Terrestris Tribulus L.

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[p1] Université Henri Poincaré Nancy 1 IUT Nancy-Brabois Département Génie Chimique Génie des Procédés Arcadia Herba Ldt. Université de Technologie Chimique et de Métallurgie Sofia, Bulgarie GOUVENEL Jean-Philippe 2 ème année, Groupe 21 Stage de 13 semaines, Du 9 avril au 6 juillet 2007 Rapport de stage industriel en entreprise Techniques et méthodes d’extraction des composés actifs de la plante T T e e r r r r e e s s t t r r i i s s T T r r i i b b u u l l u u s s L L . . Responsables du stage : Mme SEIKOVA Ilona, UTCM Sofia M. BISER Hadjiev, Arcadia Herba M. APPERT-COLLIN Jean-Christophe, IUT Nancy-Brabois

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Université Henri Poincaré Nancy 1 IUT Nancy-Brabois Département Génie Chimique Génie des Procédés

Arcadia Herba Ldt. Université de Technologie

Chimique et de Métallurgie Sofia, Bulgarie

GOUVENEL Jean-Philippe 2ème année, Groupe 21

Stage de 13 semaines, Du 9 avril au 6 juillet 2007

RRaappppoorrtt ddee ssttaaggee iinndduussttrriieell eenn eennttrreepprriissee

TTeecchhnniiqquueess eett mméétthhooddeess dd’’eexxttrraaccttiioonn ddeess ccoommppoossééss aaccttiiffss ddee llaa ppllaannttee TTeerrrreessttrriiss TTrriibbuulluuss LL..

Responsables du stage : Mme SEIKOVA Ilona, UTCM Sofia M. BISER Hadjiev, Arcadia Herba M. APPERT-COLLIN Jean-Christophe, IUT Nancy-Brabois

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Sommaire

Sommaire ................................................................................................................ 2

Résumé ................................................................................................................... 5

Abstract ................................................................................................................... 5

Резюме ................................................................................................................... 6

Mots Clés ................................................................................................................. 6

Remerciements ........................................................................................................ 7

Nomenclature .......................................................................................................... 8

I. Introduction ....................................................................................................... 9

II. Présentation de l’entreprise ................................................................................ 11

1) Historique ..................................................................................................... 11

2) Organisation de l’entreprise ............................................................................ 13

a) Broyage et tamisage .............................................................................. 13

b) Thé simple et composé .......................................................................... 13

c) Emballage des épices ............................................................................. 14

d) Extraction des matières premières avec de l’eau ou de l’alcool ................... 14

e) Séchage des produits extraits ................................................................. 14

f) Fabrication des comprimés, des capsules, et des blisters............................ 14

g) Fabrication de levure .............................................................................. 14

III. Présentation de l’objectif du stage ...................................................................... 15

IV. Présentation de la plante .................................................................................... 16

1) Tribulus Terrestris L. ...................................................................................... 16

2) Les saponines ............................................................................................... 17

V. Description du procédé : techniques et appareillages utilisés ................................. 21

VI. Résultats et exploitations ................................................................................... 30

1) Analyse granulométrique ................................................................................ 30

2) Extractions infinies ........................................................................................ 33

a) Première extraction ................................................................................ 34

b) Deuxième extraction .............................................................................. 35

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c) Troisième extraction ............................................................................... 35

d) Quatrième extraction ............................................................................. 35

e) Interprétation ........................................................................................ 35

3) Quantité maximale extractible ........................................................................ 36

4) Procédure de mise en évidence des saponines ................................................. 36

5) Etude de l’influence du changement de la concentration du solvant ................... 39

a) Extraction avec 20% d’éthanol à 25°C (température ambiante) ............................. 40

b) Extraction avec 40% d’éthanol ............................................................................ 41

c) Extraction avec 60% d’éthanol ............................................................................ 42

d) Extraction avec 70% d’éthanol ............................................................................ 43

6) Etude de l’influence du changement de température de l’extraction ....................... 44

a) Extraction avec 20% d’éthanol à 45°C ................................................................. 44

b) Extraction avec 40% d’éthanol à 45°C ................................................................. 45

c) Extraction avec 60% d’éthanol à 45°C ................................................................. 45

d) Extraction avec 70% d’éthanol à 45°C ................................................................. 46

VII. Conclusion et perspectives ................................................................................. 48

Lexique .................................................................................................................. 49

Bibliographie ........................................................................................................... 52

Table des figures et tableaux .................................................................................... 53

Table des annexes ................................................................................................... 53

Annexe I : Carte de l’Union Européenne (Europe des 27, au 1er janvier . 2007), en rouge : la Bulgarie 54

Annexe II : Tableau des résultats de l’analyse granulométrique ................................... 54

Annexe II : Pourcentage massique des 4 fractions utiles ............................................. 55

Annexe IV : Schéma procédé de l’installation de l’extraction ........................................ 56

Annexe VI : Schéma procédé de l’extracteur (cuve d’extraction) .................................. 57

Annexe VII : Schéma de procédé de l’évaporateur ..................................................... 58

Annexe XI : Photographies de la fabrication de l’installation en Chine .......................... 59

Annexe XII : Photographie du site d’exploitation Arcadia Herba Ldt. ............................ 60

Annexe VII : Fiche toxicologique de l’éthanol ............................................................. 64

Annexe XII : Fiche toxicologique du chloroforme ........................................................ 64

Annexe XVII : Fiche toxicologique de l’acétone .......................................................... 64

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Annexe XVI : Fiche toxicologique de l’éthyle acétate ................................................... 64

Annexe VII : Fiche toxicologique du méthanol ........................................................... 64

Les mots signalés par un astérisque (*) sont définis dans le lexique à la fin du rapport, page XX. Les photographies et images sont référencées dans la bibliographie de la manière suivante [pX], à partir de la page XX.

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Résumé Ce rapport décrit la période de stage en entreprise, réalisé en Bulgarie pour le Diplôme Universitaire de Technologie Génie Chimique Génie des Procédés de l’Institut Universitaire de Technologie de Nancy-Brabois. Le stage a été effectué dans une entreprise bulgare nommée Arcadia Herba et au sein de l’Université de Technologie Chimique et de Métallurgie de Sofia. Arcadia Herba est une société spécialisée dans le traitement et le conditionnement de plantes à des fins pharmaceutiques et alimentaires. L’objectif du stage consiste à améliorer les compositions du solvant et les méthodes d’extraction du composé actif saponine stéroïde de la plante médicinale Tribulus Terrestris L. Les saponines, issues d’une procédure d’isolation, rentrent directement dans la composition des additifs bioactifs du médicament, commercialisé par la société Sopharma® sous le nom de Tribestan©. L’optimisation des paramètres opératoires et le changement d’échelle, ont permis de prendre en compte les différentes conditions posées en laboratoire et à reproduire en production. Des extractions successives ont été réalisées en laboratoire pour étudier le comportement de la plante et connaître le nombre d’extractions nécessaires pour atteindre une concentration satisfaisante dans l’extrait recueilli. L’analyse des saponines a permis de mettre en place une procédure de retrait à partir de l’extrait et une étape de purification. Abstract

This report describes the period of training courses in a Bulgarian company which was realized by the University Diploma of Technology Chemical Engineering Genius of the Processes of the University Institute of Technology of Nancy-Brabois. Training courses took place in the Bulgarian company Arcadia Herba and also in the University of Chemical Technology and Metallurgy of Sofia. Arcadia Herba is a company specialized in the treatment and the conditioning of plants being used for pharmaceuticals and foods. The objectives of the training courses contains the improving of compositions of solvent and the methods of extraction the active compound saponin steroid from the medicinal plant Tribulus Terrestris L. Saponin results from a procedure of insulation return directly in the composition of the additive bioactive of the drug marketed by the Sopharma® Company under the name of Tribestan©. The optimization of the operational parameters and the scaling made it possible to take into account the various conditions posed in laboratory and to reproduce in production. Successive extractions were carried out in laboratory to study the behaviour of the plant and to know the number of extractions necessary to reach a satisfactory concentration in the extract collected. The analysis of saponins made it possible to set up a procedure of withdrawal starting from the extract and a stage of purification.

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Резюме Този абстракт описва периода на стажа във фирма, осъществен в България за получаване на Университетска Диплома за Особености на техническата химия, особености на процесите в Университетския институт по Технологии в Нанси-Брабуа. Стажът е осъществен в българска фирма, носеща името “Аркадия Херба” и така също в Университета за химически технологии и металургия в София. “Аркадия Херба” е специализирана фирма за обработване и отглеждане на растения, използвани във фармацевтиката и храненето. Целта на стажа е подобряване на начина на разтваряне и методите за екстракция на активната съставка на стероида сапонин от лековитото растение Tribulus Terrestris L. Сапонина, може да се изолира и директно в добавъчни биоактивни смеси към медикаменти, разпространявани от Sopharma® под името Tribestan©. Оптимизирането на оперативните параметри и измененията в скалата позволява да се оценят различните условия, които притежават лабораториите и серийното производство. Непрекъснати екстракции са реализирани в лабораториите, за да бъде изучено поведението на растенията и да се узнае броя на екстракции, необходими да се постигне достатъчна концентрация в събрания екстракт. Изследванията на сапонина позволи да се разработи процедура по извличане на екстракт и етап на пречистване. Mots Clés

Arcadia Herba - Bulgarie - Extraction solide/liquide - Granulométrie - Infrarouge - Saponine - Sofia - Sopharma® - Terrestris Tribulus L. - Tribestan© - Université de Technologie Chimique et de Métallurgie (UTCM)

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Remerciements Je tiens à remercier mes tuteurs de stage et toutes les personnes qui m’ont permis de réaliser et concrétiser cette expérience en entreprise. Je remercie tout d’abord M. APPERT-COLLIN, Maître de Conférences à l’IUT Nancy-Brabois, pour m’avoir donné l’opportunité de réaliser le stage de fin d’études en Bulgarie et de m’avoir dirigé dans les démarches tout au long du stage ; M. GUILET Richard, Professeur à l’IUT Paul Sabatier de Toulouse, en partenariat avec l’IUT de Nancy-Brabois. Je remercie toute l’équipe enseignante de l’UTCM de Sofia pour leurs démarches et leur aide. En particulier Mme SEIKOVA Ilona, responsable de la filière francophone et professeur agrée à l’Université de Technologie Chimique et de Métallurgie de Sofia, qui s’est occupée des relations entre l’entreprise et l’UTCM, ainsi que du stage de manière générale ; Mme GEORGIEVA Margarita, secrétaire de la filière francophone ; Mme KARSHEVA Maria, Mme PANKOVA Milka et M. DONTESH Dimitar, professeurs à l’UTCM ; Mme SAVOVA Mariana, Mme GEORGIEVA Sylvia, doctorantes à l’université. Je remercie également le personnel de l’entreprise Arcadia Herba, notamment les techniciens et ingénieurs de l’entreprise, en particulier Mme TODOROVA Vaska et M. ZHILKOV Nikoley pour leur coopération. Je tiens à remercier la scolarité de l’IUT Nancy-Brabois, Mme LIGNON Martine des Relations Internationales UHP - Nancy 1 et Mme AGAZAR Florence de l’AUEF Lorraine pour leur suivi et démarches concernant les bourses européennes et l’aide à la mobilité. Je souhaite remercier les étudiants de l’Université de Sofia, de l’IFAG et les stagiaires de l’Université Agroalimentaire de Chişinău (Moldavie), de l’Université Technique de Berlin (Allemagne), mais aussi de l’IUT Paul Sabatier de Toulouse et de Castres pour leur accueil. Entre autres, Cécile, Valène, Sokeina, Poli, Catalina, André, Guillaume, Jérémy, Andreas, Mittko, Skander et Atef, ainsi que les services de l’AUF, de l’Institut Français et du CAI à Sofia.

