 1O2 e por radicais)

3O2

B

A

Figura 1.7 Principais produtos da oxidao de lipdeos pelo 1O2. (A) Oxidao do cido linolico: (A1) Oxidao

mediada pelo 1O2; (A2) Oxidao mediada pelo 1O2 e por radicais. (B) Oxidao do colesterol: (B1) Oxidao

mediada pelo 1O2; (B2) Oxidao mediada pelo 1O2 e por radicais.

___________________________________________________________________________

Introduo - 33

1.2.3.3 Aminocidos e peptdeos como alvos para o 1O2

A maioria das interaes do 1O2 com aminocidos, peptdeos e protenas ocorre via

rotas qumicas e no atravs de supresso fsica, sendo que ambos os mecanismos concorrem

significativamente somente no caso do triptofano (Matheson et al., 1975). As constantes para

a reao qumica do 1O2 com as cadeias laterais dos aminocidos livres variam

consideravelmente, resultando em um dano seletivo a certos resduos. Dos aminocidos

comuns, apenas o triptofano, a histidina, a tirosina, a metionina, a cistena e a cistina reagem

significativamente com 1O2 em pH fisiolgico (Monroe, 1985; Wilkinson et al., 1995). A

Tabela 1.5 apresenta as constantes de velocidade de reao (k) do 1O2 com alguns

aminocidos (Davies, 2004).

Tabela 1.5 Constantes de velocidade de reao do 1O2 com cada aminocido.

Aminocido k (107 M-1s-1)

triptofano 3a

2 -7b

histidina 10a

tirosina 0,8a

cistena 0,9a

metionina 1,6a areao qumica; bsupresso fsica. Adaptada da referncia (Davies, 2004)

1.2.3.3.1 Reao com resduos de tirosina

Com o aminocido livre, demonstrou-se a formao de 3-hidroxi-6-oxo-2,3,3,6,7,7-hexahidro-1H-indol-2-cido carboxilco (HOHICA) na reao com o 1O2. Acredita-se que este produto seja gerado via um intermedirio endoperxido instvel, pela

cicloadio [4 + 2] do 1O2. A subseqente abertura do anel forma um hidroperxido no C1, o

qual via uma reao do tipo de Michael sofre ciclizao resultando em um perxido cclico

(Criado et al., 1998; Wright et al., 2002) (Figura 1.8). A reao do 1O2 com resduos de

___________________________________________________________________________

Introduo - 34

tirosina em peptdeos gera como produto principal um hidroperxido no C1, que, em baixas

temperaturas, decai lentamente para seu lcool correspondente (Wright et al., 2002).

OHNH3+

O

O

OHNH3+

O

O

OO

NH3+

O

O

O

OOH

O

OH

NHO

O

O

OOH

NHO

O

1O2

HOHICA

tirosina

Figura 1.8 Reao do 1O2 com resduos de tirosina. HOHICA: 3-hidroxi-6-oxo-2,3,3,6,7,7-hexahidro-1H-indol-2-cido carboxilco.

1.2.3.3.2 Reao com resduos de histidina

A oxidao de histidina livre pelo 1O2 parece envolver a formao inicial de um ou

mais endoperxidos instveis, atravs da 1,4 cicloadio do 1O2 aos carbonos 2,4 e/ou 2,5 do

anel imidazlico (Tomita et al., 1969). Evidncias desta formao foram obtidas quando

endoperxidos de derivados imidazlicos foram identificados em temperaturas extremamente

baixas (Kang e Foote, 2000). Utilizando a N-benzoil-histidina, Tomita e colaboradores

(Tomita et al., 1969) detectaram a formao de uria e derivados benzilados de asparagina e

cido asprtico. Recentemente, Agon e colaboradores (Agon et al., 2006) detectaram

hidroperxidos como intermedirios na fotossensibilizao e sugerem que estes produtos

resultem da decomposio dos endoperxidos iniciais. Os hidroperxidos decompem-se em

poucas horas e esta decomposio parece ser seguida por um ataque nucleoflico intra ou

intermolecular dependendo da disponibilidade de nuclefilos. No caso de adio

intramolecular h a formao de um produto cclico (Figura 1.9).

