Hindawi Publishing Perusahaan

Hindawi Publishing Perusahaan

Bukti Berbasis Pelengkap dan Pengobatan Alternatif

Volume 2012, ID Artikel 515901, 11 halaman

doi: 10,1155 / 2012/515901

penelitian Pasal

Flavonoid Terisolasi dari Korea Citrus aurantium L. Menginduksi G2 / M

Tahap Penangkapan dan Apoptosis di Human Lambung Kanker AGS Sel

Do-Hoon Lee, 1 Kwang-Il Park, 1 Hyeon-Soo Park, 1 Sang-Rim Kang, 1

Arulkumar Nagappan, 1 Jin-A Kim, 2 Eun-Hee Kim, 3 Won-Sup Lee, 4

Muda-Sool Hah, 5 Hyon-Jong Chung, 1 Su-Jin An, 1 dan Gon-Sup Kim1

1Research Institut ilmu Hidup dan College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, Gazwa,

Jinju 660-701, Republik Korea

2Korea Nasional Pusat Penelitian Sumber Daya Hewan dan Korea National Animal Bio-sumber daya Bank, Gyeongsang National University,

Gazwa, Jinju 660-701, Republik Korea

3Department Ilmu Keperawatan, Universitas Internasional Korea, Jinju 660-759, Republik Korea

4Department of Internal Medicine, Institut Ilmu Kesehatan, Gyeongsang National University School of Medicine dan

Gyeongnam Regional Cancer Center, Gyeongsang National University Hospital, Jinju 660-702, Republik Korea

5 Clinical Research Institute, Gyeongsang National University Hospital, Jinju 660-702, Republik Korea

Korespondensi harus ditujukan kepada Gon-Sup Kim, gonskim@gnu.ac.kr

Menerima 5 Agustus 2011; Diterima 14 September 2011

Akademik Editor: Jae Youl Cho

Hak Cipta 2012 Do-Hoon Lee et al. Ini adalah sebuah artikel akses terbuka didistribusikan di bawah lisensi Creative Commons Attribution,

yang memungkinkan penggunaan tak terbatas, distribusi, dan reproduksi dalam media apapun, asalkan karya asli dikutip benar.

Tujuan dari studi. Berbagai spesies jeruk telah banyak digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai obat herbal di beberapa negara Asia termasuk Korea.

Flavonioids dikenal memiliki banyak aktivitas farmakologis, seperti anti-oksidan, anti-inflamasi dan anti-kanker, dan sebagainya. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis, efek anti-kanker dari flavonioid yang diisolasi dari Citrus aurantium L. sel kanker yang dianalisis adalah sel kanker lambung (AGS) pada manusia. Bahan dan Metode. Aktivitas anti-proliferasi diuji menggunakan prosedur uji MTT. Analisis siklus sel dilakukan menggunakan sitometri dan deteksi apoptosis dilakukan dengan menggunakan proses pewarnaan ganda dengan zat warna fluoresens (Hoechst) dan Annexin V-propidium iodida. Metode Western blot digunakan untuk mendeteksi hasil ekspresi protein yang terkait dengan siklus sel dan apoptosis. Hasil. Flavonoid yang terisolasi dari Citrus aurantium L. memiliki efek anti proliferasi pada sel AGS dengan nilai IC50 dari 99 ug / mL. Flavonoid juga dapat menghambat siklus sel di G2 / M fase dan menurunkan tingkat ekspresi cyclin B1, CDC 2, CDC 25c. Flavonoid menginduksi proses apoptosis dengan mekanisme pengaktifan caspase dan penonaktifkan PARP. Kesimpulan. Flavonoid yang diisolasi dari Citrus aurantium L. Akan menginduksi reseptor G2 / M melalui modulasi siklus sel protein terkait dan apoptosis melalui aktivasi caspase. Dapat disimpulkan bahwa flavonoid yang diisolasi dari Citrus aurantium L. adalah salah satu senyawa yang berguna untuk pengobatan dan kemoprevensi kanker lambung.

