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Ruolo dei fagi nella ecologia
microbica
I fagi sono gli organismi più diffusi sul
pianeta. Il loro numero è stato stimato
intorno a 1031
Il numero dei batteri è di poco più piccolo.
I fagi controllano la moltiplicazione dei
batteri e quindi il riciclo di una enorme
massa organica.
Terapia fagica
I fagi
Twort (1915)
d’Herelle (1918)
La resistenza agli antibiotici
Il ritorno della terapia fagica
Terapia fagica: il contesto
2001
Loeffler et al., Science, 294, 2170
Nelson et al., Proc Ntl Acad Sci, USA, 98, 4107
Lisina fagica attiva contro lo Streptococcus
pnemoniae
2002
Schuck et al., Nature, 418, 884
Lisina fagica attiva contro il Bacillus antracis
Terapia fagica: il contesto2002
Cerveny et al., Inf. Immun., 70, 625
Fago attivo contro il Vibrio vulnificus
Biswas et al., Inf. Imm, 70, 204
Fago attivo contro l’Enterococcus faecium
2003
Merril et al., Nature Review Drug Discov, June 2, 489.
Loeffler et al. Inf. Immun. 71, 6199
Lisina fagica attiva contro lo Streptococcus pneumoniae
Campbell A. Nature Review Genetics, 4, 471.
2004
Schoolnick G., Summers W. J.
Watson. Nature Biotechnology 22,
506
Projan S. Nature Biotechnology 22,
167
Thiel K. Nature Biotechnology, 22,
31
Fischetti V. Lancet, The Lancet
Infectious Diseases, 4, 246.
Dixon B. The Lancet Infectious
Diseases 4, 186.
Terapia fagica: il contesto
Fagi attivi contro batteri
intracellulari
Broxmeyer et al (J. Inf.Dis. 2002, 186,
1155) hanno dimostrato che è possibile
usare il Mycobacterium smegmatis, un
micobatterio avirulento, come vettore per
trasferire all’interno dei macrofagi il fago
litico TM4. Il metodo è risultato efficace in
vitro nel ridurre il numero dei micobatteri
M. avium o M. tuberculosis intracellulari.
Terapia fagica. Vantaggi rispetto agli antibiotici.
I fagi sono attivi contro ceppi batterici antibiotico-
resistenti
Ceppi vancomicina-resistenti di
Enterococcus faecium (Biswas et al.,
Infect. Immun. 2002, 70, 204).
Ceppi meticillina-resistenti di
Staphylococcus aureus (Matsuzaki et al.,
J. Infect. Dis. 2003, 187, 613).
Limiti della terapia fagica. I batteri
sviluppano resistenza contro i fagi
Il tasso con cui i batteri sviluppano resistenza ai
fagi è circa 10 volte più basso del tasso con cui
compare la resistenza agli antibiotici
(Sulakvelidze et al., Antimicrobial. Agents and
Chem., 2001, 45, 649) .
Nelson et al. (PNAS 98, 4107, 2001), Schuck et al.
(Nature, 418, 884, 2002) non sono riusciti ad isolare
batteri fago-resistenti; sono però riusciti ad isolare
facilmente batteri antibiotico-resistenti.
Diverse tossine batteriche
sono prodotte da fagi
• La tossina del Corynebacterium diphteriae.
• La tossina del Vibrio cholerae.
• La tossina Shiga dell’E. coli.
• Gli Streptococchi del gruppo A sono molto
eterogenei dal punto di vista genetico e della
virulenza. Gran parte di queste differenze sono dovute
alla presenza di batteriofagi.
Limiti della terapia fagica
I fagi vengono riconosciuti dal sistema
immune innato ed eliminati entro poche
ore dalla somministrazione
I fagi hanno un host-range ristretto.
Non danneggiano la normale flora intestinale (vantaggio)
Impiego limitato nella pratica clinica (svantaggio).