___________________________________________________________________________

Introduo - 35

NNH

OH

ONH3

+

NHN

OH

ONH3

+

O

ONNH

OH

ONH3

+

O

O

NN

OH

ONH3

+

NN

OH

ONH3

+

OOH

NN

OH

ONH3

+

OOH

NN

OH

ONH3

+

O

OH

1O2

HOO

e / ou

Outras reaesdesconhecidas

histidina

Figura 1.9 Reao do 1O2 com resduos de histidina.

1.2.3.3.3 Reao com resduos de metionina

A fotooxidao de resduos de metionina dependente do pH: em pH 6, proposto

que a oxidao ocorre via formao de uma espcie zwitterionica que reage com uma segunda

molcula de metionina resultando em duas molculas de sulfxido; com o aumento do pH,

outras reaes podem concorrer: em pH 9 ons hidrxido podem levar a uma substituio no

tomo de enxofre da espcie zwitterionica, resultando em um mol de perxido de hidrognio

para cada mol de sulfxido formado. Alm dessas reaes, no caso do aminocido livre e

quando 7 pH 12 tambm pode ser formado um intermedirio cclico estvel, chamado

___________________________________________________________________________

Introduo - 36

dehidrometionina, e um mol de perxido de hidrognio (Sysak et al., 1977; Ando e Takata,

1985; Straight e Spikes, 1985) (Figura 1.10).

pH 6

pH 9

7 pH 12

CH3S

O

NH3+

O

CH3S

+

O

NH3+

OO O

CH3S

O

NH3+

OO

CH3S

+

O

NH2

OO O

CH3S

O

NH2

OO

CH3S

+

O

NH2

OO O

CH3S

+

O

OO

NH2

O

NH

S+

CH3

O

O

metionina

2

+ H2O2

H+

+ H2O2

OH - H2O

dehidrometionina

1O2 1O2 1O2

metionina

..

Figura 1.10 Reao do 1O2 com resduos de metionina.

1.2.3.3.4 Reao com resduos de cistena

Residuos de cistena livres reagem rapidamente com o 1O2, produzindo o dissulfeto

correspondente de um modo no quantitativo. Alm disso, oxicidos como o cido cistico

tambm podem ser formados em algumas condies (Ando e Takata, 1985; Straight e Spikes,

1985; Davies, 2004).

___________________________________________________________________________

Introduo - 37

1.2.3.3.5 Reao com resduos de triptofano

A reao do 1O2 com o triptofano (W) produz um hidroperoxipirroloindol isolvel,

entretanto, o precursor deste composto ainda no foi identificado (Davies, 2004). Postula-se

que ele seja um dioxetano formado com a dupla ligao dos carbonos 2 3 do anel indlico,

ou ainda um hidroperxido no C3. A decomposio subseqente destes intermedirios via

quebra da ligao entre os carbonos 2 3 origina 3-hidroperoxipirroloindol, 3-hidroxipirroloindol e N-formilquinurenina (FMK) (Nakagawa et al., 1975; Nakagawa et al.,

1977; Nakagawa et al., 1981) (Figura 1.11). Dados cinticos e propostas mecansticas

defendem que a reao de oxidao do triptofano pelo 1O2 em dipeptdios ocorre de forma

similar oxidao do aminocido livre. Este no um comportamento comum a outros di e

polipeptdios de aminocidos fotooxidados, nos quais a presena da ligao peptdica

influencia consideravelmente a reatividade fotodinmica. Contudo, parece que a via

preferencial de reao para os peptdios contendo triptofano diferente, formando

principalmente hidroperoxipirroloindol e seu lcool correspondente e, em menores

quantidades, quinurenina (kn) (Posadaz et al., 2004).

NH

NH2

COOH

NNH2

COOHOOH

NH

OOH

NH

COOH

O

NH

O H

COOH

NH2

NH

OH

NH

COOH

1O2

triptofano

FMK

Figura 1.11 Reao do 1O2 com resduos de triptofano.

1.3 Estudos envolvendo o mecanismo de decomposio do triptofano oxidado FMK

Apesar do grande interesse no mecanismo envolvido na oxidao do W pelo 1O2,

ainda resta muito a ser elucidado. Desta forma, como acima citado, prope-se que a foto-

___________________________________________________________________________

Introduo - 38

oxidao do W d origem a uma 3-hidroperoxiindolenina instvel (1) (Figura 1.12), o

primeiro intermedirio postulado como capaz de rearranjar FMK (7) (Ek et al., 1952;

Nakagawa et al., 1977; Nakagawa et al., 1979; Nakagawa et al., 1981). Entretanto, ao menos

trs vias tm sido sugeridas para a transformao deste hidroperxido em FMK (Figura 1.12).

