TEMA 14

Mtodos inmunolgicos para laidentificacin microbiana

Tema 14. Mtodos inmunolgicos para la identificacin microbiana

1. Introduccin2. Deteccin de antgenos

2.1. Obtencin de anticuerpos2.2. Marcado de las inmunoglobulinas2.3. Tcnicas de deteccin

2.3.1. Aglutinacin indirecta2.3.2. Inmunofluorescencia2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

3. Deteccin de anticuerpos3.1. Clases de antgenos3.2. Muestras de suero3.3. Pruebas serolgicas

3.3.1. Aglutinacin directa3.3.2. Inmunofluorescencia3.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

1. Introduccin

Antgenos y anticuerpos son complementarios

antgeno posible detectar anticuerpo especfico (suero)

anticuerpo posible detectar antgeno especfico (muestra)

Pruebas para deteccin de anticuerpos: pruebas serolgicas (suero)

Reacciones inmunolgicas

portaobjetos

tubos convencionales (plsticoo vidrio) 12 x 100 mm

placas de microtitulacin(micropocillos 8 mm y 12mm alto)

2. Deteccin de antgenos

Algunas de estas tcnicas son muy tiles para el diagnstico

rpidas (confirmadas por otras)

tcnicas de referencia (elevada eficacia)

Muy tiles para identificacin de virus y clamidias (ms rpidas, sencillas, econmicas y sensibles que el cultivo) (algunas automatizadas)

Se investiga un nico microorganismo en cada prueba (caro y laborioso)

establecer cuidadosa evaluacin clnica del paciente

solicitar la prueba para detectar microorganismo responsable (mayorprobabilidad)

AnticuerpoSitio deunin

Antgeno

Fragmento o regin Fc

2.1. Obtencin de anticuerpos

Anticuerpos

policlonales (animales inmunizados)

monoclonales (producidos in vitro)

Todos los anticuerpos pueden fijarse a travs de su fragmento Fc a:

base de un pocillo de plstico

superficie de una membrana

partculas inertes (ltex, gelatina, oro coloidal)

2.2. Marcado de las inmunoglobulinas

Inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar antgenos y otros anticuerpos

Marcado del fragmento Fc con:

Enzimas (-galactosidasa, fosfatasaalcalina, peroxidasa de rbano)

- actan sobre sustrato

- transformacin en producto coloreado (o diferente color)

Sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluorescena, rodamina,umbeliferona, lantnidos)

- producen luz cuando son excitadas por radiacin incidente

Sustancias lumnicas (luminol, isoluminol, steres de acridina, adamantildioxietano)

- producen luz (reaccin qumica, oxidacin, quimioluminiscencia)

2.3. Tcnicas de deteccin

Si el microorganismo buscado no est en la muestra

los anticuerpos no se unen a l

no se produce seal

Si el microorganismo est presente en la muestra

los anticuerpos se unen a l

se producir el efecto o la seal correspondiente

- aglutinacin

- cambio de color del sustrato

- fluorescencia

- luz

2.3.1. Aglutinacin indirecta

Anticuerpos adheridos porregin Fc a:

partculas grandes de ltex (poliestireno, 1-5 m)

otras partculas inertes

Facilita la observacin de la aglutinacin:

formacin de grumos (degran tamao)

Permite deteccin de antgenos solubles (polisacrido)

Realizable sobre portaobjetos

2.3.1. Aglutinacin indirecta

Rpida (minutos)

Generalmente menos sensible que enzimoinmunoanlisis

Salvo excepciones no muy adecuada para detectar antgenos vricos (menorcantidad que bacterianos)

2.3.2. Inmunofluorescencia

Directa (IFD)

Anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes

se fijan a los microorganismos

Microscopio de fluorescencia

microorganismo brillantesobre fondo oscuro

Virus

no pueden ser observados(pequeo tamao)

se pueden detectar protenas vricas (producidas durante multiplicacin)

- anticuerpos especficos para esas protenas

2.3.2. Inmunofluorescencia

Indirecta (IFI)

Utiliza dos anticuerpos:

- Primero

no marcado

se une al antgeno

- Segundo

dirigido contra el primero(anti-anticuerpo)

est marcado

permite revelar diferentesanticuerpos especficos no marcados

2.3.2. Inmunofluorescencia

2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

ELISA: enzyme linked immunosorbent assay

Mtodo directo

Anticuerpos fijados en base de pocillo de placa de microtitulacin o membrana de nitrocelulosa (especficos del antgeno buscado).

Se aade muestra al pocillo: antgeno presente reaccin Ag - Ac

Se aade segundo anticuerpo

dirigido contra el antgeno

marcado con enzima

2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

Tcnica en pocillos

Tcnica sobre nitrocelulosa

Antgeno diana

Anticuerpo de fijacin(o de captura)

Anticuerpode deteccin

Anticuerpo anti-Igunido a enzima

Productocoloreado

Sustratoincoloro

2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

Mtodo indirecto (sandwich)

Anticuerpos (generalmente monoclonales) fijados en base de pocillo de placa demicrotitulacin o membrana de nitrocelulosa (especficos del antgeno buscado).

Se aade muestra al pocillo

antgeno presente reaccin Ag - Ac

Se aade un segundo anticuerpo

generalmente policlonal

dirigido contra el antgeno

Se aade un tercer anticuerpo

dirigido contra el segundo anticuerpo

marcado con enzima

Sustratosin color

Productocoloreado

Segundoanticuerpo(o tercero)

Enzima

2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

Se aade sustrato (incoloro)

Acta enzima sobre sustrato

Aparece color

se puede medir intensidad(colormetro)

Si no existe antgeno buscado

no es retenido en el pocillo

es eliminado mediante lavado

al aadir sustrato no seproduce color

3. Deteccin de anticuerpos

Mtodo de diagnstico indirecto

Detectan anticuerpos formados frente al microorganismo (en suero del paciente)

Tcnicas semejantes a las descritas para la deteccin de antgenos

La mayora permiten cuantificar los anticuerpos del suero

3.1. Clases de antgenos

Naturales

microorganismos ntegros

extractos antignicos (ms o menos purificados) obtenidos de ellos

Recombinantes

se obtienen por ingeniera gentica

3.2. Muestras de suero

Extraer sangre (5-10 mL)

Dejarla coagular (temperatura ambiente, 20 minutos)

Centrifugar 1.000-1.200 g, 10 minutos (separar el suero)

Guardar suero 4-6C (una semana; -20C (aos, si se evita descongelar y congelarrepetidamente)

3.3. Pruebas serolgicas

Todos los resultados se refieren a anticuerpos totales

Aglutinacin directa, inmunofluorescencia y enzimoinmunoanlisis (msutilizadas)

3.3.1. Aglutinacin directa

Portaobjetos, tubos de ensayo o placas de microtitulacin

Antgeno (suspensin del microorganismo); si hay anticuerpos en el suero, se produce aglutinacin

3.3.1. Aglutinacin directa

Patrn caracterstico

Tubo

- sobrenadante transparente

- formacin de muchosgrumos (al resuspenderel sedimento)

Pocillos

- sedimento amplio y granulado(reaccin positiva)

- botn puntiforme central (reaccinnegativa)

Permite la cuantificacin de anticuerposmediante el clculo del ttulo de anticuerpos

3.3.2. Inmunofluorescencia

Sustrato sin color

Producto coloreadoPocillo o membrana

Antgeno

Anticuerpo primario del paciente producidocontra el antgeno (microorganismo)

Anticuerpo secundarioanti-anticuerpo del paciente

Enzima

3.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)