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Nomenclature Symbole Intitulé Unité ag Aire spécifique du grain m-1 Z Altitude d’un point m dg Diamètre du grain m Re Nombre de Reynolds - P Pression absolue Pa Patm Pression atmosphérique Pa P’ Pression relative Pa Pt Pression totale Pa T Température ° Celsius t Temps - V Volume m3 Abréviations : AUEF Lorraine : Association Université Entreprise pour la Formation en Lorraine AUF : Agence Universitaire de la Francophonie. CAI : Centre d’Accès à l’Information. DUT : Diplôme Universitaire de Technologie. GCGP : Génie Chimique Génie des Procédés. IFAG : Institut de Formation aux Affaires et à la Gestion. IUT : Institut Universitaire de Technologie. Ldt : Entreprise « Limited » correspond à une SARL. SARL : Société à responsabilité limitée. UHP : Université Henri Poincaré - Nancy 1 UTCM : Université de Technologie Chimique et de Métallurgie. Lettres grecques : τ Constante de temps s φ Flux thermique J/s ou W ρ Masse volumique kg/m3 ε Porosité - η Viscosité dynamique du fluide Pa.s Ω Surface m2

Unités usuelles : h Heure kg Kilogramme m Mètre s Seconde g Gramme Pa Pascal

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I. Introduction

Le stage du DUT Génie Chimique Génie des Procédés, qui a lieu au cours du dernier semestre, permet de mettre en place au sein d’une entreprise, les différentes techniques et procédés étudiés pendant les deux ans de formation. Le stage en entreprise a pour but de montrer à l’étudiant les différentes façons de travail en industrie, mais aussi de s’introduire plus facilement dans le milieu professionnel et construire un nouveau projet. Un stage en Bulgarie est proposé depuis quelques années aux étudiants du département GCGP au bord de la mer Noire dans la région de Varna. Cette année, le stage s’est déroulé à Sofia dans une société bulgare : Arcadia Herba.

Figure 1 : Carte de la Bulgarie

La Bulgarie, officiellement République de Bulgarie (en bulgare : Република България et en translittération romane : Republika Bălgariya), est un pays de l’Europe balkanique, situé en bordure de la mer Noire, au nord de la Grèce et de la Turquie et au sud de la Roumanie. À l’ouest, elle est bordée par la Serbie et la République de Macédoine.

Le 1er janvier 2007, la Bulgarie a adhéré à l’Union Européenne des 27, en même temps que la Roumanie (carte en annexe I). Dès 2009, les Bulgares devraient adopter la monnaie européenne.

Sofia (en bulgare : София) est la capitale de la Bulgarie, au pied du mont Vitosha, non loin du fleuve Iskar. Elle compte 1,14 millions d'habitants, les Sofiotes, soit 14 % de la population du pays. Sofia est à la fois le centre politique et culturel du pays, le principal centre d'échanges ainsi que le premier centre industriel du pays, avec des activités de sidérurgie, de métallurgie, de construction mécanique et de chimie. C'est également un centre universitaire depuis 1888. Jeune capitale, elle n’a reçu ce titre qu’en 1879 et porte l’empreinte d’une histoire au moins bimillénaire. Des vestiges romains et

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médiévaux y voisinent joyeusement avec des mosquées et des bâtiments de style austro-hongrois côtoient des constructions monumentales de l’époque stalinienne. Au cours de ce stage, plusieurs étapes ont été nécessaires avant de mettre en place les manipulations et les analyses permettant l’étude de l’extraction de la plante médicinale Terrestris Tribulus L. Des études bibliographiques et descriptions du procédé m’ont permis de comprendre le fonctionnement de l’installation. Une procédure d’isolation des saponines a été envisagée et testée à partir de diverses études. Une fois l’isolation et la purification des saponines adaptées, je me suis consacré à l’extraction à proprement dite de la plante, avec l’étude de la modification des compositions du solvant. Les proportions décrites en laboratoire ont été calculées afin de pouvoir établir un facteur d’échelle avec les proportions de production. En premier lieu, nous commencerons par présenter l’entreprise afin de situer ses secteurs d’activités. Puis, nous poursuivrons en fixant précisément les objectifs du stage et nous poserons les enjeux avec la problématique à résoudre. Dans un second temps, vous pourrez prendre connaissance des caractéristiques de la plante et de ses fonctions pharmaceutiques pour la conception du médicament, le Tribestan©. C’est en effet, grâce aux saponines présentes dans la plante, que l’on peut isoler et constituer le composé actif du médicament. Nous entamerons ensuite la partie procédée avec la description du process et des appareillages, sur lesquels j’ai pu travailler aussi bien dans l’entreprise qu’au laboratoire de l’université. Nous débuterons alors l’exploitation des analyses avec les résultats obtenus au travers des manipulations que j’ai pu réaliser. Pour conclure, nous aborderons les perspectives et la concrétisation des données obtenues pour l’entreprise. Les enjeux et apports personnels seront aussi mis en avant dans la conclusion de ce rapport de stage mais débutons tout d’abord avec l’entreprise et la présentation de son activité.

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II. Présentation de l’entreprise Arcadia Herba Ldt. est une société de type SARL (Limited) d’une vingtaine de personnes, qui possède son site de production à une trentaine de kilomètres au Sud-Est de Sofia à Novi Han. Il s’agit d’une société au procédé traditionnel, qui reçoit des épices et des plantes séchées de Bulgarie mais aussi du monde entier. Une partie des plantes est utilisée afin d’en extraire les composés actifs. Tandis qu’une seconde partie de la production (thé aux herbes médicinales et épices destinées à la cuisine) traite directement le conditionnement pour l’exportation. Les plantes comme le Terrestris Tribulus, que j’ai pu étudier, sont utilisées pour l’extraction des composés actifs saponines. Le site de production possède par ailleurs une section qui produit des levures pour la fabrication de yaourts, à l’aide d’un fermenteur biologique (Annexe XX page XX). Des procédés de séchage à froid par lyophilisation sont aussi utilisés pour le conditionnement des produits de type organique. Des installations de conditionnement et d’impression des dates de consommation, suite à l’emballage des produits, permettent leur expédition pour la commercialisation.

Figure 2 : Logo de l’entreprise Arcadia Herba Ldt.

1) Historique

L’entreprise Arcadia Herba Ldt. a été crée au début de l’année 1997, en tant que compagnie Germano-Bulgare. A cette époque, elle traite et emballe plus de 40 genres de produits différents, soit des herbes simples, soit des mélanges d'herbes (6 genres). Tout ceci pour le réseau de distribution pharmaceutique bulgare, ce qui représente environ 15% du marché pharmaceutique de matière première en plantes du pays. La compagnie travaille également avec des associés européens, principalement dans le domaine du traitement primaire des herbes médicinales et aromatiques. La spécialité de l’entreprise est de rassembler, transformer, empaqueter et finalement exporter des herbes de Bulgarie. Les herbes sont récoltées dans des montagnes écologiquement propres de Rhodope, les célèbres montagnes d’Orphée dans la mythologie grecque, aux environs des villes de Stara Planini, Rila et Strandja, au Sud-Ouest de la Bulgarie.

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La compagnie utilisait des équipements allemands jusqu'à l’année dernière ; « Winicker et Lieber » pour le découpage (avec une production de 800 kg par jour), et « Fux » pour le tamisage. Des machines italiennes, « Opem » pour l’emballage, permettent l'emballage de petite taille (200 g) et des vaporisateurs étaient aussi en fonctionnement. Depuis 2006, sa production a été principalement destinée à un marché de sous-traitance, mais aujourd'hui, la compagnie se développe en produisant de plus en plus de produit sous sa propre marque. De plus, de nouveaux équipements ont été achetés à une entreprise chinoise, Sunking Pharmaceutical Machinery Compagny Ltd. En raison de toutes les conditions d’hygiène et de sécurité à respecter dans une entreprise agroalimentaire, la compagnie prépare deux laboratoires, l’un pour des analyses physico-chimiques (analytique) et l’autre pour des analyses microbiologiques. Ils seront opérationnels pour commencer les différentes analyses pour la fin de cette année. Le procédé et le conditionnement respecte les normes de la Communauté Européenne (CE) et la norme HACCP*.

Figure 3 : Site de production Arcadia Herba Ldt.

Arcadia Herba peut fournir des solutions de procédés pour différentes plantes destinées aussi bien à une utilisation pharmaceutique qu’alimentaire. Les plantes peuvent être conditionnées dans des sacs de papier à 3 couches de 6 à 12 kg selon le type de plantes séchées.

La transformation des plantes a été crée il y a un peu plus d’un an dans la société pour accroître la production. Arcadia Herba dispose d’un inventaire de plus de 200 plantes collectées par les producteurs en Bulgarie et ces quantités sont disponibles pour les plantes à des fins médicales.

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2) Organisation de l’entreprise : Arcadia Herba Ldt. s’organise autour de plusieurs unités, principalement dans la région de Sofia, mais aussi au cœur de la chaîne de montagne des Balkans, dans la base de production écologique, pour la récolte des plantes. L’organigramme suivant en figure 4 présente les différentes unités qui composent l’entreprise.

Figure 4 : Organisation de l’entreprise Le stage s’est déroulé sur le site de production dans le village de Novi Han qui fait parti du district de Sofia. L’entreprise effectue aussi bien des étapes de traitement, que de simple étape d’emballage des matières premières d’origine végétales dont je vais décrire les différentes applications.

a) Broyage et tamisage Les plantes sont préparées dans la section découpage du site de production. Les herbes et les épices sont coupées et/ou rectifiées aux différentes tailles selon les consignes du client. Il s’agit d’une première étape avant la production des sachets de thé aux herbes et d’épices. Cette étape est par ailleurs nécessaire à l’extraction pour une meilleure diffusion des plantes dans le solvant.

b) Thé simple et composé Le département d’emballage des sachets de thé est équipé de machine qui permettent de produire des sachets avec ou sans fil (fil utilisé pour la manipulation du sachet et pour l’agiter dans la tasse). Ce service produit différents genres de thé simple ou composé, médicinaux ou apaisant.

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c) Emballage des épices L'emballage des épices est effectué dans un secteur séparé. On y trouve des machines pour la production de petits et grands emballages, une machine de micro ionisation* avec un système refroidissement (pour couper les particules vers le haut) et qui assure la conservation des arômes et des huiles volatiles des épices. L'équipement de ce département permet d’effectuer différents mélanges, des produits combinés et des additifs.

d) Extraction des matières premières avec de l’eau ou de l’alcool Le traitement de la matière première végétale se fait en plusieurs étapes dans des halls spéciaux. Il commence dans le département d'extraction et d’évaporation à l’eau ou à un mélange eau/alcool. L'installation d’extraction a une capacité de 450 litres et produit jusqu'à 200 litres d’extrait, selon la concentration de la solution. L’extrait obtenu est ensuite conduit dans la section séchage afin d’obtenir une poudre nécessaire à la conservation.

e) Séchage des produits extraits L'extrait total (liquide/solide) obtenu à partir de l’extraction puis de l’évaporation est séché dans l’atomiseur, qui a un débit d’environ 30 litres par heure. On obtient en sorti un produit sous forme de poudre contenant environ 4 % d’eau. Ce département n’est pas encore opérationnel mais des tests sont actuellement réalisés pour une future mise en fonctionnement.

f) Fabrication des comprimés, des capsules, et des blisters Les extraits secs produits sont préparés dans le département d’emballage des additifs alimentaires. Il est situé dans un hall propre spécial (zone blanche, norme HACCP*). Le département est équipé d’un appareil à pression pour la fabrication de comprimé, d'une machine à concevoir des blisters*, et d'un automate fabricant les capsules. La productivité du département est d’environ de 45 à 50 000 produits par heure.

g) Fabrication de levure Il existe également une chaîne de production de levure pour yaourt. Ce département n’est pas en lien avec le traitement des plantes et constitue une activité annexe en attendant que tout le procédé de séchage puisse devenir opérationnel. Un laboratoire est destiné à la production de levure. Il comprend un bio-réacteur pour effectuer la fermentation des levures et un lyophilisateur* les sécher. Cette dernière étape permet de conserver les levures avant de les emballer sous vide pour leur commercialisation.

