TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE: CLONAGEM E …
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Aula5
LGN0232–Genéticamolecular
ThalitaPeixotoBassoDepartamentodeGenética
TECNOLOGIADODNARECOMBINANTE:CLONAGEMETRANSFORMAÇÃOBACTERIANA
ü Módulo 1: Revisão do conceito de tecnologia do DNA recombinante ü Módulo 2: Clonagem ü Módulo 3: Transformação bacteriana ü Módulo 4: Seleção de transformantes ü Questionários e-disciplinas
Revisão do conceito de tecnologia do DNA recombinante
Enzima de restrição
Ligação
Molécula de DNA recombinante
Extremidades coesivas
(complementares)
DNA ligase
Sequência de restrição
(reconhcecimento)
VETOR DNA EXÓGENO
VETOR DE CLONAGEM PLASMIDIAL
Polylinker ou
Sítio de ligação múltipla ou
Sítio múltiplo de clonagem
Marca de seleção
Origem de replicação
Região na qual DNA
exógeno pode ser inserido
Sítiodeclonagemmúltipla
Aumenta a versatilidade do vetor plasmidial
CLONAGEMCELULARCloneéumacoleçãodemoléculasoucélulas,todasidênticasaumamoléculaou
célulaoriginal
Digestão do vetor com enzima de restrição
Digestão do DNA exógeno com enzima de restrição
Ligação com DNA ligase: obtenção
DNA recombinante
Transformação: inserção do
DNA recombinante no hospedeiro
Clonagem: replicação do
DNA de interesse no hospedeiro
Gene de interesse
(DNA exógeno)
Dependentedecélulasvivas Independentedecélulasvivas(PCR)
CLONAGEMMOLECULAR
1a etapa Incorporação do gene de interesse no plasmídeo
2a etapa Amplificação da molécula de DNA
recombinante in vivo
DNA polimerase Replicação da sequência de DNA de
interesse in vitro - PCR
Etapasparaclonagem
1. Digestão do vetor e fragmento de DNA (gene de interesse) com enzima de restrição
2. Obtenção do DNA recombinante por meio da DNA ligase 3. Transformação (introdução do DNA recombinante na célula
hospedeira) 4. Clonagem (replicação do DNA recombinante na célula hospedeira) 5. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA
purificado
AclonagemdoDNApermitequequalquerproteínasejaproduzidaemgrandequantidade
VETOR DE
EXPRESSÃO
Vetores de expressão: Plasmídeos que foram projetados para produzir uma grande quantidade de RNAm que pode ser traduzido de forma eficiente em proteína quando o plasmídeo é introduzido em células hospedeiras (bactéria, levedura, inseto, planta ou mamífero)
DNArecombinanteéinseridoemorganismoshospedeirosportransformação
Tempo de geração bactérias: 20 min
Curva de crescimento
INCOMPETENTE!!!
CÉLULASCOMPETENTES
UmabactériaécompetentequandotemcapacidadedereceberemultiplicarDNAestranho
Bacillus subtilis
Escherichia coli
TRANSFORMAÇÃOQUÍMICAMecanismomolecularpropostoparaexplicaratransformaçãodeE.colicomumamoléculade
DNAexógeno.
