TEMA 14

Métodos inmunológicos para laidentificación microbiana

Tema 14. Métodos inmunológicos para la identificación microbiana

1. Introducción2. Detección de antígenos

2.1. Obtención de anticuerpos2.2. Marcado de las inmunoglobulinas2.3. Técnicas de detección

2.3.1. Aglutinación indirecta2.3.2. Inmunofluorescencia2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

3. Detección de anticuerpos3.1. Clases de antígenos3.2. Muestras de suero3.3. Pruebas serológicas

3.3.1. Aglutinación directa3.3.2. Inmunofluorescencia3.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

1. Introducción

Antígenos y anticuerpos son complementarios

• antígeno posible detectar anticuerpo específico (suero)

• anticuerpo posible detectar antígeno específico (muestra)

Pruebas para detección de anticuerpos: pruebas serológicas (suero)

Reacciones inmunológicas

• portaobjetos

• tubos convencionales (plásticoo vidrio) 12 x 100 mm

• placas de microtitulación(micropocillos 8 mm ø y 12mm alto)

2. Detección de antígenos

Algunas de estas técnicas son muy útiles para el diagnóstico

• rápidas (confirmadas por otras)

• técnicas de referencia (elevada eficacia)

Muy útiles para identificación de virus y clamidias (más rápidas, sencillas, económicas y sensibles que el cultivo) (algunas automatizadas)

Se investiga un único microorganismo en cada prueba (caro y laborioso)

• establecer cuidadosa evaluación clínica del paciente

• solicitar la prueba para detectar microorganismo responsable (mayorprobabilidad)

AnticuerpoSitio deunión

Antígeno

Fragmento o región Fc

2.1. Obtención de anticuerpos

Anticuerpos

• policlonales (animales inmunizados)

• monoclonales (producidos in vitro)

Todos los anticuerpos pueden fijarse a través de su fragmento Fc a:

• base de un pocillo de plástico

• superficie de una membrana

• partículas inertes (látex, gelatina, oro coloidal)

2.2. Marcado de las inmunoglobulinas

Inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar antígenos y otros anticuerpos

Marcado del fragmento Fc con:

• Enzimas (β-galactosidasa, fosfatasaalcalina, peroxidasa de rábano)

- actúan sobre sustrato

- transformación en producto coloreado (o diferente color)

• Sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina,umbeliferona, lantánidos)

- producen luz cuando son excitadas por radiación incidente

• Sustancias lumínicas (luminol, isoluminol, ésteres de acridina, adamantildioxietano)

- producen luz (reacción química, oxidación, quimioluminiscencia)

2.3. Técnicas de detección

Si el microorganismo buscado no está en la muestra

• los anticuerpos no se unen a él

• no se produce señal

Si el microorganismo está presente en la muestra

• los anticuerpos se unen a él

• se producirá el efecto o la señal correspondiente

- aglutinación

- cambio de color del sustrato

- fluorescencia

- luz

2.3.1. Aglutinación indirecta

Anticuerpos adheridos porregión Fc a:

• partículas grandes de látex (poliestireno, 1-5 µm)

• otras partículas inertes

Facilita la observación de la aglutinación:

• formación de grumos (degran tamaño)

Permite detección de antígenos solubles (polisacárido)

Realizable sobre portaobjetos

2.3.1. Aglutinación indirecta

Rápida (minutos)

Generalmente menos sensible que enzimoinmunoanálisis

Salvo excepciones no muy adecuada para detectar antígenos víricos (menorcantidad que bacterianos)

2.3.2. Inmunofluorescencia

Directa (IFD)

Anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes

• se fijan a los microorganismos

Microscopio de fluorescencia

• microorganismo brillantesobre fondo oscuro

Virus

• no pueden ser observados(pequeño tamaño)

• se pueden detectar proteínas víricas (producidas durante multiplicación)

- anticuerpos específicos para esas proteínas

2.3.2. Inmunofluorescencia

Indirecta (IFI)

Utiliza dos anticuerpos:

- Primero

• no marcado

• se une al antígeno

- Segundo

• dirigido contra el primero(anti-anticuerpo)

• está marcado

• permite revelar diferentesanticuerpos específicos no marcados

2.3.2. Inmunofluorescencia

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

ELISA: enzyme linked immunosorbent assay

Método directo

Anticuerpos fijados en base de pocillo de placa de microtitulación o membrana de nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado).

Se añade muestra al pocillo: antígeno presente reacción Ag - Ac

Se añade segundo anticuerpo

• dirigido contra el antígeno

• marcado con enzima

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

Técnica en pocillos

Técnica sobre nitrocelulosa

Antígeno diana

Anticuerpo de fijación(o de captura)

Anticuerpode detección

Anticuerpo anti-Igunido a enzima

Productocoloreado

Sustratoincoloro

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

Método indirecto (“sandwich”)

Anticuerpos (generalmente monoclonales) fijados en base de pocillo de placa demicrotitulación o membrana de nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado).

Se añade muestra al pocillo

• antígeno presente reacción Ag - Ac

Se añade un segundo anticuerpo

• generalmente policlonal

• dirigido contra el antígeno

Se añade un tercer anticuerpo

• dirigido contra el segundo anticuerpo

• marcado con enzima

Sustratosin color

Productocoloreado

Segundoanticuerpo(o tercero)

Enzima

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

Se añade sustrato (incoloro)

Actúa enzima sobre sustrato

Aparece color

• se puede medir intensidad(colorímetro)

Si no existe antígeno buscado

• no es retenido en el pocillo

• es eliminado mediante lavado

• al añadir sustrato no seproduce color

3. Detección de anticuerpos

Método de diagnóstico indirecto

Detectan anticuerpos formados frente al microorganismo (en suero del paciente)

Técnicas semejantes a las descritas para la detección de antígenos

La mayoría permiten cuantificar los anticuerpos del suero

3.1. Clases de antígenos

Naturales

• microorganismos íntegros

• extractos antigénicos (más o menos purificados) obtenidos de ellos

Recombinantes

• se obtienen por ingeniería genética

3.2. Muestras de suero

Extraer sangre (5-10 mL)

Dejarla coagular (temperatura ambiente, 20 minutos)

Centrifugar 1.000-1.200 g, 10 minutos (separar el suero)

Guardar suero 4-6ºC (una semana; -20ºC (años, si se evita descongelar y congelarrepetidamente)

3.3. Pruebas serológicas

Todos los resultados se refieren a anticuerpos totales

Aglutinación directa, inmunofluorescencia y enzimoinmunoanálisis (másutilizadas)

3.3.1. Aglutinación directa

Portaobjetos, tubos de ensayo o placas de microtitulación

Antígeno (suspensión del microorganismo); si hay anticuerpos en el suero, se produce aglutinación

3.3.1. Aglutinación directa

Patrón característico

• Tubo

- sobrenadante transparente

- formación de muchosgrumos (al resuspenderel sedimento)

• Pocillos

- sedimento amplio y granulado(reacción positiva)

- botón puntiforme central (reacciónnegativa)

Permite la cuantificación de anticuerposmediante el cálculo del título de anticuerpos

3.3.2. Inmunofluorescencia

Sustrato sin color

Producto coloreadoPocillo o membrana

Antígeno

Anticuerpo primario del paciente producidocontra el antígeno (microorganismo)

Anticuerpo secundarioanti-anticuerpo del paciente

Enzima

3.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)