L’ingegneria genetica ha però sviluppato fagi modulari (che esprimono non uno, ma diversi recettori) in grado di infettare diverse specie batteriche (Merril et al., Nature Reviews, 2003,2, 489)
Terapia fagica
Data la straordinaria diversità dei fagi, non è
difficile isolare il fago con l’host range
desiderato.
E. coli O157:H7Ceppo non patogeno di E.coli
Terapia fagica: selezione per
l’attività litica in vitro102 PFU fW /tubo
106 CFU ceppo E. coli non patogeno
2h
102 PFU fW /tubo
107 CFU ceppo E. coli non patogeno
Dopo 10 cicli di selezione:
102 PFU fW in 2h lisano 102 CFU E. coli
102 PFU fD1 in 2h lisano 109 CFU E. coli
Terapia fagica: selezione del fago
fD1 per la persistenza nel sangue
108 PFU fD1
Titolo fagico
8h: 5x103 PFU/ml
24h: 0
Titolo del fago fD1 dopo 5 cicli di selezione:
18 h: 4x103 PFU/ml
Protocollo 1
Terapia fagica. Selezione del fago
fD1 per la persistenza nel sangueProtocollo 2
G1: 108 PFU fD1/topo G1: 108 PFU fD1/topo
G1: 109 CFU E. coli non pat/topo
Titolo fD2 nel sangue al G 38:
4x108 PFU/ml
G1: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo
G2: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo
G3: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo
G4: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo
Titolo fD2 nel sangue al G 38:
7x109 PFU/mlMerril et al. (Proc Ntl Acad Sci, USA, 1996, 93, 3188):
2x103 PFU/ml a 24h (inoculo iniziale: 5x107 PFU)
L’efficacia della selezione è il
risultato della:
Brevità delle generazioni (di fagi e batteri)
Elevata densità delle popolazioni (di fagi e
batteri)
Aploidia (che consente ad una mutazione di
esprimersi anche se in copia singola)
Somministrazione ai topi del ceppo non
patogeno di Escherichia coli (che ha
consentito alla popolazione fagica di
espandersi esponenzialmente)
Terapia fagica. Storia naturale del fago
fW.
fW (il fago selvaggio, isolato dal letame)
fD1 (fW selezionato rispetto alla virulenza)
fD2 (fD1 selezionato rispetto alla persistenza nel
sangue)
Distribution of phage fW and fD2 in vivoa 1
Titer (PFU/gr) Titer (PFU/ml)
Phage Time (h) Liver Spleen Blood
fWb
6
3.3 x 107
± 1.1 x 107
3.0 x 107
± 2.6 x 107
1.8 x 104
± 1.0 x 104
fD2b
6
0
0
3.2 x 106
± 1.0 x 106
2
a Values are means ± s.d. of three replicas. 3
b Phage number inoculated at time 0: 10
8 PFU/mouse. 4
Distribution of phage fW and fD2 in vivoa 1
Titer (PFU/gr) Titer (PFU/ml)
Phageb Time (h) Liver Spleen Blood
fW
24
3.6 x 106
± 1.5 x 106
3.3 x 106
± 1.5 x 106
0
fD2
24
0
0
1.3 x 107
± 0.6 x 107
2
a Values are means ± s.d. of three replicas. 3
b Phage number inoculated at time 0: 10
8 PFU/mouse. 4
Distribution of phage fW and fD2 in vivoa 1
Titer (PFU/gr) Titer (PFU/ml)
Phage Time (h) Liver Spleen Blood
fW
48
3.4 x 108
± 1.2 x 108c
3.9 x 108
± 1.3 x 108c
0
fD2
48
0
0
1.9 x 108
± 0.5 x 108c
2
a Values are means ± s.d. of three replicas. 3
b Phage number inoculated at time 0: 10
8 PFU/mouse. 4
c Phage replicate in vivo, presumably infecting E.coli bacteria present 5
in the intestinal tract. 6
Terapia fagica. Stabilità del fago fD2.
fD2 ha conservato per oltre 8 mesi il
livello di virulenza e persistenza acquisiti
attraverso la selezione. Nel corso di questi
mesi è stato amplificato e congelato
infinite volte.