Primeiro, uma indolenina hidratada (2) e um produto de seu rearranjo (3) foram sugeridos

como intermedirios (Hamilton, 1969; Sundberg, 1970). Prope-se que este mecanismo

envolva a heterlise da ligao O-O do hidroperxido, seguido de uma migrao de

grupamento alquila, resultando no produto (3). Subseqentemente, este produto sofreria

decomposio FMK. Outra via sugerida a decomposio atravs de uma homlise ou

heterlise da ligao O-O do hidroperxido tricclico (4), resultando em uma hidroxicetona

intermediria de oito membros (5), que ento sofreria decomposio FMK (Saito et al.,

1977). Finalmente, um dioxetano (6) derivado de um tautomerismo anel-cadeia entre (1) e (4)

tambm considerado um provvel intermedirio (Nakagawa et al., 1979; Nakagawa et al.,

1981). Alm da via oxidativa que leva gerao de FMK, um lcool (8) tambm tem sido

reportado como um produto de decomposio concorrente, derivado da reduo da 3-

hidroperoxindolenina (1) ou do tautmero de anel (4) (Nakagawa et al., 1979; Nakagawa et

al., 1981).

NH

NH2

COOH

NNH2

COOHOOH

NH

OOH

NH

COOH

NH

OH NH2

COOHOOH

NH OH

OOH COOH

NH2

O

NH

O H

COOH

NH2

NH

OO NH2

COOH

NH

NH

COOH

O

OH

NH

OH

NH

COOH

O

NH2

COOH

NH2

1O2

(1)

(2) (3)

(5)

(6)

(4)

(7)

(8)

(W)

(Kn)

Figura 1.12 Provveis mecanismos de reao do 1O2 com triptofano.

___________________________________________________________________________

Introduo - 39

1.4 Estados excitados, dioxetanos e reaes quimiluminescentes

1.4.1 Estados excitados

A maioria das molculas orgnicas no estado fundamental possui multiplicidade

singlete (S), a qual significa que seus eltrons possuem spins pareados. Esta concluso

tirada do clculo de multiplicidade (2S + 1), onde S o nmero quntico total de spin, que

pode ser calculado pela soma vetorial das contribuies individuais de cada eltron. No estado

singlete, os spins so opostos (+1/2, -1/2), S= 0 e multiplicidade = 1. Em contraste, no estado

triplete, S = 1 e multiplicidade = 3.

Quando uma molcula absorve luz (visvel ou ultravioleta) pode ocorrer a excitao de

um eltron do orbital molecular ocupado mais alto (HOMO, highest occupied molecular

orbital) para o orbital desocupado mais baixo (LUMO, lowest unocuppied molecular orbital).

Esta situao instvel quando comparada ao estado fundamental, e o excesso de energia

pode ser liberado na forma de energia trmica ou radioativa. As transies que no envolvem

a emisso de radiao so chamadas de no emissivas; Por outro lado, as transies que

emitem radiao so chamadas radioativas.

A radiao emitida chamada fluorescncia se o eltron no estado excitado possui a

mesma multiplicidade do estado fundamental (geralmente de um estado S1 para S0). Por outro

lado, a radiao chamada fosforescncia se a transio eletrnica ocorre de um estado

excitado com multiplicidade diferente do estado fundamental (geralmente de um estado T1

para S0). As demais vias de desativao da espcie excitada so no radioativas e incluem

converso interna (para estados de mesma multiplicidade) e cruzamento intersistema (para

estados de multiplicidade diferente). Transies radioativas so verticais e involvem mudana

da energia total da molcula, devido absoro e emisso de um fton. Por outro lado,

transies no radioativas so horizontais, e com energia constante. Estes achados esto

sumarizados no diagrama de Jablonski, ilustrado na Figura 1.13. Estes trs pargrafos tm

apenas um intuito introdutrio para os temas seguintes, e foram extrados de livros texto de

___________________________________________________________________________

Introduo - 40

fotoqumica. Para uma completa reviso, ver as referncias (Gilbert e Baggot, 1991; Turro,

1991).

S0 S1 T1

CICIS

CIS

RV

RV

RV

RV

fluorescncia

fosforescncia

absoro

Figura 1.13 Diagrama de Jablonski. S0 corresponde ao estado fundamental singlete, S1, ao estado excitado

singlete e T1 ao estado triplete excitado. RV: relaxao vibracional; CIS: cruzamento intersistemas; CI,

converso interna; : ativao trmica.

