TEKNIK PEWARNAAN dan INOKULASI MIKROBA.docx
-
Upload
maulidhyanti-hijaz -
Category
Documents
-
view
331 -
download
26
Transcript of TEKNIK PEWARNAAN dan INOKULASI MIKROBA.docx
LAPORAN PRAKTIKUM
BIOLOGI/MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN
TEKNIK PEWARNAAN DAN INOKULASI MIKROBA
Oleh:
Maulidhyanti
NIM : 082.11.027
Kelompok: 1A
Asisten:
Septian Maulana
Serra Annisa
Ghoribati Ashfiya
Jurusan Teknik Lingkungan
Fakultas Arsitektur Lansekap dan Teknologi Lingkungan
Universitas Trisakti
Jakarta
2012
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur
dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air. Untuk melihat dan mengamati bentuk sel
bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit karena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil, sehingga untuk
mengidentifikasinya dilakukan dengan metode pengecatan atau pewarnaan
sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut
juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi
dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi.
Dalam penentuan identifikasi bakteri untuk melihat morfologi atau
bentuk bakteri diperlukan suatu pewarnaan dengan menggunakan zat-
zat warna yang telah ditentukan sesuai dengan metode masing-masing
pewarnaan. Zat warna yang paling banyak digunakan adalah kristal violet,
biru metilen, gentian ungu, safranin dan juga tinta cina. Pada pewarnaan
tertentu misalnya pewarnaan Gram dapat digunakan sebagai petunjuk awal
dari identifikasi bakteri dalam penentuan genus sampai spesies bakteri
dengan melihat bentuk dan warna, flagella, spora dan kapsul bakteri. Untuk
menyiapkan bakteri agar dapat diwarnai, dibuat sediaan di atas kaca objek
dan biasanya dinamakan pulasan.
Berdasarkan hal tersebut diatas, maka maka dilakukanlah praktikum
ini untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara
pengecatan sederhana, pengecatan negatif maupun pengecatan gram serta
mengetahui morfologi mikroorganisme.yang akan dilakukan.
1.2. Tujuan
Adapun tujuan dari percobaan ini adalah :
1. Mempelajari teknik pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram untuk
pengamatan mikroba.
2. Mempelajari teknik pewarnaan pewarnaan negatif dan pewarnaan spora
untuk pengamatan mikroba.
3. Mengetahui dan mempelajari morfologi atau bentuk dan strukur bakteri
dari hasil pengamatan.
BAB II
ALAT DAN BAHAN
ALAT BAHAN
Pembakar bunsen Biakan murni dari bakteri hasil isolat
mikroba udara pada agar miring.
Kawat ose Air suling
Tang penjepit kayu Kristal violet
Mikroskop Lugol
Spatula Alkohol 95%
Batang pengaduk Larutan iodium garam
Pipet steril Safranin
Kaca preparat Tinta cina
Minyak imersi Biakan murni Klebsiella sp
Malachite green
Biakan murni Bacillus aureus
BAB III
CARA KERJA
3.1. Pewarnaan sederhana
a. Bersihkan kaca preparat dengan air kemudian dengan alkohol untuk
fiksasi diatas pembakar bunsen.
b. Inokulasikan bakteri pada medium agar miring ke kaca preparat dengan
menggunakan kawat ose sampai menimbulkan noda.
c. Teteskan larutan kristal violet pada noda di kaca preparat sebanyak 1 tetes.
d. Diamkan sejenak, cuci dengan air mengalir, kemudian angin-anginkan
sampai kering.
e. Tambahkan minyak imersi.
f. Amati dengan menggunakan mikroskop.
