Costa, C.F.

1

1. INTRODUÇÃO

Os parasitas do gênero Leishmania são protozoários flagelados, pertencentes ao

filo Sarcomastigophora, ordem Kinetoplastida e família Trypanosomatidae.

Diversas manifestações clínicas são observadas em infecções causadas por

diferentes espécies de Leishmania, variando desde lesões cutâneas localizadas e/ou

difusas, lesões muco-cutâneas, até lesões viscerais, que são potencialmente fatais.

Estima-se que cerca de 12 milhões de pessoas em todo o mundo estão infectadas

por diferentes espécies de Leishmania, sendo aproximadamente 2 milhões de casos

relatados anualmente.

O gênero Leishmania possui dois hospedeiros em seu ciclo de vida: um

hospedeiro invertebrado, que é o hospedeiro intermediário, e um hospedeiro

vertebrado, o hospedeiro definitivo. A transmissão dos protozoários para o

hospedeiro vertebrado ocorre pela picada de fêmeas de insetos dos gêneros

Phlebotomus (encontrados em países do chamado “Velho Mundo”) ou Lutzomyia

(encontrados em países do “Novo Mundo”). A figura 1 apresenta, de forma resumida,

o ciclo de vida de Leishmania.

Costa, C.F.

2

Figura 1 – Ciclo de vida de Leishmania sp. Modificado de Burchmore & Barret, 2001.

No ciclo biológico de Leishmania, destacam-se duas formas infectivas: as formas

promastigotas e as amastigotas. As formas promastigotas são encontradas inicialmente

aderidas ao intestino médio do inseto vetor, migrando para o aparelho bucal no

momento da diferenciação da forma procíclica para a metacíclica – metaciclogênese

(Muskus & Marín-Villa, 2002). As amastigotas são formas intracelulares fagocitadas por

macrófagos ou outras células do Sistema Mononuclear Fagocitário quando entram em

contato com o hospedeiro vertebrado ou no momento em que são liberadas de

macrófagos do hospedeiro durante a infecção.

Ambas as formas são capazes de infectar macrófagos, desde que sejam fagocitadas

quando interagem com o hospedeiro vertebrado. Promastigotas de Leishmania entram

em contato com o hospedeiro vertebrado no momento do repasto sangüíneo do inseto

vetor. As formas amastigotas podem ser fagocitadas novamente no organismo do

hospedeiro vertebrado já infectado, quando rompem a célula hospedeira e são liberadas.

Costa, C.F.

3

Assim, entram em contato com outros macrófagos e são fagocitadas, reiniciando a

infecção (revisado em Vannier-Santos, 2002).

Em cultura, as formas promastigotas são cultivadas extracelularmente, e demoram

um tempo estimado em 7 dias para completar seu ciclo de vida. Após o terceiro dia, as

formas promastigotas encontram-se em fase exponencial de crescimento, e a partir do

quinto dia, entram em fase estacionária. Nesse tempo, estão aptas a infectar

macrófagos, pois estão individualizadas e assim promovem uma infecção bem

estabelecida in vitro (Bates, 1994).

As formas amastigotas podem ser retiradas de lesões presentes em animais

experimentais ou serem cultivadas como culturas axênicas, desde que estejam em

condições apropriadas (pH 5,5 e temperatura de 37°C) (Al-Bashir & Rassam, 1992). Em

ambos os casos, são capazes de infectar e estabelecer uma infecção bem sucedida em

culturas de macrófagos in vitro embora precisem de um tempo maior para estabelecer a

infecção (Callahan et al., 1997). A habilidade em cultivar amastigotas axênicos in vitro

tem sido importante para o teste da atividade de novas drogas no tratamento da forma

clinicamente relevante de Leishmania (Callahan et al., 1997).

1.1. Biologia Celular de Leishmania sp.

As formas promastigotas são alongadas, medindo de 5 a 20 x 1 a 4µm de

comprimento; as amastigotas são arredondadas e medem entre 2 e 4µm de diâmetro. O

formato celular é determinado por um arranjo de microtúbulos subpeliculares, dispostos

abaixo da membrana plasmática, de forma longitudinal ao corpo do parasita. O flagelo

está inserido na bolsa flagelar, e obedece à configuração 9+2, ou seja, consiste de nove

pares de microtúbulos na periferia, circundando um par de microtúbulos centrais

(revisado em Vannier-Santos, 2002) (figuras 2 e 3).

Costa, C.F.

4

Figura 2 – Microscopia Eletrônica de Transmissão das formas promastigota (esquerda) e amastigota (direita) de Leishmania sp. As principais organelas podem ser observadas, tais como (N) – núcleo, (K) – cinetoplasto, (P) – bolsa flagelar, (F) – flagelo e (M) – megassomos (em amastigotas). Retirado de Vannier-Santos, 2002.

Figura 3 - Esquema mostrando as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania spp. e ilustrando as

organelas e estruturas presentes no parasito. Besteiro et al., 2007.

Costa, C.F.

5

A região da bolsa flagelar é o local onde ocorre todo o transporte de vesículas em

ambas as formas do parasita (Webster & Russell, 1993). As vesículas secretoras não

apresentam um conteúdo denso, sendo por isso difícil distingui-las das vesículas

endocíticas, que se formam na região flagelar e estão envolvidas na aquisição de

importantes macromoléculas ou complexos macromoleculares, tais como LDL (revisado

em De Souza, 2006).

Além das organelas presentes em todas as células eucarióticas convencionais,

os protozoários do gênero Leishmania possuem ainda algumas organelas

características, como megassomos, acidocalcissomos, glicossomos e cinetoplasto.

Os megassomos são organelas grandes quando vistas através de Microscopia

Eletrônica de Transmissão, semelhantes a um lisossomo, cujo principal conteúdo

consiste de proteinases de cisteína. Estas organelas foram primeiramente descritas em

espécies de Leishmania mexicana (Ueda-Nakamura et al., 2007), e sua principal função

está relacionada com a acumulação e possível degradação de macromoléculas

endocitadas (revisado em Vannier-Santos, 2002). Os megassomos parecem estar

envolvidos também no processo de interação parasita-célula hospedeira, de

diferenciação e sobrevivência intracelular do parasita, devido às proteinases presentes

nestas organelas e ainda na acumulação e degradação de macromoléculas em

Leishmania (Ueda-Nakamura et al., 2002). A inibição de proteinases de cisteína é capaz

de prejudicar o desenvolvimento de amastigotas no interior de macrófagos, fazendo

desta organela um possível alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos (Frame et

al., 2000).

Os acidocalcissomos são organelas com a capacidade de acumular grande

quantidade de íons cálcio, mas também outros íons, como magnésio e zinco, além de

conterem enzimas pirofosfatase e polifosfatase (Do Campo & Moreno, 2001). Estas

organelas são facilmente visualizadas através de Microscopia Eletrônica de

Transmissão, sendo semelhantes a vacúolos parcialmente vazios.

Os acidocalcissomos foram durante algum tempo confundidos com lisossomos, e

sabe-se que possuem esse aspecto por causa da aparente elétron-densidade. Eles

estão envolvidos na resposta a várias formas de estresse, como mudanças no pH e

Costa, C.F.

6

pressão osmótica, as quais os parasitas sofrem durante sua interação com a célula

hospedeira (Rao & Kornberg, 1996; Kornberg et al., 1999; Ruiz et al., 2001). Os níveis

desta organela são baixos na forma promastigota procíclica. Entretanto, no momento da

diferenciação das formas promastigotas procíclicas em metacíclicas – metaciclogênese

– os níveis desta organela aumentam, tornando-se semelhantes àqueles verificados na

forma amastigota, o que evidencia a importância desta organela na infectividade do

parasita (Zhang et al., 2005).

Os glicossomos consistem de peroxissomos modificados, com a capacidade de

compartimentalizar algumas vias metabólicas, como a via glicolítica, promovendo assim

a geração de ATP. Além da via glicolítica, outras vias metabólicas, como a β-oxidação

de ácidos graxos, a biossíntese de pirimidina e o metabolismo de purinas podem

acontecer nesta organela. A quantidade e o conteúdo enzimático desta organela variam

de acordo com a forma infectiva e a espécie de tripanossomatídeo em questão. A

compartimentalização das vias metabólicas nesta organela parece ser muito importante

nos tripanossomatídeos por permitir a regulação do processo, capacitando à célula a

enfrentar períodos curtos de anaerobiose (Michels et al., 2006).

Leishmania, da mesma forma que outros tripanossomatídeos, possuem uma

mitocôndria única e ramificada, que se estende por todo o corpo celular e tem um

grande conteúdo de material genético localizado em uma região específica da organela,

o cinetoplasto. O cinetoplasto fica em uma região vizinha ao corpo basal do flagelo, e é

responsável pela síntese e armazenamento de uma molécula de DNA menor

(minicírculo) e outra maior (maxicírculo), ambos presentes na mitocôndria (Simpson,

1986). Este DNA é codificado pela enzima topoisomerase II durante o processo de

replicação do DNA. Esta mesma enzima é ainda importante para os demais

tripanossomatídeos nos processos de transcrição, recombinação, condensação da

cromatina e segregação cromossômica (Wang, 2002).

O DNA minicírculo é responsável por codificar pequenas seqüências-molde, que

coordenam a síntese de RNA do cinetoplasto. Existem ainda muitos DNA minicírculos

que são intermediários no processo de replicação (revisado em Vannier-Santos, 2002).

O DNA maxicírculo se assemelha ao DNA mitocondrial eucariótico por codificar

RNA ribossomal e algumas proteínas, principalmente aquelas envolvidas na transdução

Costa, C.F.

7

de energia, tais como subunidades de citocromo c e NADH desidrogenase (Shapiro &

Englund, 1995).

1.2. Interação Leishmania x Macrófago

1.2.1. Célula hospedeira

Os macrófagos fazem parte do Sistema Mononuclear Fagocítico, sendo

consideradas “células fagocitárias profissionais”. Outros tipos celulares pertencentes a

este grupo são células dendríticas e neutrófilos.

As funções dos macrófagos são relacionadas à destruição de células senescentes, e

também a destruição de patógenos, como alguns protozoários (revisado em Tauber,

2003).

As infecções só ocorrem quando um determinado patógeno tem a capacidade de

resistir aos mecanismos de destruição apresentados pelos macrófagos (Tauber, 2003).

Sendo assim, conseguem sobreviver no citoplasma da célula, livres ou inseridos em um

vacúolo (revisado em Furth, 1972).

1.2.2. Invasão e formação do vacúolo parasitóforo

Patógenos em geral possuem diversas estratégias de invasão ao meio intracelular.

Eles devem alcançar o citoplasma de uma determinada célula-alvo – no caso, os

macrófagos – de modo a garantir sua sobrevivência e proliferação neste ambiente. Para

tanto, diferentes patógenos utilizam diferentes estratégias para o sucesso na invasão

(revisado em Gruenberg & van der Goot, 2006).

A fagocitose é utilizada por muitos patógenos como mecanismo de entrada em

hospedeiros vertebrados. Entretanto, a entrada na célula hospedeira por meio de

fagocitose oferece o risco da degradação pelos mecanismos de defesa desempenhados

por macrófagos ou outras células fagocíticas envolvidas. Assim, para que a entrada e

estabelecimento desses patógenos sejam bem sucedidos, eles precisam desenvolver

mecanismos eficientes de sobrevivência às condições hostis do meio intracelular, a fim

Costa, C.F.

8

de garantir a sobrevivência. Nesse sentido, protozoários do gênero Leishmania são bem

adaptados à entrada na célula hospedeira através da fagocitose por macrófagos, pois

conseguem entrar e se estabelecer no ambiente intracelular, evitando a destruição,

dessa forma multiplicando no interior do fagossomo.

A interação entre o parasita e a célula hospedeira, seja o macrófago ou a célula

epitelial do intestino médio do inseto, é muito importante para o sucesso do

estabelecimento do mesmo no interior do hospedeiro. Nesse sentido, entender os

processos de invasão e evasão do parasita à célula hospedeira, bem como as

alterações pelas quais o protozoário passa durante o tempo de interação com os seus

hospedeiros e as moléculas da superfície do parasita envolvidas neste processo, é de

grande relevância (Mello, 1997) (figura 4).

Figura 4 – Entrada e estabelecimento de Leishmania sp no interior do macrófago hospedeiro,

formação do vacúolo e conversão das formas promastigotas em amastigotas. Modificado de Nyalwhide et

al., 2003.

Costa, C.F.

9

No momento da interação entre as formas promastigotas de Leishmania e os

macrófagos, ocorrem modificações nos domínios de membrana da célula hospedeira

(revisado em Gruenberg & van der Goot, 2006). Dentre as moléculas presentes na

membrana de Leishmania, duas proteínas são muito importantes para o sucesso da

invasão do parasita e seu estabelecimento no interior do vacúolo: uma glicoproteína

(gp63) e a molécula de lipofosfoglicana (LPG) (revisado em Denkers & Butcher, 2005).

Estas moléculas interagem com receptores do complemento – CR1 e CR3 – presentes

na membrana dos macrófagos.

A molécula de gp63 é uma das mais abundantes encontradas na superfície das

formas promastigotas, sendo distribuída por todo o corpo celular destas (Bogdan &

Röllinghoff, 1999). Esta glicoproteína é uma metaloprotease dependente de zinco, com

uma ampla variedade de substratos, e forma domínios de membrana nas formas

promastigotas, em regiões de contato com a célula hospedeira. Assim, gp63 está

envolvida na infectividade do parasita e na forma como este vai se ligar à membrana da

célula hospedeira (Mosser & Rosenthal, 1993).

No momento da diferenciação das formas promastigotas em amastigotas, a

quantidade de gp63 na superfície da célula diminui, evidenciando sua função no

processo de entrada do parasita na célula hospedeira e também na sobrevivência da

forma amastigota e modulação da resposta imune do hospedeiro (revisado em Olivier et

al., 2005).

Igualmente importante para o estabelecimento das formas promastigotas no interior

da célula hospedeira e diferenciação na forma amastigota é a molécula de LPG. A

molécula de LPG é formada por unidades repetidas de um dissacarídeo e um fosfato,

que são ligados à membrana através de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI),

sendo ainda a molécula mais abundante presente na superfície da membrana de

promastigotas, e afeta uma série de mecanismos desempenhados pela célula

hospedeira, como a degradação do conteúdo interno do vacúolo formado, talvez pelo

atraso no processo de fusão lisossomal (revisado em Gruenberg & van der Goot, 2006).

A estrutura da molécula de LPG é variável, dependente da espécie de Leishmania e

também da forma infectiva em que o parasita se encontra (revisado em Olivier et al.,

2005).

Costa, C.F.

10

Durante a transição entre as formas infectivas, o número de unidades repetidas de

LPG na membrana dobra na transição da forma promastigota procíclica para a

metacíclica, provavelmente devido à importância da molécula na virulência e, dessa

forma, permitindo que a forma metacíclica se desprenda do aparelho bucal do inseto e

entre em contato com o organismo vertebrado (revisado em Lodge & Descoteaux, 2005).

A presença de LPG na membrana de promastigotas é um fator determinante para o

atraso na fusão de lisossomos ao vacúolo contendo o parasita, pois a molécula é

transportada para a membrana vacuolar, o que impede a fusão de lisossomos

(Nyalwhide et al., 2003). Isso pode ser evidenciado pela abundância de LPG na

membrana de promastigotas, formando um glicocálix que protege a célula, reduzindo

progressivamente sua expressão na diferenciação em amastigotas (Bogdan &

Röllinghoff, 1999). Em contrapartida, o número de moléculas de LPG volta a cair no

processo de diferenciação da forma metacíclica em amastigotas, permitindo a fusão do

vacúolo parasitóforo com lisossomos (revisado em Lodge & Descoteaux, 2005).

Alguns estudos anteriores sugerem que, em algumas espécies de Leishmania, a

formação do vacúolo parasitóforo seja dependente de um rearranjo do citoesqueleto da

célula hospedeira. Moléculas de F-actina são acumuladas ao redor da membrana do

vacúolo em formação no momento da invasão à célula hospedeira. Assim, o

citoesqueleto formado por F-actina contribui não só para a formação do vacúolo, mas

forma uma barreira que impede a fusão do vacúolo parasitóforo com lisossomos em

espécies de L. donovani (Holm et al., 2001). Porém, esse rearranjo do citoesqueleto não

é uma característica presente em todas as espécies de Leishmania. Como observado

em outros estudos, o vacúolo contendo L. amazonensis não depende da acumulação de

F-actina para sua formação (Courret et al., 2002).

No momento da invasão do parasita à célula hospedeira, o vacúolo formado é

derivado da maturação e fusão com organelas da via endocítica da célula e torna-se

acidificado aproximadamente 30 minutos após sua formação. Este meio adverso é

superado pelo parasita através da ação de uma ATPase translocadora de prótons

presente na membrana, mantendo o pH neutro no interior do parasito (Glaser et al.,

1992).

Costa, C.F.

11

Algumas espécies de Leishmania têm a capacidade de evitar a fusão do vacúolo com

lisossomos da célula hospedeira até que se diferenciem na forma amastigota, como L.

donovani. Porém, outras espécies, como L. amazonensis, são capazes de resistir ao

ambiente ácido do vacúolo parasitóforo mesmo antes da diferenciação em amastigotas,

permitindo a fusão de lisossomos mesmo antes da completa diferenciação das formas

promastigotas em amastigotas. Ao mesmo tempo, o vacúolo que abriga L. amazonensis

tem como característica ser um vacúolo grande, comum a outras amastigotas (Courret et

al., 2002). As formas amastigotas de todas as espécies do gênero Leishmania são

metabolicamente ativas em pH ácido, por isso, mesmo após a fusão com lisossomos,

elas conseguem sobreviver e se dividir no ambiente acidificado do fagolisossomo

formado (revisado em Leirião et al., 2004).

1.2.3. Estabelecimento do parasita no ambiente intracelular

O vacúolo parasitóforo, como já referido, possui um pH ácido, em torno de 4,7 a 5,2.