1.4.2 Decomposio unimolecular de 1,2-dioxetanos

Dioxetanos so perxidos cclicos de quatro membros, cuja clivagem produz

compostos carbonlicos sendo que um deles pode ser formado em um estado eletronicamente

excitado (McCapra, 1976). Trs mecanismos foram postulados para explicar a decomposio

destes compostos: concertado, concertado no sincronizado e birradicalar. O mecanismo

concertado foi originalmente proposto por McCapra (McCapra, 1968) e Kearns (Kearns,

1969), e involve a clivagem simultnea de ambas as ligaes, C-C e O-O do anel dioxetnico.

Prope-se que o produto eletronicamente excitado gerado diretamente no complexo ativado.

O mecanismo birradicalar foi proposto originalmente por Richardson (Richardson et al.,

1974), que considerou o mecanismo de clivagem em etapas, primeiro ocorrendo o estiramento

da ligao O-O para um birradical singlete. Este birradical singlete pode reciclizar, sofrer o

___________________________________________________________________________

Introduo - 41

rompimento da ligao C-C levando a uma carbonila excitada (n,*) ou por cruzamento intersistemas tornar-se um birradical triplete, clivando em um produto triplete excitado (Adam

e Zinner, 1982). Em contraste, no mecanismo concertado no-sincronizado (merged) a quebra

da ligao O-O mais avanada que a quebra da ligao C-C (Turro e Chow, 1981; Adam e

Baader, 1985). Este mecanismo parece o mais adequado para explicar todos os dados

experimentais obtidos at o momento (Baader et al., 2006). Os trs mecanismos propostos

esto sumarizados na Figura 1.14.

OO

O O OO

OO

O

O

O O+

*

concertado

concertadono sincronizado

birradicalar

Figura 1.14 Mecanismos de clivagem de dioxetanos. Adaptada da referncia (Baader et al., 2006).

1.4.3 Classificao das reaes quimiluminescentes

Com relao natureza do processo que d origem ao estado excitado de uma espcie

emissora, as reaes quimiluminescentes podem ser classificadas em trs tipos:

quimiluminescncia direta, quimiluminescncia indireta ou intensificada e

quimiluminescncia ativada (Schuster et al., 1979; Campbell, 1988; Baader et al., 2006).

O termo quimiluminescncia direta designa uma reao na qual o produto excitado

emite fluorescncia e/ou fosforescncia diretamente. Na presena de um aceptor apropriado

de energia e que possui um alto rendimento quntico de fluorescncia, a quimiluminescncia

___________________________________________________________________________

Introduo - 42

direta pode ser consideravelmente aumentada, e a emisso observada corresponde

fluorescncia do aceptor. Este tipo de reao chama-se quimiluminescncia indireta ou

intensificada (Adam, 1982; Campbell, 1988). Estes aceptores no participam da reao de

decomposio e, consequentemente, no alteram a velocidade da reao. O 9,10-

difenilantraceno (DPA) o aceptor mais comumente utilizado para espcies geradas na forma

singlete. Em contraste, o 9,10-dibromoantraceno (DBA) utilizado como aceptor triplete. A

transferncia de energia neste caso, de uma espcie excitada triplete para um aceptor singlete

facilitada pelo efeito do tomo pesado (heavy-atom) neste caso, o tomo de bromo (Wilson

e Schaap, 1971; Adam, 1982).

Na quimiluminescncia ativada, um composto adicionado tambm leva a um aumento

na intensidade de emisso. Contudo, contrariamente quimiluminescncia indireta, este

composto, agora chamado de ativador diretamente envolvido no processo de excitao, que

no envolve transferncia de energia. Alm disso, as constantes de velocidade e as

intensidades de emisso dependem do potencial de oxidao do ativador utilizado, indicando

uma transferncia de eltron no passo limitante de velocidade (Schuster e Horn, 1982;

Campbell, 1988; Baader et al., 2006). Este mecanismo chama-se luminescncia induzida

quimicamente pela troca de eltron (CIEEL, Chemically Initiated Electron Exchange

Luminescence) e foi proposto por Schuster (Koo e Schuster, 1978; Schuster et al., 1979).