3.2. Pewarnaan gram
a. Bersihkan kaca preparat dengan air kemudian dengan alkohol untuk
fiksasi diatas pembakar bunsen.
b. Inokulasikan bakteri pada medium agar miring ke kaca preparat dengan
menggunakan kawat ose sampai menimbulkan noda.
c. Teteskan larutan kristal violet pada noda di kaca preparat sebanyak 1 tetes.
d. Diamkan sejenak, cuci dengan air mengalir, kemudian angin-anginkan.
e. Setelah kering berikan 1 tetes lugol, cuci kembali dengan air mengalir.
f. Bilas kaca preparat dengan mencelupkan ke alkohol.
g. Berikan 1 tetes larutan safranin, kemudian cuci dengan air mengalir.
h. Amati dengan menggunakan mikroskop.
3.3. Pewarnaan negatif
a. Bersihkan kaca preparat dengan air kemudian dengan alkohol untuk
fiksasi diatas pembakar bunsen.
b. Teteskan sebanyak 1 tetes tinta cina diujung sebelah kiri kaca preparat.
c. Inokulasikan biakan murni mikroba Klebsiella sp dengan menyampurkan
pada noda tinta cina menggunakan kawat ose.
d. Ratakan tinta cina dan bakteri tersebut dengan ujung kaca preparat lainnya
ke arah kanan, sampai menyebar secara merata.
e. Amati dengan menggunakan mikroskop.
3.4. Pewarnaan spora
a. Bersihkan kaca preparat dengan air kemudian dengan alkohol untuk
fiksasi diatas pembakar bunsen.
b. Inokulasikan bakteri pada medium agar miring ke kaca preparat dengan
menggunakan kawat ose sampai menimbulkan noda.
c. Teteskan larutan malachite green pada noda di kaca preparat sebanyak 1
tetes, tunggu sejenak (± 1 menit)
d. Kemudian cuci dengan air mengalir, lalu angin-anginkan.
e. Setelah kering berikan 1 tetes safranin, lalu cuci kembali dengan air
mengalir.
f. Panaskan hingga kering.
g. Amati dengan menggunakan mikroskop.
3.5. Inokulasi mikroba ke cawan petri
a. Gambarkan segi enam beraturan dan sebuah garis zig-zag pada salah satu
sisinya ke arah dalam pada sisi bawah cawan petri yang telah berisikan
medium agar NA untuk membuat pola.
b. Bakar kawat ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup
(ujung) sampai berpijar merah.
c. Biarkan selama beberapa detik sampai pijar menghilang, kemudian segera
ambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, buka penutupnya dengan
ketiga jari tengah, manis dan kelingking sedangkan jari telunjuk dan ibu
jari memegang kawat ose.
d. Dekatkan bibir tabung reaksi dengan cara memutar tabung sehingga semua
bagian bibir tabung terkena api.
e. Segera masukkan kawat ose ke dalam cawan petri yang diberi pola segi
enam sebelumnya, kemudian oleskan kultur bakteri ke media agar sesuai
dengan pola yang telah digambarkan lalu segera keluarkan. Usahakan
ketika memasukkan kawat ose lakukan dengan perlahan agar tepat sesuai
dengan pola yang telah ditentukan dan lakukan di dekat pembakar bunsen.
f. Ambil tabung reaksi lainnya yang akan diinokulasi, buka tutupnya dengan
dan bakar bibirnya dengan cara yang sama.
g. Segera masukkan kawat ose ke dalam tabung tadi
h. Bakar bibir tabung reaksi dan tutup
i. Bakar kembali kawat ose
j. Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan dilusi atau
pengenceran.