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III. Présentation de l’objectif du stage Le stage pose la problématique de résoudre un problème technologique concernant les solvants et méthodes alternatifs pour l’extraction à partir de la plante médicinale Tribulus Terrestris L. Il s’agit de l’extraction des composants actifs dénommés saponine stéroïde du type Furostanol, à partir desquelles l’usine Sopharma® commercialise l’additif bioactif Tribestan©. Dans le procédé originaire, l’extraction fonctionne avec des alcools, actuellement on travaille sur la possibilité de changer le solvant. Le travail va comprendre l’optimisation des paramètres opératoires et le changement d’échelle lors de passage d’un extracteur périodique à l’échelle laboratoire à l’échelle de production.

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IV. Présentation de la plante

1) Tribulus Terrestris L. Le Tribule Terrestre ou Tribulus terrestris L., également appelé Croix-de-Malte, est une plante appartenant à la famille des zygophyllacées, dont elle est l'un des rares représentants en Europe. C'est la principale espèce recensée du genre Tribulus, auquel appartient aussi Tribulus cistoides L., espèce antillaise. Indigène en Méditerranée, le Tribule Terrestre a longtemps été considéré comme une mauvaise herbe. Depuis les années 1980, on attribue à ses fruits, à tort ou à raison, un effet favorable sur les performances sportives et sur la libido. Si bien que l'extrait de Tribule est aujourd'hui consommé aussi bien par les athlètes désireux d'améliorer leurs résultats que par les amoureux en quête de prouesses.

Figure 5 : Tribulus Terrestris L. Le mot Tribulus désigne en latin une chausse-trape, piège à plusieurs pointes. Il évoque l'aspect des fruits aux pointes peu agréables pour les pieds. Le qualificatif Terrestris s'applique à des plantes poussant sur le sol, en particulier à des plantes rampantes. C'est également le fruit qui est à l'origine du nom populaire « croix-de-Malte » : vu de dessous, avec ses épines, il ressemble très nettement à une croix de Malte qui aurait cinq branches. Les bulgares appellent ce fruit plus communément, dents de grand-mère.

Figure 6 : Bourgeon du Tribulus Terrestris L. Il s’agit d’une plante annuelle très velue, à poils plus ou moins argentés. Tige rampante, assez peu ramifiée, pouvant atteindre 50 cm. Nombreuses feuilles paripennées, le plus souvent à six paires de folioles ovales à marge entourée de longs poils blancs (le nombre

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de paires de folioles varie de cinq à huit). Les fleurs sont jaunes et de petite taille (< 1 cm), pédonculées et solitaires à l'aisselle des feuilles, latérales et alternes le long de la tige. Le calice est constitué de cinq sépales étroits et la corolle de cinq pétales arrondis. Dix étamines à filets et anthères jaunes, ovaire supère. Les fruits sont étoilés à cinq carpelles verruqueux portant chacun deux longues épines et deux plus petites. Celles-ci permettent à l'espèce de se propager à l'aide d'animaux dans les pattes desquels ces épines peuvent se planter, et qui peuvent ainsi malgré eux transporter la graine sur de longues distances. Par ailleurs, ce fruit flottant se déplace souvent sur de courtes distances lors de forts orages, car la plante pousse volontiers sur des terrains compacts à faible perméabilité. Caractéristiques : Type d'inflorescence : fleur solitaire latérale Répartition des sexes : hermaphrodite Type de pollinisation : entomogame Période de floraison : avril à septembre Graine : Type de fruit: capsule Mode de dissémination: épizoochore Habitat et répartition : Habitat type: friches annuelles, nitrophiles, thermophiles Aire de répartition : cosmopolite (thermo)

Figure 7 : Bourgeon du Tribulus Terrestris ou "dents de grand-mère"

Phénomène de mode ou réalité médicale, l'extrait du fruit de Tribule est paré de nombreuses vertus. Il aurait permis dans les années 1980 aux haltérophiles bulgares d'améliorer leurs performances sans avoir recours à des produits dopants. Dix ans plus tard, il devient un remède « miracle » pour améliorer la sexualité, qu'elle soit masculine ou féminine. Il serait également efficace dans le traitement des maladies coronariennes.

2) Les saponines Les saponines sont des glycosides des stéroïdes, des alcaloïdes stéroïdes (stéroïdes avec une fonction d'azote) ou des triterpènes trouvés aux usines, particulièrement dans les peaux d'usine où elles forment un enduit protecteur cireux. Quelques auteurs distinguent une troisième classe de saponine, les saponines d'alcaloïde. Ils se dissolvent dans l'eau

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pour former une mousse savonneuse stable ; ceci est pensé pour être dû à leur nature amphiphile. Le mot Sapon signifie le savon, se rapportant aux saponines permanentes de mousse font sur être mélangé avec de l'eau.

Figure 8 : Molécule du composé actif saponine On pense que des saponines sont utiles dans le régime humain pour commander le cholestérol, mais certains (ceux y compris produits par le soapberry) sont toxiques si avalé et peuvent causer l'urticaria (éruption de peau) dans beaucoup de gens. N'importe quelle saponine nettement toxique est connue comme sapotoxin.Des saponines ont été identifiées dans :

• Aloès, Amaranthe, • Asperge (comme protodioscin), • Mouron des oiseaux, • Monnieri de Bacopa, Espèces de

Chlorophytum, • Espèces de Chlorogalum, • usines de savon, • Conkers/marrons d'Inde, • Espèces tubéreuses de courge, • Digitale (comme digitonine), • Échinodermes, Fenugrec, • Or, • Cola de Gotu, • Peau de raisin, • Gypsophila (le souffle du bébé), • Jiaogulan, Réglisse, Mullein, • Olives,

• Panax (comme ginsenoside), • Saponaria de quillaja (bois De

Panama, membre de la famille de Rosaceae),

• Quinoa, • Ramboutan, • Soapberry et beaucoup d'autres

membres de la famille Sapindaceae, y compris des marronniers américains, Saponaria (Soapwort, rebondissant Betty),

• Soja, • Terrestris de Tribulus (comme

protodioscin), • Igname de chine sauvage, • Yucca.

Beaucoup d'autres plantes sont utilisées dans la médecine ou comme compléments alimentaires. En particulier les saponins du saponaria de quillaja sont

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employées dans les vaccins vétérinaires comme adjuvant (par exemple, vaccins de fièvre aphteuse, aidant à augmenter l'immuno-réaction). Au départ, la fraction brute a été employée. Plus tard un mélange épuré, appelé Quil A a été développé par Dalsgaard qui était plus efficace et a causé des réactions secondaires moins locales. Quil A est toujours un mélange de plus de 25 molécules différentes de saponine. L'une d'entre elles, la saponine QS21, est étudiée pour des effets auxiliaires bénéfiques possibles sur le système immunitaire humain. Les saponines sont également des détergents doux et sont employées aussi bien que pour la recherche que pour la vente. Elles sont employées dans le musée britannique comme détergent pour nettoyer doucement les manuscrits antiques. Dans des études de laboratoire que des saponines peuvent être employées à 0.04% - 0.2% pour rendre perméable (« faire les trous dans ») la membrane de plasma aussi bien que les membranes des organelles internes comme HEU et du Golgi mais ne pénètre pas la membrane nucléaire. Par conséquent elle est employée en histochimie intracellulaire souillant pour permettre l'accès d'anticorps aux protéines intracellulaires. En raison de sa nature réversible sur des cellules et de sa capacité perméable les cellules sans morphologie détruisant de cellules, elle est employée dans des applications de laboratoire pour traiter les cellules de phase afin de faciliter le peptide ou les réactifs tels que des anticorps pour écrire des cellules au lieu du triton détersif plus dur X-100. Elle est également faite sur les préparations entières de cellules telles que des souillures et des cytosines de cellules où la membrane de cellules est intacte. Elle peut également être faite sur les sections gelées mais n'est pas employée sur les sections fixes de tissu. Pour préserver l'effet perméabilisant, la saponine doit être employée dans tous les processus impliqués dans les étapes de souillure ou autrement enlevés après que le réactif d'intérêt ait atteint la cellule. Une saponine est un hétéroside complexe, appartenant aux terpènes cycliques (nom générique donné aux hydrocarbures saturés cycliques ou acycliques) ou aux stéroïdes, se trouvant chez de nombreux végétaux (salsepareille, saponaire, quinoa, etc.) sous forme d'hétérosides (saponosides). Douées de propriétés tensioactives, les saponines font mousser leurs solutions et servent de détergent. Elles provoquent aussi la lyse (dissolution de cellules ou de tissus sous l'influence d'agents chimiques, physiques ou biologiques) des globules rouges. Un glycoside de saponine ou simplement saponine est issu de la combinaison chimique d’un sucre (voir hydrates de carbone) et d’un stéroïde, d’un stéroïde alcaloïde (il s’agit d’un stéroïde comportant une fonction azotée) ou d’un triterpène. C’est pourquoi on parle aussi de saponine stéroïde, de saponine alcaloïde stéroïde et de saponine triterpène. En raison de la multiplicité des structures possibles d'hydrate de carbone et de la grande variabilité structurelle des aglycones (voir glycoside), ce groupe de corps présente une grande variété structurelle et par là une grande variabilité dans ses caractères biologiques. Les saponines ont reçu leur nom du fait qu’elles produisent une mousse semblable à celle du savon quand on les agite dans l’eau (du latin sapo, le savon). Cette propriété que possède cette sorte de liaison explique en premier lieu son caractère détergent. Les saponines donnent naissance à des mousses généralement

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stables, qui présentent une activité hémolytique, agissent sur la perméabilité des membranes, complexifient le cholestérol, ont généralement un goût amer et sont piscicides (c’est-à-dire toxiques pour des poissons). Les saponines sont très fréquentes dans les végétaux supérieurs, surtout dans les tissus riches en substance nutritive, comme les racines (glycyrrhizine dans les racines de réglisse), les tubercules, les feuilles, les fleurs et les graines. On les trouve dans les légumes, comme le soja, les petits pois, les épinards, les tomates, les pommes de terre, l'ail et le quinoa, et ils constituent en outre des agents dans les herbes aromatiques, le thé et le ginseng (voir métabolite secondaire). Les saponines sont présentes en grande quantité dans les châtaignes et dans le bois de Panama d’Amérique du Sud (en latin Quillaja saponaria Molina). On trouve aussi des saponines dans les concombres de mer et le plancton. Les saponines servent probablement aux plantes comme substances défensives, en particulier contre les agressions fongiques. Répandues dans de nombreux végétaux tels que saponaire, salsepareille, igname, muguet, digitale, agave, dioscorée, les sapogénines sont la partie aglycone de glycosides, les saponines. La structure de ces dernières est voisine de celle des hétérosides cardiotoniques ; certaines (convallamarine, F-gitonine et digitonine) en ont les propriétés. Les saponines livrent, par scission hydrolytique, un ou des sucres et une sapogénine, stéroïde dérivant du cholestérol après hydroxylation en C-16, C-22 et C-26. En général, ces fonctions oxygénées forment des ponts qui apparentent les molécules au spirostane ; dans certains cas, le cycle F peut être insaturé, hydroxylé ou même ouvert (furostanes). Les saponines, avec une partie hydrosoluble (sucre) et une partie liposoluble (stéroïde), sont douées de propriétés tensio-actives, qui leur ont valu leur nom (sapo = savon en latin). À côté de leur utilisation traditionnelle dans les lessives et shampooings, certaines, telles la diosgénine et l'hécogénine, ont acquis une importance commerciale considérable, car elles sont transformables par hémisynthèse en hormones stéroïdes.