Entretanto, as formas amastigotas conseguem sobreviver e ainda manter o pH no meio

intracelular em torno de 7,0. Isso é devido à presença de um gradiente de prótons na

membrana do parasita, cuja manutenção é essencial para a sobrevivência deste

(Burchmore & Barret, 2001).

Após a completa diferenciação das formas promastigotas em amastigotas e seu

estabelecimento em um pH ácido, os parasitas são capazes de se dividir no interior do

vacúolo e ainda proliferar, estabelecendo a infecção no hospedeiro vertebrado (figura

5).

Costa, C.F.

12

Figura 5 – Estabelecimento das formas amastigotas no interior do vacúolo, com subseqüente divisão

celular e liberação do parasita, estabelecendo a infecção no hospedeiro vertebrado. Modificado de

Vannier-Santos, 2002.

A entrada bem sucedida do parasita no meio intracelular é de suma importância para

que todos os eventos acima observados ocorram. Para tal, o parasita deve desenvolver

estratégias de escape dos mecanismos microbicidas apresentados por macrófagos.

Deve ainda se adaptar a um vacúolo que atenda às suas necessidades nutricionais, ao

mesmo tempo fornecendo proteção à degradação.

Já no início do processo de entrada e estabelecimento do parasita no ambiente

intracelular, a molécula de gp63 tem importância na proteção das formas amastigotas à

degradação. Esta molécula é capaz de converter o componente C3b do sistema

complemento em uma forma inativa, C3bi. Assim, as formas promastigotas conseguem

escapar da opsonização pelo complemento, evitando a degradação mediada por esta

via (revisado em Olivier et al., 2005).

No interior do macrófago, as formas amastigotas de Leishmania conseguem inibir as

funções dos macrófagos, como os processos de produção de radicais livres,

Costa, C.F.

13

apresentação de antígenos e produção de citocinas, decorrentes da ativação da

expressão de moléculas imunossupressoras pelos parasitas, como metabólitos de ácido

araquidônico, e citocinas como IL-10 e TGF-β (revisado em Olivier et al., 2005). O

processo de ativação da expressão de moléculas imunossupressoras é provavelmente

devido à interação entre o macrófago e fosfatidilserina exposta na membrana das formas

amastigotas (Freitas Balanco et al., 2001), processo conhecido por “mimetismo

apoptótico” e relatado em trabalhos anteriores (Freitas Balanco et al., 2001; Wanderley

et al., 2005). A inibição dos mecanismos de defesa de macrófagos infectados por

Leishmania está representada na figura 6.

Figura 6 – Inibição dos mecanismos de defesa de macrófagos durante a interação com Leishmania.

Modificado de Olivier et al. , 2005.

Costa, C.F.

14

Duas moléculas microbicidas produzidas por macrófagos são muito importantes para

a degradação de patógenos no meio intracelular: óxido nítrico (ON) e espécies reativas

de oxigênio (ROI) (Liew et al., 1990; Murray, 1982). ON é produzido através da atividade

da enzima óxido nítrico sintase (iNOS), e a atividade desta enzima parece ser inibida

pela presença de LPG na superfície de Leishmania em resposta à produção de INF-γ

pelos macrófagos infectados (Proudfoot et al., 1995; Proudfoot et al., 1996). A inibição

na produção de ON ainda deve ser um resultado da produção de algumas citocinas,

como interleucina-10 (IL-10) e TGF-β, e da inativação de algumas vias de sinalização,

como JAK/STAT, ativação de fosfatases de fosfotirosina e produção de ceramidas.

A produção de ROI também parece ser inibida por LPG e gp63 (Sorensen et al.,

1994; Descoteaux & Turco, 1999), mas parece ter menos importância na eliminação do

parasita do ambiente intracelular (Murray & Nathan, 1999).

A apresentação de antígenos pelo macrófago infectado também fica comprometida,

já que Leishmania consegue diminuir a capacidade de apresentação de antígenos a

outros componentes do sistema imune, o que parece estar relacionado com a

infectividade do parasita (Reiner et al., 1987). Esta inibição da apresentação de

antígenos parece também estar relacionada à inibição da expressão gênica de MHC de

classe II em L. donovani (De Almeida et al., 2003), ou por interferir no reconhecimento

de antígenos pelas moléculas de MHC de classe II, ou ainda através da endocitose

destas moléculas ou os próprios antígenos, inserindo-os no fagolisossomo, como é o

caso de L. amazonensis (De Souza Leão et al, 1995; Kima et al., 1997).

Leishmania ainda é capaz de prevenir a ativação de uma resposta imune efetiva

através da inibição na produção de citocinas, principalmente àquelas envolvidas na

resposta inflamatória (IL-1 e TNF-α) ou a ativação de linfócitos T (IL-12). Isso representa

um mecanismo de sobrevivência pelo qual os parasitas são capazes de inibir qualquer

reação inflamatória (revisado em Olivier et al., 2005).

O vacúolo que abriga L. amazonensis é um vacúolo largo, que pode conter várias

amastigotas. A formação de um vacúolo com essas características é possibilitada pela

secreção, pelo parasita, de uma molécula proteofosfoglicana (aPPG) não filamentosa no

meio extracelular, o que provavelmente contribui para o alargamento do vacúolo

parasitóforo. Acredita-se que esta proteína seja semelhante a LPG, compartilhando com

Costa, C.F.

15

esta alguns carboidratos. Assim, a molécula de aPPG contribui para a formação de

vacúolos largos (revisado em Vannier-Santos, 2002).

1.2.4. Aquisição de nutrientes no interior do vacúolo

As células eucarióticas em geral adquirem nutrientes por duas vias: através da

endocitose de macromoléculas, mediada por receptores presentes na membrana da

célula e através de transporte ativo de solutos de baixo peso molecular. No caso de

Leishmania, o sistema endocítico da célula hospedeira é subvertido, de modo que os

nutrientes produzidos e adquiridos pela célula são levados para o vacúolo parasitóforo

pelas duas vias citadas (revisado em Burchmore & Barret, 2001) (figura 7).

Figura 7 – Modelo para a aquisição de nutrientes em amastigotas de Leishmania no interior do

vacúolo parasitóforo. Modificado de Burchmore & Barret, 2001.

O ambiente ácido no interior do vacúolo parasitóforo, assim como a disponibilidade

de oxigênio e dióxido de carbono no interior do vacúolo, parecem ser muito importantes

para a eficiente aquisição de nutrientes pelo parasita. A acidificação do vacúolo

parasitóforo ocorre através do processo de fusão de endossomos e posteriormente de

Costa, C.F.

16

lisossomos com este. O ambiente ácido formado é altamente hidrolítico, devido à

presença de enzimas hidrolases e proteases, sendo muito favorável à degradação de

macromoléculas. Assim, são produzidos nutrientes de baixo peso molecular. A

acidificação do vacúolo pode ser acelerada pela secreção de proteinases de cisteína

pelo parasita, dessa forma acelerando também a aquisição de nutrientes. Assim, as

amastigotas otimizam a utilização de ácidos graxos e aminoácidos como fontes de

carbono (Hart e Coombs, 1982).

Os nutrientes presentes no vacúolo parasitóforo são então disponibilizados às formas

amastigotas de Leishmania aí inseridas. O pH interno do parasita é neutro, como já

referido anteriormente, e isso é possível pela presença de ATPases presentes na

membrana. Porém, a membrana externa do parasita é adaptada a resistir às condições

ácidas impostas a ela no vacúolo parasitóforo. Ao mesmo tempo, esta membrana possui

receptores e canais que permitem a entrada de nutrientes além de transportadores de

membrana do tipo simporte, para a aquisição de macromoléculas (McConville et al.,

2007). Desse modo, várias moléculas de aminoácidos e nucleosídeos hidrolisadas no

vacúolo parasitóforo são transportadas para o interior das amastigotas, que adquirem os

nutrientes necessários ao seu estabelecimento no meio intracelular (Burchmore &

Barret, 2001).

O vacúolo parasitóforo parece ser um ambiente pobre em hexoses, como a glicose

(McConville et al., 2007; Opperdoes & Coombs, 2007). Assim, os parasitas dependem

de vias metabólicas que permitem a produção de glicose a partir de outras fontes de

carbono, como a gliconeogênese. Quando a gliconeogênese não é suficiente para suprir

as necessidades de glicose do parasita, a via das pentoses fosfato é ativada, além da

produção intracelular de mananas, principais reservas energéticas em curto prazo

destes parasitas (Sernee et al., 2006).

A aquisição de nutrientes pelas amastigotas presentes no vacúolo parasitóforo é

também devido à presença de moléculas tanto do vacúolo quanto de endossomos e

lisossomos que se fundem a ele no momento de sua maturação (Burchmore & Barret,

2001).

Costa, C.F.

17

Uma importante fonte nutricional para Leishmania é a transferrina. Esta molécula é

transportada do vacúolo parasitóforo para o interior do parasita, sendo degradada e

assim constituindo uma fonte de ferro (Borges et al., 1998).

Outra molécula importante, não só na aquisição de nutrientes, mas na virulência do

parasita, é a tripanotiona. Esta molécula é produzida em amastigotas virulentos e está

envolvida em numerosas atividades metabólicas desempenhadas pelo parasita, sendo

ainda uma componente chave nas defesas oxidativas de Leishmania. A biossíntese

desta molécula é dependente de fontes exógenas de arginina e ornitina, moléculas

igualmente importantes na síntese protéica das formas amastigotas (Roberts et al.,

2004). A diminuição dos níveis de arginina e ornitina do hospedeiro parece ainda inibir o

desenvolvimento das amastigotas e ainda torná-las vulneráveis ao stress oxidativo

(Schaible & Kaufmann, 2005; Roberts et al., 2004).

A aquisição de purinas pelo parasita a partir do lúmen do vacúolo parasitóforo é

também muito importante para o desenvolvimento e sobrevivência das formas

amastigotas. As purinas são essenciais para o desenvolvimento do parasita na ausência

de síntese de novo por este (McConville et al., 2007).

Como a integridade da membrana plasmática do parasita é muito importante para o

estabelecimento e aquisição de nutrientes pelo parasita, drogas que desestabilizam a

superfície da membrana plasmática, suas funções e integridade, podem ser

considerados bons quimioterápicos para o tratamento de leishmanioses (Burchmore &

Barret, 2001).

1.3. Drogas utilizadas no tratamento das leishmanioses

Para o tratamento das leishmanioses, faz-se o uso de antimoniais pentavalentes,

inicialmente, e de Pentamidina e Anfotericina B, além de drogas alternativas, se os

pacientes não respondem ao tratamento com os primeiros.

Entretanto, tem sido verificado que as drogas utilizadas no tratamento das

leishmanioses são muito tóxicas, apesar de utilizadas com freqüência (Iwn et al., 1994).

A toxicidade decorrente do uso dessas drogas deve-se ao fato de que todas as drogas

utilizadas interferem na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD), gerando um

Costa, C.F.

18

stress oxidativo no parasita. Da mesma maneira que estas drogas interferem na

atividade enzimática do parasita, agem também na atividade enzimática da célula

hospedeira, causando os efeitos tóxicos observados no hospedeiro em conseqüência do

uso prolongado das referidas drogas. Ainda, o aparecimento de cepas resistentes às

drogas utilizadas no tratamento das leishmanioses tem se tornado freqüente (Sereno et

al., 2001; Al-Mohammed et al., 2005).

As drogas tradicionalmente utilizadas no tratamento das leishmanioses são os

antimoniais pentavalentes (SbV), como Glucantime e Meglumine. Recentes estudos

sugerem que o mecanismo de ação dos SbV esteja relacionado ao comprometimento do

potencial redox de grupamentos tiol da célula, induzindo o efluxo de grupamentos tióis

celulares, e ainda inibindo a enzima tripanotiona redutase (Wyllie et al., 2004).

Provavelmente, para serem ativos, os antimoniais pentavalentes devem ser convertidos

a uma forma trivalente (Ouellette et al., 2004).

Recentes estudos têm demonstrado que tanto SbIII quanto SbV medeiam a

fragmentação do DNA em Leishmania, sugerindo que antimoniais conduzem os

parasitos a um processo de morte celular com características semelhantes ao processo

de apoptose (Lee et al., 2002; Sudhandiram & Shaha, 2003).

Devido a sua grande utilização, tem sido observada aquisição de resistência por

parte do parasita aos SbV. Um dos mecanismos mais aceitos de aquisição de

resistência seria a perda da capacidade de reduzir SbV a SbIII, como tem sido

observado em experimentos realizados utilizando amastigotas axênicos de Leishmania

donovani (Shaked-Mishan et al., 2001). Outro possível mecanismo pelo qual Leishmania

adquire resistência aos antimoniais pentavalentes seria pela expressão genética, sendo

o gene expresso capaz de conduzir à aquisição de resistência por um mecanismo até o

momento desconhecido (Haimeur & Ouellette, 1998).

Devido à aquisição de resistência e das limitações observadas no tratamento com os

antimoniais pentavalentes, a Pentamidina tem sido utilizada como droga de segunda

linha no tratamento de leishmanioses viscerais, quando este é refratário ao tratamento

com os antimoniais pentavalentes (Sundar, 2001).

Um possível mecanismo de ação dessa droga é a sua acumulação na mitocôndria

(Basselin et al., 2002). Segundo alguns estudos, a Pentamidina tem a capacidade de

Costa, C.F.

19

aumentar significativamente a eficácia de inibidores do complexo II da cadeia

transportadora de elétrons mitocondrial (Mehta & Saha, 2004).

A droga mais utilizada no tratamento das leishmanioses, quando o tratamento com os

antimoniais pentavalentes e a pentamidina não é eficaz, é a Anfotericina B (AmB). A

AMB é um poderoso antifúngico, utilizado no tratamento de infecções fúngicas

sistêmicas. Sua eficácia como agente antifúngico se deve à presença de ergosterol na

membrana plasmática da maioria dos fungos parasitas, alvo preferencial da AmB. Como

os fungos, Leishmania também possui ergosteróis semelhantes ao ergostano em sua

membrana plasmática, sendo este seu principal esterol de membrana (revisado em

Ouellette et al., 2004), e este fato pode explicar a eficácia da AmB contra Leishmania.

Apesar de sua reconhecida eficácia, o uso de AMB está relacionado ao surgimento

de efeitos tóxicos decorrentes do tratamento, além da aquisição de resistência por parte

do parasita após o tratamento prolongado com a droga, como foi observado em estudos

recentes (Al-Mohammed et al., 2005).

Nesse sentido, outros compostos têm sido analisados na tentativa de se

identificar novos quimioterápicos eficientes no tratamento das leishmanioses. Os

compostos mais utilizados são aqueles à base de extratos vegetais (Chen et al., 1993;

Fournet et al., 1993; Fournet et al., 1996; Grandic et al., 2004; Ayres et al., 2007).

Entretanto, poucos estudos verificam a atividade de compostos sintéticos na

sobrevivência extracelular e intracelular de Leishmania.

Nosso grupo tem utilizado compostos sintéticos no tratamento de células infectadas

com protozoários parasitas intracelulares. Alguns desses compostos com reconhecida

atividade na interrupção do ciclo celular na fase de replicação do DNA já têm sido

utilizados no tratamento de culturas de células infectadas com Toxoplasma gondii,

mostrando-se eficientes na eliminação do parasita do meio intracelular.

Costa, C.F.

20

1.4. Drogas antiproliferativas – tiosemicarbazonas

1.4.1. Mecanismo de ação

As tiosemicarbazonas fazem parte de uma classe de compostos com alta afinidade

de ligação a metais (Casas et al., 2000). Estes compostos possuem diversas atividades

farmacológicas, além de eficácia reconhecida como agentes antimalarial e antiviral

(Ferrari et al., 2002). A atividade quimioterápica das tiosemicarbazonas foi inicialmente

verificada contra o vírus vaccinia (Hutchinson et al., 1985).

O alvo celular das tiosemicarbazonas é a síntese da molécula de DNA, pois impede a

incorporação da timidina à molécula. Dessa forma, as tiosemicarbazonas interferem na

atividade da enzima ribonucleotídeo redutase (RR) (Cabantchik et al., 1999; Rubin et al.,

1993), desempenhando uma forte correlação entre a atividade da enzima e a proporção

da replicação da molécula de DNA (Elford et al., 1970; Weber, 1983).

A enzima RR é composta por duas subunidades: M1 e M2, ambas sendo muito

importantes para a atividade catalítica. O centro catalítico da subunidade M2 contém um

radical tirosil livre, que é estabilizado por um radical não-heme contendo ferro (Thelander

et al., 1985). Assim, a enzima é dependente de íons ferro para sua atividade. Entretanto,

as tiosemicarbazonas têm afinidade para o íon, dessa forma impedindo sua ligação às

subunidades catalíticas da enzima e bloqueando a síntese da molécula de DNA.

Nesse sentido, estudos realizados utilizando como modelo o Plasmodium falciparum

revelaram que a enzima RR catalisa a etapa limitante de síntese de DNA. Daí, a

utilização de um composto com alta afinidade de ligação para o ferro, importante para o

crescimento destes parasitas impediria o desenvolvimento dos mesmos; por isso, esses

compostos puderam ser considerados importantes agentes no tratamento da malária a

partir de então (Cabantchik et al., 1999; Richardson, 1999).

1.4.2. Hidroxiuréia

A Hidroxiuréia (HU) é uma tiosemicarbazona que vem sendo utilizada no

tratamento de diferentes tipos de câncer nos últimos anos, como o de mama, de colo no

Costa, C.F.

21

útero e outros, tendo assim grande aplicabilidade clínica (Gwilt & Tracewell, 1998).

Porém, a HU tem uma baixa afinidade pela enzima, uma vida média curta no homem

(Gwilt & Tracewell, 1998), e uma das limitações da utilização da HU como um

quimioterápico é o desenvolvimento de resistência, que ocorre por muitos mecanismos

diferentes, envolvendo mudanças tanto quantitativas quanto qualitativas na RR

(Donehower, 1996) (figura 8).

Figura 8: Fórmula estrutural da Hidroxiuréia. Retirado de Tenório et al., 2005.

