Tema 14. Tema 14.

Taxonomía molecularTaxonomía molecular

• Filogenia molecular basada en marcadores Filogenia molecular basada en marcadores moleculares: el ADNr procariota, 16S, 23S; el ADNr moleculares: el ADNr procariota, 16S, 23S; el ADNr eucariótico: 18S, 28S y 5,8. eucariótico: 18S, 28S y 5,8. Métodos de Métodos de fingerprinting: ITS, RAPD, ARDRA, BOX, REP, fingerprinting: ITS, RAPD, ARDRA, BOX, REP, ERIC, ribotyping, ADN mitocondrial. ERIC, ribotyping, ADN mitocondrial. Métodos de Métodos de estudios basados en el ADN de comunidades estudios basados en el ADN de comunidades microbianas: FISH, DGGE, T-RFLP.microbianas: FISH, DGGE, T-RFLP. BioinformáticaBioinformática.. Concepto e Importancia. Bases de datos en Concepto e Importancia. Bases de datos en Internet: NCBI, EMBL. Software (DNAman, MEGA Internet: NCBI, EMBL. Software (DNAman, MEGA 4, Treeview) y Programas 4, Treeview) y Programas on lineon line para análisis de para análisis de secuencias: Workbench Biology, Eztaxon Server, secuencias: Workbench Biology, Eztaxon Server, Ribosome DataBase Project, NCBI. Algoritmos de Ribosome DataBase Project, NCBI. Algoritmos de comparación: BLAST. Construcción de Árboles comparación: BLAST. Construcción de Árboles Filogenéticos. Filogenéticos.

• La taxonomía estudia los principios La taxonomía estudia los principios de clasificación de los organismos de clasificación de los organismos según las semejanzas y diferencias según las semejanzas y diferencias de sus caracteres.de sus caracteres.

• La sistemática trata de los La sistemática trata de los resultados que se obtienen al aplicar resultados que se obtienen al aplicar tales principiostales principios

• Las unidades sistemáticas de cualquier Las unidades sistemáticas de cualquier categoría se designan con el nombre de categoría se designan con el nombre de taxones taxones o o estirpesestirpes

• Las especies que poseen una serie de Las especies que poseen una serie de caracteres comunes se agrupan en caracteres comunes se agrupan en Géneros, Géneros, éstos de forma análoga en éstos de forma análoga en Familias;Familias;

• Órdenes, Órdenes, • Clases Clases • Divisiones. Divisiones.

• Dentro de las especies suelen Dentro de las especies suelen distinguirse distinguirse Subespecies, Subespecies, Variedades, Líneas y Clones Variedades, Líneas y Clones o o Cepas. Cepas.

• Población de células genéticamente Población de células genéticamente idénticas, procedentes de una solaidénticas, procedentes de una sola

• Tradicionalmente hemos visto la biodiversidad relativa a nuestra escala de conocimiento. Nuestra especie es una dentro de 12.500.000 que ahora existe y muchos que existieron en el pasado.

• Estas especies se han desarrollado durante un periodo de 3.800.000.000 años. Durante la mayor parte de este tiempo las formas han existido las formas microbianas.

• De los 3 dominios de la vida, 2 son exclusivamente procariotas, pero ellos contienen solamente alrededor de 5000 especies conocidas.

• Muchas mas especies microbianas son conocidas entre los eucariotas, pero aun muchas menos que el número de especies animales

• Mucha de la biodiversidad no es vista por nosotros y Mucha de la biodiversidad no es vista por nosotros y fue totalmente desconocida hasta antes de la fue totalmente desconocida hasta antes de la invención del microscopio por invención del microscopio por Van LeeuwenhoekVan Leeuwenhoek en el en el siglo XVII. siglo XVII.

• De acuerdo con la tradición, todas las cosas vivas De acuerdo con la tradición, todas las cosas vivas fueron ubicadas en fueron ubicadas en reinos animal y reino vegetalreinos animal y reino vegetal. .

• Cuando los microbios aparecieron, fueron puestas Cuando los microbios aparecieron, fueron puestas dentro de este sistema; dentro de este sistema; bacterias, hongos y algasbacterias, hongos y algas como las como las plantasplantas y y protozoosprotozoos como como animalesanimales. .