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V. Description du procédé : techniques et appareillages utilisés Le procédé utilisé par Arcadia Herba a été mis en place d’après des études allemandes. Le model retenu par la société est de fabrication chinoise, choisit pour une construction similaire à des coûts moins onéreux. Le réservoir multifonction d’extraction (modèle DQ400L en annexe XX page XX) est construit par la société Sunking Pharmaceutical Machinery Compagny Ldt. Il s’agit d’une cuve d’extraction, dont la technique ancestrale provient de la médecine chinoise pour l’extraction de différents composés, comme la séparation d’huile ou le recyclage d’alcool. L’équipement est composé :

• D’un échangeur de chaleur, • D’un collecteur, • D’un séparateur eau/huile, • D’une cuve d’extraction.

Le principe de fonction repose sur la macération et le passage des composés dans le solvant par une extraction à des températures et pressions moyennes et basses. L’équipement est seulement adapté pour l’extraction à partir de mélange de solutions aqueuses et pour les huiles. Pour l’extraction avec de l’eau :

• Mettre les composés et l’eau dans la cuve • Commencer la chauffe avec la vapeur, qui circule dans la chemise de l’extracteur • Lorsque la température maximale est atteinte, diminuer le débit de vapeur

Le schéma procédé de l’installation permet de visualiser les différentes étapes de l’extraction (Annexe XX page XX). L’installation d’extraction est constituée d’une cuve d’extraction avec une ouverture en tête pour permettre l’entrée des plantes séchées. Un moteur actionnant un agitateur à palles permet d’imbiber les plantes de solvant au démarrage. L’agitation est ensuite arrêtée afin de ne pas perturber la macération et éviter la suspension des plantes. Un condenseur est situé à en haut de l’extracteur pour condenser les vapeurs de solvant. L’extracteur possède un filtre dans la base de la cuve. Le filtre permet de séparer, une fois l’extraction terminée, l’extrait de la partie solide restante. L’extrait est retiré de l’extracteur à l’aide d’une pompe à vide. Il est ensuite acheminé vers un second réservoir munis lui aussi d’un filtre pour retirer les solides restants. L’extrait est alors conduit dans un évaporateur, qui permet de séparer l’extrait du solvant suivant le principe de température d’ébullition distincte des composés. Un échangeur, placé au dessus de l’évaporateur, condense les vapeurs. Le solvant est ensuite récupérer dans un collecteur. L’extrait recherché est soutiré de l’évaporateur. L’extrait et le solvant sont chauffés dans l’évaporateur à l’aide de vapeur circulant dans un circuit de serpentin. La vapeur sous pression est produite par une chaudière au bois.

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Caractéristiques de l’extraction solide-liquide : Volume du réacteur : 250 L Solvant : Eau distillée et alcool (éthanol) Taux de dilution : (L solvant / kg solide)

Minimum : 5/1 Maximum : 9/1 Moyen : 5,6/1

Gsolide sec 30 kg Vsolvant 150 L Densité du solvant : 850 - 900 kg.m-3 Viscosité du solvant : 0,7 - 1,0.10-3 Pa.s Durée moyenne de l’extraction : 1,5 h Caractéristiques de la séparation solide-liquide : Quantité totale à séparer dans un cycle 200 L Quantité récupérée 150 - 160 L de solution avec 2 à 4% de

soluté Produit séparé 25 - 30 kg de solide Granulométrie (fractions) de solide Fin > 1 mm

Grand > 2 mm Moyen : 1 - 2 mm

Quantité de solide dans la suspension (% massique)

Minimum : 10% Maximum : 20% Moyen : 18%

Humidité finale du solide traité : Jusqu’à 10% Densité de solide : 980 - 1100 kg.m-3 Epaisseur du solide dans le percolateur : 10 cm Débit de décharge de l’extracteur : 100 L/h Durée de la filtration : 0,5 h Caractéristiques de l’évaporation : Quantité totale à concentrer 200 L 2 - 4 % de soluté extrait dans 40 %

de solution aqueuse d’éthanol Produit de récupération : 7 L de solution concentrée

65 % de soluté dans l’eau Produit pour séparer : 25 - 30 kg de composition final en éthanol

dans la solution concentrée et au maximum 1 %

Taux de concentration : Jusqu’à 7/1 Température : Jusqu’à 50°C Pression résiduelle : 33 mbar absolu Capacité d’évaporation : 100 L/h Durée de l’évaporation : 2 h

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Caractéristiques du séchage : Quantité totale à sécher pour un cycle : 7 L de solution concentrée

65 % de soluté dans l’eau Produit final : 4,7 kg/h d’extrait sec Humidité résiduelle Jusqu’à 2 % Caractéristique de la colonne pour la récupération d’éthanol : (A terminer) Broyeur : Le broyage est une opération qui consiste à diviser un solide, pour augmenter sa surface spécifique (surface développée de la poudre par unité de masse) et donc sa réactivité. Le broyage des plantes permet d’obtenir une meilleure diffusion dans le solvant pour l’étape d’extraction. Extracteur : L’extraction solide-liquide est une opération de transfert ou d’échange de matière entre une phase solide (plantes médicinales), la matière à extraire (principes actifs), et une phase liquide (eau ou éthanol), le solvant d’extraction, le constituant recherché étant le soluté. On peut donc considérer que l’opération a pour but d’enlever par dissolution un corps utile d’un solide sans valeur. Dans notre cas le principe de cette extraction est une digestion ou macération à chaud. La macération à chaud est un procédé utilisé pour extraire les principes actifs des plantes médicinales, en les mettant dans de l'alcool ou de l’eau, sous agitation et à une température adéquate, pendant une certaine durée. Si la macération est trop courte, les principes actifs ne passent qu'incomplètement ou sont trop faiblement dissous à tel point qu'on n’obtiendra une concentration dans ses principes dans le soluté trop faible. A l'inverse, si la macération est trop longue, la plante peut entrer en décomposition et apporter des goûts malvenus. L’appareillage utilisé est un extracteur à simple agitation mécanique. Les appareils de cette catégorie sont des mélangeurs dans lesquels le solide et le solvant sont mis en contact par agitation mécanique. Ces appareils sont utilisés pour l’extraction de particules de toutes tailles en discontinu et en continu. Il sera adjoint au mélangeur (dont le rôle n’est que la mise en contact du solide), un dispositif de séparation par filtration. Caractéristiques techniques principales : Volume utile (m3) 0.25 Volume total (m3) 0,4

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Pression conçue intérieure (MPa) 0.09 La veste a conçu la pression (MPa) 0.3 Pression de compression d'air (carte) 0.6--0.7Diamètre d’entrée (mm) 300 Diamètre de la sortie de rebut (mm) 800 Surface de chauffe (m2) 2.5 Secteur de refroidissement (m2) 1 Surface de la toile filtrante (m2) 0.25 Vitesse d’agitation (tour/min) 35 Evaporateur : L’évaporation correspond au passage de l’état liquide à l’état vapeur. Nous englobons dans ce même concept la vaporisation calme en surface d’un liquide et celle avec formation de bulles dans la masse que l’on appelle ébullition. L’évaporation peut se limiter à un simple changement de phase d’un liquide dont la composition ne change pas. Ce phénomène permet le transfert de chaleur d’un fluide à un autre et l’absorption d’énergie dans des conditions de température et de pression constantes pour le fluide vaporisé. Il y a donc concentration du produit dissous dans la phase liquide. En fin d’opération, on récupère ce que l’on appelle le concentrat. Le solvant est de l’eau, on parlera généralement d’eau évaporée. Le moyen de chauffage utilisé est la vapeur d’eau, que l’on récupère, en fin d’opération, sous forme de condensat.

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Atomiseur : C’est l’opération unitaire ayant pour but d’éliminer par évaporation un liquide imprégnant un solide ou un liquide. Le terme déshydratation a un sens plus restrictif : il ne concerne que l’élimination de l’eau dans un solide ou dans un liquide. Dans cet appareil, l’élément essentiel est le système de pulvérisation qui conditionne l’efficacité du sécheur et la qualité du produit sec. Le produit est pulvérisé au sommet d’une enceinte cylindrique verticale parcourue par un courant d’air chaud descendant ou en spirale ascendante. Les particules pulvérisées au contact de l’air chaud descendent par gravité. Les plus grosses sont récupérées à la base de l’enceinte, les plus légères étant emportées par le courant d’air chaud et récupérées par les systèmes de dépoussiérage. La pulvérisation augmente considérablement la surface d’échange entre l’air et le produit, conférant ainsi une grande efficacité de séchage.

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Aspect théorique de l’extraction solide-liquide : L’extraction solide-liquide est l’opération fondamentale qui a pour but d’extraire, de séparer ou de dissoudre, par immersion dans un liquide ou par arrosage par un liquide, un ou plusieurs composants (solide ou liquide) mélangés à un solide. C’est une opération très ancienne, utilisée pour retirer des plantes et de certains organes animaux des produits alimentaires, pharmaceutiques, colorants ou odoriférants, en vue de la production de breuvages, drogues, teintures ou parfums. Dans les industries agro-alimentaires, pharmaceutiques et de la parfumerie, de nombreux exemples d’extraction de produits naturels par l’eau, les alcools (éthanol, méthanol), ou par des solvants organiques tels que l’hexane, les solvants chlorés, le benzène ou le toluène (ces deux derniers sont de moins en moins utilisés en raison de la législation sur les produits toxiques) peuvent être cités à titre indicatif :

• les extraits de café et de thé (fabrication des préparations solubles) sont produits par traitement à l’eau bouillante : la caféine est extraite à l’eau du café et du thé ; le café décaféiné est obtenu par élimination de la caféine du grain de café vert par un traitement aux solvants chlorés.

• le sucre (saccharose) est extrait à l’eau chaude des racines de betteraves ; • les huiles alimentaires (colza, soja, arachide) sont retirées des graines

oléagineuses par pression puis extraction à l’hexane ; • un grand nombre de produits à activité pharmacodynamique, contenus dans les

plantes médicinales, sont extraits par l’eau, les alcools, les hydro- carbures ou les solvants chlorés ;

• les parfums naturels sont isolés des plantes (fleurs, racines, tiges) par les alcools ou les corps gras et donnent des teintures, infusions ou pommades ;

• les tanins naturels sont obtenus par traitement à l’eau de l’écorce de certains arbres.

L’utilisation de l’extraction solide-liquide dans l’industrie minérale (hydro- métallurgie) est très courante. On sépare fréquemment le produit utile de la gangue d’un minerai par dissolution dans des solutions d’attaques (alcalines, neutres ou acides). On peut citer :

• le cuivre est extrait des minerais à faibles teneurs (< 1,5 %) sous forme de sulfate par l’acide sulfurique ou une solution de sulfate ferrique ;

• le zinc, le chrome et les terres rares sont obtenus de la même façon ; • l’or et l’argent sont isolés des minerais par dissolution dans une solution de

cyanure de potassium ; • l’uranium est solubilisé à partir du minerai par attaque avec une solution acide ou

une solution de carbonate de sodium ; • l’aluminium est obtenu sous forme d’aluminate de sodium par attaque alcaline.

Le champ d’application de l’extraction solide-liquide étant très vaste, le grand nombre de vocables employés pour définir les opé- rations et les produits circulants impose la définition de quelques termes couramment utilisés. Le liquide d’extraction, appelé solvant, dissout un (ou plusieurs) composant cristallisé ou liquide, dénommé soluté, pour donner une solution ou extrait (solvant + soluté) et laisse un solide épuisé, appelé résidu, inerte ou insoluble, contenant très peu ou pas de soluté.

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Le terme miscella, pour désigner la solution ou l’extrait, est également très employé, notamment en huilerie. Par analogie avec l’extraction liquide-liquide qui procède de l’extraction d’un composant (soluté) contenu dans un liquide par un solvant pour donner une solution de soluté (extrait) et un liquide appauvri en soluté (raffinat), on peut encore utiliser le terme raffinat pour désigner le résidu de l’extraction solide-liquide. Les noms de surverse (overflow) et de sousverse (underflow) sont très employés par les Anglo-Saxons pour désigner respectivement la solution et le solide (ou la suspension très épaisse de solide). Ces termes traduisent la position de sortie des produits des appareils continus industriels où la solution sort par la partie supérieure et le solide par la partie inférieure. Les opérations d’extraction solide-liquide regroupent plusieurs méthodes différentes énumérées ci-après.