BAB IV
HASIL PENGAMATAN
4.1. Pewarnaan sederhana
GAMBAR PENGAMATAN
Sampel : Lab mikro (1)
Bentuk : coccus
Bakteri : Streptococcus sp
Warna : ungu kebiruan
Sampel : Lab mikro (2)
Bentuk : coccus
Bakteri : Staphylococcus aureus
Warna : biru keunguan
Sampel : Kamar mandi lt 8 (1)
Bentuk : coccus
Bakteri : Staphylococcus aureus
Warna : ungu muda
Sampel : Kamar mandi lt 8 (2)
Bentuk : basil
Bakteri : Actymonoues Basiv
Warna : ungu
Sampel : Basement TL
Bentuk : coccus
Bakteri : Staphylococcus aureus
Warna : ungu kebiruan
GAMBAR PENGAMATAN
Sampel : Himpunan TL
Bentuk : coccus
Bakteri : Staphylococcus aureus
Warna : ungu kebiruan
Sampel : Gedung M
Bentuk : basil
Bakteri : Streptobasil
Warna : biru tua
4.2. Pewarnaan gram
GAMBAR PENGAMATAN
Sampel : Lab mikro (1)
Bentuk : coccus
Bakteri : Streptococcus sp
Warna : ungu tua – gram positif
Sampel : Lab mikro (2)
Bentuk : coccus
Bakteri : Enterococcus
Warna : ungu tua – gram positif
Sampel : Kamar mandi lt 8 (1)
Bentuk : coccus
Bakteri : Staphylococcus aureus
Warna : ungu tua – gram positif
GAMBAR PENGAMATAN
Sampel : Kamar mandi lt 8 (2)
Bentuk : basil
Bakteri : Actymonoues Basiv
Warna : ungu – gram positif
Sampel : Basement TL
Bentuk : coccus
Bakteri : Staphylococcus aureus
Warna : ungu – gram positif
Sampel : Himpunan TL
Bentuk : coccus
Bakteri : Staphylococcus aureus
Warna : ungu tua – gram positif
Sampel : Gedung M
Bentuk : basil
Bakteri : Streptobasil
Warna : ungu tua – gram positif
4.3. Pewarnaan negatif
GAMBAR PENGAMATAN
Kelompok : 1A
Bentuk : coccus
Bakteri : Klebsiella sp
Warna : putih-hitam
GAMBAR PENGAMATAN
Kelompok : 2A
Bentuk : coccus
Bakteri : Klebsiella sp
Warna : putih-hitam
Kelompok : 3A
Bentuk : coccus
Bakteri : Klebsiella sp
Warna : putih-hitam
Kelompok : 4A
Bentuk : coccus
Bakteri : Klebsiella sp
Warna : putih-hitam
4.4. Pewarnaan spora
GAMBAR PENGAMATAN
Kelompok : 1A
Bakteri : Bacillus
Letak spora : sentral
Kelompok : 2A
Bakteri : Bacillus
Letak spora : sentral
GAMBAR PENGAMATAN
Kelompok : 3A
Bakteri : Bacillus
Letak spora : sentral
Kelompok : 4A
Bakteri : Bacillus
Letak spora : sentral
4.5. Inokulasi mikroba
GAMBAR PENGAMATAN
Praktikan : Evin Eginer
Terdapat bakteri dengan pola
osekan segi enam namun kurang
jelas.
Praktikan : Maulidhyanti
Terdapat bakteri dengan pola
osekan segi enam cukup jelas.
Praktikan : Adzra Raihana
Terdapat bakteri namun dengan
pola segi enam yang kurang jelas.
Praktikan : David Jonatan
Terdapat bakteri dengan pola
osekan segi enam namun kurang
jelas
GAMBAR PENGAMATAN
Praktikan : Annisa Amadreja
Terdapat bakteri dengan pola
osekan yang kurang jelas, tidak
membentuk segi enam.
Praktikan : Adityo Jati K
Terdapat bakteri dengan pola
osekan segi enam namun kurang
jelas
Praktikan : Anissa Riski F
Terdapat bakteri dengan pola
osekan segi enam namun kurang
jelas
Praktikan : Hendri Nofriandi
Terdapat bakteri namun dengan
pola segi enam yang kurang jelas.
BAB V
PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini hal yang dilakukan adalah pewarnaan bakteri yang
digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar
belakang, sehingga dapat mempertajam bentuk sel-sel mikroba itu sendiri. Teknik
pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel.
Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan
pengecatan kapsul.
