1

Sveučilište u Zagrebu

Prehrambeno-biotehnološki fakultet

Zavod za biokemijsko inženjerstvo

Laboratorij za tehnologiju i primjenu stanica i biotransformacije

Tehnologija životinjskih i biljnih stanica

Zagreb, 3. listopada 2014.

1

Osnovni podaci o modulu

• Obavezni modul na studiju Molekularne biotehnologije

• Izborni modul A na studiju Bioprocesnog inženjerstva

• 1. studijska godina/zimski semestar• 4 ECTS boda• Ukupno 50 sati nastave i vježbi• Izvođenje nastave

• predavanja 20 h• seminari 15 h• vježbe 15 h

• Nastavnici i suradnici• Izv. prof. dr. sc. Višnja Gaurina Srček• Izv. prof. dr. sc. Ivana Radojčić Redovniković• Doc. dr. sc. Igor Slivac• Dr. sc. Marina Cvjetko Bubalo

2

Tehnologija životinjskih stanica

V. Gaurina Srček i I. Slivac

1. Svojstva kulture životinjskih stanica-primarnekulture i stanične linije

2. Uzgoj kultura životinjskih stanica i ulogamedija i seruma. Metabolizam stanica u kulturi

3. Razvoj proizvodne stanične linije4. Bioreaktori za kulture životinjskih stanica5. Proizvodi tehnologije životinjskih stanica-

virusna cjepiva i monoklonska protutijela6. Dostignuća u primjeni matičnih stanica.

Tkivno inženjerstvo. 7. Postupci pročišćavanja proizvoda dobivenih

tehnologijom životinjskih stanica-seminar

8. Praćenje i kontrola procesa s kulturamaživotinjskih stanica-seminar

9. Uzgoj CCO (Channel Catfish Ovary) staničnelinije-praćenje krivulje rasta i utroška glukozeu mediju za uzgoj -vježbe

Tehnologija biljnih stanica

I. Radojčić Redovniković i M. Cvjetko Bubalo

1. Kultura biljnih stanica i dobivanje biomasestanica, začetak staničnih kultura, održavanje kalusa i priprava suspenzijskihstanica

2. Infekcija biljnog materijala, sekundarni metaboliti i biotransformacije

3. Genetičke transformacije biljaka i genetičko inženjerstvo

4. Imobilizirane biljne stanice. Bioreaktori za biljne stanice

5. Genetički modificirane biljke – za i protiv-

seminar

6. Coleus blumei-izvor ružmarinske kiseline-

seminar

7. Izolacija eksplantata i uspostavljanje kalusaiz mrkve (Daucus carota) te iz listovaukrasne koprive (Coleus blumei)-vježbe

3

Raspored metodskih jedinica po datumima održavanja i predavačima

5

Datum Vrsta nastave Naziv nastavne jedinice Mjesto

održavanja

Vrijeme

održavanja

Nastavnik

03. 10. 2014. Predavanje Svojstva kulture životinjskih stanica. Primarne kulture i stanične linije.

P 5 13.00-14.30 h V. Gaurina Srček

07. 10. 2014. Predavanje Uzgoj kultura životinjskih stanica. Uloga medija i seruma. Metabolizam stanica u kulturi.

P 5 12.00-13.30 h I. Slivac

10. 10. 2014. Predavanje Razvoj proizvodne stanične linije. P 5 13.00-14.30 h I. Slivac14. 10. 2014. Predavanje Bioreaktori za kulture životinjskih

stanica.P5 12.00-13.30 h I.Slivac

17. 10. 2014. Predavanje Proizvodi tehnologije životinjskih stanica-virusna cjepiva i monoklonska protutijela.

P 5 13.00-14.30 h V. Gaurina Srček

21. 10. 2014. Predavanje Dostignuća u primjeni matičnih stanica.Tkivno inženjerstvo.

P5 12.00-13.30 h V. Gaurina Srček

24. 10. 2014. Predavanje Kultura biljnih stanica i dobivanje biomase stanica, začetak staničnih kultura, održavanje kalusa i priprava suspenzijskih stanica

P 5 13.00-14.30 h I. Radojčić Redovniković

28. 10. 2014. Predavanje Infekcija biljnog materijala, sekundarni metaboliti i biotransformacije.

P 5 12.00-13.30 h I. Radojčić Redovniković

31. 10. 2014. Predavanje Genetičke transformacije biljaka i genetičko inženjerstvo.