1.4.4 Decomposio catalisada de perxidos

1.4.4.1 Catlise Intermolecular

Parece que a catlise intermolecular inicia-se por um complexo de transferncia de

carga entre o perxido e o ativador, seguindo-se de uma transferncia de eltron do ativador

para o perxido, provavelmente concomitantemente com a quebra da ligao O-O. Na

seqncia, ocorre a quebra da ligao C-C, com perda de fragmento neutro, transformando o

perxido num radical nion. Na verdade esta perda de fragmento neutro deixa um par de

___________________________________________________________________________

Introduo - 43

radicais em contato na gaiola do solvente (o radical ction do ativador e o radical nion do

perxido). A transferncia de eltron de volta entre estes dois ons radicais pode liberar

energia suficiente para formar o ativador em seu estado singlete excitado (Scandola et al.,

1981; Schuster e Horn, 1982).

1.4.4.2 Catlise Intramolecular

Geralmente, a clivagem trmica de 1,2-dioxetanos gera duas carbonilas, uma delas

podendo ser formada no seu estado excitado, predominantemente triplete (Zimmerman et al.,

1976; Koo e Schuster, 1977). Entretanto, quando dioxetanos possuem um substituinte rico em

eltrons, obtm-se predominantemente o estado singlete, e acredita-se que ocorra uma CIEEL

intramolecular (Nakamura e Goto, 1979a, 1979b; Zaklika et al., 1979). A grande eficincia da

produo do estado singlete e da quimiluminescncia podem ser explicadas em termos da

conjugao de um grupo doador de eltrons e cromforo altamente fluorescente com o estado

excitado da carbonila a ser formada (McCapra, 1977; Nakamura e Goto, 1979b).

1.5 Propagao do dano e conseqncias biolgicas da oxidao de resduos de

aminocidos em protenas

Estudos tm demonstrado que perxidos de peptdeos e protenas tm uma meia vida

relativamente longa (vrias horas, num ambiente celular) (Wright et al., 2003). Ainda no se

sabe claramente qual a razo da longa meia-vida, mas experimentos mostraram que a maioria

dos sistemas responsveis pela remoo de perxidos nas clulas no reagem rapidamente

com espcies derivadas de protenas (Morgan et al., 2004).

Os perxidos de protenas podem sofrer decomposio trmica ou catalisada por ons

metlicos, gerando radicais peroxila (Hawkins e Davies, 2001) (Equao 1.5)

ROOH + Fe3+ ROO + Fe2+ + H+ (Equao 1.5)

___________________________________________________________________________

Introduo - 44

Os perxidos de protenas tambm podem sofrer reduo por um eltron gerando

radicais alcoxila (reao de Fenton) (Hawkins e Davies, 2001) (Equao 1.6).

ROOH + Fe2+ RO + HO- + Fe3+ (Equao 1.6) Deste modo, a formao de perxidos em uma protena pode resultar em danos

subseqentes a outras protenas. Estes danos incluem inativao enzimtica, como a que foi

demonstrada quando caspases, cisteno-proteases que desempenham um papel central na

apoptose, foram expostas a hidroperxidos de triptofano e tirosina (Hampton et al., 2002).

Outro exemplo de inativao enzimtica o da enzima gliceraldedo 3-fosfato desidrogenase.

Perxidos de protenas demonstraram reagir com o grupo tiol do stio ativo desta enzima,

inativando-a (Morgan et al., 2002). Recentemente, foi demonstrada a oxidao seletiva de

certos resduos de cistena da ATPase dependente de clcio do retculo sarco/endoplasmtico

por perxidos de triptofano e tirosina. Estes perxidos foram inclusive mais reativos que o

H2O2. Utilizando ferramentas analticas importantes tais como HPLC acoplado a

espectrometria de massa em tandem, foi possvel identificar os resduos de cistena mais

susceptveis oxidao e correlacionar estes achados com a estrutura da protena e o

mecanismo de oxidao (Dremina et al., 2007).

Geralmente as modificaes oxidativas levam a uma perda de funo destas protenas

(ou ganho de uma funo indesejada). Com o intuito de evitar o acmulo em excesso destas

protenas danificadas, as clulas eucariticas dispem de um sistema proteassomal,

responsvel pela degradao de protenas oxidadas no citoplasma, ncleo e retculo

endoplasmtico (Grune et al., 2003).