Pertama-tama teknik pewarnaan yang dilakukan adalah pewarnaan
sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna dengan
tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi
dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada
umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin.
Yang kedua adalah pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan
terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan
latar belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode
perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke
dalam sel-sel bakteri melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan atau
nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif).
Kemudian yang ketiga pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang
digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri
gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak
berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan
kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu
diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah.
Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi
dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain :
crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine.
Lalu yang keempat pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan
menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan
muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya yaitu
pada Bacillus subtitulis.
Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan
hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan
suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum.
Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung
dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru
melainkan ke dalam latar belakangnya.
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri ; sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna
dan penambahan larutan pencuci.
Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang
menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan
muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya.
Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna
ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri.
Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan
sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal.
Nigrosin/tinta cina adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang
dibuat dengan memanaskan campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida.
Didalam praktikum ini, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri.
Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap
latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda
positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi
sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga organisme terlihat.
Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa
mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa.
Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari
iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik
dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen
untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes medis.
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi.
Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan.
Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Persiapan safranin komersial sering
mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai
indikator redok dalam kimia analitik.
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel
agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses
pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel
bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya.
Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan
bakteri dengan bentuk basil dan coccus yang berwarna ungu. Pada pewarnaan
negatif, tidak ditemukan terlalu banyak bakteri, ditemukan bakteri dengan bentuk
coccus dan pewarnaan negatif mewarnai belakangnya berwarna kehitaman dan
bakteri berwarna putih kekuningan. Pada pewarnaan gram tidak ditemukan bakteri
jenis gram negatif dengan warna merah dan hanya memiliki bentuk coccus dengan
warna ungu tua yaitu menunjukkan bakteri gram positif. Sedangkan, pada
perwarnaan spora yang menggunakan malachite green dan safranin, spora
seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya
sedikit dari sel vegetatifnya yang terlihat..
Beberapa faktor kesalahan kami pada praktikum kali ini antara lain
pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang
maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati,
dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas
zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air
Berikut adalah hasil pengamatan dari pertumbuhan bakteri pada cawan
petri yang telah diinokulasikan sebelumnya yaitu :
Hari ke-2, Jumat, pukul 11.00 wib
Terdapat koloni bakteri yang tumbuh sesuai dengan pola segi enam yang
telah dibuat dengan proses inokulasi pada 2 hari sebelumnya yaitu Rabu
tanggal 10 Oktober 2012. Namun ada juga beberapa hasil pertumbuhan
yang tidak sesuai dengan pola yang telah ditentukan. Hal itu diakibatkan
karena terjadinya kesalahan pada saat inokulasi yang kurang
memperhatikan ketepatan mengikuti jalur pola, proses fiksasi yang tidak
benar, dan juga rusaknya medium akibat pengolesan kawat ose yang
terlalu kuat pada medium agar.
Dengan mempelajari dan mempraktekkan mengenai teknik pewarnaan dan
inokulasi mikroba kali ini, maka kita akan dapat melihat dan mengetahui bentuk
atau morfologi bakteri sehingga kita dapat mengenali bakteri tersebut.
BAB VI
KESIMPULAN
Dari hasil praktikum mikrobiologi isolasi bakteri dapat disimpulkan :
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,
peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat
warna penutup
Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel
bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau
kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan
antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna.
Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna
merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.
Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain:
alkohol, carbol fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugol’s
iodida, dan safranin.
DAFTAR PUSTAKA
Moerdjoko, Sintorini dan Rinanti Nugroho, Astri. 2003. Penuntun Praktikum
Biologi/Mikrobiologi Lingkungan. Jakarta: Universitas Jakarta
Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com
Diakses pada tanggal 15 Oktober 2012
Anonymous, 2012. Pewarnaan Bakteri. http://artikelteknikkimia.blogspot.com
Diakses pada tanggal 1 Oktober 2012