P5 13.00-14.30 h I. Radojčić Redovniković

04. 11. 2014. Predavanje Imobilizirane biljne stanice. Bioreaktori za biljne stanice.

P 5 12.00-13.30 h I. Radojčić Redovniković

07. 11. 2014. Seminar Postupci pročišćavanja proizvoda dobivenih tehnologijom životinjskih stanica.

P5 13.00-14.30 h V. Gaurina Srček

11.11. 2014. Seminar Praćenje i kontrola procesa s kulturama životinjskih stanica.

P 5 12.00-13.30 h I. Slivac

14. 11. 2014. Seminar Genetički modificirane biljke – za i protiv.

P 5 13.00-14.30 h I. Radojčić Redovniković

18. 11. 2014. Seminar Coleus blumei-izvor ružmarinske kiseline.

P 5 12.00-13.30 h M. Cvjetko Bubalo

Svojstva kulture životinjskih stanica

Primarne kulture i stanične linije

Predavanje 1

Sveučilište u Zagrebu

Prehrambeno-biotehnološki fakultet

Zavod za biokemijsko inženjerstvo

Laboratorij za tehnologiju i primjenu stanica i biotransformacije

6

4

Povijesni razvoj tehnologije životinjskih stanica

• metoda razvijena u cilju istraživanja ponašanja životinjskih stanica

1880. Roux održavao pileće embrije u otopini soli

1890. -1900. Harrison uzgajao stanice živaca embrija žabe “hanging drop” tehnikom

1910. Carrel koristio aseptičnu tehniku za dugotrajan uzgoj pilećeg embrija, Rous & Jones koristili tripsin za supkultiviranje

1920.-1930. oblikovana “Carrel-ova” boca za kulturu stanica

1940.-1950. dodani antibiotici u podlogu za uzgoj

Earle izolirao mišje fibroblaste

Enders uzgojio virus dječje paralize na kultiviranim ljudskim stanicama

1950.-1960. Grey uzgojio HeLa stanice (iz tumor vrata maternice pacijentice Henriete Lacks)

Earle razvio kemijski definiranu podlogu za uzgoj

1960.-1970. Hayflick & Moorhead dokazali da ljudske stanice imaju ograničen životni vijek

Ham uzgojio stanice u podlozi bez dodatka seruma

Harris & Watkins fuzionirali ljudske i mišje stanice

1970.-1980. Kohler & Milstein proizveli hibridoma stanice koje izlučuju protutijela

Sato razvio podlogu bez seruma uz dodatak hormona i faktora rasta

1980.-1990. proizveden humani inzulin pomoću bakterija

monoklonsko protutijelo (OKT3) korišteno za terapiju u ljudi

dozvoljena proizvodnja rekombinantnog tkivnog aktivatora plazminogena (tPA) za terapiju u ljudi

1990.-2000. kimerna protutijela korištena za terapiju u ljudi

izolacija matičnih stanica

2000-te tkivno inženjerstvo i istraživanja u području primjene matičnih stanica7

8

PODRUČJA PRIMJENE KULTURE

STANICA

IMUNOLOGIJA

(površinski epitopi, hibridoma stanice, citokini)

GENOMIKA

(genetičke analize, transfekcija, infekcija)

TKIVNO INŽENJERSTVO

(tkivni konstrukti, nosači)

TOKSIKOLOGIJA

(infekcija, citotoksičnost, mutageneza)

INTERAKCIJE STANICA-STANICA

(morfogeneza, parakrina kontrola, kinetika proliferacije

stanica)

FARMAKOLOGIJA

(djelovanje lijeka, metabolizam lijeka)

PROIZVODI STANICA

(proteomika, izlučivanje, biotehnologija)

UNUTARSTANIČNA AKTIVNOST

(transkripcija DNK, sinteza proteina)

UNUTARSTANIČNI FLUKS

(procesiranje RNK, djelovanje hormon-

receptor)

5

9

Većina životinja - višestanični organizmi

Osnovni koncept kulture životinjskih stanica

Specijalizirane stanice - imaju specifičnu funkciju

Stanice se mogu inducirati da rastu in vitro uz određene uvjete

(temperatura, pH, hranjive tvari itd.)