Melo e Beiral (2003) realizou estudos utilizando HU para tratamento de células

infectadas com parasitas intracelulares como Toxoplasma gondii, Leishmania

amazonensis e Trypanosoma cruzi. Estes estudos demonstraram que, na presença de

4mM de HU, os referidos parasitas são eliminados do meio intracelular, sem danos

aparentes à célula hospedeira (Melo & Beiral, 2003). Estudos iniciais utilizando células

infectadas com T. gondii demonstraram que na presença de 4mM de HU, observa-se um

decréscimo na infecção após 5 horas de tratamento. Após 48 horas de tratamento,

observa-se um efeito ainda mais drástico, com a maioria dos parasitas intracelulares

destruídos (Melo et al., 2000). O efeito da droga sobre os outros parasitas (L.

amazonensis e T. cruzi) foi semelhante àquele decorrente do tratamento do T. gondii

com a HU. Após 48 horas de tratamento com a HU, o número de células infectadas e

parasitas intracelulares diminuiu drasticamente na cultura (Melo & Beiral, 2003), sendo

que a HU não causou nenhum efeito na morfologia da célula hospedeira (Melo et al.,

2000; Melo & Beiral, 2003).

Costa, C.F.

22

1.4.3. Tiosemicarbazonas e derivados tiazolidinônicos

Além da HU, outras tiosemicarbazonas têm sido utilizadas contra protozoários,

como Plasmodium falciparum, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi e outros

parasitas (Bharti et al., 2002; Bharti, et al., 2003; Walcourt et al., 2004). Elas são, como a

HU, inibidoras reconhecidas da enzima RR, porém são aproximadamente 1000 vezes

mais potentes que a HU (Liu et al., 1992).

Esses compostos foram sintetizados no departamento de Antibióticos e no

Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco, e

gentilmente cedidos ao nosso laboratório, para posterior análise da atividade contra

protozoários parasitas. Eles são obtidos através da condensação equimolar em meio

alcoólico sob refluxo de tiosemicarbazidas, que podem ser adquiridas comercialmente

ou através de síntese química, com derivados carbonilados, como aldeídos e cetonas,

recebendo a denominação da classe após o nome do respectivo aldeído ou cetona

condensado (Bharti et al., 2002). Quantidades catalíticas de ácido são utilizadas na

síntese destes compostos (Akinchan et al., 2002; Easmon et al., 1992). No presente

trabalho, o ácido tioglicólico foi utilizado para a produção das tiosemicarbazonas (figura

9).

Figura 9 – Reação de síntese das tiosemicarbazonas. Retirado de Pessanha, 2006.

Os derivados tiazolidinônicos são compostos derivados carbonilados de

tiazolidinas e tiosemicarbazonas. Estes compostos possuem como as

tiosemicarbazonas, atividades antiprotozoários (Alves et al., 1993), antibacteriana

(Gürsoy et al, 1997; Khawass et al., 1989), fungicidas (Liu et al., 2000), entre outras,

Costa, C.F.

23

sendo por isso também muito importante na indústria farmacêutica. Apesar da pouca

utilização destes compostos contra protozoários parasitas, estudos utilizando outros

patógenos demonstram potencial atividade dos derivados tiazolidinônicos contra estes

parasitas (Khawass et al., 1989; Küçükgüzel et al., 2002).

A síntese dos derivados tiazolidinônicos se dá a partir da reação de ciclização

entre as tiosemicarbazonas e anidrido maléico em solução contendo tolueno seco ou

benzeno sob refluxo (Brown, 1961). A estrutura química destes compostos é formada

por um anel contendo cinco membros, sendo dois heteroátomos: um enxofre e um

nitrogênio, além de um grupo carbonila na posição 4. A estrutura do anel formador do

núcleo tiazolidinona está representada na figura 9. Os derivados tiazolidinônicos

utilizados no presente trabalho contêm um grupo hidrazona na posição 2 (fig. 10).

No presente trabalho, ainda, foi utilizado o grupo nitro (NO2) como substituinte nas

posições orto, meta ou para do anel aromático, substituindo o radical R1, devido aos

maiores valores de redução observados nestes grupos em observações prévias. A fim

de aumentar o espectro de moléculas formadas, o radical R2 foi substituído por grupos

H ou CH3, ou ainda CH2CH3 ou C6CH5 (fig. 11).

Figura 10 – Anel formador do núcleo tiazolidinona. Retirado de Pessanha, 2006.

Figura 11 – Estrutura geral dos derivados tiazolidinônicos. Retirado de Pessanha, 2006.

Costa, C.F.

24

De acordo com a análise desta, observa-se a seguinte denominação:

nomenclatura de número 2 para as tiosemicarbazonas e 3 para os derivados

tiazolidinônicos. Além disso, as tiosemicarbazonas e derivados tiazolidinônicos foram

divididos em 4 grupos de 3 compostos para cada série, devido à presença de diferentes

radicais, basicamente, ou pela presença de diferentes radicais substituintes de R2 ou

pela diferença na posição do grupo nitro em R1. Essas diferenças observadas na

posição dos radicais, bem como na inserção de diferentes radicais em R2 contribui para

a alteração na potencialidade dos compostos (fig. 12).

Figura 12 – Radicais formadores das tiosemicarbazonas (2) e derivados tiazolidinônicos (3). Retirado de

Tenório et al, 2005.

Nosso grupo tem recentemente utilizado esses compostos também contra

Toxoplasma gondii (Melo et al., 2000; Tenório et al., 2005). Esta série de compostos tem

sido testada, e os compostos são sintetizados com modificações no anel heterocíclico.

Isso tem sido feito baseado na observação prévia de que algumas modificações nas

moléculas de tiosemicarbazonas levam a uma perda substancial da atividade

quimioterápica (Hutchinson, 1985). A atividade pode aumentar ou diminuir, dependendo

do complexo formado entre o metal e as tiosemicarbazonas (Ferrari et al., 2002).

Resultados preliminares demonstraram que células infectadas com Toxoplasma

gondii tratadas com tiosemicarbazonas apresentaram algumas alterações, decorrentes

das modificações realizadas nas moléculas. Estas foram capazes de causar alguns

efeitos que refletiram nas diferentes atividades desses compostos sobre o parasito

intracelular e algumas vezes também na célula hospedeira (Melo et al., 2003). Na

presença de derivados de tiosemicarbazonas foi constatada uma drástica redução nas

Costa, C.F.

25

células infectadas com o parasita. Após 24 horas de tratamento, os parasitas

apresentaram-se destruídos no interior do vacúolo.

Ainda foram realizados outros estudos utilizando as tiosemicarbazonas e seus

derivados tiazolidinônicos apresentados na tabela 1. Células infectadas com T. gondii

foram incubadas in vitro com as tiosemicarbazonas (classe 2) e seus derivados

tiazolidinônicos (classe 3) na concentração de 1mM, ou com Hidroxiuréia na

concentração de 4mM. Os resultados deste estudo mostraram que na presença dos

referidos compostos, observou-se uma drástica redução no número de células

infectadas, devido à eliminação do parasita do meio intracelular após o tratamento com

os compostos. Além disso, as células hospedeiras não apresentaram alterações

morfológicas após o tratamento e continuaram seu desenvolvimento normalmente após

a retirada de qualquer dos compostos do meio.

Entretanto, todos os compostos utilizados mostraram menor toxicidade que HU, e

foram também mais eficientes na eliminação do parasita do meio intracelular. Porém, as

tiosemicarbazonas não apresentaram o mesmo padrão de eliminação do parasita, como

foi observado para os derivados tiazolidinônicos, mostrando diferenças na eficiência em

eliminar os parasitas intracelulares dependendo das modificações observadas na

molécula, enquanto os derivados tiazolidinônicos apresentaram o mesmo padrão de

eliminação do parasita, apesar das modificações feitas nas moléculas (Tenório et al.,

2005).

Costa, C.F.

26

2. OBJETIVOS

• Geral

Verificar os efeitos morfológicos e ultraestruturais decorrentes do tratamento com as

tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos utilizados no presente trabalho,

bem como sua eficácia na progressiva eliminação das formas intracelulares de L.

amazonensis do vacúolo parasitóforo.

• Específicos

� Quantificar o número de promastigotas de L. amazonensis em cultura após o

tratamento com tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos;

� Descrever as alterações morfológicas produzidas pelo tratamento com os

compostos testados;

� Analisar se há redução no número médio de amastigotas intracelulares após o

tratamento com algum dos compostos utilizados, bem como se há redução no

número de células infectadas;

� Caracterizar as alterações morfológicas nas células hospedeiras infectadas por L.

amazonensis;

� Caracterizar as alterações morfológicas nas formas amastigotas após o

tratamento com as tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos;

� Descrever a ultraestrutura de promastigotas e amastigotas de L. amazonensis

após o tratamento com os compostos utilizados.

Costa, C.F.

27

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Cultura de L. amazonensis

As formas promastigotas de L. amazonensis da cepa Josefa foram mantidas em

meio de cultura, observadas e quantificadas diariamente com o objetivo de se montar

uma curva de crescimento. As formas promastigotas foram mantidas em Meio Warren’s,

suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), por cinco dias. Ao final desse tempo,

quando as formas promastigotas atingiam o fim da fase exponencial de crescimento, as

culturas foram submetidas a um novo repique, ou seja, 1ml do meio contendo

promastigotas de L. amazonensis foi transferido para um meio fresco, garantindo dessa

forma a manutenção da cultura in vitro de promastigotas.

3.2. Obtenção de macrófagos peritoneais

Camundongos suíços adultos foram mortos em câmara contendo CO2. Então, foi

realizado um lavado peritoneal com 5ml de Hank’s a temperatura de 4°C, a fim de retirar

os macrófagos presentes no peritônio do camundongo. Os macrófagos foram

submetidos à contagem em câmara de Neubauer, e um número médio de 105

macrófagos foi obtido.

A seguir, foram adicionadas ao fundo dos poços de uma placa de 24 poços estéril

lamínulas estéreis, acrescentando em seguida 0,5ml de solução Hank’s à temperatura

de 4°C e então, com uma pipeta Pasteur, as lamínulas foram submersas no fundo dos

poços. O volume de solução de Hank’s contendo os macrófagos foi previamente

calculado, através da contagem em câmara de Neubauer, e em seguida o volume

necessário da solução foi adicionado a cada poço da placa. A placa foi mantida em

estufa a 37°C, em uma atmosfera contendo 5% de CO2. Após 1h, a solução de Hank’s

foi retirada e substituída por meio DMEM, contendo 10% de SFB.

Costa, C.F.

28

3.3. Interação Macrófago x L. amazonensis

Após 24h de estabelecimento da cultura de macrófagos, foi realizada contagem do

número de macrófagos por poço, que deve ser em torno de 105 células por poço.

Promastigotas de L. amazonensis foram centrifugadas por 10min a 1200 RPM. O

pellet obtido foi ressuspenso em 1ml de PBS, e uma alíquota de 10µl da solução de

promastigotas foi retirada e diluída em líquido de contagem (90µl), para posterior

contagem em câmara de Neubauer.

Após a contagem do número de parasitos presentes em 1ml de meio DMEM, foram

realizados os cálculos necessários para a obtenção do número de parasitos adicionados

em cada poço da placa, para uma interação de 10 parasitos para cada célula. Dessa

forma foi obtido o volume de tampão que continha os protozoários, sendo este

adicionado a cada poço da placa.

Após 1h de incubação dos parasitos na placa, esta foi lavada com PBS a

temperatura de 37°C, para retirada das promastigotas que não foram fagocitadas. Após

a lavagem, foi adicionado 1ml por poço de meio DMEM contendo 10% de SFB. A placa

contendo os macrófagos infectados com L. amazonensis foi mantida em estufa 37°C

com 5% de CO2 por 72h.

3.4. Preparação das Tiosemicarbazonas e derivados tiazolidinônicos para

incubação de L. amazonensis

Os 20 compostos que foram utilizados neste trabalho (tabela 1) foram gentilmente

cedidos pela Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).

Para o tratamento das culturas de promastigotas, os compostos foram diluídos em

40µl de DMSO e em seguida em 10ml de meio Warren’s com 10% de SFB, obtendo-se

assim uma solução estoque de 10mM. A solução estoque preparada foi então diluída em

diferentes volumes de meio Warren’s, produzindo dessa forma as soluções finais de

0,1mM, 1mM e 5mM, com 5ml cada uma.

As formas promastigotas de L. amazonensis foram centrifugadas por 10 min, a

1200 RPM. O pellet obtido deste procedimento foi ressuspenso em meio fresco (cultura

Costa, C.F.

29

controle) ou em meio contendo uma das tiosemicarbazonas de classe 2 ou 3 utilizadas

no presente trabalho, em diferentes concentrações.

Para o tratamento das culturas de macrófagos infectadas com L. amazonensis, os

compostos foram diluídos em 100µl de DMSO e agitados por 10 min para dissolução do

pó. Foi preparada uma solução estoque (10mM) diluindo-se o DMSO contendo o

composto em 20ml de meio DMEM sem SFB, e desta solução foram preparadas as

demais soluções de uso, com diferentes concentrações, contendo cada uma um volume

final de 10ml.

Após a preparação da solução de uso, o meio de cultura da placa foi trocado,

sendo adicionado meio DMEM com 10% de SFB sem qualquer uma das drogas nos

poços reservados para controle, e meio DMEM com 10% de SFB contendo uma das

drogas nos poços destinados ao tratamento. A cultura foi mantida em estufa a 37°C com

5% de CO2, por 24h.

Os novos derivados tiosemicarbazonas utilizados no presente trabalho estão

representados na tabela a seguir:

Tabela 1: Moléculas dos compostos tiosemicarbazonas (classe 2) e seus derivados

tiazolidinônicos (classe 3).

Composto R1 R2 Fórmula Estrutural

2b (RP-7) -H p-NO2

2d (RP-34) -CH3 m-NO2

2e (RP-12) -CH3 p-NO2

2f (RP-30) -CH2CH3 o-NO2

Costa, C.F.

30

2g (RP-38) -CH2CH3 m-NO2

2h (RP-18) -CH2CH3 p-NO2

2i (RP-26) C6H5 o-NO2

2j (RP-36) -C6H5 m-NO2

3b (RP-8) -H p-NO2

3d (RP-35) -CH3 m-NO2

3e (RP-13) -CH3 p-NO2

3f (RP-31) -CH2CH3 o-NO2

3g (RP-39) -CH2CH3 m-NO2

Costa, C.F.

31

3h (RP-19) -CH2CH3 p-NO2

3i (RP-27) -C6H5 o-NO2

3j (RP-37) -C6H5 m-NO2

3.5. Análise quantitativa das culturas tratadas com as tiosemicarbazonas e

derivados tiazolidinônicos

Durante seis dias de incubação com as tiosemicarbazonas, as promastigotas

foram submetidas à contagem, a cada 24h.

Uma alíquota de 10µl contendo promastigotas de L. amazonensis, tratadas ou

não com uma das tiosemicarbazonas, foi retirada das culturas e diluídas em 90µl de

líquido de contagem (26% de formol + 74% de PBS). Esta solução de contagem foi

colocada em câmara de Neubauer e submetida à contagem em Microscópio Óptico de

Contraste de Fase. Os valores relativos às contagens foram anotados e uma média do

número de promastigotas na cultura foi obtida, ao final de seis dias, referente a cada dia

de experiência. Dessa forma, ao final de seis dias de experiência, os valores médios de

promastigotas na cultura foram analisados em um gráfico, para a observação da curva

de crescimento de promastigotas, tanto as submetidas a tratamento com alguma das

tiosemicarbazonas quanto às culturas controle.

Costa, C.F.

32

3.6. Processamento para microscopia óptica das formas promastigotas

Nos dias 1°, 3° e 7° de tratamento com as tiosemicarbazonas, promastigotas de L.

amazonensis tratados e não tratados com as drogas foram fixados com solução de

formaldeído (4% de formaldeído a 10% + PBS + 5% de Sacarose). A seguir, as células

fixadas foram lavadas em PBS à temperatura ambiente duas vezes, e em seguida uma

alíquota da solução de promastigotas tratadas e não tratadas foi retirada e colocada

sobre lâmina histológica, realizando assim um esfregaço celular. As lâminas contendo as

células foram colocadas em placa aquecedora para a aderência das células à lâmina.

Após esse processo, as células aderidas às lâminas foram coradas com solução de

Giemsa (azul de metileno), por 15min. As lâminas coradas foram lavadas em água

destilada e, após secas ao ar, uma lamínula foi aderida com Bálsamo do Canadá ao

esfregaço celular.

Foram obtidas imagens das promastigotas devidamente fixadas e coradas para

análise morfológica das mesmas, através do Software Analysis (Software Imaging

System).

3.7. Processamento para microscopia óptica de macrófagos infectados com

L. amazonensis

A cultura de macrófagos infectada com amastigotas de L.amazonensis tratada por

24h com as tiosemicarbazonas foi lavada em PBS a temperatura ambiente para a

retirada do meio de cultura e células debris. Então, a cultura foi fixada em solução Bouin

(114ml de ácido pícrico, 38ml de formol, 19ml de ácido acético – este adicionado no

momento da utilização) por 5 min. Após o tempo de fixação, as células foram lavadas

três vezes em PBS a temperatura ambiente para a retirada completa do fixador. Em

seguida, foi adicionada em cada poço da placa solução de Giemsa (solução de azul de

metileno diluída em água destilada) previamente preparada, a uma proporção de 1:10

em água destilada. Então, a placa foi mantida a temperatura ambiente por 2h e em

seguida lavada em água destilada.

Costa, C.F.

33

As lamínulas foram desidratadas em concentrações decrescentes de acetona e

crescentes de xilol, como se segue:

1° - acetona pura;

2° - acetona pura;

3° - acetona 90% + xilol 10%;

4° - acetona 70% + xilol 30%;

5° - acetona 30% + xilol 70%;

6° - xilol puro.

Após a desidratação, as lamínulas foram montadas em lâminas histológicas,

aderidas com bálsamo do Canadá, e devidamente identificadas.

Foi realizada a contagem do número de células infectadas e parasitas intracelulares

tanto nas lamínulas contendo células tratadas quanto naquelas referentes ao controle

(não tratadas). Também foi contado o número de vacúolos contendo parasitas

destruídos nas lamínulas contendo células tratadas com os compostos para análise

quantitativa.