Pendahuluan

Buah jeruk merupakan sumber makanan yang sangat populer karena kandungan gizi, rasa, dan atribut intrinsik yang dimilikinya, serta telah sejak lama sering digunakan dalam obat tradisional pada beberapa negara Asia. Kulit buah jeruk yang belum matang dapat menghasilkan senyawa yang dapat digunakan untuk mengobati gangguan pencernaan dan telah menunjukkan potensi sebagai senyawa yang dapat dimanfaatkan dalam kemoterapi. Salah satu nutrisi yang terkandung dalam buah jeruk, flavonoid baru-baru ini telah diakui memiliki berbagai manfaat untuk pengobatan, seperti antioksidan, antimikroba, anti-inflamasi, dan antikanker. Buah jeruk memiliki banyak kandungan flavonoid aktif seperti naringin, naringenin, narirutin, nobiletin, quercetin, kaempferol, hesperidin, neohesperidin, didymin, dan poncirin, secara khusus, naringin, nobiletin, dan hesperidin menampilkan efek antikanker melalui mekanisme penangkapan siklus sel dan apoptosis. Kanker lambung adalah kanker paling umum di Korea. Menurut data statistik Departemen Kesehatan dan Kesejahteraan, ada 28.078 kasus kanker lambung di Korea pada tahun 2008, yang mewakili 15,7% dari semua kasus kanker di negara ini. Secara global, Kanker lambung adalah kanker utama yang menjadi penyebab kematian terkait kanker, setelah kanker paru-paru. Pengobatan kanker lambung umumnya terdiri dari operasi, kemoterapi, dan / atau radiotherapy. While perawatan

bisa efektif, sekitar setengah dari pasien kanker lambung yang tidak dapat diobati [11]. Kebutuhan formore pengobatan yang efektif adalah menekan.

Diprogram mekanisme kematian sel yang apoptosis adalah regulator utama proliferasi sel dan merupakan fokus penelitian kanker sebagai cara yang efektif untuk menghilangkan prakanker dan / atau sel-sel kanker [1]. Caspases memainkan penting

peran dalam apoptosis; berlebih dan belahan dada mereka adalah prekursor apoptosis pada sel mamalia. Sampai saat ini, 14 caspases telah diidentifikasi berdasarkan fungsinya. Mereka merupakan tiga kelompok fungsional: caspases inflamasi (caspase-1, -4, dan -5), caspases inisiator apoptosis (caspase-2, -8, -9, dan -10), dan caspases efektor apoptosis (caspase-3, -6, dan -7) [12]. Caspases memiliki zymogens aktif yang terdiri dari P20 (besar) dan p10 (kecil) subunit. Menanggapi sinyal apoptosis, yang zymogens aktif yang dibelah, menghasilkan bentuk aktif dari protein yang berkaitan dengan induksi apoptosis [13]. Juga, Bcl-2 keluarga protein, yang aktivitasnya diarahkan untuk bertindak di mitokondria membran luar, adalah regulator utama apoptosis. The Bcl-2 keluarga terdiri dari proapoptotik dan antiapoptotik anggota [14]. Apoptosis Bcl-2 protein seperti Bax dan Bak menciptakan pori-pori di outermembrane themitochondrial, melalui yang sitokrom c dilepaskan ke sitosol. Pengikatan sitokrom c untuk Apaf-1 menciptakan sebuah kompleks apoptosome yang mengaktifkan caspase-9, yang pada gilirannya mengaktifkan caspase-3. antiapoptotik Bcl-2 protein seperti Bcl-2 dan Bcl-xL mempertahankan struktur membran mitokondria melalui interaksi dengan apoptosis Bcl-2 protein [15].

Penangkapan siklus sel juga merupakan regulator utama proliferasi sel. Pada sel eukariotik, siklus sel terdiri dari G1,S, G2, dan M fase. Pemeriksaan untuk siklus hadir di G1 dan G2 fase. Dalam perkembangan siklus sel, siklin dan kinase tergantung cyclin (cdks) memainkan peran sentral sebagai regulator. Pada fase pertengahan G1, progresi siklus sel dikendalikan oleh cyclin D-Cdk4 / cdk6 kompleks. Pada akhir-G1, perkembangan dikendalikan oleh cyclin E-Cdk2 kompleks. Di fase G2, progresi siklus sel dikendalikan oleh cyclin A / B-kompleks Cdc2 [16-18]. Kerusakan DNA dapat menghambat proliferasi sel oleh inaktivasi siklin dan cdks dan

penangkapan siklus sel berikutnya.