KULTURA

ORGANAKULTURA

EKSPLANTATA

KULTURA

STANICAORGANOTIPSKA

KULTURA

3D kultura nerazgrađenog tkiva; zadržana histološka

struktura

Tkivo na čvrstoj podlozi; stanice

migriraju i prerastaju

Kultura dobivena od pojedinačnih stanica

izoliranih iz tkiva; stanice tvore tzv.

monosloj kada rastu na čvrstoj podlozi

Stanice različitih vrsta rastu u ko-kulturi s i bez matriksa; uspostavljena organotipska struktura

Vrste kultura životinjskih stanica

10

6

Kultura organa i tkiva

• održavanje cijelih organa ili dijelova tkiva• problemi dugotrajnog održavanja zbog različitih

potencijala rasta pojedinačnih stanica unutar tkiva

11

Kultura eksplantata

• izvorna metoda koju su razviliHarrison (1907), Carrel (1912) u cilju započinjanja kulture tkiva

• dolazi do migracije stanica iz eksplantata i prihvaćanja za čvrstu podlogu

• eksplantat-komadić tkiva

Kultura stanica

Tkivo (čovjek, eksperimentalne životinje)

In vitro kultura stanica ili tkiva

Primarna kultura

Sekundarna kultura

Precjepljivanje

Stanična linija

Precjepljivanje

ImortalizacijaSukcesivno precjepljivanjeIzolacija pojedinačnih stanica

Klonalna stanična linija Starenje

Transformirana stanična linija

Besmrtna stanična linija

Gubitak kontrole staničnog rasta

7

Primarna kultura

• kultura dobivena izravno iz tkiva

• stanje od izolacije stanica do prvog subkultiviranja/precjepljivanja

• najsličnija je prirodnom tkivu

• zadržavaju svoj diploidni karakter

• ograničeni potencijal rasta

• ograničeni životni vijek

• određenim manipulacijama

može prerasti u staničnu liniju

ili postati besmrtna

Primarna kultura glatkih mišića

Primarna kultura keratinocita

13

Koraci u uspostavi primarne kulture

1. Izolacija tkiva

2. Usitnjavanje tkiva (mehaničko) i razgradnja stanica proteolitičkimenzimima

3. Odvajanje pojedinačnihstanica od ostataka tkiva

4. Uspostavljanje kulture-inkubacija, prihvaćanje i rast stanica

1.

2.

3.

4.

14

8

1. Izolacija tkiva

• uvijek u skladu s pravilima

• siguran rad, osobito ako se radi s tkivom koje potječe od ljudi

• rad s embrionalnim tkivom-posebna regulativa

2./3. Usitnjavanje, razgradnja tkiva i odvajanje stanica

• mehaničko usitnjavanje (škare, skalpeli)

• kod male količine tkiva i kad prinos stanica nije važan

• enzimska disocijacija

• cilj je razbiti veze između stanica i ekstracelularnog matriksa

• enzimi koji se koriste za razgradnju: tripsin, kolagenaza II, elastaza, hijaluronidaza, DNK-ze, pronaze

• najčešće se koristi kombinacija spomenutih enzima

HEMATOPOETSKE STANICE NE TREBA DISOCIRATI, JER SU VEĆ U OBLIKU

POJEDINAČNIH STANICA!

15

4. Inkubacija, prihvaćanje i rast stanica

• stanice zahtijevaju čvrstu podlogu za prihvaćanje prije nego dođe do njihova rasta • u laboratorijskim uvjetima ta podloga su različite posude (Petrijeve zdjelice, T-boce...)• interakcija između stanične membrane i površine za rast je kritičan korak i uključuje kombinaciju

elektrostatskih privlačenja i van der Waalsovih sila• prihvaćanje stanica se odvija u prisutnosti Ca2+- kationa i bazičnih proteina pri čemu nastaje sloj

između čvrste podloge i površine stanice• stanice zahtijevaju medij za uzgoj s dodatkom glukoze, aminokiselina, soli, vitamina, hormona,

faktora rasta te kontroliranu atmosferu i temperaturu

nacjepljivanje prihvaćanje (1-2 h)

širenje (24 h)

supstrat/čvrsta podloga

stanica

Prihvaćanje adherentnih stanica na čvrstu podlogu16

9

Stanične linije

• Dobivaju se iz primarnih ili sekundarnih kultura

• Konačne i kontinuirane (beskonačne)• spontano (npr. spontane genetičke mutacije)

• vektorima za transformaciju (npr. virusi i/ili plazmidi)