Foram feitas imagens referentes às culturas tratadas e não tratadas, para análise das

alterações morfológicas das células e dos parasitos intracelulares, através do Software

Analysis.

3.8. Processamento para microscopia eletrônica de transmissão

As promastigotas de L. amazonensis incubadas com a tiosemicarbazona 2g e o

derivado tiazolidinônico 3g foram lavadas com PBS, pH 7,2 e as culturas de macrófagos

infectados com L. amazonensis e incubadas com a tiosemicarbazona 2g por 12 e 24

horas foram lavadas com PBS, pH 7,2.

A fixação foi realizada utilizando-se 2% de glutaraldeído e 2% de formaldeído em

tampão cacodilato de sódio a 0,1M, pH 7,2, cloreto de cálcio 5mM e sacarose a 5% por

1h. Após esse procedimento as células foram lavadas em uma solução de tampão

cacodilato de sódio 0,1M, pH 7,2 e sacarose 5%. Então, essa solução foi centrifugada a

2000 RPM, por 10min. O pellet formado foi pós-fixado em uma solução de tetróxido de

ósmio 2% (SIGMA), em tampão cacodilato e ferrocianeto de potássio a 0,8% (SIGMA)

Costa, C.F.

34

por 1h em temperatura ambiente, protegido da luz. As células pós-fixadas foram

centrifugadas a 2000 RPM por 10min e lavadas com uma solução de tampão cacodilato

0,1M e sacarose 5%. Subseqüentemente, foi realizada desidratação em uma série

crescente de acetona na seguinte ordem:

1° - Acetona 30% por 10min;

2° - Acetona 50% por 10min;

3° - Acetona 70% por 10min;

4° - Acetona 90% por 10min;

5° - Acetona 100% por 10min (duas vezes).

Após a desidratação, as células foram incubadas em uma solução de resina

epon-acetona 100% na proporção 1:1 “overnight”, a temperatura ambiente.

Posteriormente, a solução epon-acetona foi substituída por epon puro e incubada por 6h

a temperatura ambiente. O material foi então incluído em Epon e polimerizado em estufa

a 60°C durante 48h. Os blocos foram cortados no Reichert Ultratrin – Leica – para

formar pirâmides truncadas onde se encontra o material. Cortes ultrafinos foram obtidos

no ultramicrótomo Reichert Ultracut – Leica – e coletados em grades de cobre. Acetato

de uranila (5% por 20min) e citrato de chumbo (5min) foram utilizados na contrastação

dos cortes. O material foi observado no microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM

900, operando a 80 kV.

Costa, C.F.

35

4. RESULTADOS

4.1. Efeitos citotóxicos de diferentes concentrações das tiosemicarbazonas e

derivados tiazolidinônicos no desenvolvimento de promastigotas de Leishmania

amazonensis

4.1.1. Análise quantitativa

Culturas de promastigotas de Leishmania amazonensis foram tratadas por 6 dias

com as concentrações de 0,1mM, 1mM e 10mM de 4 compostos, sendo 2 derivados

tiosemicarbazonas (2g e 2j) e 2 derivados tiazolidinônicos (3g e 3j). Durante o

tratamento, promastigotas foram contadas em câmara de Neubauer.

A concentração de 0,1mM não apresentou nenhuma redução significativa no

número de promastigotas em cultura (figura 13). No tratamento com a concentração de

1mM, a redução do número de promastigotas foi mais acentuada (figura 13). A partir do

terceiro dia de tratamento, todos os compostos analisados foram capazes de conter o

crescimento das formas promastigotas nas culturas tratadas. Porém, os compostos

tiosemicarbazonas (2g e 2j) foram mais efetivos, conseguindo reduzir o crescimento das

culturas em tempos menores (figuras 13a e c), quando comparados aos resultados

observados após o tratamento com os derivados tiazolidinônicos 3g e 3j (figuras 13b e

d, respectivamente).

O tratamento com a concentração de 10mM foi o mais efetivo em reduzir o

número de promastigotas na cultura. A partir do terceiro dia de tratamento, nenhuma

forma promastigota viável foi observada (figura 13). Sendo assim, esta concentração foi

capaz de impedir o desenvolvimento em cultura das formas promastigotas, levando-as a

morte já no terceiro dia de tratamento.

Dentre as concentrações testadas, a de 1mM foi escolhida para dar continuidade

aos testes com todos os demais compostos durante um único tempo de incubação (6

dias de tratamento). Esta foi escolhida porque, apesar de menos tóxica para as

promastigotas que a concentração de 10mM, foi também capaz de reduzir a taxa de

crescimento das promastigotas a partir do terceiro dia de tratamento.

Costa, C.F.

36

Figura 13 – Gráficos representativos do número de promastigotas na cultura após otratamento com diferentes concentrações de tiosemicarbazonas e seus derivadostiazolidinônicos (A), número de promastigotas após o tratamento com o composto 2g;(B), número de promastigotas após o tratamento com o composto 3g; (C) número depromastigotas após o tratamento com o composto 2j; (D) número de promastigotasapós o tratamento com o composto 3j.

Promastigotas de L. amazonensis tratados com o composto 3g - citotoxicidade

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 Tempo (dias)

Núm

ero

de p

rom

astig

otas

na

cul

tura

(10

6 /ml)

Controle 0,1mM 1mM 10mM

Promastigotas de L. amazonensis tratados com o composto 2g - citotoxicidade

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5 6 Tempo (dias)

Núm

ero

de p

rom

astig

otas

na

cul

tura

(10

6 /ml)

Controle 0,1mM 1mM 10mM

Promastigotas de L. amazonensis tratados com o composto 3j - citotoxicidade

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6 Tempo (dias)

Núm

ero

de p

rom

astig

otas

na

cul

tura

(10

6 /ml)

Controle 0,1mM 1mM 10mM

Promastigotas de L. amazonensis tratados com o composto 2j - citotoxicidade

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5 6 Tempo (dias)

Núm

ero

de p

rom

astig

otas

na

cul

tura

(10

6/m

l)

Controle 0,1mM 1mM 10mM

A B

C D

Costa, C.F.

37

No decorrer do tratamento, foi observada uma redução do número de parasitas ao

longo do tempo nas culturas tratadas com quaisquer dos compostos, como observado

através da análise dos gráficos 1 e 2, que mostram, respectivamente, promastigotas de

Leishmania amazonensis tratados com os compostos tiosemicarbazonas (gráfico 1) e

derivados tiazolidinônicos (gráfico 2).

De acordo com a análise dos gráficos, verifica-se que, ao longo do tratamento

com os compostos, tanto as tiosemicarbazonas (gráfico 1) quanto os derivados

tiazolidinônicos (gráfico 2) foram capazes de parar a multiplicação do parasita em

cultura em comparação à cultura não tratada (linha pontilhada), e ainda reduzir seu

número após o terceiro dia de tratamento. Entretanto, os compostos se comportaram de

modos diferentes, dependendo do radical apresentado.

Após o tratamento com o composto 2h, foi possível observar que não houve uma

redução significativa no número de promastigotas (gráfico 1). Da mesma forma, as

promastigotas tratadas com os compostos 2g e 2j apresentaram uma redução no

numero de promastigotas na cultura após o tratamento de 85% e 71%, respectivamente.

Para o composto 2g, esta redução é observada já no segundo dia de tratamento. Já o

tratamento com o composto 2j mostrou que a taxa de crescimento começa a declinar a

partir do terceiro dia de tratamento, reduzindo-se o número de promastigotas em cultura

a partir do quarto dia de tratamento (gráfico 1).

Após o tratamento das formas promastigotas com os derivados tiazolidinônicos,

observa-se um comportamento bastante diferenciado dependendo do composto

analisado. Alguns compostos, como o composto 3d, não impediram a multiplicação das

promastigotas até o quinto dia de tratamento (gráfico 2). Entretanto, compostos como o

3b, 3e e o 3g, reduziram a taxa de crescimento em 72%, 77% e 72%, respectivamente

(gráfico 2).

Costa, C.F.

38

Gráficos 1 e 2 – Promastigotas de L. amazonensis tratados com astiosemicarbazonas (classe 2) e derivados tiazolidinônicos durante 6dias, mostrando a interrupção da multiplicação do parasita ao longo dotempo de tratamento com os compostos referidos.

Promastigotas de L. amazonensis tratados com os compostos tiosemicarbazonas (Classe 2)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 1 2 3 4 5 6 Tempo (dias)

Núm

ero

méd

io d

e pr

omas

tigot

as

na c

ultu

ra (

106 /

ml)

Controle 2b 2d 2e 2f

2g 2h 2i 2j

Promastigotas de L. amazonensis tratados com os derivados tiazolidinônicos (Classe 3)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 1 2 3 4 5 6 Tempo (dias)

Núm

ero

méd

io d

e pr

omas

tigot

as n

a cu

ltura

(10

6/m

l)

Controle 3b 3d 3e 3f3g 3h 3i 3j

1

2

Costa, C.F.

39

Conforme observado através da análise dos gráficos acima, foi verificado que os

compostos analisados foram capazes de inibir o ciclo celular do parasita. Entretanto,

cada um dos compostos apresentou tempos diferentes de ação após o tratamento, onde

se observa que alguns compostos inibiram o crescimento das formas promastigotas em

um tempo mais reduzido, sendo que outros demoraram um tempo maior para

demonstrarem atividade inibidora do ciclo celular do parasita. Esta diferença

apresentada na atividade dos compostos pode estar relacionada às modificações dos

radicais realizadas na estrutura química das moléculas (tabelas 1 e 2).

Através da análise da tabela 2, observa-se que a maioria dos compostos que se

mostrou mais eficiente em reduzir o número de promastigotas na cultura apresentou o

radical 2 na posição orto. Pode-se, então, inferir que moléculas com esta conformação

possivelmente possuem atividade mais intensa na interrupção da multiplicação das

promastigotas em cultura que as demais moléculas, onde se observa o radical 2 em

outras posições (para ou meta).

A posição do radical 1 provavelmente não foi determinante para o aumento ou

diminuição da atividade dos compostos, embora a presença do radical –CH2CH3 tenha

sido observada em dois dos compostos com maior atividade na redução do número de

promastigotas na cultura (2g e 3g). Por isso, pode-se inferir que em moléculas onde há

presença tanto do radical 2 na posição orto quanto da presença de um radical –CH2CH3

possa ser um fator importante no aumento da atividade destes compostos com relação à

sua eficácia em reduzir a multiplicação do parasita em cultura (tabela 2).

Costa, C.F.

40

Costa, C.F.

41

4.1.2. Análise morfológica

As formas promastigotas tratadas com as diferentes concentrações dos

compostos foi retirada nos dias 1, 3 e 6 de tratamento para posterior análise através da

técnica de microscopia óptica de campo claro. Análises morfológicas foram feitas através

da obtenção de imagens de culturas de promastigotas tratadas com dois compostos,

sendo um derivado tiosemicarbazona (2g) e seu derivado tiazolidinônico (3g).

As culturas de promastigotas, antes dos tratamentos, apresentavam-se com

morfologia normal, sendo as células alongadas, flagelo longo, materiais citoplasmáticos

organizados (figura 14a).

Após o tratamento com 0,1mM do derivado tiosemicarbazona, não foram

observadas alterações morfológicas em nenhum dos tempos de tratamento (figuras 14-

A2, B2 e C2). Portanto, como observado na figura 1, esta concentração não causou

efeitos na morfologia dos parasitas (figuras 14-A2, B2 e C2, setas brancas).

No primeiro dia de tratamento com 1mM do composto, nenhuma alteração

morfológica foi observada (figura 14-A3, setas brancas). Porém, a partir do terceiro dia

de tratamento, algumas alterações morfológicas começam a ser observadas, como

retração do material citoplasmático (figura 14-B3, setas pretas), provavelmente devido

à incapacidade que algumas células apresentaram de se dividir após o tratamento com

os compostos. Outras células, entretanto, mantiveram sua morfologia normal, pois

aparentemente estavam em uma fase diferente no ciclo celular em comparação àquelas

que sofreram alterações (figura 14-B3, setas brancas). No sexto dia de tratamento, um

número maior de células apresentava morfologia alterada, com o conteúdo

citoplasmático retraído (figura 14-C3, setas pretas).

Já o tratamento com 10mM demonstrou as alterações mais drásticas na

morfologia das promastigotas. No primeiro dia, não foi possível observar nenhuma

alteração morfológica (figura 14-A4, setas brancas), mas já no terceiro dia, foram

observadas alterações morfológicas como retração do conteúdo citoplasmático (figura

14-B4, setas pretas). Essas alterações se mantiveram no sexto dia de tratamento, onde

se observam alterações ainda mais drásticas, que indicam divisão anormal das células,

como a presença de três núcleos em uma mesma célula, sugerindo que os compostos

Costa, C.F.

42

foram capazes de interromper o ciclo celular e assim conduzirem ao processo de

destruição dos parasitas, o que se observa através das alterações morfológicas

produzidas no decorrer do tempo de tratamento (figura 14-C4, setas pretas).

Costa, C.F.

43

Costa, C.F.

44

Costa, C.F.

45

Costa, C.F.

46

O tratamento com diferentes concentrações do derivado tiazolidinônico também

produziu alterações morfológicas semelhantes àquelas observadas em decorrência do

tratamento com o derivado tiosemicarbazona utilizado. Antes do tratamento, as células

mostravam morfologia normal, com corpo celular alongado, flagelo longo partindo da

bolsa flagelar e citoplasma organizado (figura 15-A1), o que se manteve até o final do

experimento (figura 15-B1 e C1).

Durante o tratamento com a concentração de 0,1mM, não se observou nenhuma

alteração morfológica na cultura, mesmo após 6 dias de tratamento (figura 15-C2). Isso

comprova o que também foi observado para o derivado tiosemicarbazona, ou seja, que

esta concentração não é efetiva para produzir os efeitos morfológicos visíveis no

tratamento com concentrações maiores.

Já no tratamento com a concentração de 1mM, observa-se que as alterações

morfológicas são dependentes do tempo de exposição ao composto (figura 15-A3, B3 e

C3). No primeiro dia de tratamento, não se observa nenhuma alteração morfológica

(figura 15g, setas brancas).

No terceiro dia de tratamento, algumas células com citoplasma retraído e

conteúdo citoplasmático desorganizado são observadas (figura 15b, setas pretas),

embora algumas células com morfologia normal ainda possam ser observadas (figura

15b, setas brancas). Este resultado parece confirmar o observado para o tratamento

com o derivado tiosemicarbazona, ou seja, que as promastigotas não estão no mesmo

período do ciclo celular, fazendo com que estas respondam de forma diferente ao

tratamento neste período. No sexto dia de tratamento, o número de células que

continham alterações morfológicas foi ainda maior (figura 15c). Porém, as alterações

observadas foram da mesma natureza daquelas observadas no terceiro dia de

tratamento, verificando-se retração citoplasmática e desorganização do material nuclear

(figura 15c, setas pretas). Nesse tempo, algumas células destruídas também são

observadas.

O tratamento com 10mM do composto, como esperado, foi o que demonstrou ser

mais efetivo em produzir os efeitos observados na morfologia das promastigotas

observados após o tratamento (figura 15-A4, B4 e C4). Como nos demais tratamentos,

o primeiro dia não apresentou nenhuma alteração morfológica significativa na cultura

Costa, C.F.

47

(figura 15j). Entretanto, a partir do terceiro dia de tratamento, aparecem algumas

alterações morfológicas, como arredondamento do corpo celular e desorganização do

citoplasma e do núcleo (figura 15B4, seta preta). Essas alterações foram observadas

em todas as células observadas após o tratamento com essa concentração e pelo

referido tempo, mostrando que, diferente do que se observa no tratamento com a

concentração de 1mM, onde ainda se observam algumas células viáveis no terceiro dia

de tratamento, a concentração de 10mM foi capaz de causar as mesmas alterações na

maioria das células da cultura (figura 15B4). No sétimo dia de tratamento, as mesmas

alterações ainda eram observadas, como retração e desorganização citoplasmática

(figura 15C4, setas pretas). Foram também observados também alguns restos

celulares (figura 15C4, setas pretas), sugerindo que, neste tempo de tratamento, na

concentração de 10mM, as células podem estar sendo destruídas por causa da alta

concentração do composto, resultado diferente do observado para o tratamento com a

concentração de 1mM, onde apenas algumas células sem alterações morfológicas foram

observadas.

Costa, C.F.

48

Costa, C.F.

49

Costa, C.F.

50

Costa, C.F.

51

Como citado anteriormente, a concentração de 1mM foi escolhida para dar

continuidade aos ensaios, pois foi capaz, assim como a concentração de 10mM, de

causar danos as promastigotas já a partir do terceiro dia de tratamento. Dessa forma, as

tiosemicarbazonas e derivados foram a partir daí testadas por 6 dias, na concentração

de 1mM, a fim de realizarmos uma análise comparativa dos efeitos dos diferentes

compostos nas promastigotas nesta concentração e tempo de tratamento.

No primeiro dia de tratamento com os compostos tiosemicarbazonas, observa-se a

forma promastigota apresentando morfologia normal, mesmo após o tratamento com o

composto 2g (figuras 16a e b). As células permaneceram alongadas, apresentando

flagelo longo inserido na região da bolsa flagelar (figura 16).

No terceiro dia de tratamento com o composto 2g, entretanto, algumas alterações

morfológicas foram observadas. As formas promastigotas, que antes se apresentavam

alongadas e com flagelo longo, começaram a perder as características originais,

mostrando morfologia arredondada provavelmente devido à diminuição do conteúdo

citoplasmático (figura 16d, seta preta). Além da redução do citoplasma, as

promastigotas apresentaram encurtamento do flagelo ou ainda ausência deste (figura

16d, seta preta). Quando se observa a cultura controle no terceiro dia de tratamento,

verifica-se a ausência de qualquer alteração na forma promastigota, esta mantendo as

características típicas da forma infectiva em questão (figura 16c, setas brancas).