Uma oxidao moderada das protenas aumenta sua suscetibilidade protelise e as

torna substrato para o proteassomo. Contudo, protenas severamente oxidadas parecem ser

substratos de difcil ubiquitinao, primeiro agregando-se e ento formando ligaes cruzadas

que as tornam altamente resistentes protelise. A incapacidade de degradar protenas

extensivamente oxidadas pode contribuir para o acmulo de agregados proticos que ocorre

___________________________________________________________________________

Introduo - 45

em algumas doenas (incluindo vrias doenas neurodegenerativas tais como doena de

Alzheimer e Parkinson) e durante o processo de envelhecimento (Grune et al., 2003).

1.5.1 Modificaes oxidativas em protenas: um enfoque em resduos de triptofano

Uma das reaes mais amplamente estudadas na rea de agregao de protenas a

formao da ligao 2,2-bifenil entre dois radicais de tirosina, gerando ditirosina (Giulivi et

al., 2003). Entretanto, recentemente tm-se demonstrado que produtos de oxidao do

triptofano tambm parecem estar envolvidos em alguns eventos relacionados formao de

ligaes cruzadas e agregados proticos. Dentro deste contexto, cabe ressaltar a importncia

da formao de derivados oxidados do triptofano, em especial FMK e kn. bem conhecido

que o acmulo gradual de quinureninas nos tecidos humanos pode resultar em um aumento do

dano por fotossensibilizao, j que estes compostos so agentes fotossensibilizantes

eficientes. Este ponto particularmente significante em rgos humanos expostos radiao

solar (Posadaz et al., 2004). Como exemplo, pode-se citar o cristalino do olho humano, que

desempenha um papel fundamental na viso. O cristalino contm compostos de baixo peso

molecular (formados principalmente de quinureninas) que atuam como filtros intra-oculares,

absorvendo a luz UV na regio situada entre 300 400 nm, e prevenindo o dano induzido

retina por esta luz. Muitos pesquisadores tm investigado a possibilidade de estes filtros

modificarem covalentemente o cristalino. Em pessoas jovens, as molculas de filtros UV

existem primariamente na forma livre. Entretanto, com o passar do tempo, o nvel de

quinureninas ligadas covalentemente s protenas do cristalino do olho aumenta

exponencialmente (Vazquez et al., 2002). Parker e colaboradores demonstraram que a foto-

exposio de agregados quinurenina-protena pode iniciar um dano oxidativo mediado pelo

1O2 s protenas do cristalino do olho (Parker et al., 2004). Esta foto-oxidao resulta em

formao de H2O2 e outros perxidos proticos.

___________________________________________________________________________

Introduo - 46

Outra implicao biolgica observada envolvendo produtos de oxidao do triptofano

(kn e FMK) foi a formao de agregados covalentes da superxido dismutase humana. Parece

que a oxidao de um resduo de triptofano kn e FMK resulta em ligaes cruzadas e

agregados proteicos. Estes agregados parecem estar envolvidos na esclerose lateral

amiotrfica, uma doena degenerativa do neurnio motor (Zhang et al., 2003; Zhang et al.,

2004a; Zhang et al., 2004b). Outro dado importante foi a comprovao de que o resduo de

W32 potencializa a agregao e a citotoxicidade da superxido dismutase. A substituio

deste resduo de W por fenilalanina resultou em uma diminuio desta citotoxicidade (Taylor

et al., 2007). Estes estudos demonstram que o resduo de W 32 fundamental no

desenvolvimento de agregados covalentes desta enzima, e que parece que esta agregao

dependente da formao de FMK e kn. Entretanto, os dados disponveis at agora no so

capazes de elucidar os mecanismos qumicos destas reaes.

Tm-se demonstrado que a oxidao protica gera uma srie de implicaes biolgicas

como as acima citadas, por exemplo, formao de agregados proticos e modificaes

oxidativas acumuladas durante o desenvolvimento de catarata. Alm disso, tm-se

demonstrado que o triptofano um aminocido extremamente susceptvel a oxidao,

inclusive pelo 1O2. Entretanto, h poucos trabalhos enfocando detalhadamente as reaes,

com estudos de estabilidade, identificao de subprodutos e propostas mecansticas. Desta

forma, pretendemos com este trabalho contribuir no esclarecimento do mecanismo de

oxidao do triptofano pelo 1O2, atravs da anlise e caracterizao de produtos de oxidao

gerados e de estudos para elucidar os mecanismos destas reaes.

