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� INTRODUCCIÓN

� PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCIÓN DE VITAMINAS

� EXTRACCIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES

� EXTRACCIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES

� EXTRACCIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO (VITAMINA C)

� EXTRACCIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES DE FORMA

GLOBAL

� DETERMINACIÓN DE VITAMINAS

INDICE

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS

�Primer problema: definir las sustancias involucradas

�Definición de vitamina:� Sustancia necesaria para la vida y en particular para garantizar

la salud y el crecimiento de los seres vivos� Se necesitan menos de 100 mg al día de cada vitamina. En su

conjunto representan el 0.2 % de la dieta� Se encuentran de forma natural en los alimentos o se adicionan

durante su elaboración

�Gran variedad de estructuras químicas pueden encontrarse dentrode este grupo. Clasificación muy generalista, según su solubilidad:� Vitaminas liposolubles� Vitaminas hidrosolubles

�Estructura química � métodos de determinación

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DETERMINACIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES

VIT. A (retinol)

VIT. D2 VIT. D3

VIT E (tocoferol)

VIT. K

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLESVITAMINA A

VITAMINA A(all-trans-retinol)

PRO-VITAMINA A

Se convierte en retinol mediante reacciones enzimáticas en la mucosa intestinal y el hígado

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DETERMINACIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLESVITAMINA A

DéficitDesecación de la piel, pérdida de pelo, ceguera nocturna,…

HipervitaminosisDolor de cabeza, labios sangrantes, huesos frágiles, cirrosis,…

Zanahorias2000 µg/100 g = 20 µg/g = 20 mg/kg = 20 ppm

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLESVITAMINA D

VITAMINA D2(calciferol)

Sardinas7.5 µg/100 g = 0.075 µg/g = 75 µg/kg = 75 ppb

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DETERMINACIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLESVITAMINA E

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLESVITAMINA E

Aceite de girasol55 mg/100 g = 0.55 mg/g = 550 mg/kg = 550 ppm α-tocoferol

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DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES

VIT. B2(Riboflavina)

VIT. B3(Niacina)

VIT. B6(Piridoxina)

VIT. B1(Tiamina) VIT. B9

(Acido fólico)VIT. C(Acido ascórbico)

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLESVITAMINA B1

VIT. B1(Tiamina)

DéficitPérdida de memoria, dificultad al hablar, reducción movilidad muscular…

FunciónFuncionamiento del sistema nervioso, cricimiento y mantenimiento de la piel,…

Levadura de cerveza3100 µg/100 g = 31 µg/g = 31 mg/kg = 31 ppm

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DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLESVITAMINA B2

VIT. B2(Riboflavina)

Riboflavina-5-fosfato(mononucleótido)

Riboflavina-Adenina(dinucleótido)

DéficitLesiones en piel, mucosas, ojos,…

FunciónCoenzimas que regulan procesos de transferencia de H

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLESVITAMINA B2

Levadura de cerveza2070 µg/100 g = 20.7 µg/g = 27 mg/kg = 27 ppm

EstabilidadMuy inestable fotoquímicamente

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DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLESVITAMINA B3

VIT. B3(Niacina)

Ácido nicotínico Nicotinamida

NADPNAD

FunciónCoenzimas que regulan procesos de transferencia de H

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLESVITAMINA B3

VIT. B3(Niacina)

Levadura de cerveza58 mg/100 g = 0.58 mg/g = 580 mg/kg = 580 ppm

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DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLESVITAMINA B6

VIT. B6(Piridoxina)

DéficitLesiones en piel, trastornos nerviosos,…

FunciónCoenzimas en reacciones de síntesis de aminoácidos y neurotransmisores

Sardinas960 µg/100 g = 9.6 µg/g = 9.6 mg/kg = 9.6 ppm

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLESVITAMINA B9

VIT. B9(Acido fólico)

DéficitRetraso en el crecimiento, defectos en órganos, anemia,…

FunciónCoenzimas en reacciones de metabolismo de aminoácidos y síntesis de nucleótidos

Embarazo

ContenidoEn general, muy bajo en los alimentos

Durante el procesado, se pierden entre un 20-75% de los folatos

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DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLESVITAMINA C

VIT. C(Acido ascórbico)

DéficitEscorbuto,…

FunciónSíntesis del colágeno (huesos, dentina, cartílagos,…)Protege al organismo de infecciones

EstabilidadEs la vitamina más inestable y lábil

Más estable a pH ácidoSoporta alta temperaturaen ausencia de oxígeno

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLESVITAMINA C

VIT. C(Acido ascórbico)

Kiwi500 mg/100 g = 5 mg/g = 5000 mg/kg = 5000 ppm = 0.5%

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DETERMINACIÓN DE VITAMINAS

�Determinación en dos etapas importantes:

� Extracción de las vitaminas, distinguiendo�Liposolubles�Hidrosolubles�Vitamina C (por su inestabilidad)

� Determinación: típicamente, cromatografía

�Alternativas:

� Bioensayo (con animales o seres humanos). Sólo B12 y D.� Ensayo microbiológico: seguir el crecimiento de

microorganismos (bacterias, hongos o protozoos) como una función de la concentración de ciertas vitaminas. Sólo para hidrosolubles.

EXTRACCIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES

�Procedimiento general para la extracción global de las vitaminasliposolubles � adecuado para todo tipo de alimentos

� Tratamiento con KOH (para saponificar los posibles lípidospresentes en la muestra que contengan vitaminas)

� Neutralización con HCl� Extracción de las vitaminas con éter de petróleo� Típicamente, cambio de disolvente a n-hexano

�Modificaciones para la extracción particular de las vitaminas A, D o E:

� Adición de ácido ascórbico en medio alcohólico (vit. E) � Uso de potasa etanólica para saponificar (vit. E y D) � Utilización de éter etílico como extractante en lugar de éter de

petróleo (vit. A).

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EXTRACCIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES

Muestra de alimento(5 g)

+ 10 ml KOH 33%+ 40 ml EtOH/alc. amilic

(99.6/0.4)

Mantener a reflujo30 min

+ 17 ml HCl 25%

Enfriar + 50 ml eter de petroleo

Agitar durante 3 min

Dejar reposar hastaseparación de fases

fase acuosa fase orgánica

Secar sobre sulfato sódico anhidro

Evaporar a sequedada 35°C a vacío

Disolver finalmenteen n-hexanoAgitar durante 3 min

Dejar reposar hastaseparación de fases

ConcentraciónMasa inicial = 5 gVolumen final = 5 mL

x 1

EXTRACCIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES

�Hay que distinguir entre:� Extracción del ácido ascórbico� Extracción del resto de vitaminas hidrosolubles.

�Extracción del ácido ascórbico (vitamina C)

�Se basa en utilizar como extractante una disolución acuosa de ácido metafosfórico al 0.4%. El extracto se filtra y purifica mediante EFS (Extracción en Fase Sólida) sobre C18

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EXTRACCIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES

�Extracción de vitaminas hidrosolubles de forma global

�Procedimiento recomendado para la determinación de todas las vitaminas hidrosolubles excepto el ácido ascórbico

�Fundamento:� Tratamiento con HCl 0.1 M en caliente (30 min, 100 ºC)� Ajustar el pH a 4.5 � Tratamiento con enzimas (β amilasa y taka-diastasa),

durante 12 horas a 37ºC� Filtrar y diluir con agua� Determinación analítica

DETERMINACIÓN ANALÍTICA. VITAMINAS LIPOSOLUBLES

VITAMINA A(all-trans-retinol)

HPLC-FDColumna: Sílice, 250x4mm, 7 µmFase móvil: hexano/eterFluorescencia, exc: 330 nm

em: 470 nm

HPLC-UVColumna: C8, 250x4mm, 5 µmFase móvil: metanol/agua (92:8)UV, absorbancia a 330 nm

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DETERMINACIÓN ANALÍTICA. VITAMINAS LIPOSOLUBLES

VITAMINA E (tocoferol)

HPLC-FDColumna: Sílice, 250x4mm, 7 µm

Fase móvil: hexano/isopropanol (99:1)Fluorescencia, exc: 290 nm

em: 330 nm

HPLC-UVColumna: C8, 250x4mm, 5 µm

Fase móvil: metanol/agua (92:8)UV, absorbancia a 288 nm

DETERMINACIÓN ANALÍTICA. VITAMINAS HIDROSOLUBLES

VIT. B1(Tiamina)

Fluorescencia, exc: 360 nmem: 435 nm

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DETERMINACIÓN ANALÍTICA. VITAMINAS HIDROSOLUBLES

paresiónicos

R4N+ ⇔⇔⇔⇔ -3OS(CH2)5CH3

DETERMINACIÓN ANALÍTICA. VITAMINAS HIDROSOLUBLES

VIT. C(Acido ascórbico)

2,6-dicloroindofenol Volumetría redoxOxidante (RV): 2,6-dicloroindofenolReductor (analito): Vitamina CPunto final: exceso de reactivo valorante (rosa púrpura a pH < 4)

Kiwi 500 mg/100 gNaranja 50 mg/100 g