• Serijskim uzgojem povećava se brzina rasta u kulturi

• Homogena populacija stanica

• Gubitak ovisnosti rasta o podlozi i kontaktne inhibicije

• Neograničen životni vijek in vitro

• Diferencijacijski fenotip:• zadržan u određenom stupnju kod tumorskih staničnih linija

• vrlo mali kod transformiranih stanica

• Genetički nestabilne

Faze razvoja stanične linije

Konačna stanična linija Kontinuirana stanična linija (20-80 dioba)

Starenje i stanična smrt

Tjedni u kulturi

Primarna

kultura

TransformacijaTransformacija

1. supkultiviranje

2. supkultiviranje

Interval između supkultiviranjaK

um

ula

tivn

i bro

j sta

nic

a

18

10

Usporedba svojstava konačnih i kontinuiranih staničnih linija

Konačna/normalna Kontinuirana/beskonačna

• diploidne (46 kromosoma za humane stanice)

• nisu maligne (ne tvore tumore u miševima)

• ograničen životni vijek (maksimalno 50±10 generacija)

• duže zadržavanje diferenciranih staničnih funkcija

• ovisnost o površini za rast

• kontaktna inhibicija, rast u monosloju

• ovisnost o dodatku vanjskih faktora rasta i signala za proliferaciju

• imaju tipične površinske receptore

• abnormalan broj kromosoma (aneuploidi)

• maligne (tvore tumore u miševima)

• neograničen životni vijek

• obično gube diferencirane stanične funkcije

• nisu ovisne o površini za rast (rastu u suspenziji)

• nema kontaktne inhibicije, rast u slojevima

• često ne trebaju dodatak vanjskih faktora rasta

• površinski receptori mogu biti izmijenjeni

19

Najčešće korištene stanične linije u proizvodnji i istraživanjima

Stanična linija Porijeklo Tip stanice Komentar

BHK Bubreg hrčka Fibroblasti adherentne i suspenzijskeza proizvodnju cjepiva

CHO Ovarij kineskog hrčka Epitelne adherentne i suspenzijskepogodne za genetičko inženjerstvo

HeLa Humani karcinom vrata Epitelne brzorastuće tumorske stanicematernice (cerviksa) izolirane 50-ih godina prošlog

stoljeća

L Vezivno tkivo miša Fibroblasti

MDCK Bubreg psa Epitelne za proizvodnju cjepiva u veterini

MRC-5 Embrionalna pluća čovjeka Fibroblasti za proizvodnju humanih cjepiva

Namalwa Humani limfom Limfoblasti za proizvodnju alfa-interferona

WI-38 Embrionalna pluća čovjeka Fibroblasti za proizvodnju humanih cjepiva

3T3 Mišje vezivno tkivo Fibroblasti za razvoj tehnika zbog brzog rasta

Vero Bubreg afričkog zelenog Fibroblasti slična diploidnim staničnim linijama

majmuna za proizvodnju humanih cjepiva

NB41A3 Neuroblastom miša Neuronske posjeduju karakteristike neuronskihstanica; odgovor na NGF

MPC-11 Mijelom miša Limfoblasti izlučuju imunoglobuline

20

11

Tipovi stanica • životinjske stanice se definiraju tkivom iz kojeg potječu te imaju karakterističan

oblik/morfologiju koja se može vidjeti svjetlosnim mikroskopom.

Epitelne stanice

• prekrivaju organe i šupljine (koža, probavni sustav)

• rastu kao pojedinačne stanice tvoreći monosloj i karakterističnu strukturu

• relativno se lako održavaju u kulturi

21

Fibroblasti

• potječu iz vezivnog tkiva i najčešći su korišteni tip stanica u istraživanjima

• stanice su okruglog oblika kada se enzimski disociraju, a kako rastu poprimajukarakterističan vretenasti oblik

• relativno se jednostavno uzgajaju i imaju duplikacijsko vrijeme u rasponu 18-24 h

22

Mišićne stanice

• mišićno tkivo sadrži niz tubula nastalih iz stanica prekursora koje sefuzioniraju i stvaraju komplekse s više jezgri koji sadrže i strukturneproteine aktin i miozin

Krvne stanice

• leukociti, trombociti, limfociti

• najčešće se koriste limfoblasti (bijele krvne stanice) zbog sposobnostiizlučivanja imunoregulacijskih spojeva

Živčane stanice

• visoko diferencirane stanice koje se u kulturi ne dijele

• dodatkom neralnog faktora rasta (NGF) može doći do nastajanja tzv. neurita

• neuroblastomi posjeduju neke karakteristike neurona, a potječu od tumorskihstanica koje rastu u kulturi