No sexto dia de tratamento, as alterações morfológicas foram ainda mais

pronunciadas. Foram observadas células arredondadas, com conteúdo citoplasmático

reduzido, da mesma forma que aquelas observadas no terceiro dia de tratamento. Além

disso, foi observada ausência de flagelo em algumas destas células morfologicamente

alteradas (figura 16f, seta preta). Foram ainda observados restos celulares nas culturas

tratadas (figura 16f, estrelas). As culturas não tratadas, em contrapartida, não sofreram

qualquer alteração morfológica em seis dias de incubação (figura 16e).

Costa, C.F.

52

Costa, C.F.

53

A morfologia de promastigotas tratadas com 1mM dos derivados tiazolidinônicos

também foram analisadas. No primeiro dia de tratamento, as culturas tratadas

apresentaram-se sem qualquer alteração morfológica. As formas promastigotas

mantiveram sua morfologia inalterada, alongada e com flagelo de aspecto normal (figura

17b, setas brancas), comparada com a cultura não tratada (figura 17a).

No terceiro dia de tratamento alguns efeitos morfológicos começam a ser

observados. As culturas tratadas apresentaram formas promastigotas com morfologia

alterada. Após o terceiro dia de tratamento com o composto derivado tiazolidinônico 3g,

foram observadas células arredondadas, sendo que estas apresentaram ainda núcleo

condensado em relação as promastigotas com morfologia normal (figura 17d, seta

preta).

Em relação ao tratamento com a tiosemicarbazona 2g, as alterações morfológicas

decorrentes do tratamento com o derivado tiazolidinônico 3g apareceram mais

lentamente. No terceiro dia de tratamento com o composto 2g (figura 16d), o número de

células com morfologia alterada foi aparentemente maior do que o número de células

alteradas após o terceiro dia de tratamento com o derivado tiazolidinônico 3g (figura

17d). Dessa forma, o derivado tiosemicarbazona 2g se mostrou mais efetivo em um

tempo menor de tratamento que o derivado tiazolidinônico 3g.

No sexto dia de tratamento, as alterações morfológicas foram mais drásticas. Em

comparação à cultura controle (figura 17e), no sexto dia de tratamento com o composto

3g, as formas promastigotas se mostraram arredondadas, com citoplasma reduzido, e

algumas células ainda apresentaram citoplasma contendo muitos vacúolos (figura 17f,

setas pretas). Entretanto, apesar das alterações observadas, algumas promastigotas

não perderam o flagelo, que se manteve longo (figura 17f, seta pontilhada).

Além das alterações já verificadas, foi observado ainda um número anormal de

núcleos e cinetoplastos em algumas células. Formas promastigotas grandes, contendo

dois núcleos e três cinetoplastos foram encontradas após o sexto dia de tratamento com

o derivado tiazolidinônico 3g (figura 17f, seta cinza). Essa alteração pode ser devido à

incapacidade das promastigotas, após esse tempo de tratamento, de completar o

processo de divisão celular, impedindo a citocinese e ficando a célula com número

anormal de organelas.

Costa, C.F.

54

Costa, C.F.

55

4.1.3. Aspectos ultraestruturais

Para observar a ultraestrutura de promastigotas de L. amazonensis tratadas com

os derivados tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos, foi utilizada

microscopia eletrônica de transmissão. As culturas contendo promastigotas foram

submetidas ao tratamento com 1mM dos derivados tiosemicarbazonas ou seus

derivados tiazolidinônicos por 5 dias.

As formas promastigotas não tratadas apresentaram aspecto normal (figura 18a),

tendo seu formato alongado mantido. As organelas celulares apresentavam-se com

aparência normal, o núcleo apresentando cromatina descondensada (figura 18a - N),

bem como cinetoplasto único na célula e com aspecto normal, localizado na região

posterior da célula (figura 18a – C) e presença de acidocalcissomo (figura 18a – A).

Após o tratamento com o derivado tiosemicarbazona 2g, algumas alterações

drásticas foram observadas (figura 18b). O núcleo apresentava-se desorganizado e

continha cromatina condensada após o tratamento (figura 18b, setas pretas) Não foi

possível observar o cinetoplasto (figura 18b). As promastigotas ainda apresentaram

desorganização do sistema endomembranar, mostrando algumas invaginações nas

membranas internas, além da presença de inúmeros vacúolos citoplasmáticos (figura

18b, setas cinzas). A promastigota não apresentava mais seu formato normal,

mostrando retração no citoplasma e arredondamento celular, e intenso processo de

destruição celular pode ser observado após o tratamento (figura 18b).

O mesmo foi observado em decorrência do tratamento com o derivado

tiazolidinônico 3g (figura 18c). Cromatina nuclear condensada (figura 18c, setas

pretas), cinetoplasto apresentando padrão de divisão anormal, sendo observados dois

cinetoplastos na promastigota (figura 18c – C) e vacuolização citoplasmática (figura

18c, cabeça de seta) foram vistas após o tratamento. As alterações observadas

sugerem que as promastigotas, após o tratamento, entram em processo de morte celular

programada, devido à incapacidade de completar a divisão celular. Observa-se ainda

que o derivado tiosemicarbazona foi mais efetivo no processo de destruição das formas

promastigotas após o tratamento que o derivado tiazolidinônico (figuras 18b e c).

Costa, C.F.

56

Costa, C.F.

57

4.2. Efeito citotóxico de diferentes concentrações das tiosemicarbazonas e

derivados tiazolidinônicos no desenvolvimento intracelular de Leishmania

amazonensis

4.2.1. Análise quantitativa

Culturas de macrófagos infectadas com L. amazonensis foram testadas nas

concentrações de 0,1mM, 1mM, 5mM e 10mM por 24 horas. Os compostos 2b e 3b

foram escolhidos para a análise comparativa, já que os demais compostos apresentam

atividades semelhantes aos utilizados.

Foram analisados após os tratamentos, além do número de células infectadas, o

número médio de células na cultura, o número de parasitas intracelulares e ainda os

números de vacúolos contendo parasitas destruídos.

Após 24 horas de tratamento com as diferentes concentrações do composto 2b,

observou-se uma redução progressiva do número de células infectadas na cultura, à

medida que se aumenta a concentração do composto utilizado (figura 19a). A

concentração de 0,1mM não foi suficiente para reduzir o número de células infectadas,

mostrando que esta não é eficaz em eliminar o parasita do meio intracelular. A partir da

concentração de 1mM, observa-se uma redução em aproximadamente 70% do número

de células infectadas na cultura. Essa redução foi ainda maior quando foi utilizada a

concentração de 5mM, onde se observa uma redução em aproximadamente 85% e na

utilização da concentração de 10mM, não se observam mais células infectadas (figura

19a).

A redução do número de células infectadas veio acompanhada da redução do

número de células na cultura (figura 19b). Enquanto o tratamento com as

concentrações de 0,1 e 1mM não reduziu o número de células, mostrando que essas

concentrações não causaram efeitos citotóxicos nos macrófagos, a partir do tratamento

das culturas com a concentração de 5mM, verifica-se uma redução de 17% no número

de macrófagos na cultura. Esse número reduziu-se ainda mais após o tratamento com

10mM do composto (33%) (figura 19b).

Houve ainda redução do número de parasitas intracelulares após o tratamento

com as diferentes concentrações do composto, devido não só a eliminação do parasita

Costa, C.F.

58

do meio intracelular após o tratamento, mas também devido à redução do número de

células na cultura (figura 19c). Este número se reduz em 83% aproximadamente, após

o tratamento com a concentração de 1mM, 86% em decorrência do tratamento com

5mM, até a completa eliminação dos parasitas do meio intracelular após o tratamento

com 10mM do composto.

Ao mesmo tempo, é observado um aumento no número de vacúolos contendo

parasitas destruídos a partir do tratamento com a concentração de 1mM do derivado

tiosemicarbazona 2b (figura 19d). Entretanto, estes não foram observados quando a

cultura foi tratada com 0,1mM do composto, já que esta concentração não foi efetiva em

permitir a eliminação do parasita do meio intracelular. O número de vacúolos contendo

parasitas destruídos diminui após a utilização das concentrações de 5mM e 10mM

(figura 19d), provavelmente devido à redução do número de células na cultura.

Costa, C.F.

59

Costa, C.F.

60

Para o derivado tiazolidinônico testado (3b), os resultados obtidos foram

semelhantes. O composto, da mesma forma que para o derivado tiosemicarbazona, foi

testado pelo tempo de 24 horas nas mesmas concentrações e analisados os mesmos

parâmetros.

A porcentagem de células infectadas na cultura reduziu com o aumento da

concentração de composto utilizada (figura 20a). Enquanto a concentração de 0,1mM

não foi capaz de reduzir o número de células infectadas na cultura, sendo comparável à

cultura controle, a partir da utilização da concentração de 1mM, observa-se uma redução

de 70% do número de células infectadas na cultura, aproximadamente. Com o aumento

da concentração de composto, esse número reduziu-se ainda mais, sendo a

concentração de 5mM capaz de reduzir em aproximadamente 75% a porcentagem de

células infectadas na cultura. Entretanto, diferente do que foi observada para o derivado

tiosemicarbazona 2b, a utilização de 10mM do derivado tiazolidinônico 3b não foi capaz

de eliminar completamente as células infectadas da cultura, sendo a redução deste

número em aproximadamente 80% após o tratamento (figura 20a).

Os efeitos citotóxicos para as células hospedeiras, entretanto, foram observados

com o aumento da concentração do composto utilizado. Através da análise da figura

20b, observa-se que o número de células na cultura se reduz à medida que a

concentração do composto é aumentada. Enquanto na cultura controle e nos

tratamentos com 0,1 e 1mM de composto esse número não se reduz, a partir da

utilização das concentrações de 5 e 10mM do composto, ocorre redução de 17% e 33%,

respectivamente, no número de células na cultura (figura 20b). Isso acontece devido à

eliminação progressiva das células da cultura em decorrência do aumento da

concentração do composto, mostrando que as concentrações mais altas foram tóxicas

para a célula hospedeira.

O número de parasitas intracelulares ao longo do tratamento também se reduziu,

e esta redução foi maior quanto maior fosse a concentração do composto utilizada

(figura 20c). Após o tratamento com 0,1mM do composto, não ocorre redução do

número de parasitas intracelulares, confirmando as observações prévias de que esta

concentração não foi efetiva na eliminação do parasita do interior da célula. A partir do

tratamento com a concentração de 1mM, observa-se redução do número de parasitas

Costa, C.F.

61

intracelulares em aproximadamente 66%, mostrando que a partir desta concentração os

parasitas começam a ser eliminados do meio intracelular. Esta redução foi maior após a

utilização das concentrações de 5mM (83%) e 10mM (86%) (figura 20c). Porém, não se

pode afirmar que a redução do número de parasitas intracelulares decorrentes da

utilização das duas últimas concentrações foi devido à eliminação do parasita do meio

intracelular, pois o número de células na cultura após o tratamento com estas

concentrações também se reduziu (figura 20b). Por isso, esta redução pode também

estar relacionada com a diminuição do número de células hospedeiras na cultura, devido

a efeitos citotóxicos decorrentes da utilização de concentrações mais altas.

Da mesma forma, foi analisado o número de vacúolos contendo parasitas

destruídos (figura 20d). Após o tratamento com 0,1mM, não foi observado número

significante de vacúolos com parasitas destruídos, mostrando mais uma vez que esta

concentração não foi efetiva em causar os danos aos parasitas intracelulares

observados com a utilização de concentrações maiores. Este número começa a subir

após o tratamento com a concentração de 1mM, mas reduz após o tratamento com as

concentrações de 5 e 10mM do composto (figura 20d). Esta redução é provavelmente

devido à eliminação das células hospedeiras, já que após o tratamento com essas

concentrações foi observada a redução do número destas na cultura.

Costa, C.F.

62

Costa, C.F.

63

Devido a aparente ineficiência da concentração de 0,1mM e aos efeitos

citotóxicos observados na célula hospedeira após o tratamento com 5mM e 10mM dos

compostos, a concentração de 1mM foi selecionada para dar continuidade aos testes.

Todos os compostos tiosemicarbazonas e seus derivados foram, a partir de então,

utilizados na concentração de 1mM, por 24h em culturas de macrófagos infectados com

L. amazonensis, a fim de realizarmos uma análise comparativa do efeito das drogas.

De acordo com as análises quantitativas, ocorreu uma redução no número de

células infectadas na cultura após o tratamento com quaisquer dos compostos testados.

Através da análise da tabela 3, pode-se observar que houve uma redução em

aproximadamente 70% do número de células infectadas após o tratamento com os

compostos. Porém, essa redução no número de células infectadas mais uma vez foi

mais ou menos efetiva dependendo do composto testado, de modo que alguns

compostos puderam ser destacados devido à sua maior atividade (tabela 3).

Dentre as tiosemicarbazonas, pode-se destacar os compostos 2e, 2f e 2j como os

mais eficazes na eliminação do parasita do meio intracelular (tabela 3). Após o

tratamento com estes compostos, o número de células infectadas reduziu-se em

aproximadamente 80% e o número de parasitas intracelulares reduziu-se em

aproximadamente 83%, enquanto os demais compostos reduziram em

aproximadamente 75% o número de parasitas intracelulares.

O número de vacúolos parasitóforos, entretanto, não foi muito diferente nos

tratamentos com os diferentes compostos analisados. De acordo com a análise da

tabela 3, verifica-se que os compostos analisados apresentaram todos eles números

relativamente similares de vacúolos contendo parasitas destruídos. Assim, verifica-se

que os compostos apresentaram a capacidade de permitir a eliminação do parasita da

célula hospedeira através do processo de destruição pela própria célula.

Os derivados tiazolidinônicos também foram eficazes em reduzir tanto o número

de células não infectadas após o tratamento quanto o número de parasitas

intracelulares, como pode ser visto através da análise da tabela 3. Vale destacar ainda

que alguns compostos, porém, podem ser destacados como mais efetivos no tempo e

concentração analisados. Os compostos 3e, 3g e 3i foram os que conseguiram uma

maior redução do número de células infectadas, bem como o número de parasitas

Costa, C.F.

64

intracelulares quando comparados com os demais compostos. Eles foram eficazes em

promover uma redução em aproximadamente 75% o número de células infectadas,

enquanto os demais compostos reduziram em 70% o número de células infectadas na

cultura. (tabela 3). O número de parasitas intracelulares reduziu-se em 75%,

aproximadamente, após o tratamento com os derivados tiazolidinônicos (tabela 3). O

aumento observado no número de vacúolos contendo parasitas destruídos, porém, deve

estar relacionado com o aumento da capacidade do composto em permitir a progressiva

eliminação do parasita do meio intracelular, da mesma forma que analisado para as

tiosemicarbazonas.

Costa, C.F.

65

Tabela 3 – Porcentagem de células infectadas e não infectadas com L. amazonensis, número de parasitas intracelulares e vacúolos contendo parasitas alterados antes e após o tratamento com as tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos. Macrófago + L. amazonensis tratados com tiosemicarbazonas e derivados tiazolidinônicos

Compos R1 R2 Células não infectadas Células infectadas Parasitas intracelulares Vacúolos contendo tos Controle Tratado Controle Tratado Controle Tratado parasitas alterados

2b H m-NO2 32 ± 3 76 ± 4 68 ± 3 23 ± 4 486 ± 58 125 ± 33 35 ± 5 3b H m-NO2 30 ± 6 79 ± 4 69 ± 6 20 ± 4 558 ± 116 147 ± 52 31 ± 2

2d CH3 o-NO2 39 ± 2 60 ± 2 79 ± 2 21 ± 2 410 ± 68 104 ± 21 35 ± 3

3d CH3 o-NO2 26 ± 2 72 ± 5 72 ± 2 21 ± 4 484 ± 216 125 ± 96 23 ± 3

2e CH3 m-NO2 31 ± 7 88 ± 2 69 ± 4 12 ± 2 682 ± 33 95 ± 39 27 ± 4

3e CH3 m-NO2 25 ± 7 75 ± 6 71 ± 7 19 ± 6 524 ± 108 119 ± 20 45 ± 3 2f CH3 p-NO2 36 ± 4 88 ± 3 64 ± 4 11 ± 3 505 ± 143 54 ± 17 34 ± 4

3f CH3 p-NO2 33 ± 6 76 ± 6 67 ± 6 23 ± 6 521 ± 252 311 ± 84 35 ± 8

2g CH2CH3 o-NO2 31 ± 3 82 ± 3 68 ± 3 17 ± 3 521 ± 52 135 ± 24 23 ± 1

3g CH2CH3 o-NO2 31 ± 3 82 ± 5 68 ± 3 17 ± 5 525 ± 52 136 ± 35 20 ± 2

2h CH2CH3 m-NO2 36 ± 6 77 ± 9 64 ± 6 23 ± 9 521 ± 118 135 ± 74 29 ± 4

3h CH2CH3 m-NO2 36 ± 6 78 ± 6 64 ± 6 22 ± 5 535 ± 118 139 ± 30 23 ± 3

2i CH2CH3 p-NO2 31 ± 4 75 ± 2 68 ± 4 25 ± 2 543 ± 33 141 ± 59 29 ± 4

3i CH2CH3 p-NO2 33 ± 6 78 ± 6 67 ± 6 19 ± 6 527 ± 283 137 ± 123 43 ± 4

2j C6H5 o-NO2 39 ± 2 60 ± 2 80 ± 2 20 ± 2 410 ± 68 103 ± 15 37 ± 3

3j C6H5 o-NO2 33 ± 3 72 ± 4 72 ± 3 21 ± 4 484 ± 216 125 ± 36 41 ± 4

Costa, C.F.

66

4.2.2. Análise morfológica

As culturas de macrófagos infectadas com L. amazonensis e tratadas com as

diferentes concentrações do derivado tiosemicarbazona 2b foram analisadas através de

microscopia óptica de campo claro, e foram obtidas imagens referentes aos tratamentos.

A análise da cultura tratada com a concentração de 0,1mM do composto 2b não

revelou alterações morfológicas significativas na cultura após 24 horas de tratamento.