• La lixiviation ou lessivage, traduit en anglais par leaching, s’applique essentiellement à l’hydrométallurgie. Le solide (minerai), finement divisé, est mis en contact avec une liqueur d’attaque, chaude ou froide, qui solubilise le soluté. Le terme lavage peut être utilisé mais il prête à confusion avec le vocable iden- tique utilisé pour désigner l’opération de triage gravimétrique.

• La percolation consiste à laisser couler un solvant générale- ment chaud sur un lit de solides finement divisés afin de dissoudre les composants solubles qui y sont contenus. La préparation du café relève de cette opération.

• La décoction est l’opération dans laquelle le solide est mis à bouillir dans un liquide en vue d’extraire les parties solubles. Le traitement du malt en brasserie utilise cette méthode.

• L’infusion est la mise en suspension d’un solide dans un liquide chaud (proche de l’ébullition) ou l’arrosage du solide par ce liquide, afin de dissoudre les constituants utiles, suivie du refroidissement du mélange. La préparation du thé est l’exemple type de cette opération.

• La macération est la mise en contact plus ou moins prolongé à froid d’un solide dans un solvant en vue d’extraire les parties solubles.

• La digestion est une macération à chaud. Cette opération et la macération sont utilisées particulièrement en pharmacie et en parfumerie.

• L’élution consiste à enlever un soluté fixé à la surface d’un solide par simple contact avec un solvant. C’est l’opération complémentaire à la fixation dans les opérations d’échange d’ions. Elle est fréquemment employée dans les méthodes d’analyses (chromatographie).

L’extraction solide-liquide est une opération de transfert ou d’échange de matière entre une phase solide, la matière à extraire, et une phase liquide, le solvant d’extraction, les constituants recherchés pouvant être soit le soluté, soit le résidu. On peut donc considérer que l’opération a pour but d’enlever par dissolution un corps utile d’un solide sans valeur ou d’éliminer un produit indésirable, soluble, qui souille un solide intéressant. Elle permet de séparer des liquides (ou des solides) d’avec un solide lorsque cette séparation est peu commode ou incomplète par les opérations mécaniques ou thermiques.

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Les opérations mécaniques ne sont en effet utilisables que pour les corps solides ayant des différences très marquées de propriétés gravimétriques, électriques ou magnétiques, tandis que les opérations thermiques telles que le séchage et l’entraînement à la vapeur ne sont praticables que lorsque le composant retenu par le substrat est assez volatil et résiste à l’action prolongée de la chaleur. Elle fait partie, avec l’extraction liquide-liquide et l’absorption, des opérations d’extraction par les liquides, c’est-à-dire de celles pour lesquelles un produit, dans un solide, un liquide ou un gaz, passe à l’état dissous dans un liquide. L’extraction solide-liquide est régie par des phénomènes très complexes au sein des molécules. Processus de transfert de matière : L’extraction solide-liquide est réalisée, en principe, par contact intime du solide avec le solvant et séparation mécanique de la solution d’avec le solide. Toutefois une certaine quantité de solution est retenue à la surface du solide, ce qui oblige parfois à procéder à un lavage par élution ou à l’opération nommée désolvantisation qui consiste à chasser, par évaporation, le solvant imbibé dans le résidu (séchage). La totalité de l’opération se déroule en trois étapes théoriques :

• le passage du soluté dans le solvant (ou dissolution), • le lavage du solide par du solvant frais ou pauvre en soluté, • la séparation mécanique du solide.

Ces trois processus sont réalisés soit dans des appareils distincts, soit dans un appareil unique ; l’ensemble constitue l’étage unitaire de l’extraction solide-liquide. Arcadia Herba possède un extracteur permettant de réaliser directement ces 3 étapes. Le transfert du soluté dans le liquide est l’extraction solide-liquide proprement dite. Ce transfert exige un certain temps pour être complet et il est essentiel de déterminer la vitesse globale du phénomène, c’est-à-dire la vitesse de transfert ou vitesse d’extraction, pour définir un appareil d’extraction. Cette vitesse résultante est régie par trois processus élémentaires de l’échange de matière : la dissolution du soluté au sein des particules par le solvant, la diffusion de la solution vers l’extérieur de la particule et la diffusion du soluté contenu dans la solution au contact du solide vers la masse restante du solvant. Le passage du soluté de la solution au contact du solide vers la masse de solvant peut être considéré comme une simple opération de mélange dont la vitesse est telle que son influence sur la vitesse globale est très limitée. Une bonne agitation favorise l’homogénéisation du mélange solvant-soluté, mais n’accélère pas nécessairement l’opération globale. De plus, des phénomènes de suspension spécifiques aux plantes séchées ont lieu dans l’extracteur en cas d’agitation trop intense. La diffusion du liquide vers la surface extérieure du solide joue un rôle important dans la cinétique du transfert de matière. Ce phénomène est souvent décrit à travers la théorie des films. C’est la résistance opposée par le film mince entourant la particule qui détermine la vitesse de diffusion, généralement lente.

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Par le mouvement des particules, on peut réduire l’épaisseur de la couche liquide autour du solide (couche limite). L’agitation du milieu peut permettre d’augmenter la vitesse de diffusion à travers le film liquide. En ce qui concerne la dissolution du soluté, une distinction doit être faite suivant que le soluté est cristallisé (attaque d’un minerai) ou liquide (extraction des matières végétales). Dans le premier cas, la dissolution ne peut être totale que si le solvant n’est pas saturé (une quantité minimale de solvant est nécessaire à la dissolution de tout le soluté). La dissolution complète du soluté exige généralement un temps beaucoup trop long et l’opération est arrêtée lorsqu’une concentration déterminée est atteinte. Lorsque la vitesse de dissolution des cristaux est très faible comparée à la vitesse de diffusion (cas général), la vitesse globale d’extraction est assimilable à la vitesse de dissolution. L’agitation des particules solides pour accélérer le processus n’a pratiquement aucun effet et son rôle est limité au maintien d’une suspension homogène. On peut agir, en revanche, sur la fragmentation du solide : plus celui-ci sera fin, plus grande sera la vitesse d’extraction. Dans le second cas, si le soluté est localisé en surface du solide, généralement poreux, sa mise en solution est rapide et la vitesse de transfert est très dépendante de la vitesse de diffusion (diffusion par capillarité ou diffusion surfacique) et peut être accrue par l’agitation du milieu (effet de film). Dans le cas typique de l’extraction des matières végétales, le soluté est localisé dans des cellules végétales à parois très peu perméables. Le cheminement du soluté à travers les parois des cellules peut être très lent. Le processus est régi par un phénomène de diffusion à travers une membrane ou dialyse. La résistance au passage du soluté est beaucoup plus grande que celle observée par simple effet de film. Dans ces conditions, c’est cette diffusion interne qui gouverne la vitesse de transfert et l’agitation même vigoureuse du milieu n’a que peu d’influence sur la vitesse de transfert Opération à étage unique ou à simple contact Cette opération, représentée sur la figure 1, est généralement incomplète en raison de la valeur élevée du temps de contact nécessaire pour épuiser totalement le solide de son soluté, même avec un très bon solvant et dans des conditions très éloignées de l’équilibre thermodynamique ou de la saturation du solvant. Cette opération est discontinue pour les opérations à petite échelle, au laboratoire par exemple, et pour les extractions industrielles de produits à haute valeur ajoutée, comme en pharmaceutique. Arcadia Herba utilise ce procédé en fonction des plantes à traiter, selon les saisons. Une réalisation d’extraction complète, ou très poussée, qui fait appel aux procédés à contacts multiples à courants parallèles, serait inutile puisque les débits de solvant et de solide sont trop faibles pour pouvoir établir un procédé en continu. C’est pourquoi le procédé fonctionne en discontinu ou procédé batch, mais reste continu en établissant l’ordonnancement de l’installation.

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VI. Résultats et exploitations

1) Analyse granulométrique Le respect des conditions de production est essentiel pour permettre des analyses cohérentes et représentatives lors des études en laboratoire. C’est pourquoi j’ai procédé à une analyse granulométrique de la plante avant de commencer toutes manipulations. La plante arrive sur le site de production déjà séchée dans des sacs en lin. Les herbes séchées sont alors découpées et broyées pour permettre une meilleure diffusion dans le solvant.

Figure 2 - Plante séchée avant analyse, toutes fractions mélangées, à l’état brute lors de l’arriver dans l’entreprise

Pour réaliser cette analyse, 30 g de plantes séchées et découpées à l’état brute ont été tamisés. J’ai réalisé 10 analyses granulométriques, dont les résultats figurent en annexe I, pour obtenir un pourcentage moyen sur chaque fraction. Le tableau 1 présente les moyennes obtenues. Pour respecter les conditions de production, j’ai choisi d’utiliser 30 g de plantes puisque les techniciens mettent environ 30 kg de solide lors de la charge de l’extracteur. Je conserve alors un rapport 1/10. Tableau 1 : Moyenne des résultats de l’analyse granulométrique

Tamis (mm) Moyenne > 2,5 24,36 % > 2 6,05 %

> 1,25 30,92 % > 1 10,15 %

> 0,8 8,70 % Poussières < 0,8 19,83 %

Total = 100 % A partir du tableau 1, la figure X a été construite sous forme d’un histogramme, qui permet de visualiser l’importance des différentes fractions dans les échantillons de 30 g mais aussi de manière plus générale au sein des sacs de plantes séchées reçus pour l’extraction.

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0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

24,36%

6,05%

30,92%

10,15%8,70%

19,83%

Pour

cent

age

mas

siqu

e

Tamis (mm)> 2,5 > 2 > 1,25 > 1 > 0,8 Poussières < 0,8

On remarque que la fraction comprise entre 1,25 et 2 mm (en vert) est la plus représentative avec 30,92% de la masse totale (30 g). Il s’agit de la fraction représentée sur la figure 10, constituée essentiellement de feuilles, petites tiges et autres éléments de la plantes à l’issue du découpage. Les poussières sont aussi en très grands nombre (19,83%, en orange) et demeure un véritable problème lors de l’extraction. Ces poussières (figure XX) ne contiennent pas des composés actifs et perturbent l’extraction en gênant la diffusion des plantes dans le solvant et le passage dans le filtre à la sortie de l’extracteur. Les particules inférieures à 1 mm (figure XX) sont considérées comme des poussières (8,70%, en bleu clair). Elles sont dues au découpage des plantes et constituent de véritables pertes de matières. Une solution de recyclage pourrait être envisagée par un système de tamisage et de filtration de l’air dans l’atelier de découpage des plantes par des systèmes de cyclones. Les deux fractions les plus petites soient 28,53% de la masse initialement analysée sont considérées comme inutilisables et perturbatrice pour l’extraction. Or, en pratique ces deux fractions ne sont pas totalement retirées. Une opération de séparation en amont pourrait augmenter le rendement et la qualité de l’extrait.

Figure 3 : Histogramme des fractions de plantes analysées (Tribulus Terrestris L.)

Les saponines se situent essentiellement dans la fleur de la plante. Pour les analyses en laboratoire, seules les 4 premières fractions seront prises en compte afin d’obtenir une qualité d’extrait satisfaisante. Le tableau 2 présente les pourcentages moyens des 4 fractions les plus représentatives pour l’extraction. Tableau 2 : Pourcentages des fractions utiles

Tamis (mm) Moyenne

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0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

34,08%

8,46%

43,26%

14,20%

Pour

cent

age

mas

siqu

e

Tamis (mm)> 2,5 > 2 > 1,25 > 1

> 2,5 34,08% > 2 8,46%

> 1,25 43,26% > 1 14,20%

Total = 100% Un nouvel histogramme présenté en figure XX montre la répartition de ces 4 fractions. Les deux fractions les plus importantes sont les fractions supérieures à 2,5 mm (34,08%, en bleu) et comprises entre 1,25 et 2 mm (43,26% en vert). La fraction la plus grande (figure XX) est constituée essentiellement de grosses tiges et des fleurs contenant les saponines.