• Llegaron cambios necesarios para acomodar las Llegaron cambios necesarios para acomodar las diferencias fundamentales tales como las células diferencias fundamentales tales como las células eucariotas y procariotaseucariotas y procariotas. .

• Los Los Macro-organismos Macro-organismos se desarrollaron a se desarrollaron a partir de los partir de los microbios microbios y fueron capaces y fueron capaces de extender la vida regiones desérticas de de extender la vida regiones desérticas de la tierra, creando los nuevos hábitat para la tierra, creando los nuevos hábitat para los microbios en el proceso. los microbios en el proceso.

• Esto fue relativamente reciente en la Esto fue relativamente reciente en la evolución. evolución.

• Relativamente poco de la diversidad Relativamente poco de la diversidad microbiana existente es conocido por el microbiana existente es conocido por el hombre. hombre.

• Esto significa que hay un Esto significa que hay un potencial potencial enormeenorme para encontrar los nuevos para encontrar los nuevos recursos para la biotecnología. recursos para la biotecnología.

Echemos una ojeada breve algunos de los grupos Echemos una ojeada breve algunos de los grupos microbianos que se conocen en la actualidadmicrobianos que se conocen en la actualidad

• La diversidad de los organismos vivos es tan La diversidad de los organismos vivos es tan grande que no hay grande que no hay definición simple de especiedefinición simple de especie aplicable a todos los grupos. aplicable a todos los grupos.

• Esto hace que sea imposible hacer una Esto hace que sea imposible hacer una comparación significativa de diversidad entre comparación significativa de diversidad entre diferentes grupos.diferentes grupos.

Definición taxonómica de Definición taxonómica de las especieslas especies

• En microbiología - especialmente en En microbiología - especialmente en bacterias bacterias y levadurasy levaduras: grupos genéticamente aislados de : grupos genéticamente aislados de organismos altamente similares (los criterios organismos altamente similares (los criterios son descendiente fértil del acoplamiento, como son descendiente fértil del acoplamiento, como en la especie biológica, o la semejanza del en la especie biológica, o la semejanza del genoma en más del genoma en más del 70%70% basada en basada en hibridacioneshibridaciones cuantitativas in vitro de cuantitativas in vitro de ADNn/ADNn, o la alta semejanza en base a ADNn/ADNn, o la alta semejanza en base a secuencias de ciertas regiones homólogas del secuencias de ciertas regiones homólogas del ADN).ADN).

• La especie biológica - sobre todo desarrollada La especie biológica - sobre todo desarrollada por los zoologistas: Dobzhansky 1937: " las por los zoologistas: Dobzhansky 1937: " las especies son sistemas de poblaciones: el especies son sistemas de poblaciones: el intercambio de genes entre estos sistemas esta intercambio de genes entre estos sistemas esta limitado o prevenido por un mecanismo de limitado o prevenido por un mecanismo de aislamiento reproductivoaislamiento reproductivo o quizás por una o quizás por una combinación variada de dichos mecanismos."combinación variada de dichos mecanismos."

• Las especies filogenéticas - un Las especies filogenéticas - un grupo grupo monofilogenéticomonofilogenético integrado por el conjunto integrado por el conjunto diagnosticable más pequeño de organismos diagnosticable más pequeño de organismos individuales dentro de los cuales hay un individuales dentro de los cuales hay un patrón parentalpatrón parental de la ascendencia y de de la ascendencia y de descendencia. (Cracraft, 1983).descendencia. (Cracraft, 1983).

Estimaciones del número de Estimaciones del número de especie descripta y de especie especie descripta y de especie posible de microorganismos no posible de microorganismos no

descriptas.descriptas.(World Conservation Monitoring Center, 1992, Global

Biodiversity,D. L. Hawksworth and R. R. Colwell)

Grupo Especies Descriptas Especies estimadas %Con.

Algas 40.000 350.000 11.0

Bacterias 4.000 3.000.000 0,1(incluye no cultivables)

Hongos 70.000 1.500.000 5,0

Protozoarios 40.000 100.000 40.0

Virus 5.000 500.000 1.0(incluye plásmidos, fagos etc.)