Da mesma forma que a cultura controle (figura 21a e b), as células tratadas por 24

horas com 0,1mM do composto 2b se apresentavam íntegras, sem alterações no núcleo

e com citoplasma bem aderido e espalhado sobre o substrato, infectados por

amastigotas também com morfologia inalterada, com formato arredondado, sem flagelo

aparente e sem alterações no núcleo ou em outras organelas, como o cinetoplasto

(figura 21c).

Quando foram analisadas as culturas de macrófagos infectados com amastigotas

de L. amazonensis tratadas com 1mM do derivado tiosemicarbazona 2b, algumas

alterações puderam ser observadas (figura 21d). Alguns parasitas com alterações

morfológicas, como material citoplasmático reduzido, foram observados (figura 21d,

setas pretas) e algumas células não infectadas também foram observadas após o

tratamento (figura 21d, setas pontilhadas). Apesar das alterações nos parasitas, as

células mantiveram sua morfologia inalterada (figura 21d). Assim, observa-se que,

nesta concentração, ocorre uma redução no número de células infectadas, além das

alterações observadas na morfologia dos parasitas intracelulares (figura 21d, setas

pretas), sendo esta concentração eficiente em reduzir a infecção sem alterar a

morfologia da célula hospedeira.

As concentrações de 5mM e 10mM apresentaram resultados bastante

significativos com relação à eliminação do parasita, reduzindo ou até mesmo eliminando

as formas amastigotas do meio intracelular (figura 21c e d). Entretanto, através da

análise da morfologia das culturas tratadas por 24 horas com as concentrações acima

referidas, foram observadas alterações morfológicas na célula hospedeira decorrentes

do tratamento com estas concentrações (figura 21e e f). Após o tratamento com 5mM

do derivado tiosemicarbazona 2b, as células apresentavam-se com seu conteúdo

Costa, C.F.

67

citoplasmático bastante reduzido (figura 21e, estrela). Apesar disso, foi observada

significativa redução no número de parasitas no meio intracelular (figura 21e, seta

pontilhada).

Após o tratamento com 10mM do composto 2b, as células apresentaram

alterações morfológicas ainda mais acentuadas (figura 21f). Apesar de não terem sido

observadas células infectadas na cultura tratada com esta concentração (figura 21f,

seta pontilhada), os macrófagos apresentaram-se com o citoplasma retraído (figura

21f, estrelas). A redução do material citoplasmático decorrente do tratamento com esta

concentração foi mais acentuada em comparação com aquela observada para a

concentração de 5mM.

Costa, C.F.

68

Costa, C.F.

69

A análise morfológica do tratamento com diferentes concentrações do derivado

tiazolidinônico 3b mostrou o mesmo padrão de alterações morfológicas verificadas após

o tratamento com o derivado tiosemicarbazona 2b.

O tratamento com 0,1mM do composto 3b não apresentou nenhuma alteração

significativa na morfologia dos parasitas intracelulares ou dos macrófagos (figura 22c),

tendo a cultura mantido aspecto semelhante àquele observado na cultura controle

(figura 22a e b), onde as células se mantiveram espalhadas e aderidas ao substrato,

com núcleo e citoplasma íntegros. Os parasitas intracelulares, da mesma forma, se

mantiveram sem alterações morfológicas, apresentando-se com sua morfologia

arredondada, com núcleo visível e sem flagelo aparente (figura 22c). Dessa forma, esta

concentração não foi considerada efetiva na eliminação do parasita do meio intracelular,

como observado anteriormente em decorrência do tratamento da tiosemicarbazona 2b

(figura 21c).

Após o tratamento com 1mM do composto 3b, entretanto, algumas alterações nos

parasitas intracelulares foram observadas. Vacúolos contendo parasitas destruídos ou

com certo grau de desorganização e redução do volume citoplasmático foram

observados (figura 22d, setas pretas), bem como uma redução do número de parasitas

inseridos no vacúolo parasitóforo (figura 22d, asterisco).

Após o tratamento com 5mM do composto 3b, ainda foram observados alguns

parasitas no interior de vacúolos presentes nos macrófagos. Entretanto, estes parasitas

estavam visivelmente destruídos no interior do vacúolo (figura 22e, setas pretas). Os

macrófagos que continham os vacúolos contendo parasitas destruídos não

apresentaram alterações morfológicas. Porém, outros macrófagos presentes na mesma

cultura tratada com a concentração (5mM) apresentaram-se com o conteúdo

citoplasmático bastante reduzido, ou seja, causando efeitos citotóxicos na célula

hospedeira (figura 22e, estrelas).

A concentração de 10mM, quando utilizada no tratamento por 24 horas das

culturas, foi ainda mais citotóxica. Após o tratamento com esta concentração, não foram

observadas células infectadas, tampouco vacúolos contendo parasitas destruídos no

interior de macrófagos, mas as células hospedeiras apresentaram-se bastante alteradas

morfologicamente (figura 22f). Os macrófagos, após o tratamento com a concentração

Costa, C.F.

70

referida, mostraram conteúdo citoplasmático totalmente retraído, além de apresentarem

formato bastante arredondado, o que contrasta com a morfologia normal deste tipo

celular (figura 22f, estrelas).

Devido à ineficiência da concentração de 0,1mM em conduzir à eliminação do

parasita do meio intracelular e aos efeitos citotóxicos observados após o tratamento com

as concentrações de 5mM e 10mM, a concentração obtida como a ideal para dar

continuidade aos testes e avaliar os diferentes efeitos apresentados por cada composto

em 24h de tratamento foi a de 1mM. Nesta concentração, observou-se redução no

número de parasitas intracelulares e um número significativo de vacúolos contendo

parasitas alterados, sem haver redução no número de macrófagos e alterações

morfológicas nestas células, demonstrando que a esta concentração os compostos não

foram tóxicos para a célula hospedeira (figuras 21d e 22d).

Costa, C.F.

71

Costa, C.F.

72

Após 24 horas de tratamento, as culturas tratadas com 1mM das tiosemicarbazonas

2e, 2f e 2j, aquelas que demonstraram atividade mais significativa quando analisadas

quantitativamente, foram analisadas também morfologicamente (Figura 23).

A análise da morfologia das culturas de macrófagos infectados e tratados com 1mM

dos compostos utilizados mostrou que houve uma redução no número de células

infectadas após o tratamento em comparação à cultura controle. Após o tratamento com

os compostos, foram observadas alterações morfológicas nos parasitas intracelulares

para todos os compostos verificados (figura 23b-d, setas pretas), em comparação com

a cultura que não recebeu nenhum tratamento, onde os parasitas mostraram-se com sua

morfologia normal, arredondado, com núcleo justaposto ao cinetoplasto (figura 23a).

Os vacúolos parasitóforos também foram analisados morfologicamente. Em todos os

tratamentos com os derivados tiosemicarbazonas analisados (2e, 2f e 2j), observa-se

um número significativo de parasitas inseridos no vacúolo aparentemente destruídos

(figura 23b-d, setas pretas), ao contrário do que é observado na cultura onde não

houve a utilização de quaisquer dos compostos (figura 23a), o que sugere que estes

compostos foram capazes de permitir a progressiva eliminação do parasita do meio

intracelular pela célula hospedeira através da reativação dos mecanismos microbicidas.

Ainda, foi verificado um grande número de células não infectadas após o tratamento com

os compostos (23b-d, setas pontilhadas). Contudo, nenhuma alteração morfológica na

célula hospedeira foi observada.

Costa, C.F.

73

Costa, C.F.

74

As culturas tratadas por 24 horas com os derivados tiazolidinônicos foram também

analisadas morfologicamente. Foram analisadas as culturas tratadas com os compostos

3e, 3g e 3i, que foram mais eficazes na redução do número de células infectadas (tabela

3).

A figura 24 mostra a redução no número de células infectadas na cultura após o

tratamento por 24 horas com os compostos citados anteriormente. Observa-se, no meio

intracelular, parasitas alterados morfologicamente (figura 24b-d, setas pretas). Estes

parasitas provavelmente perderam a capacidade de se dividir no meio intracelular após

o tratamento com os compostos e foram destruídos pela célula hospedeira, da mesma

forma que observado após o tratamento com as tiosemicarbazonas (figura 23b-d, setas

pretas). A cultura que não recebeu tratamento apresentou parasitas inseridos no

vacúolo parasitóforo com sua morfologia normal, dividindo-se normalmente (figura 23a,

VP). Da mesma forma que o observado para as tiosemicarbazonas, também foram

observadas células não infectadas na cultura após o tratamento, confirmando a redução

da infecção observada nas análises quantitativas (figura 24b-d, setas pontilhadas).

Isso provavelmente se deve à eliminação do parasita do meio intracelular pela célula

hospedeira após o tratamento ter inibido a divisão do parasita.

Costa, C.F.

75

Costa, C.F.

76

4.2.3. Aspectos ultraestruturais

Para análise ultraestrutural de macrófagos infectados com 1mM da tiosemicarbazona

2g por 12h e 24h, foi utilizada microscopia eletrônica de transmissão.

As culturas de macrófagos que não foram submetidas a nenhum tratamento,

mantidas também por 12h e 24h, apresentavam-se com aspecto normal (figuras 25a e

26a), tendo a célula hospedeira núcleo com cromatina descondensada (figura 25a e 26a

– N), e o parasita inserido em um vacúolo grande, onde as formas amastigotas são

capazes de se dividir (figura 25a e 26a, setas pontilhadas). Da mesma forma, as

formas amastigotas apresentavam formato arredondado, ou seja, sem qualquer

alteração em sua forma, e algumas organelas puderam ser visualizadas, como núcleo

(figuras 25a e 26a – N) e acidocalcissomos (figuras 25a e 26a – A).

Após o tratamento com o derivado tiosemicarbazona por 12h, apesar de a célula

hospedeira não ter sofrido nenhuma alteração morfológica, as formas amastigotas

apresentavam-se em processo de destruição no interior do vacúolo (figuras 25b e c).

Foi possível observar, após o tratamento, algumas organelas, como cinetoplasto (figura

25b – C). Porém, as amastigotas apresentaram ainda intensa vacuolização

citoplasmática (figura 25b – cabeça de seta) e perda do formato celular, o que indica

que o processo de destruição do parasita no vacúolo leve a um processo de morte

celular programada. Foram observadas também condensação da cromatina nuclear

(figura 25c – setas pretas) e desorganização do sistema endomembranar (figura 25c –

setas cinzas). Essas alterações observadas se devem provavelmente à incapacidade

de dar continuidade ao processo de divisão celular após o tratamento e à recuperação

dos mecanismos microbicidas da célula hospedeira. O vacúolo, porém, não sofreu

nenhuma modificação nesse tempo de tratamento (figura 25b, setas pontilhadas).

Após o tratamento com o composto 2g por 24h, observa-se destruição total dos

parasitas no interior do vacúolo (figura 26b e c). Restos de membranas e citoesqueleto

podem ser observados após esse tempo de tratamento com o referido composto (figura

26b e c, setas cinzas). Além disso, também podem ser observados fragmentos

nucleares no interior do vacúolo (figura 26c, setas pretas). Não são observadas

alterações na célula hospedeira (figura 26), esta apresentando todas as organelas

Costa, C.F.

77

observáveis em uma célula eucariótica convencional, como complexo de Golgi (figura

26c – CG), mitocôndrias dispostas principalmente ao redor do vacúolo parasitóforo

(figura 26c – M) e núcleo com cromatina descondensada (figura 26c – N). O vacúolo

parasitóforo, entretanto, começa a apresentar algumas alterações, como a presença de

descontinuidade da membrana em sua posição em relação ao parasita (figura 26c,

setas pontilhadas).

Essas alterações sugerem que um tempo curto de incubação com o composto 2g é

suficiente para causar as alterações observadas, como a condensação da cromatina,

vacuolização citoplasmática e danos ao cinetoplasto. Em 24h de incubação com o

referido composto estas alterações se mostram ainda mais drásticas, dessa forma

levando o parasita à completa destruição no interior do vacúolo. Isso mostra que as

formas amastigotas não conseguem completar o processo de divisão celular após o

tratamento, mesmo em um tempo curto como o tempo de 12h, e assim sofrem o

processo de degradação devido à recuperação dos mecanismos microbicidas dos

macrófagos. A atividade antiproliferativa das tiosemicarbazonas ainda pode estar

conduzindo a um processo de morte celular programada semelhante a apoptose nos

parasitas intracelulares.

Costa, C.F.

78

Costa, C.F.

79

Costa, C.F.

80

5. DISCUSSÃO

No presente trabalho, promastigotas de Leishmania amazonensis foram tratados

com a concentração de 1mM dos derivados tiosemicarbazonas e seus derivados

tiazolidinônicos por 6 dias, tempo necessário para que as formas promastigotas

atingissem a fase exponencial (3° dia) e em seguida a fase estacionária (5° dia) de

crescimento em cultura. Em decorrência do tratamento, foi observada redução no

número de promastigotas já no 3° dia de tratamento, sendo esse número mantido ou

reduzido no último dia de tratamento.

De acordo com a observação do mecanismo de ação das tiosemicarbazonas e seus

derivados tiazolidinônicos, sua atividade está relacionada à ligação a enzimas que

utilizam metais para sua atividade, como a ribonucleotideo redutase (Finch et al., 1999).

Como esta enzima está relacionada com a replicação do DNA e conseqüente passagem

da fase G1 para a fase S do ciclo celular (Thelander & Reichard, 1979; Cory & Sato,

1983), pode-se inferir que a interrupção do crescimento das formas promastigotas em

cultura ao longo do tempo de tratamento, bem como a redução do número de

promastigotas na cultura está relacionada com a atividade dos compostos na enzima

ribonucleotideo redutase. Entretanto, o alvo específico na célula que foi afetado pelos

compostos não pode ser definido com precisão. Estudos posteriores voltados para a

determinação dos alvos na célula que estão sendo afetados pelos compostos ainda

precisam ser realizados.

As análises da ultraestrutura das formas promastigotas tratadas com derivados

tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos revelam que após o quinto dia de

tratamento, as formas promastigotas tratadas com qualquer um dos compostos

apresentam alterações como cromatina condensada, divisão anormal de núcleo e

cinetoplasto, retração e vacuolização citoplasmática. Segundo Lee e colaboradores

(2002), algumas alterações relacionadas à morte celular programada podem ser

observadas em culturas de promastigotas de L. amazonensis no final da fase

estacionária, como condensação da cromatina, presença de mais de um núcleo ou

cinetoplasto e retração do material citoplasmático. Porém, este tipo de morte celular não

pode ser considerado apoptose, já que L. amazonensis é um organismo unicelular.

Costa, C.F.

81

As mesmas alterações foram observadas no presente trabalho, sugerindo que um

processo de morte celular esteja acontecendo durante o tratamento com as

tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos, conduzindo-os a um processo de

morte celular programada.

5.1. Interação Macrófago/Leishmania amazonensis

Para se estabelecer no interior da célula hospedeira, Leishmania amazonensis

emprega uma série de mecanismos capazes de burlar o sistema microbicida dos

macrófagos, de forma a inativá-lo e permitir sua sobrevivência e assim dar continuidade

à infecção no hospedeiro vertebrado (revisado em Bogdan & Rollinghoff, 1999).

Leishmania amazonensis é capaz de sobreviver ao ambiente ácido do vacúolo

parasitóforo formado, já que não impede a fusão com lisossomos da célula ao vacúolo, e

ainda aproveita o ambiente ácido formado em benefício próprio, otimizando a aquisição

de nutrientes ali presentes (Burchmore & Barret, 2001). É possível, para o parasita,

resistir ao ambiente ácido do vacúolo devido a presença, em sua membrana, de

ATPases, que bombeiam prótons para o exterior, mantendo um pH neutro no interior do

parasita, apesar do ambiente ácido encontrado no lúmen do vacúolo parasitóforo

(Burchmore & Barret, 2001).

Sendo assim, o vacúolo parasitóforo pode ser considerado uma barreira para a

utilização de drogas contra o parasita, bem como à sua eliminação do ambiente

intracelular, pois além de ser uma barreira à penetração das drogas, as formas

amastigotas que ali estão permitem o efluxo das drogas de seu interior, por causa da

presença de ATPases em sua membrana.

O principal alvo do presente trabalho é justamente o vacúolo parasitóforo, pois as

tiosemicarbazonas e seus derivados foram utilizados com o intuito de se estudar e

verificar o desenvolvimento intracelular do parasita após o tratamento. Ademais, o alvo

para desenvolvimento de quimioterápicos no tratamento de leishmanioses é a forma

amastigota, presente no interior do vacúolo.

Macrófagos infectados com L. amazonensis foram tratados por 24 horas com os

compostos tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos. Antes do tratamento

Costa, C.F.

82

com todos os compostos testados, alguns deles foram testados em diferentes

concentrações, para o estabelecimento de uma concentração ideal para a continuação

dos testes, concentração esta que deveria permitir alterações no parasita intracelular

sem causar danos à célula hospedeira.

Após o estabelecimento da concentração ideal (sendo esta concentração 1mM),

foram analisados aspectos morfológicos e dados quantitativos do tratamento com os

referidos compostos. Foi observada, em decorrência do tratamento com todos os

compostos, uma redução não só no número de células infectadas, mas também no

número de parasitas intracelulares. Porém, essa redução foi dependente do composto

testado, já que alguns compostos mostraram-se mais efetivos que outros.

Segundo Hutchinson (1985), modificações feitas nas moléculas de

tiosemicarbazonas levam a perda substancial da atividade quimioterápica destes

compostos. Isso confirma os dados apresentados, pois de acordo com as mudanças

apresentadas nos radicais das moléculas, o efeito antiproliferativo destas foi alterado,

sendo mais ou menos efetivas dependendo da mudança do radical. Da masma forma,

as tiosemicarbazonas apresentaram-se mais eficientes na eliminação do parasita do

meio intracelular que seus derivados tiazolidinônicos.