Terapia fagica. fW ed fD2 sono
imparentati tra loro.
fW e fD2 analizzati con 6 diversi random primers
fW fW fW fW fW fW
fD2 fD2 fD2 fD2 fD2 fD2
M M
Terapia fagica. Selezione del fago
fD1 per la persistenza nel sangueProtocollo 2
G1: 108 PFU fD1/topo G1: 108 PFU fD1/topo
G1: 109 CFU E. coli non pat/topo
Titolo fD2 nel sangue al G 38:
4x108 PFU/ml
G1: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo
G2: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo
G3: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo
G4: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo
Titolo fD2 nel sangue al G 38:
7x109 PFU/mlMerril et al. (Proc Ntl Acad Sci, USA, 1996, 93, 3188):
2x103 PFU/ml a 24h (inoculo iniziale: 5x107 PFU)
Antibacterial activity of phage fW and fD2 in vivoa
1
Bacterial titer (CFU/gr)
Treatment Time (h) Liver Spleen Kidney Faeces
E. coli O157:H7b
6
3.7 x 108
± 1.2 x 108
3.5 x 108
± 1.2 x 108
4.2 x 108
± 1.7 x 108
4.5 x 108
± 2.4 x 108
E. coli O157:H7b
+ fWc
6
7.3 x 107
± 2.1 x 107
1.7 x 107
± 0.6 x 107
4.2 x 107
± 1.7 x 107
2.8 x 107
± 1.5 x 107
E. coli O157:H7b
+ fD2c
6
2.7 x 106
± 2.1 x 106
3.3 x 106
± 1.5 x 106
4.7 x 106
± 1.5 x 106
4.2 x 107
± 1.9 x 106
2
a Values are means ± s.d. of three replicas.
3
b 10
7 CFU/mouse. 4
c 10
8 PFU/mouse. 5
Antibacterial activity of phage fW and fD2 in vivoa
1
Bacterial titer (CFU/gr)
Treatment Time (h) Liver Spleen Kidney Faeces
E. coli O157:H7b
24
2.6 x 108
± 1.5 x 108
3.7 x 108
± 1.2 x 108
3.5 x 109
± 1.3 x 109
4.1 x 109
± 2.1 x 109
E. coli O157:H7b
+ fWc
24
1.7 x 105
± 0.3 x 105
2.4 x 105
± 0.8 x 105
11.6 x 107
± 0.2 x 107
6.0 x 105
± 1.5 x 105
E. coli O157:H7b
+ fD2c
24
7.2 x 102
± 2.5 x 102
4.2 x 102
± 3.0 x 102
3.0 x 102
± 1.5 x 102
4.2 x 102
± 3.0 x 102
2
a Values are means ± s.d. of three replicas.
3
b 10
7 CFU/mouse. 4
c 10
8 PFU/mouse. 5
Antibacterial activity of phage fW and fD2 in vivoa
1
Bacterial titer (CFU/gr)
Treatment Time (h) Liver Spleen Kidney Faeces
E. coli O157:H7b
48
5.3 x 108
± 2.5 x 108
4.2 x 108
± 1.8 x 108
7.2 x 109
± 2.5 x 109
6.0 x 109
± 2.2 x 109
E. coli O157:H7b
+ fWc
48
4.0 x 104
± 1.7 x 104
2.0 x 104
± 0.5 x 104
7.0 x 105
± 2.0 x 105
4.3 x 105
± 0.9 x 105
E. coli O157:H7b
+ fD2c
48
0
0
0
0
2
a Values are means ± s.d. of three replicas.
3
b 10
7 CFU/mouse. 4
c 10
8 PFU/mouse. 5
Terapia fagica. Attività terapeutica
del fago fD2.
Gruppo di controllo
G1 - 40 topi: 107 CFU E.coli patogeno
G5 – n° topi morti: 39/40
Gruppo sperimentale
G1 - 40 topi: 107 CFU E.coli pat + 108 PFU fD2
G10 – n° topi morti: 16/40