Total 159.000 5.450.000 3.0

• La verdadera dimensión de la diversidad La verdadera dimensión de la diversidad microbiana fue reconocida recién en las microbiana fue reconocida recién en las pasadas décadas con el desarrollo de pasadas décadas con el desarrollo de métodos genéticos molecularmétodos genéticos molecular..

• Cronómetros evolutivos Cronómetros evolutivos • Macromoléculas celulares que ayudan a Macromoléculas celulares que ayudan a

medir cambios evolutivos:medir cambios evolutivos:• • De Distribución universal De Distribución universal • • Funcionalidad homólogo Funcionalidad homólogo • • Alineación apropiada de las Alineación apropiada de las

secuencias secuencias • • Índice de cambios lento Índice de cambios lento

Secuencias de: • Citocromos • Secuencias de: • Citocromos • Ferredoxinas • Otras proteínas (ATPasas, Ferredoxinas • Otras proteínas (ATPasas, RecA) • ARNsRecA) • ARNs

• El El ARN RibosomalARN Ribosomal como cronómetro como cronómetro evolutivoevolutivo

• • Moléculas antiguas Moléculas antiguas

• • Funcionalmente constante Funcionalmente constante

• • Distribuido universalmente Distribuido universalmente

• • Moderado secuencias Moderado secuencias conservadasconservadas

• • Gran número de secuencias Gran número de secuencias disponiblesdisponibles

• Huella dactilar molecularHuella dactilar molecular• ARDRAARDRA• RFLP by PFGERFLP by PFGE• RAPDRAPD• ITSITS• t-DNAt-DNA• Secuenciado de ARNrSecuenciado de ARNr• Perfil PlasmídicoPerfil Plasmídico• SSCPSSCP• Huella dactilar para comunidadHuella dactilar para comunidad• FISHFISH• DGGEDGGE• T-RFLPT-RFLP• Real time-PCRReal time-PCR

rRNA operon of Prokaryotes

5S rRNA (120 nucleótidos) 16S rRNA (1500 nucleótidos) 23S rRNA (2900 nucleótidos)

Operon ARNr

Operon ARNr de Eucariotas

5.8S ARNr18S ARNr28S ARNr

Árbol filogenético• Distancia: distancia evolutiva, basada en las

diferencias• Parsimonia (Parsimony): mínimos cambios en la

líneas de un ancestro común

• Filogenia tentativa de los eucariotas basado en la secuencia ribosomal y comparaciones (Perry & Staley 1997)

Biodiversidad

MétodosConvencion

ales

Screening,enriquecimi

entoaislamiento

Identificación y

caracterización

Métodos Moleculares

Extracción de ADNtotal

Librerías de Colección

Evolución Directa

Screening,enriquecimie

ntoaislamiento

Cultivos puros

Libreríasmetabólicas

Expresión de la/las

enzimas de interésEvaluación de los

procesos

Optimización deproducción

Transferencia

Secuencia de ADNr de un cultivo de microorganismo

puroBACTERIA

ADN AISLADO

5’3’

3’5’

Tamaño correctoBanda simple

Cebadores universales para PCR

Gel de agarosa

Secuenciado

Análisis de la secuencia

5’ 3’

5’3’

Comunidades microbianas

Cultivos no individiuales

ADN AISLADO

Microorganismo aislado

5’3’

3’5’

5’ 3’

5’3’

Clonado Cebadores específicos para PCRSecuenciadoAnálisis de las secuencias

T-RFLPDGGEFISHReal-time PCR

Pulsed field gel Pulsed field gel electrophoresis electrophoresis PFGE

ADN cromosomal obtenido por PFGE de cepas de Z. mobilis digeridas con NotI (a) y SfiI (b). Lanes: M, Mid. Range I Molecular Weight PFGE Marker; 1, PROIMI A1; 2, ATCC 10988T; 3, ATCC 29191; 4, ATCC 29192T.Migration conditions: 3 V cm-1, 9 s, 40 h.

RAPDRandom Amplification of

Polymorphic DNA

RAPD analysis of Z. mobilis strains. Lanes: M1, Molecular Weight Marker 100 bp DNA Ladder; M2, 1 kb DNA Step Ladder; 1, PROIMI A1; 2, ATCC 10988T; 3, ATCC 29191; 4, ATCC 29192T. Primers used: (a) UBC4; (b) B6; (c) B7; (d) B9; (e) A8.