Através da análise morfológica do tratamento com os compostos, pode ser

observado que existem parasitas intracelulares com aspecto alterado quando

comparado às culturas controle. Isso sugere que, após o tratamento com os compostos,

as células foram capazes de reativar seus mecanismos microbicidas, já que as

tiosemicarbazonas e derivados tiazolidinônicos agem em enzimas relacionadas com a

interrupção do ciclo celular. Alguns parasitas mantiveram sua morfologia inalterada

mesmo após o tratamento. Isso sugere que nem todos os parasitas estavam na mesma

fase do ciclo celular no momento do tratamento, ou seja, a cultura de promastigotas

utilizadas para a infecção de macrófagos era assincrônica. Assim, as formas

amastigotas que se apresentavam em interfase sofreram mais os efeitos da droga,

provavelmente pela interrupção da replicação do DNA.

O aumento do número de vacúolos contendo parasitas destruídos ainda foi

verificado. Isso confirma as observações anteriores de que, após o tratamento com os

compostos, os parasitas intracelulares interrompem seu desenvolvimento e a célula é

Costa, C.F.

83

capaz de reativar seus mecanismos celulares, conduzindo à eliminação do parasita.

Entretanto, estudos posteriores devem ser realizados no sentido de verificar se, após a

remoção das drogas da cultura, os parasitas que não apresentaram alterações

morfológicas são capazes de voltar a se multiplicar e restabelecer a infecção.

Como já referido, as tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos têm sua

atividade relacionada à ligação a enzimas que utilizam metais para a sua atividade,

como a enzima ribonucleotídeo redutase (Finch et al., 1999). Por isso, tem sido sugerido

que o principal alvo celular desses compostos seja o ciclo celular, impedindo replicação

do DNA através da inativação da enzima.

A análise da ultraestrutura das culturas de macrófagos infectados com L.

amazonensis e tratados com as tiosemicarbazonas mostrou que, após 12 horas de

tratamento com os compostos, as amastigotas começam a sofrer alterações drásticas,

como vacuolização citoplasmática, condensação da cromatina e divisão anormal de

algumas organelas, como o cinetoplasto, levando o parasita à destruição. Estas

alterações foram ainda mais pronunciadas após 24h de incubação com o derivado

tiosemicarbazona, levando o parasita à completa destruição no interior do vacúolo.

Podem ser observados fragmentos nucleares em algumas amastigotas após o

tratamento, o que sugere uma divisão anormal desta organela durante o tratamento.

Segundo Lee e colaboradores, protozoários parasitas passam por um processo

de morte celular programada semelhante a apoptose no final da fase estacionária ou

quando sofrem a ação de alguma droga antiproliferativa. Após o tratamento com um dos

derivados tiosemicarbazonas por 12 horas, algumas alterações características de

células apoptóticas foram observadas, e estas foram ainda mais drásticas após 24 horas

de incubação com o derivado tiosemicarbazona testado. Isto sugere que, após 12 horas

de incubação com o referido composto, um processo de morte celular programada

semelhante a apoptose pode estar ocorrendo devido ao tratamento com drogas

antiproliferativas, e este processo continua após 24h de incubação, sendo capaz de

conduzir a completa destruição dos parasitas intracelulares.

Como referido, o macrófago é um tipo celular capaz de fagocitar e destruir

grandes partículas que entram em contato com o organismo, incluindo patógenos

(Alberts et al., 2002). Entretanto, Leishmania tem a capacidade de burlar o sistema

Costa, C.F.

84

imune, inativando os mecanismos de defesa dos macrófagos (revisado em Bogdan &

Rollinghoff, 1999). Com a utilização de drogas que de alguma forma são capazes de

interromper o processo de divisão celular dos parasitas presentes no interior do vacúolo,

estes se tornam incapazes de estabelecer a infecção no meio intracelular. Assim, os

macrófagos são capazes de recuperar seus mecanismos microbicidas e destruir os

parasitas contidos no interior do vacúolo.

Entretanto, estudos mais detalhados, utilizando marcadores apropriados para

diferentes alvos celulares, principalmente aqueles envolvidos no ciclo celular, devem ser

realizados para a determinação exata do alvo celular onde os compostos podem estar

agindo, de modo a impedir o desenvolvimento dos parasitas intracelulares, contribuindo

assim para sua eliminação.

Diante dos resultados apresentados, pode-se verificar que os compostos de

tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos foram capazes de causar

alterações morfológicas nas formas amastigotas presentes no interior de vacúolo

parasitóforo, provavelmente devido à interrupção do desenvolvimento e multiplicação

intracelular destes parasitas. Este efeito pôde ser confirmado através da análise da

redução do número de células infectadas e parasitas intracelulares, estas células

inclusive contendo vacúolos com parasitas destruídos em seu interior.

Os parasitas provavelmente são incapazes de recuperar sua capacidade de

desenvolvimento e multiplicação, devido às drásticas alterações sofridas. Entretanto,

outros estudos devem ser realizados a fim de verificar a capacidade de reativação do

desenvolvimento e multiplicação intracelular destes parasitas. Estes efeitos estão

possivelmente relacionados à inativação da enzima ribonucleotideo redutase, porém

estudos posteriores devem ser conduzidos para a confirmação dessas constatações.

Costa, C.F.

85

6. CONCLUSÕES

• O tratamento com diferentes concentrações dos derivados tiosemicarbazonas e

seus derivados tiazolidinônicos demonstraram redução do número de

promastigotas na cultura ao longo de tratamento a partir da concentração de

1mM, sendo a concentração de 10mM capaz de eliminar as promastigotas já no

terceiro dia de tratamento;

• Os compostos tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos foram

capazes reduzir o número de promastigotas de L. amazonensis in vitro após um

tempo de tratamento de 6 dias com 1mM de composto. Essa redução foi

observada a partir do terceiro dia de tratamento. Porém, foi mais ou menos

significativa dependendo do radical presente em cada composto testado;

• As alterações morfológicas decorrentes do tratamento com concentrações

crescentes das tiosemicarbazonas e seus derivados tiazolidinônicos foram

pronunciadas após o terceiro dia de tratamento, sendo mais drásticas quanto

maior fosse a concentração utilizada dos compostos e o tempo de tratamento,

caracterizando-se por alterações no material citoplasmático (retração e

desorganização);

• A observação da ultraestrutura de promastigotas de L. amazonensis após o

tratamento com 1mM dos derivados tiosemicarbazonas e derivados

tiazolidinônicos por 5 dias mostrou alterações morfológicas como condensação da

cromatina nuclear, divisão anormal do cinetoplasto, retração e vacuolização do

citoplasma, o que pode ser um indício de morte celular programada, devido à

incapacidade de completar o processo de divisão celular após o tratamento com

os compostos;

• Através de análise de culturas de macrófagos infectadas com L. amazonensis

tratadas por 24 horas com diferentes concentrações dos compostos foi possível

identificar a concentração de 1mM como a concentração capaz de causar

redução do número de parasitas no meio intracelular sem, contudo, reduzir o

número de macrófagos na cultura. Porém, concentrações maiores reduziram o

número de células hospedeiras, além do número de parasitas intracelulares;

Costa, C.F.

86

• As culturas de macrófagos infectados com L. amazonensis tratados por 24 horas

com 1mM dos compostos apresentaram uma redução de aproximadamente 75%

do número de células infectadas em cultura, e igual redução no número de

parasitas intracelulares, além de uma quantidade significativa de vacúolos

contendo parasitas alterados após o tratamento. Mais uma vez, estes números

foram maiores ou menores dependendo do composto analisado;

• Foi possível verificar que os parasitas intracelulares sofriam danos morfológicos

na concentração de 1mM, sem, no entanto alterar a morfologia da célula

hospedeira. Todavia, concentrações mais altas causaram danos aos macrófagos;

• As culturas de macrófagos infectados com L. amazonensis tratados com os

derivados tiosemicarbazonas por 12h e 24h sofreram um processo de destruição

dependente do tempo, onde a completa destruição dos parasitas no interior do

vacúolo, bem como a presença de fragmentos nucleares, é observada após 24h

de tratamento, sugerindo que após o tratamento com a tiosemicarbazona, houve

interrupção no processo de divisão celular do parasita, levando-o a um processo

de morte celular programada semelhante a apoptose e assim o macrófago

consegue recuperar seus mecanismos microbicidas e destruí-los no interior do

vacúolo.

Costa, C.F.

87

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AKINCHAN, N.T., DROZDZEWSKI, P.M. & HOLZER, W. Synthesis and spectroscopic

studies on zinc (II) and mercury (II) complexes of isatin-3-thiosemicarbazone. J Mol

Struct 2002; 641:17-22.

AL-BASHIR, N. & RASSAM, M. Axenic cultivation of amastigotes of Leishmania

donovani and Leishmania major and their infectivity. Ann Trop Med Parasitol 1992;

86: 487-502.

ALBERTS, B., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K. & WALTER, P.

(2002). Células auxiliares e ativação de linfócitos. Pp.1414-1415 in: Biologia

Molecular da Célula. Ed. Artmed, São Paulo, Brasil.

AL-MOHAMMED, H.I., CHANCE, M.L. & BATES, P.A. Production and characterization

of stable Amphotericin B-resistant amastigotes and promastigotes of Leishmania

mexicana. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2005; 49(8): 3274-3280.

ALVES, A.J., LEITE, A.C.L., SANTANA, D.P., BELTRÃO, T.M. & COELHO, M.R.D.

Synthesis of some 4-oxo-∆2-thiazolin-2-ylhydrazones as potential antiprotozoal

agents. IL Farmaco 1993; 48(8): 1167-1171.

AYRES, D.C., MARCUCCI, M.C. & GIORGIO, S. Effects of Brazilian propolis on

Leishmania amazonensis. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2007; 102(2): 215-220.

BASSELIN, M., DENISE, H., COOMBS, G.H. & BARRETT, M.P. Resistance to

pentamidine in Leishmania mexicana involves exclusion of the drug from the

mitochondrion. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 3731-3738.

Costa, C.F.

88

BASSELIN, M. & GERO, M.R. Alteractions in membrane fluidity, lipid metabolism

mitochondria activity and lipophosphoglycan expression in pentamidine resistant

Leishmania. Parasitol Res 1998; 84: 78-83.

BATES, P. The developmental biology of Leishmania promastigotes. Exp Parasitol

1994; 79: 215-218.

BECKLOFF, G.L., LERNER, H.J., FROST, D., RUSSO-ALESI, F.M. & GITOMER, S.

Hydroxyurea (NSC-32065) in bilogic fluids: dose-concentration relationship. Cancer

Chemother Rep 1965; 48: 57-58.

BHARTI, N., SHAILENDRA, SHARMA, S., NAQVI, F. & AZAM, A. New palladium (II)

complexes of 5-nitrothiosephene-2-carboxaldehyde thiosemicarbazones derivates.

Bioorg Med Chem Letters 2003; 12: 3475-3478.

BHARTI, N., HUSAIN, K., GARZA, M.T.G., CRUZ-VEGA, D.E., CASTRO-GARZA, J.,

MATA-CARDENAS, B.D., NAQVI, F. & AZAM, A. Synthesis and in vitro antiprotozoal

activity of 5-nitrothiosephene-2-carboxaldehyde thiosemicarbazones: synthesis,

spectral studies and in vitro anti-amoebic activity. Biorg Med Chem 2002; 11: 2923-

2929.

BESTEIRO, S., WILLIAMS, R.A.M., COOMBS, G.H. & MOTTRAN, J.C. Protein

turnover and differentiation in Leishmania. Int J Parasitol (Accepted Manuscript),

2007; 1-36.

BOGDAN C, RÖLLINGHOFF M. How do protozoan parasites survive inside

macrophages? Parasitol Today. 1999 Jan;15(1):22-8. Review.

BORGES, V.M., VANNIER-SANTOS, M.A., DE SOUZA, W. Subverted transferring

trafficking in Leishmania-infected macrophages. Parasitol Res 1998; 84:811-822.

Costa, C.F.

89

BRAY, P.G., BARRETT, M.P., WARD, S.A. & DE KONNING, H.P. Pentamidine uptake

and resistance in pathogenic protozoa: Past, present and future. TRENDS Parasitol

2003; 19: 232-239.

BROCHU, C., WANG, J. ROY, G., MESSIER, N., WANG, X.Y., SARAVIA, N.G. &

OUELLETTE, M. Antimony uptake systems in the protozoan parasite Leishmania

and accumulation differences in antimony-resistant parasites. Antimicrob Agents

Chemother 2003; 47: 3073-3079.

BROWN, F.C. 4-thiazolidinones. Chem Revs 1961; 61: 463-521.

BURCHMORE, R.J. AND M.P. BARRETT. Life in vacuoles – nutrient acquisition by

Leishmania amastigotes. Int J Parasitol 2001; 12:1311-1320.

CABANTCHIK, Z.I., MOODY-HAUPT, S. & GORDEUK, V.R. Iron chelators as anti-

infectives; malaria as a paradigm. FEMS Immunol Med Microbiol 1999; 26, 289-298.

CALLAHAN, H.L., PORTAL, A.C., DEVEREAUX, R., GROGL, M. An axenic amastigote

system for drug screening. Antimic Ag Chem 1997; 41(4): 818-822.

CARRIO, J. & PORTUS, M. In vitro susceptibility to pentavalent antimony in

Leishmania infantum strains is not modified during in vitro or in vivo passages but

is modified after host treatment with meglumine antimoniate. BMC Pharmacol 2

(2002) 11 Epub 2002 May 02.

CASAS, J.S., GARCIA-TASENDE, M.S. & SORDO, J. Main group metal complexes of

semicarbazones and thiosemicarbazones. A structural review. Coord Chem rev. 2000;

209, 197-261.

CHEN, M., CHRISTENSEN, S.B., BLOM, J., LEMMICH, E., NADELMANN, L., FICH, K.,

THEANDER, T.G. & KHARASMI, A. Licochalcone A, a novel antiparasitic agent with

Costa, C.F.

90

potent activity against human pathogenic protozoan species of Leishmania.

Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 2550-2556.

CORY, J.G. & SATO, A. Regulation of ribonucleotídeo reductase in mammalian

cells. Mol Cell Biochem, 1983; 53: 257-266.

COURRET, N., FRÉHEL, C., GOUHIER, N., POUCHELET, M., PRINA, E., ROUX, P. &

ANTOINE, J.A. Biogenesis of Leishmania-harbouring parasitophorous vacuoles

following phagocytosis of the metacyclic promastigote or amastigote stages ot the

parasites. J Cell Sci, 2002; 115, 2303-2316.

CROFT, S.L. & COOMBS, G.H. Leishmaniasis – Current chemotherapy and recent

advances in the search for novel drugs. TRENDS Parasitol 2003; 11: 502-508.

DAS, A., DASGUPTA, A., SENGUPTA, T. & MAJUMDER, H.K. Topoisomerases of

kinetoplastid parasites as potential chemotherapeutic targets. TRENDS Parasitol

20(8): 381-387.

DENKERS EY, BUTCHER BA. Sabotage and exploitation in macrophages

parasitized by intracellular protozoans. Trends Parasitol. 2005 Jan;21(1):35-41.

Review.

DESCOTEAUX, A. & TURCO, S.J. Glycoconjugates in Leishmania infectivity.

Biochim Biophis Acta 1999; 1455: 341-352.

DE ALMEIDA, M.C., CARDOSO, S.A. & BARRAL-NETTO, M. Leishmania (Leishmana)

chagasi infection alters the expression of cell adhesion and costimulatory

molecules on human monocyte and macrophage. Int J Parasitol 2003; 33: 153-162.

DE SOUZA, W. Secretory organelles of pathogenic protozoa. Anais da Academia

Brasileira de Ciências, 2006; 78(2): 271-291.

Costa, C.F.

91

DE SOUZA LEAO, S., LANG, T., PRINA, E., HELLIO, R. & ANTOINE, J.C. Intracellular

Leishmania amazonensis amastigotes internalize and degrade MHC class II

molecules of their host cells. J Cell Sci 1995; 108:3219-3231.

DO CAMPO, R. & MORENO, S.N. The acidocalcisome. Mol Biochem Parasitol 2001;

114, 151-159.

DONEHOWER, R.C. (1996). Hydroxyurea. Pp. 253-260 in Cancer Chemotherapy and

Biotherapy (B.A. Chabner and C.L. Longo, eds.) Lippincott-Raven, Philadelphia.

EASMON, J., HEINISCH, G., HOLZER, W. & ROSENWIRTH, B. Novel

thiosemicarbazones derived from formyl and acyldiazines: synthesis, effects on

cell proliferation and synergism with antiviral agents. J Biol Chem 1992; 35: 3288-

3296.

ELFORD, H.L., FREESE, M., PASSAMANI, E. & MORRIS, H.P. Ribonucleotide

reductase and cell proliferation 1. Variations of ribonucleotide reductase activity

with tumor grown in a series of rats hepatomas. J Biol Chem 1970; 245:5228-5233.

FERRARI, M.B., BISCEGLIE, F., PELOSI, G., SASSI, M., TARASCONI, P., CORNIA, M.,

CAPACCHI, S., ALBERTINI, R. & PINELLI, S. Synthesis, characterization and X-

raystructures of new antiproliferative and proapoptotic natural aldehyde

thiosemicarbazone and their nickel(II) and copper(II) complexes. J Inorg Biochem

2002; 90, 113-126.

FINCH, A.R., LIU, M., CORY, A.H., CORY, J.G. & SARTORELLE, A.C. Triapine (3-

aminopyrine-2-carboxaldehyde; 3-AP): an inhibitor of ribonucleotídeo reductase

with antineoplastic activity. Adv Enzyme Regul 1999; 39: 3-12.

Costa, C.F.

92

FOURNET, A., FERREIRA, M.H., ARIAS, A.R., ORTIZ, S.T., FUENTES, S.,

NAKAYAMA, H., SCHININI, A. & HOCQUEMILLER, R. In vitro efficacy of oral

intralesional administration of 2-substituted quinolines in experimental treatment

New World cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania amazonensis.

Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 2447-2451.

FOURNET, A., BARRIOS, A.A., MUÑOZ, V., HOCQUEMILLER, R., CAVÉ, A. &

BRUNETON, J. 2-Substituted quilone alkaloids as potential antileishmanial drugs.

Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 859-863.

FRAME MJ, MOTTRAM JC, & COOMBS GH. Analysis of the roles of cysteine

proteinases of Leishmania mexicana in the host-parasite interaction. Parasitology.