Figure 4 : Histogramme des fractions utiles de la plantes Terrestris Tribulus L.

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Les figures suivantes montrent les caractéristiques visuelles des fractions de plantes.

Figure 5 : Poussières < 0,8 mm

Figure 6 : Fraction > 1 mm

Figure 7 : Fraction > 2 mm

Figure 8 : Fraction > 0,8 mm

Figure 9 : Fraction > 1,25 mm

Figure 10 : Fraction > 2,5 mm

1) Extractions infinies En pratique, les techniciens réalisent deux extractions successives pour extraire le plus de composés actifs possible. J’ai reconduit cette expérimentation pour déterminer le nombre d’extraction optimal pour ce type de plante. J’ai utilisé 30 g de solide et 250 ml d’eau distillée. Les 30 g de solide ont été réparti d’après l’analyse granulométrique (§ page XX). Tableau X : Masse de solide utilisée selon la répartition granulométrique

Tamis (mm) Moyenne Masse (g) Masse pesée (g) > 2,5 34,08% 10,224 10,2236 > 2 8,46% 2,538 2,5379

> 1,25 43,26% 12,978 12,9782

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> 1 14,20% 4,26 4,2599 Total = 100% 30 29,9996

a) Première extraction Environ 30 g de solide sont chargés avec 250 ml d’eau. La première extraction est réalisée à 90°C pendant 1h30. J’ai pu récupérer 147 ml d’extrait. A l’aide du Soxlet, j’ai concentré l’extrait en retirant 55 ml d’eau. Les 92 ml restants ont été évaporés à sec pour obtenir un solide. La masse de solide sec après évaporation est de 4,828 g.

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b) Deuxième extraction Le solide chargé est maintenant imbibé de solvant, mais un ajout de 250 ml de solvant frais est tout de même nécessaire pour continuer l’extraction des composés actifs vers le solvant. J’obtiens 262 ml d’extrait, ce qui signifie que du solvant de l’extraction précédente est passé avec l’extrait. 188 ml d’eau sont évaporés et les 74 ml restants sont concentrés par évaporation à sec. La masse de solide sec obtenue est de 2,7951 g.

c) Troisième extraction Une troisième extraction est réalisée dans les mêmes conditions opératoires. J’ai ajouté de nouveau 250 ml de solvant frais. L’extrait mesuré est de 250 ml, les plantes sont complètement imbibées de solvant et la diffusion va être de plus en plus difficile. Seulement 88 ml sont évaporés avec l’appareil Soxlet étant donné la durée d’évaporation. Les 170 ml d’extrait restant sont évaporés à sec pour obtenir le résidu solide sec. J’ai obtenu une masse de solide sec de 1,3546 g.

d) Quatrième extraction Une quatrième extraction est envisagée pour l’expérimentation mais demeure inutile pour l’isolation des saponines, la quantité d’extrait de solide résiduel sec étant déjà trop insuffisante à la fin de la troisième extraction. La quatrième extraction suit les mêmes conditions mais demeure très difficile. Du solvant frais a été ajouté (250 ml) mais la diffusion des composés actifs est pratiquement nul. Au bout de 1h30, l’extrait récupéré est incolore. On récupère seulement une masse de solide sec de 0,3464 g.

e) Interprétation D’après l’histogramme de la figure 11, on observe une forte diminution de la quantité d’extrait solide résiduel sec. En effet, dès la deuxième extraction, on récolte environ la moitié de solide par rapport à la première, ce qui est faible pour une deuxième extraction successive. Les troisième et quatrième extractions permettent d’obtenir encore moins d’extrait sec. C’est pourquoi, il est important de garder le même protocole opératoire avec deux extractions successives. Les pertes de temps et d’énergie de chauffe sont plus importantes si l’on réalise quatre extractions à la suite puisqu’elles suivent le même protocole opératoire que les deux premières (1h30 à 90°C). Une deuxième extraction avec du solvant frais permet une seconde diffusion des composés actifs dans le solvant et un lavage de la charge.

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0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

54,8528

2,7951

1,3546

0,3464

Mas

se d

'ext

rait

solid

e ré

sidu

el s

ec (

g)

Nombre d'extraction (Durée d'une extraction = 1,5 heure)

1ère 2ème 3ème 4ème

Figure 11 : Masse d’extrait solide (g) en fonction du nombre d’extraction

2) Quantité maximale extractible

Pour connaître la quantité maximale de saponines que l’on peut récupérer, j’ai réalisé une extraction avec 1 g de solide et 300 ml de solvant. L’eau a été utilisée comme solvant pour pouvoir élever la température de chauffe à 90°C, ce qui n’aurait pas été possible avec un alcool, à la température d’ébullition plus faible (température d’ébullition de l’éthanol = 78,5°C). Une colonne réfrigérante à boules est placée au dessus pour condenser les vapeurs (Figure XX). Les 1 g de plantes ont été répartis suivant l’analyse granulométrique (§ page XX). L’extrait récupéré est de 287 ml, ce qui signifie que 1 g de plante peut absorber 3 ml de solvant, si l’on néglige les pertes en solvant lors de la chauffe malgré le condenseur à boules et les pertes résiduelles sur la verrerie. 163 ml d’eau ont été évaporés et les 124 ml restants évaporés à sec.

3) Procédure de mise en évidence des saponines

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Une procédure de mise en évidence des saponines a été mise en place pour pouvoir observer l’isolation des composés actifs à l’issu de l’extraction. A partir d’une procédure réalisée sur une plantes contenant aussi des saponines, Herba Astragali, j’ai pu établir une analyse similaire en modifiant et expérimentant certains produits sur l’extrait sec des extractions. Cette analyse a été conduite dans des conditions optimales à partir d’extractions réalisées avec 30 g de solide et 250 ml de solvant (eau) à 90°C pendant 2 heures. Une fois l’extraction terminée, l’extrait est récupéré par filtration de la partie solide restante. L’extrait est soit placé dans un appareil Soxlet (figure XX) ou soit évaporé à sec (figure XX) pour le concentrer au maximum. Un solide résiduel sec est alors obtenu. Il est placé à l’étuve à 50°C pendant 48 heures (figure XX). L’extrait est ensuite repris avec 10 ml de méthanol et 5 ml d’eau distillée chaude. Afin de faciliter l’obtention une solution homogène, l’ensemble peut être chauffé. Un rapport ½ doit être conservé entre l’eau et le méthanol pour homogénéiser la solution. La solution est ensuite lavée à plusieurs reprises par du chloroforme pour chasser la couleur brunâtre des flavonoïdes. Le chloroforme est à son tour enlever par l’éthyle acétate jusqu’à l’obtention d’une couleur jaune transparente. Les saponines sont précipitées dans l’acétone et récupérées par filtration sur filtre à papier de diamètre 110 mm. La masse mesurée après séchage du filtre représente la masse des saponines extraites. Les saponines sont solubles dans les alcools, j’ai donc effectué différentes dilutions pour tester l’homogénéité des saponines pour plusieurs concentrations. Le méthanol a été le plus concluant. L’éthanol et l’acétone ont directement précipité les saponines, ce qui les a détruits.

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Figure 12 : Evaporation

Figure 13 : Saponines en suspension

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5) Etude de l’influence du changement de la concentration du solvant A l’aide de l’analyse granulométrique, j’ai préparé plusieurs réacteurs respectant le rapport 1/10 pour étudier l’influence du changement de concentration du solvant. 3 g de plantes seront analysés avec 30 ml de solvant. L’influence de l’éthanol est étudiée pour plusieurs concentrations : 20%, 40%, 60% et 70% d’éthanol avec de l’eau distillée pour une quantité totale de 30 ml de solvant. Tableau 3 : Quantité de solvant suivant le pourcentage d’éthanol Concentration (% vol) Ethanol (ml) Eau (ml) Total (ml)

20% 6 24 30 40% 12 18 30 60% 18 12 30 70% 21 9 30

Deux extractions successives ont été réalisées d’après la quantité maximale extractible. La même quantité de solvant est reprise (solvant frais) afin de laver et récupérer le maximum de soluté. Tableau 4 : Pourcentage des fractions représentatives et masses correspondantes au 3 g de solide

Tamis (mm) Moyenne Masse (g) > 2,5 34,08% 1,0224 > 2 8,46% 0,2538

> 1,25 43,26% 1,2977 > 1 14,20% 0,4260

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Total = 100% 3

a) Extraction avec 20% d’éthanol à 25°C (température ambiante) Durée de la 1ère extraction : 1h30 Tableau 5 : Masse de pesé exacte

Tamis (mm) Masse (g) > 2,5 1,0223 > 2 0,2536

> 1,25 1,2978 > 1 0,4263

Total = 3 Tare de la boîte de pétri = 63,0301 g Tare du réacteur = 116,2341 g Calcul des pertes lors de la manipulation des plantes séchées et coupées : 119,2268 – 116,2341 = 2,9927 g Soit à partir des 3 g au départ : 3 - 2,9927 = 7,3.10-3 g, ce qui représente 0,2433% de pertes liées aux manipulations de pesé. Une fois la 1ère extraction terminée, le contenu du réacteur est filtré et on obtient 17 ml d’extrait. L’extrait est ensuite traité par évaporation à sec afin de le concentrer au maximum, suivant la procédure d’analyse des saponines (vu précédemment page XX § XX). Tare du bécher = 45,42 g Soit la masse de l’extrait sec : 45,6731 - 45,42 = 0,2531 g J’ai pu recueillir les saponines après traitement sur un papier filtre de diamètre 110 mm de masse : 0,8217 g Soit la masse de saponine lors de la 1ère extraction à température ambiante (25°C) avec une charge de 3 g de solide et 30 ml de solvant à 20% d’éthanol : 0,8638 - 0,8217 = 0,0421 g de saponines. Durée de la 2ème extraction : 1h30 30 ml de solvant frais sont ajoutés. 29 ml d’extrait sont obtenus. Tare du bécher = 46,5494 g Soit la masse de l’extrait sec = 46,5494 - 46,5724 g = 0,023 g Masse du papier filtre : 0,8243 g Soit la masse de saponine recueilli lors de la 2ème extraction : 0,8531 - 0,8243 = 0,0288 g

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Autrement dit, les deux extractions successives m’ont permis de prélever 0,0421 + 0,0288 = 0,0709 g, ce qui représente 2,36% des 3 g initiaux. L’analyse confirme la présence de 2 à 5% des saponines dans la plante Terrestris Tribulus.

b) Extraction avec 40% d’éthanol Durée de la 1ère extraction : 1h30 Tableau 6 : Masse de pesé exacte

Tamis (mm) Masse (g) > 2,5 1,0224 > 2 0,2540

> 1,25 1,2978 > 1 0,4260

Total = 3,0002 Tare du réacteur 2 = 87,1289 g Calcul des pertes lors de la manipulation des plantes séchées et coupées : 90,1261 - 87,1289 = 2,9972 g Soit à partir des 3 g au départ : 3 - 2,9972 = 3.10-3 g, ce qui représente 0,0999% de pertes liées aux manipulations de pesé. Une fois la 1ère extraction terminée, le contenu du réacteur est filtré et on obtient 18,5 ml d’extrait. L’extrait est ensuite traité par évaporation à sec afin de le concentrer au maximum, suivant la procédure d’analyse des saponines (vu précédemment page XX § XX). Tare du bécher = 45,983 g Soit la masse de l’extrait sec : 46,1224 - 45,983 = 0,1394 g J’ai pu recueillir les saponines après traitement sur un papier filtre de diamètre 110 mm de masse : 0,7931 g Soit la masse de saponine lors de la 1ère extraction à température ambiante (25°C) avec une charge de 3 g de solide et 30 ml de solvant à 20% d’éthanol : 0,8713 - 0,7931 = 0,0782 g de saponines. Durée de la 2ème extraction : 1h30 30 ml de solvant frais sont ajoutés. 27 ml d’extrait sont obtenus. Tare du bécher = 46,662 g Soit la masse de l’extrait sec : 46,7421 - 46,662 = 0,0801 g Masse du papier filtre : 0,7986 g