12

Morfologija stanica

Fibroblasti

Endotelijske

Epitelne

Neuronske

Dostupnost staničnih linija

Banke stanica: imaju veliki izbor karakteriziranih staničnih linija

• American Type Cell Culture ATCC

www.atcc.org

• National Institute of Health (NIH) USA

www.nih.gov

• European Collection of Cell Culture

www.ecacc.org.uk

• ostale privatne ili javne banke stanica

• sam autor neke stanične linije

24

13

Stanice iz službene banke stanica - 1 ampula

1. pasaža

3. pasaža

1 T-boca (75 cm2)

2 T-boce (150 cm2)

8 T-boca (150 cm2)

Smrzavanje i čuvanje u tekućem dušiku cca 15 ampula s 4-8 x 106

stanica

Master banka stanica (MBS) u referentnom laboratoriju

Radna banka stanica (RBS) u laboratoriju

4. pasaža

5. pasaža

6. pasaža

1 T-boca (75 cm2)

2 T-boce (150 cm2)

8 T-boca (150 cm2)

Smrzavanje i čuvanje u tekućem dušiku cca 15 ampula s 4-8 x 106

stanica

Uzimanje stanica iz MBS

Korištenje stanica za uspostavljanje kulture i svakodnevnu primjenu

Shema uspostavljanja banke stanica

25

2. pasaža

Kontaminacija u kulturama stanica

Kontaminacija – neželjena pojava koja ima negativne učinke na stanice ili njihovu primjenu.

Kemijska kontaminacijaMedij za uzgojInkubatorSerumVoda

Biološka kontaminacijaBakterije i kvasciVirusiMikoplazmeUnakrsne kontaminacije drugim stanicama

Kako kontrolirati kontaminaciju

Aseptična tehnika

Primjena antibiotika

Stanice iz radne banke

Pažnja tijekom rada i rukovanja

Razumijevanje izvora

kontaminacije

Program praćenja kontaminacija

14

Kontaminacije u kulturama stanica

a) bakterije

b) kvasci

c) plijesni

d) mikoplazma

e-f) SEM (skenirajućaelektronska mikroskopija) mikoplazmi koje rastu na površini stanica

Oprema laboratorija za rad s kulturom stanica

1. Osnovna – nužna za rad s kulturama stanica(komora za sterilan rad, inkubator, autoklav, mikroskopi, jednokratno plastično suđe ...)

2. Ostala – omogućuje bolji, učinkovitiji i napredniji rad s kulturama stanica

Komora za sterilan rad-(laminar)

• Struja zraka koja prolazi kroz filtre osigurava sterilnu atmosferu za rad (precjepljivanje i nacjepljivanje stanica

CO2 Inkubator

• Osigurava stalnu temperaturu, koncentraciju CO2 i vlažnu atmosferu za uzgoj stanica

Autoklav

• Sterilizacija podloga, otopina te suđa i pribora

Mikroskopi

Pregled kultura i

brojanje stanica

15

Prednosti primjene kulture životinjskih stanica

Kriterij Prednost

Fizikalno-kemijski okoliš Kontrola pH, otopljenih plinova, temperature

Fiziološki uvjeti Kontrola hranjivih tvari i hormona

Mikrookoliš Regulacija interakcija stanica-stanica

Homogenost stanične linije Dostupnost medija za uzgoj, kloniranje

Karakterizacija Rutinsko provođenje

Pohrana Čuvanje u tekućem dušiku

Validacija i akreditacija Praćenje porijekla i čistoće

Štednja reagensa Smanjenje volumena, smanjenje troškova

Smanjenje broja pokusnih životinja Citotoksičnost, praćenje toksičnosti farmaceutika, kozmetičkih pripravaka i sl.

29

Nedostaci primjene kulture životinjskih stanica

Kriterij Primjer

Ekspertiza Rukovanje, kemijska kontaminacija, mikrobna kontaminacija, unakrsna kontaminacija

Kontrola uvjeta Radno mjesto,

inkubacija, kontrola pH

odlaganje biološkog otpada

Količina i troškovi Kapitalna oprema,

medij, serum, suđe

Genetička nestabilnost Heterogenost, promjenjivost

Fenotipska nestabilnost Dediferencijacija,

adaptacija, selekcija

Identifikacija Ekspresija markera, histologija, citologija

30