Seperti disebutkan sebelumnya, flavonoid diisolasi dari Citrus aurantiumL. memiliki antikanker effect.However, themechanisms aktivitas antikanker dari Korea Citrus aurantium L. masih tetap tidak diketahui. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa flavonoid diisolasi fromKorea Citrus aurantiumL. Penyebab penangkapan siklus sel dan apoptosis pada kanker lambung AGS manusia sel. Tingkat ekspresi beberapa protein penting adalah terbukti sangat terkait dengan siklus sel dan apoptosis. Akhirnya, terjadinya penangkapan siklus sel dan apoptosis adalah bertekad untuk memastikan mekanisme antikanker dari flavonoid yang terisolasi.

2.Materials andMethods

2.1. Antibodi dan Reagen. Cyclin B1, CDC 2, CDC 25c, dan -aktin dibeli fromMillipore (Billerica, MA, USA). Antibodi untuk Bcl-xL, Bax, dibelah poli (ADP-ribosa) polimerase (PARP), dan caspases-3, -6, -8, dan -9 dibeli dari Sel Signaling Teknologi (Danvers, Mass, USA). Lobak peroxidase- (HRP-) ditambah kambing anti-tikus IgG dan anti-kelinci IgG yang dibeli dari Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). RPMI-1640 adalah dibeli dari HyClone (Logan, UT, USA). janin sapi serum (FBS) dan antibiotik (streptomycin / penisilin) yang dibeli dari Gibco (BRL Life Technologies, Grand Island, NY, USA). 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-il) -2,5-dephenyltetrazolium bromide (MTT), dimetilsulfoksida (DMSO), dan RNase A diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Isothiocyanate fluorescein (FITC) annexin-V Deteksi apoptosis kit 1 dibeli dari BD PharMingen (San Diego, CA, USA). peningkatan chemiluminescence

(ECL) kit dibeli dari Amersham Life Science (Buckinghamshire, Inggris). Bahan dan bahan kimia yang digunakan untuk elektroforesis diperoleh dari Bio-Rad Laboratories (Hercules. CA, USA).

2.2. Isolasi Flavonoid. Analisis isolasi flavonoid dilakukan di Departemen Kimia, Gyeongsang National University oleh Profesor Sung Chul Shin. Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dilakukan sebagai descried. Secara singkat, analisis HPLC adalah dilakukan dengan menggunakan sistem LC 1100 seri diinstal dengan G1322A degasser, pompa G1312A, autosampler G1313A, dan oven G1316A (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Pemisahan kromatografi dilakukan pada kolom Zorbax StableBond Analytical SB-C18 (4,6 250mm, 5 m; Agilent Technologies). Pelarut biner Sistem ini terdiri dari 0,1% asam format berair (A) dan metanol / asetonitril (1: 1) (B). Elusi dilakukan menggunakan gradien linier (0% -25% B) lebih 10 menit dan 40% -70% B selama 10 menit, diikuti oleh 30 menit dari elusi isokratik,

menurun dari 40% -25% B lebih 5 menit dan diikuti dengan10 menit dari elusi isokratik. Laju aliran adalah 0,5 mL / menit suhu kolom 35C dan volume infus dari 10 uL dalam setiap percobaan. Data kromatografi yang dikumpulkan dan dikendalikan dengan menggunakan ChemStation, Rev.B.0301 (Agilent Technologies). Data spektral dikumpulkan (200-400nm, resolusi 2nm) untuk seluruh perkembangan, dan flavonoid yang diukur dengan mengekstraksi setiap kromatogram pada 280 nm (Gambar 1). Semua flavanon dan flavon yang diukur dengan menggunakan kurva kalibrasi eksternal hesperetin dan nobiletin, masing-masing. Spektrometri massa tandem (MS / MS) Percobaan dilakukan dengan menggunakan 3200QTRAP sebuah LC-MS / MS sistem (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dengan Turbo V-sumber dan Semprot penyelidikan Turbo Ion (Applied Biosystems). Spektrometer massa dioperasikan dalam modus positif dengan pemantauan ion terpilih (SIM), BioAnalyst, versi 1.4.2 (AB Sciex, Zagreb, Kroasia). Itu elektron tegangan semprot ditetapkan pada 5,2 kV dan sumber Suhu di 500C. Spektrum massa dicatat antara m / z 100 dan m / z 1000 dengan ukuran langkah 0,06 Amu.