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Soit la masse de saponine recueilli lors de la 2ème extraction : 0,8301 - 0,7986 = 0,0315 g Autrement dit, les deux extractions successives m’ont permis de prélever 0,0782 + 0,0315 = 0,1097 g, ce qui représente 3,66% des 3 g initiaux. L’analyse confirme la présence de 2 à 5% des saponines dans la plante Terrestris Tribulus.

c) Extraction avec 60% d’éthanol Durée de la 1ère extraction : 1h30 Tableau 6 : Masse de pesé exacte

Tamis (mm) Masse (g) > 2,5 1,0224 > 2 0,2539

> 1,25 1,2977 > 1 0,4260

Total = 3 Tare du réacteur 3 = 108,5705 g Calcul des pertes lors de la manipulation des plantes séchées et coupées : 111,5657 - 108,5705 = 2,9952 g Soit à partir des 3 g au départ : 3 - 2,9952 = 4,8.10-3 g, ce qui représente 0,16% de pertes liées aux manipulations de pesé. Une fois la 1ère extraction terminée, le contenu du réacteur est filtré et on obtient 19 ml d’extrait. L’extrait est ensuite traité par évaporation à sec afin de le concentrer au maximum, suivant la procédure d’analyse des saponines (vu précédemment page XX § XX). Tare du bécher = 46,7338 g Soit la masse de l’extrait sec : 46,9874 - 46,7338 = 0,2536 g J’ai pu recueillir les saponines après traitement sur un papier filtre de diamètre 110 mm de masse : 0,7930 g Soit la masse de saponine lors de la 1ère extraction à température ambiante (25°C) avec une charge de 3 g de solide et 30 ml de solvant à 20% d’éthanol : 0,8757 - 0,7930 = 0,0827 g de saponines. Durée de la 2ème extraction : 1h30 30 ml de solvant frais sont ajoutés. 27,5 ml d’extrait sont obtenus. Tare du bécher = 60,4236 g Soit la masse de l’extrait sec : 60,5893 - 60,5893 = 0,1657 g

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Masse du papier filtre : 0,8235 g Soit la masse de saponine recueilli lors de la 2ème extraction : 0,8372 - 0,8235 = 0,0137 g Autrement dit, les deux extractions successives m’ont permis de prélever 0,0827 + 0,0137 = 0,1097 g, ce qui représente 3,21% des 3 g initiaux. L’analyse confirme la présence de 2 à 5% des saponines dans la plante Terrestris Tribulus.

d) Extraction avec 70% d’éthanol Durée de la 1ère extraction : 1h30 Tableau 7 : Masse de pesé exacte

Tamis (mm) Masse (g) > 2,5 1,0224 > 2 0,2537

> 1,25 1,2979 > 1 0,4261

Total = 3,0001 Tare du réacteur 4 = 83,4197 g Calcul des pertes lors de la manipulation des plantes séchées et coupées : 86,4174 - 83,4197 = 2,9977 g Soit à partir des 3,0001 g au départ : 3,0001 - 2,9977 = 2,4.10-3 g, ce qui représente 0,0799% de pertes liées aux manipulations de pesé. Une fois la 1ère extraction terminée, le contenu du réacteur est filtré et on obtient 21 ml d’extrait. L’extrait est ensuite traité par évaporation à sec afin de le concentrer au maximum, suivant la procédure d’analyse des saponines (vu précédemment page XX § XX). Tare du bécher = 46,8947 g Soit la masse de l’extrait sec : 47,0593 - 46,8947 = 0,1646 g J’ai pu recueillir les saponines après traitement sur un papier filtre de diamètre 110 mm de masse : 0,8128 g Soit la masse de saponine lors de la 1ère extraction à température ambiante (25°C) avec une charge de 3 g de solide et 30 ml de solvant à 20% d’éthanol : 0,8513 - 0,7928 = 0,0585 g de saponines. Durée de la 2ème extraction : 1h30 30 ml de solvant frais sont ajoutés. 27,5 ml d’extrait sont obtenus. Tare du bécher = 46,5432 g Soit la masse de l’extrait sec : 46,5875 - 46,5432 = 0,0443 g

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Masse du papier filtre : 0,8134 g Soit la masse de saponine recueillie lors de la 2ème extraction : 0,8450 - 0,8134 = 0,0316 g Autrement dit, les deux extractions successives m’ont permis de prélever 0,0585 + 0,0316 = 0,0901 g, ce qui représente 3,00% des 3 g initiaux. L’analyse confirme la présence de 2 à 5% des saponines dans la plante Terrestris Tribulus.

6) Etude de l’influence du changement de température de l’extraction

a) Extraction avec 20% d’éthanol à 45°C Durée de la 1ère extraction : 1h30 Tableau 7 : Masse de pesé exacte

Tamis (mm) Masse (g) > 2,5 1,0226 > 2 0,2540

> 1,25 1,2976 > 1 0,4261

Total = 3,0003 Tare de la boîte de pétri = 63,0301 g Tare du réacteur 5 = 87,1579 g Calcul des pertes lors de la manipulation des plantes séchées et coupées : 90,1527 - 87,1579 = 2,9948 g Soit à partir des 3,0003 g au départ : 3,0003 - 2,9948 = 5,5.10-3 g, ce qui représente 0,184% de pertes liées aux manipulations de pesé. Une fois la 1ère extraction terminée, le contenu du réacteur est filtré et on obtient 16 ml d’extrait. L’extrait est ensuite traité par évaporation à sec afin de le concentrer au maximum, suivant la procédure d’analyse des saponines (vu précédemment page XX § XX). Tare du bécher = 46,4365 g Soit la masse de l’extrait sec : XX - 46,4365 = XX g Durée de la 2ème extraction : 1h30 30 ml de solvant frais sont ajoutés. XX ml d’extrait sont obtenus. Tare du bécher = 46,8990 g Soit la masse de l’extrait sec : 45,6731 - 45,42 = 0,2531 g

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b) Extraction avec 40% d’éthanol à 45°C

Durée de la 1ère extraction : 1h30 Tableau 8 : Masse de pesé exacte

Tamis (mm) Masse (g) > 2,5 1,0226 > 2 0,2537

> 1,25 1,2977 > 1 0,4258

Total = 2,9998 Tare du réacteur 6 = 116,2347 g Calcul des pertes lors de la manipulation des plantes séchées et coupées : 119,2321 - 116,2347 = 2,9974 g Soit à partir des 2,9998 g au départ : 2,9998 - 2,9974 = 2,4.10-3 g, ce qui représente 0,08% de pertes liées aux manipulations de pesé. Une fois la 1ère extraction terminée, le contenu du réacteur est filtré et on obtient XX ml d’extrait. L’extrait est ensuite traité par évaporation à sec afin de le concentrer au maximum, suivant la procédure d’analyse des saponines (vu précédemment page XX § XX). Tare du bécher = 46,3549 g Soit la masse de l’extrait sec : XX - 46,3549 = XX g Durée de la 2ème extraction : 1h30 30 ml de solvant frais sont ajoutés. XX ml d’extrait sont obtenus. Tare du bécher = 60,4238 g Soit la masse de l’extrait sec : XX - 60,4238 = XX g

c) Extraction avec 60% d’éthanol à 45°C Durée de la 1ère extraction : 1h30 Tableau 6 : Masse de pesé exacte

Tamis (mm) Masse (g) > 2,5 1,0223 > 2 0,2538

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> 1,25 1,2978 > 1 0,4260

Total = 2,9999 Tare du réacteur 7 = 83,4197 g Calcul des pertes lors de la manipulation des plantes séchées et coupées : 86,4176 - 83,4197 = 2,9979 g Soit à partir des 2,9999 g au départ : 2,9999 - 2,9979 = 2.10-3 g, ce qui représente 0,0667% de pertes liées aux manipulations de pesé. Une fois la 1ère extraction terminée, le contenu du réacteur est filtré et on obtient XX ml d’extrait. L’extrait est ensuite traité par évaporation à sec afin de le concentrer au maximum, suivant la procédure d’analyse des saponines (vu précédemment page XX § XX). Durée de la 2ème extraction : 1h30 30 ml de solvant frais sont ajoutés. XX ml d’extrait sont obtenus.

d) Extraction avec 70% d’éthanol à 45°C Durée de la 1ère extraction : 1h30 Tableau 7 : Masse de pesé exacte

Tamis (mm) Masse (g) > 2,5 1,0225 > 2 0,2536

> 1,25 1,2977 > 1 0,4261

Total = 2,9999 Tare du réacteur 8 = 108,5698 g Calcul des pertes lors de la manipulation des plantes séchées et coupées : 111,5691 - 108,5698 = 2,9993 g Soit à partir des 2,9999 g au départ : 2,9999 - 2,9993 = 6.10-4 g, ce qui représente 0,02% de pertes liées aux manipulations de pesé. Une fois la 1ère extraction terminée, le contenu du réacteur est filtré et on obtient XX ml d’extrait. L’extrait est ensuite traité par évaporation à sec afin de le concentrer au maximum, suivant la procédure d’analyse des saponines (vu précédemment page XX § XX).

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Durée de la 2ème extraction : 1h30 30 ml de solvant frais sont ajoutés. XX ml d’extrait sont obtenus. Optimisation des paramètres opératoires : Mise en évidence des saponines : 1ère extraction : On réalise une sélection des plantes afin de récupérer la partie aérienne de la plante. C’est en effet dans les fleurs que se trouvent les saponines. Nous avons utilisé des tamis pour séparer les différents éléments de la plante. Une analyse granulométrique est réalisée à partir des plantes séchées que l’entreprise a reçu de l’exploitation. Un tamiseur est utilisé pour faciliter la séparation des éléments. Le champ de dispersion s’étend de 2,50 à 0,80 mm. Les tamis utilisés sont répartis de la façon suivante : 2,50 > 2,00 > 1,25 > 1,00 > 0,80. Dans les conditions de laboratoire nous prendrons 30 g de solide avec 250 ml de solvant. Pour cette première analyse le solvant utilisé est de l’eau. De plus, seulement 15,2 g de solide et 125 ml d’eau permettront cette première extraction. Le mélange est porté à 90°C pour faciliter la macération et le passage des composants dans l’eau. Après 2 heures, l’extrait est refroidi et filtré. On concentre l’extrait à l’aide du procédé Soxlet puis on évapore l’eau restante à sec en utilisant un bain marie. Un solide brunâtre est obtenu, que l’on placera à l’étuve puis dans un excitateur pendant 48 heures. Filtration Buchner après la 1ère extraction. Masse du solide avec le bécher et l’agitateur : 119,07 g (Tare 117,33 g) Soit la masse du solide obtenu = 1,74 g Ajout de 5 ml de méthanol et de 5 ml d’eau chaude pour commencer. On agite jusqu’à l’obtention d’une solution homogène. On chauffe pour accélérer l’homogénéisation de la solution. On utilise une ampoule à décanter pour séparer les 2 phases. La phase légère est soluble avec le chloroforme. On laisse décanter pendant une vingtaine de minutes, afin d’obtenir dans la phase aqueuse, les saponines et encore quelques impuretés. Dans la phase organique nous avons le chloroforme et le méthanol. La couleur brunâtre est lavée et récupérée dans la phase organique. Nous avons ajouté 20 ml de chloroforme afin d’observer plus nettement la dispersion. On obtient 3 phases.