SSCP SSCP Single-Strand Conformation Single-Strand Conformation

PolymorphismPolymorphism

• SSCP is the electrophoretic separation of single-stranded SSCP is the electrophoretic separation of single-stranded nucleic acids based on subtle differences in sequence (often a nucleic acids based on subtle differences in sequence (often a single base pair) which results in a different secondary single base pair) which results in a different secondary structure and a measurable difference in mobility through a structure and a measurable difference in mobility through a gel. gel.

• El proceso usado durante el desarrollo de El proceso usado durante el desarrollo de SSCP fue el siguiente: SSCP fue el siguiente:

•Digestión del ADN total con enzimas de Digestión del ADN total con enzimas de rectricción rectricción

•Desnaturalización en solución alcalina Desnaturalización en solución alcalina •Electroforesis sobre gel de poliacrilamida Electroforesis sobre gel de poliacrilamida

neutro neutro •Transferencia a una membrana de nylon Transferencia a una membrana de nylon •Hibridización con otro fragmento de ADN Hibridización con otro fragmento de ADN

o mas claro empleando copias de ARN o mas claro empleando copias de ARN sintetizadas sobre cada cadena usadas sintetizadas sobre cada cadena usadas como sondas (Orita et al., 1989). como sondas (Orita et al., 1989).

DGGE (Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis)

Aplicaciones de la técnica de DGGE.

• Estudiar diversidad de microorganismos ambientales en una comunidad compleja (16S rDNA) o diversidad de genes catabólicos.

• Estudiar las poblaciones con actividad metabólica o genes activos por análisis de productos de RT-PCR

• Estudiar la distribución espacial y temporal de poblaciones bacterianas:

• Monitoreo en el tiempo

• Analizar como varía la composición de las poblaciones frente a cambios ambientales (contaminación, clima, perturbación)

• Buscar microorganismos “indicadores” y específicos

• Monitorear la liberación de microorganismos genéticamente modificados

• Screening de mutaciones en genes específicos: diagnóstico de

enfermedades

• Ventajas• - La secuenciación individual de bandas puede

revelar información filogenética → se evita la clonación y la selección previa secuenciación

• - Análisis de hibridación de los perfiles con sondas específicas de grupo (Agrobacterium tumefasciens)

• - Se pueden correr simultáneamente fragmentos patrones correspondientes a grupos o especies específicas →

• identificación directa• - El bandeo complejo puede reducirse usando

primers específicos de grupo (cyanobacterias, agrobacteria, actinomycetes)

• Ventajas• • Amplificar fragmentos de genes

funcionales presentes en grupos particulares de bacterias ([NiFe] hidrogenasas en Desulfovibrio)

• • Análisis simultáneo de gran cantidad de muestras en poco tiempo (2 geles simultáneos con 30 calles c/u en 3 hs)

• • Se pueden identificar las bandas si se corren simultáneamente patrones específicos

• Desventajas:• • No se pueden correr más de 500 pb• • Existen diferencias gel a gel, pero las

posiciones relativas de las bandas permanecen estables

• • Hasta que una banda en el gel es verificada, la sola posición en el gradiente no tiene significado

• • No es posible separar fragmentos de DNA con cierta “cantidad” de variación de secuencia

• Desventajas:• • Se pueden observar “bandas dobles”

como resultado de la presencia de “bases balanceantes” en primers degenerados solamente muestra los fragmentos de DNA de las especies predominantes de la comunidad (se estima que las bacterias que estén en proporción superior al 1%)

• • La microheterogeneidad de secuencias y la presencia de múltiples operones pueden llevar a una sobrestimación del nº de bacterias de una comunidad.

• Limitaciones de la técnica• 1. Manipuleo en la toma de la muestra:

condiciones de muestreo y mantenimiento de la muestra

• 2. Extracción de ácidos nucleicos: lisis reproducible de todas las bacterias, remoción de sustancias que inhiben la reacción de PCR (ács. húmicos, exopolisacáridos)

• 3. Reacción de PCR:• - Amplificación diferencial o preferencial (por

renaturalización del templado)• - Formación de heterodúplex (renaturalización de

productos de PCR)

• Conclusiones• ♦ DGGE ofrece una rápida detección de

las poblaciones predominantes• AMPLIFICABLES.• ♦ Detecta rápidamente diferencias en las

secuencias de fragmentos de genes homólogos amplificados por PCR.