2.3. Budaya sel. AGS sel kanker lambung manusia diperoleh dari Korea Sel Baris Bank (Seoul, Korea) dikultur.Bukti Berbasis Pelengkap dan AlternativeMedicine

Gambar 1: pola kromatogram HPLC dari Korea Citrus aurantium L. pada 280 nm. (1) naringin, (2) hesperidin, (3) poncirin, (4) isosiennsetin,(5) hexamethoxyflavone, (6) sineesytin, (7) hexamethoxyflavone, (8) tetramrthnl-o-isoscutellaeein, (9) nobiletin, (10) hepta methoxyflavone,(11) 3-hydoxynobiletin, (12) tangeretin, (13) methoxyflavone hydroxypent, dan (14) hexamethoxyflavone.di medium RPMI-1640 ditambah dengan 10% panas dilemahkan serum janin anak sapi dan 100 mg / ml penisilin dan streptomisin dalam suasana lembab dari 5% CO2 di 37C.

2.4. Sel Viabilitas Assay dan morfologi Pemeriksaan.Viabilitas sel ditentukan dengan menggunakan MTT 24 jam setelah perlakuan eksperimental. Secara singkat, sel berlapis dalam sumur piring 12-baik dan diinkubasi selama 24 jam pada 37C. Sel yang tidak diobati atau diobati dengan berbagai konsentrasi flavonoid (10, 50, 100, 150, dan 200 mg / mL) selama 24 jam pada 37C. DMSO (0,1%) digunakan sebagai kontrol kendaraan. solusi MTT (5 mg / mL dalam fosfat buffer saline; PBS) terdilusi menjadi 0.5mg / mL oleh media. Setelah 3 jam inkubasi pada 37C, MTTcontaining media telah dihapus dan kristal yang telah dibentuk dilarutkan dengan penambahan DMSO untuk masing-masing baik. Setelah pencampuran, absorbansi sel diukur di 540Nm dengan menggunakan uji enzyme-linked immunosorbent pembaca piring. Untuk pemeriksaan morfologi, sel-sel yang tumbuh di piring 6-baik, diperlakukan dengan flavonoid selama 24 jam, dan kemudian diperiksa di bawah mikroskop cahaya ( 400).

2.5. Hoechst 33258 Fluorescent Pewarnaan. Sel AGS dari eksponensial budaya yang berkembang yang diunggulkan dalam budaya 12-baik piring. Sel AGS yang tidak diobati atau diobati dengan berbagai konsentrasi flavonoid (20, 40, 60, 80, dan 100 mg / mL) selama 24 jam pada 37C. Sel-sel kemudian dicuci dingin saline (PBS) dan tetap dalam larutan buffer fosfat-3,7% paraformaldehyde selama 15 menit pada suhu kamar. Untuk mengidentifikasi sel AGS apoptosis, mereka bernoda dengan Hoechst 33258 (5 mg / mL dalam PBS) untuk 10 menit di kamar temperatur. Struktur inti sel diperiksa oleh Leica mikroskop fluoresensi. Sel-sel apoptosis yang diamati pada pembesaran 1000x.