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A chercher :

• Fiche toxicologique du Chloroforme CHCl3 : solubilité, T°C, risques… • acide acétique = acide éthanoïque • Méthanol = alcool méthylique • Acétone C3H60 • Acétate d’éthyle C4H8O2 = éthanoate d’éthyle • Flavonoïdes

Masses des phases (avec bécher) :

1. Masse de saponine = 58,01 g (Tare = 46,62 g) soit 11,39 g. 2. Masse de chloroforme en excès (couleur jaune) = 85,75 g (Tare = 46,35 g)

soit 39,40 g. 3. Masse des composé (couleur brunâtre) = 70,32 g (Tare = 46 g) soit 24,32 g.

Lavage des fractions de chloroforme par l’éthyle acétate C4H8O2 jusqu’à l’obtention d’une couleur transparente pour chasser les flavonoïdes. Pour une première expérience, on utilisera une quantité supérieure à 3 fois celle de la phase à laver soit environ 30 ml d’éthyle acétate. Produit sec (masse de l’enveloppe 6,2 g). Soit une masse de solide sec après une 1ère extraction de 11,05 g. Pb de pertes au niveau du bilan de matière > pertes lors de la filtration. 2ème extraction (expérimentation) : 10 x 100 pour 1 kg. Masse du ballon 179,2 g 1ère extraction : 30 g de solide avec 250 ml d’eau (solvant). Quantité d’extrait : 134 ml 205,9 g avec le bécher (solide humide) 2ème extraction : solide humide avec 100 ml d’eau. Quantité d’extrait : 63 ml Quantité d’eau évaporée pour la 1ère extraction : 82 ml Quantité d’eau évaporée pour la 2ème extraction : 52 ml VII. Conclusion et perspectives

Le stage en entreprise constitue un véritable tremplin dans le milieu professionnel et permet d’envisager des perspectives pour le post-DUT. Au cours de ce stage, j’ai pu

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mettre en a pplication des connaissances apprises pendant les deux années de formation. Le fait d’avoir pu réaliser le stage en Bulgarie m’a permis de découvrir d’autres méthodes de travail et de partager nos points de vue sur les différentes façons de faire. Outre la barrière de la langue, j’ai compris au cours de ces 13 semaines Lexique

A

B

Blister Il s’agit d’un mot d’origine anglaise désignant à l'origine les ampoules en verre à usage médical mais aussi les plaquettes en aluminium thermoformé destinées au conditionnement des médicaments sous forme de gélules ou pastilles pour un usage unique.

C

D

E

F

G

H

HACCP Le système d'analyse des dangers et de maîtrise des points critiques, en abrégé système HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point), est une méthode de maîtrise de la sécurité sanitaire des denrées alimentaires élaborée avec le concours d'une entreprise privée (aux États-Unis d'Amérique) par un

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laboratoire dépendant de la NASA avec le concours de la firme Pillsbury dès 1959 dont l'objectif est la prévention, l'élimination ou la réduction à un niveau acceptable de tout danger biologique, chimique et physique. Pour ce faire, la démarche consiste en une analyse des dangers permettant la mise en place de points critiques à maîtriser. Élaboré par des experts grâce à une collaboration internationale au fil des ans, le système HACCP est bon exemple de "norme" qui s'est développé à côté des États et des administrations réglementaires qui l'ont ensuite adopté. De fait, cet outil qui est devenu un standard ou plus précisément une norme-concept, et non pas une norme au sens français du terme, est désormais imposée par les différents règlements des autorités européennes pour l'hygiène alimentaire.

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Lyophilisateur Le lyophilisateur est une machine permettant de dérouler un processus de lyophilisation. La lyophilisation consiste à ôter l'eau d'un produit liquide, pâteux ou solide (principalement des aliments ou produits pharmaceutiques), à l'aide de l'action combinée du froid et du vide. Le principe de base est que lorsqu'on réchauffe de l'eau à l'état solide à très basse pression, l'eau se sublime, c’est-à-dire qu'elle passe directement de l'état solide à l'état gazeux. La vapeur d'eau (ou de tout autre solvant) quitte le produit et on la capture par congélation à l'aide d'un condensateur ou piège. Cette technique permet de conserver à la fois le volume et l'aspect du produit traité mais reste très onéreuse d’un point de vue énergétique.

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Lyse :Verruqueux : Bibliographie Documents [dx] Informations sur les saponines : Informations sur le Tribestan© : [d1] Dicova, N., V. Ognyanova : Pharmalogical studied of Tribestant. Scientific Technical Report, 1980. [d2] Krasteva, M., Kincheva, S. Zazkava, S. Ilieva : Studies of possible mitogenic. Tanev, G., S. Zarkova : Toxicological studies on Tribestan. Scientific Technical Report, 1981. [d3] Brochure Tribestan, Sopharma [d4] Procédure d’extraction des saponines à partir de la plante Herba Astragali, I. Seikova. [d5] The Jouranl of Biological Chemistry, Steroidal Sapogenins, Extraction, isolation and identification, Monroe E. Wall, Merle M. Krider, Edward S. Rothman, C. Roland Eddy, the Eastern Regional Research Laboratory, Philadelphia, Pennsylvania, 1952. [d6] Journal oh the Science of Food and Agriculture, n°85:406-412, Microwave-assisted extraction of bioactive saponins from chickpea (Cier arietinum L), 2005. [d7] Treatment of vulvovaginitis with spirostanol enriched extract from Tribulus Terrestris, Alex Brian, Santa Monica, California, 2003. [d8] Main data of manufacturing and testing, Multi-function extracting technology. [d9] [d10] [d11] [d12] [d13] [d14] [d15] Sites internet [sx] Informations sur les saponines : [s1] fr.wikipedia.org/wiki/Saponine www.universalis-edu.com

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Informations constructeurs : www.pharmpackaging.com www.sunkingpm.com www.eunde-verfahrenstechnik.de/extraction Photographies et images [px] [p1] Plante Terrestris Tribulus L., upload.wikimedia.org/wikipedia/fr/5/5c/Tribule.jpg [p2] Drapeau sous forme géographique de la République de Bulgarie, www.lexilogos.com/images/bulgarie_drapeau.jpg [p3] Blason de la Bulgarie, upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d4/Bulgaria_coa.png [p4] Eglise russe Saint-Nicolas, Sofia. [p5] Drapeau bulgare. [p6] Cathédrale Saint-Alexandre-Nevski, Sofia. [p7] Carte de la Bulgarie, www.vacanceo.com/cartes/78-bulgarie.html [p8] Logo de l’entreprise Arcadia Herba Ldt., www.arcadia-herba.com Table des figures et tableaux Figure 14 : Carte de la Bulgarie, page Figure 2 : Logo de l’entreprise Arcadia Herba Ldt., page Figure 3 : Site de production Arcadia Herba Ldt., page Figure 4 : Organisation de l’entreprise, page Figure 5 : Tribulus Terrestris L., page Figure 6 : Bourgeon du Tribulus Terrestris L., page Figure 7 : Bourgeon du Tribulus Terrestris ou "dents de grand-mère", page Figure 8 : Molécule du composé actif saponine, page Tableau 1 : Tableau 2 : Table des annexes Annexe I : Carte de l’Union Européenne (Europe des 27, au 1er janvier 2007), en rouge : la Bulgarie, page Annexe II : Annexe III : Annexe IV : Annexe V : Annexe VI : Annexe VII :

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Annexe VIII : Annexe IX : Annexe X : Annexe XI : Annexe XII : Annexe XIII : Annexe XIV : Annexe XV : Annexe XVI : Annexe XVII : Annexe XVIII : Annexe I : Carte de l’Union Européenne (Europe des 27, au 1er janvier 2007), en rouge : la Bulgarie

Annexe II : Tableau des résultats de l’analyse granulométrique

Analyses (g)

Tamis (mm) 1 2 3 4 5

> 2,5 7,05 23,69% 6,39 21,46% 6,67 22,36% 7,77 26,12% 7,88 26,50%

> 2 1,14 3,83% 1,43 4,80% 1,85 6,20% 1,89 6,35% 2,19 7,36%

> 1,25 7,59 25,50% 10,23 34,35% 9,89 33,15% 9,36 31,46% 10,26 34,50%

> 1 3,64 12,23% 2,5 8,39% 2,75 9,22% 2,93 9,85% 2,6 8,74%

> 0,8 2,79 9,38% 2,53 8,50% 2,6 8,72% 2,63 8,84% 2,18 7,33%

Poussières < 0,8 7,55 25,37% 6,7 22,50% 6,07 20,35% 5,17 17,38% 4,63 15,57%

Masse totale = 29,76 g 100% 29,78 g 100% 29,83 g 100% 29,75 g 100% 29,74 g 100%

Analyses (g)

Tamis (mm) 6 7 8 9 10

> 2,5 6,54 22,08% 7,17 24,12% 7,99 26,88% 7,21 24,26% 7,76 26,11%

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> 2 2,02 6,82% 2,43 8,17% 1,65 5,55% 1,91 6,43% 1,47 4,95%

> 1,25 8,7 29,37% 8,29 27,88% 9,5 31,97% 9,51 32,00% 8,61 28,97%

> 1 3,02 10,20% 3,63 12,21% 3,07 10,33% 2,69 9,05% 3,35 11,27%

> 0,8 2,62 8,85% 2,75 9,25% 2,61 8,78% 2,57 8,65% 2,6 8,75%

Poussières < 0,8 6,72 22,69% 5,46 18,37% 4,9 16,49% 5,83 19,62% 5,93 19,95%

Masse totale = 29,62 g 100% 29,73 g 100% 29,72 g 100% 29,72 g 100% 29,72 g 100%

Annexe II : Pourcentage massique des 4 fractions utiles

Tableau des pourcentages massiques avec les poussières :

Tableau des pourcentages massiques sans les poussières :

Tamis (mm) Moyenne > 2,5 24,36% > 2 6,05%

> 1,25 30,92% > 1 10,15%

Total = 71,47%

Tamis (mm) Moyenne > 2,5 34,08% > 2 8,46%

> 1,25 43,26% > 1 14,20%

Total = 100%

Application numérique : %08,3410047,7136,24

=× ; %46,810047,7105,6

=× ;

%26,4310047,7192,30

=× ; %20,1410047,7115,10

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Annexe IV : Schéma procédé de l’installation de l’extraction

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Annexe VI : Schéma procédé de l’extracteur (cuve d’extraction)

Légende :

1. Canalisation de rejet de vapeur 2. Sortie d’air / mise à l’atmosphère 3. Sortie d’eau de refroidissement 4. Condenseur de 3 m3 5. Entrée d’eau de refroidissement 6. Pot de recette / collecteur 7. Séparateur eau/huile 8. Sortie d’huile volatile 9. Moteur de l’agitateur de puissance 1,5 kW 10. Entrée d’eau dans l’extracteur ou autre solvant 11. Entrée d’eau de lavage de la cuve d’extraction 12. Entrée des produits pour la charge de l’extracteur 13. Entrée de la vapeur dans la chemise de l’extracteur 14. Sortie de l’extrait liquide après passage du filtre dans la cuve 15. Sortie d’eau condensée

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Annexe VII : Schéma de procédé de l’évaporateur

Légende :

1. Bouilleur (surface de chauffe 4 m²), l’extrait concentré est récupéré en bas du bouilleur.

2. Evaporateur 3. Condenseur horizontal (surface de refroidissement 3 m²) 4. Condenseur vertical (surface de refroidissement 7 m²) 5. Pot de récupération du solvant (eau ou éthanol)

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Annexe XI : Photographies de la fabrication de l’installation en Chine

Vue générale de l’installation en cours de montage

Pot de recette de l’extrait concentré en sortie de l’évaporateur

Assemblage des différents éléments constitutifs

de l’installation

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Annexe XII : Photographie du site d’exploitation Arcadia Herba Ldt.

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Annexe VII : Fiche toxicologique de l’éthanol Annexe XII : Fiche toxicologique du chloroforme Annexe XVII : Fiche toxicologique de l’acétone Annexe XVI : Fiche toxicologique de l’éthyle acétate Annexe VII : Fiche toxicologique du méthanol