Diferentes etapas para el análisis de comunidades microbianas con el DGGE

Terminal-restrictionfragment length

polymorphism (T-RFLP)

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP or sometimes T-RFLP) is a molecular biology technique for profiling of microbial communities based on the position of a restriction site closest to a labeled end of an amplified gene. The method is based on digesting a mixture of PCR amplified variants of a single gene using one or more restriction enzymes and detecting the size of each of the individual resulting terminal fragments using a DNA sequencer

Por que nos enfocamos en el ARNr

• RNA content/cell:• • ~ 80% del ARN celular es ARNr• • ~ 15% del ARN celular es ARNt• • ~ 5% del ARN celular es ARNm

Aspecto microbiano de la biodiversidad

• • Es imposible de cuantificar la abundancia de un organismo no cultivable

• La posibilidad para realizar La posibilidad para realizar “genómica ambiental” abre una “genómica ambiental” abre una perspectiva para determinar el perspectiva para determinar el potencial fisiológico de potencial fisiológico de microorganismos microorganismos no cultivablesno cultivables

Precauciones

• Saber que la heterogeneidad del gen ARNr debe ser por arriba del 5-6% de la secuencia disimilar (Haloarcula, Thermobispora)

• El estudio apropiado debe contribuir con un buena calidad de secuencia de ARNr (p.e. evitando artefacto de PCR) debe ser conducido por una muestra bien documentada desde los sitios característicos, preferentemente acompañado por cultivos y experimentos de hibridización

Por que buscar la diversidad microbiana

• Estrategias y limites de vida• El rol de los microorganismos en los ciclos

biogeoquímicos• Una fuente de biotecnología• Para el monitoreo de cambios medioambientales• Para la protección de los organismos superiores• Para el entendimiento de la ecología y los

principios de evolución

Cómo determinar diversidad microbiana

• Análisis de secuencias randomizadas inserto en los clones

• Hibridización con sondas taxón específicas

• • RFLP• • ARDRA• • DGGE• • TGGE• • T-RFLP

Terminal-restriction fragment length

polymorphism (T-RFLP)• Técnicas de cultivos independientes para el

seguimiento de comunidades microbianas• Basado en amplificació por PCR de

marcadores genéticos de ARNr 16s• Aspectos a considerar: 1) limites de

detección, 2)• reproducibilidad, 3) cuestiones biológica

para tratar diversidad total • Miembros predominantes • Dinámica de la población, etc

Cebadores marcados fluorescentemente

• Pares de cebadores universales: FAM63F and HEX1389R (numerados por E. coli)

• De acuerdo al sistema de seguimiento, el mas usado para estudios ecológicos

• Regiones mas amplificadas del gene ARN16s

Protocolo para T-RFLP • 1. Extracción del ADN de la comunidad

o muestras de ARN medioambientales• 2. Amplificación por PCR del gen

ARNr 16s con cebadores fluorescentes• 3. Digestión con enzimas de restricción

(ej. CfoI, AluI)• 4. Detección y determinación del

tamaño de los fragmentos terminales marcados por electroforesis capilar o en gel

• CfoI profile

Perfil del T-RFLP :• Electroferograma• •Diferentes fragmentos provienen

de diferentes organismos• • Diversos organismos pueden

compartir un tamaño común de fragmento terminal

• La Altura de pico “en principio” correlacionado a la abundancia del grupo de organismos (?)

Los Pro y contra de T-RFLP

• LIMITACIONES• •Predispocisión inherente a los fundamentos técnicos de PCR• Datos generados dependientes de la elección de enzima de

restricción• Un grupo grande de organismos puede compartir el mismo

tamaño terminal del fragmento • El tamaño evidente puede diferenciar de tamaño real y varía

con el tipo de análisis genéticos • VENTAJAS• • Técnica directa• • Alta reproducibilidad en cada paso del proceso• • altamente Preciso (si no siempre exacto) • • Los datos pueden ser objetivamente procesados

digitalmente