2000 Oct;121 ( Pt 4):367-77.

FREITAS BALANCO, J.M., MOREIRA, M.E.C., BONOMO, A., BOZZA, P.T.,

AMARANTE-MENDES, G., PIRMEZ, C. & BARCINSKI, M.A. Apoptotic mimicry by na

obligate intracellular parasite downregulates macrophage microbicidal activity. Cur

Biol 2001; 11: 1870-1873.

GLASER, T.A., UTZ, G.A. & MUKKADA, A.J. The plasma membrane electrical

gradient (membrane potential) in Leishmania donovani promastigotes and

amastigotes. Mol Biochem Parasitol. 1992; 51, 9-15.

GRANDIC, S.R.L., FOURNEAU, C., LAURENS, A., BORIES, C., HOCQUEMILLER, R. &

LOISEAU, P.M. In vitro antileishmanial activity of acetogenins from Annonaceae.

Biomed Pharmacother 2004; 58: 388-392.

GRANT , K.M., DUNION, M.H., YARDLEY, V., SKALTSOUNIS, A.L., MARKO, D.,

EISEBRAND, G., CROFT, S.L., MEIJER, L., MOTTRAN, J. Inhibitors of Leishmania

mexicana CRK3 cyclin-dependent kinase: chemical library screen and

antileishmanial ativity. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 3033-3042.

Costa, C.F.

93

GRUENBERG, J. & VAN DER GOOT, F.G. Mechanisms of pathogen entry through

the endossomal compartments. Nat Rev Mol Cell Biol 2006; 7:495-504.

GWILT, P.R. & TRACEWELL, W.G. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of

hydroxyurea. Clin Pharmacokinet 1998; 34, 347-358.

GÜRSOY, A., TERZIOGLU, N. & ÖTUK, G. Synthesis of some new hydrazide-

hidrazones, thiosemicarbazides and thiazolidinones as possible antimicrobials.

Eur J Med Chem 1997; 32: 753-757.

HAIMEUR A. & OUELLETTE, M. Gene amplification in Leishmania tarentolae

selected for resistance to sodium stibogluconate (in process citation). Antimicrob

Agents Cemother 1998; 42: 1689-1694.

HART, D.T. & COOMBS, G.H. Leishmania mexicana: energy metabolism of

amastigotes and promastigotes. Exp Parasitol 1982; 54:397-409.

HOLM, A., TEJLE, K., MAGNUSSON, K.E., DESCOTEAUX, A., & RASMUSSON, B.

Leishmania donovani promastigotes lipophosphoglycan causes periphagosomal

actin accumulation: correlation with impairment translocation of PKCa and

defective phagosome maturation. Cell Microbiol 2001 (3); 439-447.

HUTCHINSON, D.W. Metal chelators as potential antiviral agents. Antiviral Res 1985;

5, 193-205.

IWN, M.M., JACKSON, J.E. & SCHUSTER, B.G. Medicinal plants in the fight against

leishmaniasis. Parasitol Today 1994; 10: 65-68.

Costa, C.F.

94

KELLY, J.X., IGNATUSHCHENKO, M.V., BOUWER, H.G., PEYTON, D.H., HINRICHS,

D.J., WINTER, R.W., RISCOE, M. Antileishmanial drug development: exploitation of

parasite heme dependency. Mol Biochem Parasitol, 2003; 126: 43-49.

KHAWASS, S.M.E., KHALIL, M.A. & CHAABAN, I. Synthesis of some thiazoline and

thiazolidinone derivates of 1,4-benzoquinone as potential antimicrobial agents. IL

Farmaco 1989; 44(4) 415-421.

KNOCHKAERT, M., GREENGARD, P., MEIJER, L. Pharmacological inhibitors of

cyclin-dependent kinases. TRENDS Pharm Sci 2002; 23: 417-425.

KIMA, P.E., SOONG, L., CHICHARRO, C., RUDDLE, N.H. & McMAHON-PRATT, D.

Leishmania-infected macrophages sequester endogenously synthesized parasite

antigens from presentation to CD4+ T cells. Eur J Immunol 1997; 26:3163-3169.

KORNBERG A, RAO NN & AULT-RICHÉ D. Inorganic polyphosphate: a molecule of

many functions. Annu Rev Biochem. 1999; 68:89-125.

KRAKOFF, I.H. Clinical and pharmacologic effects of hydroxyurea. Antineoplastic

and Immunosupressive Agents pp 789-792. Part 2 (Sartorelli A.C. & Johns, D.E., eds.)

Springer-Verlag, New York.

KÜÇÜKGÜZEL, S.G., ORUÇ, E.E., ROLLAS, S., SAHIN, F. & ÖZBEK, A. Synthesis,

characterization and biological activity of novel 4-thiazolidinones, 1,3,4-

oxadializones and some related compounds. Eur J Med Chem 2002; 37:197-206.

LEE, N., BERTHOLET, S., DEBRABANT, A., MULLER, J., DUNCAN, R, & NAKHASI,

H.L. Programmed cell death in the unicellular protozoan parasite Leishmania. Cell

Death Differ 2002; 9: 53-64.

Costa, C.F.

95

LEIRIÃO, P., RODRIGUES, C.D., ALBUQUERQUE, S.S. & MOTA, M.M. Survival of

protozoan parasites in host cells. EMBO Rep 2004; 5(12): 1142-1147.

LIEW, F.Y., MILLOT, S., PARKINSON, C., PALMER, R.M. & MONCADA, S.

Macrophage killing of Leishmania parasite in vivo is mediated by nitric oxide from

L-arginine. J Immunol 1990; 144:4794-4797.

LIU, H.L., LI, Z. & ANTHONSEN, T. Synthesis and fungicidal activity of 2-imino-3-(4-

arylthiazol-2-yl)-thiazolidin-4-ones and their 5-aryllidene derivates. Molecules 2000;

5:1055-1061.

LIU, M.C., LIN, T.S. & SARTORELLI, A.C. Synthesis and antitumor activity evaluation

of amino derivates of pyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone. J Med Chem

1992; 35, 3672-3677.

LODGE, R. & DESCOTEAUX, A. (2005). Modulation of phagolisosome biogenesis by

the lipophosphoglycan of Leishmania. Clin Immunol 114, 256-265.

McCONVILLE, M.J., DE SOUZA, D., SAUNDERS, E., LIKIC, V.A. & NADERER, T.

Living in a phagolysosome; metabolism of Leishmania amastigotes. TRENDS

Parasitol 2007; 23(8): 368-375.

MEHTA, A. & SAHA, C. Apoptotic death in Leishmania donovani promastigotes in

response to respiratory chain inhibition: complex II inhibition results in increased

pentamidine cytotoxicity. J Biol Chem 2002; 279: 11798-11813.

MELLO, M.D. (1997). Interação Leishmania major com macrófagos: a participação

do Lipofosfoglicano (LPG). Monografia apresentada ao Centro de Biociências e

Biotecnologia. Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil.

Costa, C.F.

96

MELO, E.J.T. & BEIRAL, H.J.V. Effect of hydroxyurea on the intracellular

multiplication of Toxoplasma gondii, Leishmania amazonensis and Trypanosoma

cruzi. Braz J Med Biol Res 2003; 36, 65-69.

MELO, E.J.T., MAYERHOFFER, R. O. & DE SOUZA, W. Hydroxyurea inhibits

intracellular Toxoplasma gondii multiplication. FEMS Microbiol Lett 2000; 185, 79-82.

MICHELS PA, BRINGAUD F, HERMAN M, HANNAERT V. Metabolic functions of

glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 2006 Dec;1763(12):1463-77.

MOSSER DM, ROSENTHAL LA. Leishmania-macrophage interactions: multiple

receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Semin Cell Biol. 1993

Oct;4(5):315-22. Review.

MOORE, E.C., & HURLBERT, R.B. The inhibition of ribonucleoside diphosphate by

hidroxyurea, guanazole and pyrazoloimidazole (IMPY). Inhibitors of Ribonucleoside

Diphosphate Reductase Activity pp165-201 (Cory, D.G. & Cory, eds.) Pergamon Press,

Oxford.

MOORE, E.C., ZEDECK, M.S., AGRAWAL., K.C. & SARTORELLI, A.C. (1970).

Inhibition of ribonucleoside diphosphate reductase by 1-Formylisoquinoline

thiosemicarbazones and related compounds. Biochemistry vol.9, n°23.

MURRAY, H.W. & NATHAN, C.F. Macrophage microbicidal mechanisms in vivo:

reactive nitrogen versus oxygen intermediates in the killing of intracellular visceral

Leishmania donovani. J Exp Med 1999; 189:741-746.

MURRAY, H.W. Cell-mediated immune response in experimental visceral

leishmaniasis II. Oxygen-dependent killing of intracellular Leishmania donovani

amastigotes. J Immunol, 1982; 129:351-357.

Costa, C.F.

97

MUSKUS CE, MARÍN VILLA M. Metacyclogenesis: a basic process in the biology of

Leishmania. Biomedica. 2002 Jun;22(2):167-77. Review. Spanish.

NAULA, C., PARSONS, M. & MOTTRAN, J.C. Protein kinases as drug targets in

trypanosomes and Leishmania. Biochim Biofis Acta, 2005; 1754: 151-159.

NYALWIDHE J, MAIER UG, LINGELBACH K. Intracellular parasitism: cell biological

adaptations of parasitic protozoa to a life inside cells. Zoology (Jena).

2003;106(4):341-8.

OLIVIER, M., GREGORY, D.J. & FORGET, G. Subversion mechanisms by which

Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of

view. Clin Microbiol Rev. 2005 Apr;18(2):293-305. Review.

OPPERDOES, F. & COOMBS, G.H. Metabolism of Leishmania; proven and

predicted. TRENDS Parasitol 2007; 23: 149-158.

OUELLETTE, M., DRUMMELSMITH, J. & PAPADOPOULOU, B. Leishmaniasis: drugs

in the clinic, resistance and new developments. Drug Resist Update 2004; 7: 257-

266.

PESSANHA, C.S. (2006). Efeito in vitro de tiosemicarbazonas e seus derivados

tiazolidinônicos sobre o desenvolvimento intracelular do Toxoplasma gondii.

Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia. Campos dos

Goytacazes, RJ, Brasil.

PROUDFOOT, L., NICOLAEV, A.V., FENG, G.J., WEI, W.Q., FERGUSON, M.A.,

BRIMACOMBE, J.S. & LIEW, F.Y. Regulation of the expression of nitric oxide

synthase and leishmanicidal activity by glycoconjugates of Leishmania

lipophosphoglycan in murine macrophages. Proc Natl Acad Sci USA1996; 93:10984-

10989.

Costa, C.F.

98

PROUDFOOT, L., O’DONNELL, C.A. & LIEW, F.Y. Glycoinositolphospholipids of

Leishmania major inhibit nitric oxide synthesis and reduce leishmanicidal activity

in murine macrophages. Eur J Immunol 1995; 25: 745-750.

RAO NN & KORNBERG A. Inorganic polyphosphate regulates responses of

Escherichia coli to nutritional stringencies, environmental stresses and survival in

the stationary phase. Prog Mol Subcell Biol. 1999;23:183-95. Review.

REINER, N.E., NG, W. & McMASTER, W.R. Parasite-acessory cell-interactions in

murine leishmaniasis. 2. Leishmania donovani suppresses macrophage

expression of class I and class II major histocompatibility complex gene products.

J Immunol 1987; 138:1926-1932.

RICHARDSON, D.R. Therapeutic potential of iron chelators. Exp Opin Invest Drugs,

1999; 8, 2141-2158.

ROSENTHAL, E. & MARTY, P. Recent understanding in the treatment of visceral

leishmaniasis. J Postgrad Med 2003; 49: 61-68.

RUBIN, H., SALEM, J.S., LI, L.S., YANG, F.D., MAMA, S., WANG, Z.M., FISHER, A.,

HAMANN, C.S. & COOPERMAN, B.S. Cloning, sequence determination and

regulation of the ribonucleotide reductase subunits from Plasmodium falciparum:

a target for anti-malarial therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 1993; 90, 9280-9284.

RUIZ FA, RODRIGUES CO, DOCAMPO R. Rapid changes in polyphosphate content

within acidocalcisomes in response to cell growth, differentiation, and

environmental stress in Trypanosoma cruzi. J Biol Chem. 2001 Jul 13;276(28):26114-

21.

SCHAIBLE, U.E. & KAUFMANN, S.H. A nutritive view on the host-pathogen

interplay. TRENDS Microbiol 2005; 13(8): 373-380.

Costa, C.F.

99

SEN, N., DAS, B.B., BANGULY, A., MUKHERJEE, T., TRIPATHI, G.,

BANDYOPADHYAY, S., RAKSHIT, S., SEN, T., & MAJIMDER, H.K. Camptothecin

induced mitochondrial dysfunction leading to programmed cell death in unicellular

hemoflagellate Leishmania donovani. Cell Death Differentiation 2004; 11: 924-936.

SERENO, D., GUILVARD, E., MAQUAIRE, S., CAVALEYRA, M., HOLZMULLER, P.,

OUAISSI, A. & LEMESRE, J.L. Experimental studies on the evaluation of antimony-

resistant phenotype during the in vitro life of Leishmania infantum: implications for

the spread of chemoresistance in endemic areas. Acta Tropica 2001; 80: 195-205.

SERNEE, N.F., RALTON, J.E., DINEV, Z., KHAIRALLAH, G.N., O’HAIR, R.A.,

WILLIAMS, S.J. & McCONVILLE, M.J. Leishmania ββββ-1,2-mannan is assembled on a

mannose-cyclic phosphate primer. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:9458-9463.

SHAKED-MISHAN, P., ULRICH, N., EPHROS, M. & ZILBERSTEIN, D. Novel

intracellular SbV reducing activity correlates with antimony susceptibility in

Leishmania donovani. J Biol Chem 2001; 276: 3971-3976.

SHAPIRO TA, ENGLUND PT. The structure and replication of kinetoplast DNA. Annu

Rev Microbiol. 1995;49:117-43.

SIMPSON, L. Kinetoplast DNA in tripanosomid flagellates. Int Rev Cytol 1986; 99:

119-207.

SORENSEN, A.L., HEY, A.S. & KHARAZMI, A. Leishmania major surface gp63

interferes with the function of human monocytes and neutrophils in vitro. APMIS

1994; 102:14395-14399.

SUDHANDIRAN, G., SHAHA, C. Antimonial-induced increase in intracellular

Ca2+through non-selectivecation channels in the host and the parasite is

Costa, C.F.

100

responsible for apoptosis of intracellular Leishmania donovani amastigotes. J Biol

Chem 2003; 278: 25120-25132.

SUNDAR, S. Drug resistance in Indian visceral leishmaniasis. Trop Med Int Health

2002; 6: 849, 854.

TAUBER, A.I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews 2003; 4,

897-901.

TENÓRIO, R.P., CARVALHO, C.S., PESSANHA, C.S., LIMA, J.G., FARIA, A.R., ALVES,

A.J., MELO, E.J.T. & GÓES, A.J.S. Synthesis of thiosemicarbazone and 4-

thiazolidinone derivates and their in vitro anti-Toxoplasma gondii activity. Bioorg

Med Chem Letters 2005; 15, 2575-2578.

THELANDER, L. & REICHARD, P. Reduction of ribonucleotides. Annu Rev Biochem

1979; 48: 133-158.

THELANDER, M., GRASLUND, A. & THELANDER, L. Subunit M2 of mammalian

ribonucleotide reductase. J Biol Chem, 1985; 260, 2737-2741.

UEDA-NAKAMURA, T., ATTIAS, M. & DE SOUZA, W. Comparative analysis of

megasomes in members of the Leishmania mexicana complex. Res Microbiol. 2007

Jun;158(5):456-62. Epub 2007 Apr 7.

UEDA-NAKAMURA, T., DACONCEIÇÃO ROCHA SAMPAIO, M., CUNHA-E-SILVA, N.L.,

TRAUB-CSEKO, Y.M. & DE SOUZA, W. Expression and processing of megasome

cysteine proteinases during Leishmania amazonensis differentiation. Parasitol Res.

2002 Apr;88(4):332-337.

URBINA, J.A. Mechanisms of action of lysophospholipid analogues against

trypanosomatid parasites. Trans Royal Soc Med Hyg 2006; 100: 9-16.

Costa, C.F.

101

VANNIER-SANTOS, M.A., MARTINY, A. & DE SOUZA, W. Cell biology of Leishmania

spp.: invading and evading. Current Pharmaceutical Design 2002; 8, 297-318.

WALCOURT, A., LOYEVSKY, M., LOVEJOY, D.B., GORDEUK, V.R. & RICHARDSON,

D.R. Novel aroylhydrazone and thiosemicarbazone with anti-malarial activity

against chloroquine-resistant and –sensitive parasites. Int J Biochem Cell Biol 2004;

36, 401-407.

WANDERLEY, J.L.M., BENJAMIN, A., REAL, F., BONOMO, A., MOREIRA, M.E.C. &

BARCINSKI, M.A. Apoptotic mimicry: an altruistic behavior in host/Leishmania

interplay. Braz J Med Biol Res 2005; 38:807-812.

WANG, J.C. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nature

Review. Mol and Cell Biol 2002; 3: 430-440.

WEBER, G. Biochemical strategy of cancer cells and the design of chemotherapy.

Cancer Res. 1983; 43: 3466-3492.

WEBSTER, P & RUSSEL, DG. The flagellar pocket of trypanosomatids. Parasitol

Today. 1993; Jun;9(6):201-6.

WYLLIE, S., CUNNINGHAM, M.L., FAIRLAMB, A.H. Dual action of antimonial drugs

on thiol redox metabolism in the human pathogen Leishmania donovani. J Biol

Chem 2004; 279 (38): 39925-39932.

ZHANG K, HSU FF, SCOTT DA, DOCAMPO R, TURK J & BEVERLEY SM. Leishmania

salvage and remodelling of host sphingolipids in amastigote survival and

acidocalcisome biogenesis. Mol Microbiol. 2005 Mar;55(5):1566-78.