2.6. Analisis Siklus sel. Setelah mencapai 70% -80% pertemuan, Sel AGS yang tidak diobati atau diobati dengan berbagai konsentrasi flavonoid (20, 40, 60, 80, dan 100 mg / mL) selama 24 jam pada 37C. Kemudian, sel-sel dicuci dua kali dengan dingin PBS, trypsinized, dan disentrifugasi. Sel-sel yang tetap di 70% (v / v) etanol selama 24 jam pada 4C. Sel-sel yang dicuci dengan PBS dan diwarnai dengan propidium iodida (PI; 50 ug / mL) termasuk RNase A (0.1mg / mL) di PBS (pH 7,4) selama 30 menit dalam gelap. Sampel PI bernoda dianalisis dengan cytometer FACScan aliran (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Dalam setiap sampel, 10.000 sel diurutkan. Data yang dianalisis menggunakan software CellQuest (Becton Dickinson).

2.7. Apoptosis Tes. Sel apoptosis dideteksi menggunakan FITC annexin-V deteksi apoptosis kit 1 (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Secara singkat, sel-sel yang tidak diobati atau diobati dengan berbagai konsentrasi flavonoid (20, 40, 60, 80, dan 100 mg / mL) selama 24 jam pada 37C. Sel-sel yang trypsinized dan dicuci dengan PBS. Sel-sel dicuci adalah disuspensi dalam Annexin-V mengikat buffer yang mengandung 10mm HEPES / NaOH, pH 7,4, 140mm NaCl dan 2.5mm CaCl2 menurut protokol pabrik. Sel-sel yang bernoda bersamaan dengan FITC-terkonjugasi Annexin-V dan PI pada suhu kamar selama 15 menit dalam gelap, sebelum penambahan buffer mengikat. Sel-sel apoptosis yang diukur dengan menggunakan aliran FACScan cytometer. Sel-sel yang diurutkan ke dalam sel utuh (Annexin V PI-), apoptosis dini sel (Annexin V + PI-), sel-sel akhir apoptosis (Annexin V +

PI +), dan sel-sel nekrotik (Annexin V PI +).

2.8. Caspase-3 Kegiatan. Caspase-3-aktivitas ditentukan oleh uji kolorimetri menggunakan caspase-3 aktivasi kit sesuai dengan protokol produsen (Millipore, Billerica, MA, USA). Secara singkat, sel-sel segaris disediakan penyangga lisis dan diinkubasi selama 10 menit di esbath. Kemudian, sampel disentrifugasi selama 5 menit dalam microcentrifuge (10.000 g). Supernatan yang dikumpulkan dan diinkubasi dengan Assay penyangga dan Caspase-3 Substrat (Ac-DEVD-PNA) untuk 1h di 37 C. Optik kepadatan campuran reaksi diukur dengan menggunakan Enzim-Linked Immunosorbent pembaca plat uji pada 405 nm.

2.9. Western Blot Analysis. Konsentrasi protein ditentukan menggunakan uji Bradford (Bio-Rad). Sebuah protein yang sama Jumlah dipisahkan oleh 12% natrium dodesil sulfatepolyacrylamide gel elektroforesis (SDS-PAGE), dan protein diselesaikan dipindahkan ke 0.45mm Immobilon- P polyvinylidene fluoride (PVDF) membran (Millipore). Setiap membran diblokir dengan TBST (10mMTris- HCl, pH 7,4, 150mm NaCl, 0,1% Tween-20) yang mengandung 5% susu kulit. Pemblokiran dilakukan selama 1 jam pada suhu kamar. Kemudian, masing-masing membran diinkubasi dengan primer antibodi (1: 1.000 pengenceran) untuk bermalam di 4C, dicuci lima kali selama 10 menit setiap kali dengan TBST, dan diinkubasi dengan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi (1: 2000 pengenceran) selama 2 jam pada suhu kamar. Setiap membran dicuci 5 kali selama 10 menit setiap kali dengan TBST. pita proteindivisualisasikan dengan ECL dan Barat Blotting Detection Reagen dan terkena film X-ray (Fuji, Tokyo, Jepang). Masing-masing band dianalisis dengan menggunakan program Image J (http: //rsb.info.nih.gov/).

2.10. Analisis Statistik. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Hasil dinyatakan sebagai mean standar penyimpangan setidaknya tiga percobaan terpisah. Statistik Analisis ditentukan dengan Tes t menggunakan SPSS versi 10.0 for Window (SPSS, Chicago, IL, USA). nilai AP