___________________________________________________________________________

Objetivos - 47

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Contribuir no esclarecimento das bases qumicas envolvidas na oxidao do triptofano pelo

1O2, atravs da anlise e caracterizao de produtos de oxidao gerados e de estudos para

elucidar os mecanismos destas reaes.

2.2 Metas

9 Sintetizar, purificar e caracterizar por HPLC/MS/MS e RMN os produtos formados

pela oxidao do triptofano pelo 1O2;

9 Sintetizar os produtos de oxidao do triptofano pelo 1O2 isotopicamente marcados

com [18O] para estudos mecansticos;

9 Avaliar a estabilidade dos principais foto-produtos em diferentes temperaturas e pHs,

bem como a reatividade frente a metais;

9 Estudar os mecanismos de decomposio dos foto-produtos iniciais, utilizando

marcao isotpica acoplada experiementos de HPLC/MS/MS e medidas de emisso

de luz.

___________________________________________________________________________

Materiais e Mtodos - 48

3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Materiais

A gua deuterada (99,9 %), a gua marcada com [18O] (H218O, 97 %), o 9,10-

difenilantraceno (DPA), e o 9,10-dibromoantraceno (DBA) foram obtidos junto a Aldrich

(Wisconsin, Estados Unidos).

cido sulfrico, azul de metileno e cido frmico foram adquiridos junto Merck

(Rio de Janeiro, Brasil).

Alaranjado de xilenol foi adquirido junto a Synth (Diadema, Brasil).

Cloreto de sdio, tampo tris, azida de sdio, dimetilsulfxido (DMSO), formiato de

amnio, fosfato de sdio monobsico, fosfato de sdio dibsico, acetato de sdio, hidrxido

de sdio, borohidreto de sdio (NaBH4), resina Chelex, rosa bengala, L- triptofano (W),

cloreto de cobre (CuCl2) e sulfato de ferro heptahidratado (FeSO4 . 7 H2O) foram obtidos da

Sigma (Missouri, Estados Unidos).

Os filtros de seringa Acrodisc de 13 mm com membrana de politersulfona de 0,2 m foram obtidos junto Pall Corporation (Arbor, MI, Estados Unidos).

Colunas para HPLC, LC-18 Luna (250 x 4,6 mm, tamanho de partcula 5 m) e coluna semi-preparativa LC-18(2), Luna, (250 x 10 mm, tamanho de partcula 10 M) foram obtidas junto Phenomenex (Califrnia, Estados Unidos).

gua oxigenada 35 % foi adquirida da Perxidos do Brasil (Paran, Brasil).

Todos os solventes utilizados (acetonitrila, metanol, etanol) eram de nvel para HPLC

e foram adquiridos da Merck (Rio de Janeiro, Brasil). A gua ultrapura utilizada foi tratada

pelo sistema de purificao da Water System Nanopure da marca Barnstead (Iowa, Estados

Unidos).

___________________________________________________________________________

Materiais e Mtodos - 49 3.2 Equipamentos

- Agitador Thermomixer Confort da Eppendorf (Hamburgo, Alemanha) modelo 5355.

- Balanas da Denver Instrument Company (Estados Unidos) modelos XE-310 e AA-200.

- Centrfuga da Hitachi (Tquio, Japo) modelo SCR 20B.

- Espectrofotmetro da Hitachi (Tquio, Japo) modelo U-3000.

- Injetor manual da Rheodyne (Califrnia, Estados Unidos).

- Liofilizador Savant (Nova Iorque, Estados Unidos), modelo RVT 4104.

- pHmetro da Corning (Estados Unidos) modelo 320.

- Sistema de HPLC da Shimadzu (Tquio, Japo): 2 bombas LC-10ADVP, injetor automtico

SIL-10ADvp, detector de absorbncia UV SPD-10AVVP, detector de fluorescncia RF-551,

detector de fotodiodos em srie SPD-M10AVVP, controlador de Sistema SCL-10AVP

conectado a um computador e software CLASS-VP verso 5.03.

- Sistema de MS composto por: espectrmetro de massa Quattro II da Micromass

(Manchester, Reino Unido), com fonte API z-spray e software Masslynx verso 3.2.

- Espectrmetros de ressonncia magntica nuclear (RMN) modelos DRX 500, srie Avance,

e AC 200, da Bruker Biospin (Alemanha).

- Sistema contador de ftons que consiste em um tubo fotomultiplicador sensvel na regio do

vermelho (9203 BM Thor