MandeleHiga,1970
MecanismodecaptaçãodoDNA
++ Íons de cálcio (Ca2+)
TRANSFORMAÇÃOQUÍMICA
Suspensãodecélulascompetentes
+
MoléculasdeDNArecombinante
=Incubar30min0oCgelo
Choquetérmico
(42°C/30s)
Temperatura de 0oC: diminuir a fluidez da membrana Choque térmico: desbalanço térmico, bombeamento do DNA através da zona de adesão
Tratamento com íons de cálcio em fase logarítimica
(canais na membrana)
Íons de cálcio neutralizam a carga negativa do fosfato
do DNA
TRANSFORMAÇÃOPORELETROPORAÇÃO
Suspensão de células
Eletrodo Eletrodo
Cuveta
Pulso elétrico (campo elétrico)
Eletroporador
ü Aumenta a permeabilidade da membrana ü Lipídeos sofrem rearranjo, criando canais
Pulso elétrico (campo elétrico)
ODNArecombinantepodesercopiadonointeriordecélulasbacterianas
Construção
CéluladeE.coli
Transformação
Meioseletivo
Clonesrecombinantes
Ex:Meiocomantibiótico(ampicilina)
SELEÇÃODECLONESRECOMBINANTES
AeletroforeseemgelpermiteaseparaçãoentreosDNAsdovetoredofragmentoclonado
Construção
CéluladeE.coli
Transformação
Meioseletivo
Clonesrecombinantes
ETAPASPARAOBTENÇÃOESELEÇÃODECLONESRECOMBINANTES1. Digestão com a enzima de restrição para ambos os DNA
(do vetor e do gene de interesse)
2. Inserção do gene de interesse no vetor – DNA ligase
3. Por transformação, o DNA recombinante é inserido no
organismo hospedeiro (bactéria E.coli)
4. Clonagem do DNA recombinante através do cultivo do
organismo hospedeiro em meio seletivo
5. Seleção da célula contendo o DNA recombinante através da marca de seleção ao antibiótico
Fragmento de DNA a ser
clonado
Inserir enzimaticamente o DNA no vetor
plasmidial
Misturar E.coli com plasmídeos na presença de CaCl2 e choque
térmico, ou eletroporação
Cultivar em placar de ágar contendo meio
de cultura seletivo com
antibiótico
Célula transformada
Células que não incorporam o
plasmídeo, não cresce na presença
do antibiótico
MC
+ tetraciclina
Células transformadas Clones resistentes a tetraciclina
Células controle (não transformadas) Clones sensíveis a tetraciclina
GenelacZativo
Produçãodaenzimaβ-galactosidase
X-galémetabolizado=colôniaazul
GenelacZinterrompido
Nãoháproduçãodaenzimaβ-galactosidase
X-galnãoémetabolizado=colôniabranca
Ágar+ampicilina+X-gal
Sítiomúltiplodeclonagem
pUC8Vieira&Messing,1982
Genederesistênciaàampicilina
SELEÇÃODECLONESRECOMBINANTES
GenelacZ=codificaaenzimaβ-galactosidaseX-gal ou 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosídio (incolor)
β-galactosidase Galactose + 5-bromo-4-cloroindigo (azul)
Plasmídeocominserto
ü Resistênciaàampicilina
ü LacZnãofuncional
ü Colôniasbrancas
Semplasmídeo
ü Semresistênciaàampicilina
ü SemgeneLacZ
ü Semcrescimento
CélulabacterianaDNAcromossomal
POSSÍVEISRESULTADOSAPÓSAETAPADETRANSFORMAÇÃO
Plasmídeoseminserto
ü Resistênciaàampicilina
ü LacZfuncional
ü Colôniasazuis
*MC=Meiodecultura
MC+X-gal+amp MC+X-gal+amp MC+X-gal+amp
Amp. Amp.
Inserto
GenelacZ=codificaaenzimaβ-galactosidase
Quais colônias nosinteressameporquê?
SELEÇÃODECLONESRECOMBINANTES
GenelacZ=codificaaenzimaβ-galactosidase
VegetaistransgênicosPlasmídeoTideAgrobacteriumtumafaciens
VegetaistransgênicosPlasmídeoTideAgrobacteriumtumafaciens
Explante inicial (folha)
Disco foliar
Cultivo com bactéria em meio líquido
Plaqueamento em meio sólido seletivo
Por totipotência, os discos foliares transformados dão origem a uma planta inteira
Seleção de plantas transformadas
Planta transgênica
Fragmento de DNA a ser
clonado X123
Inserir enzimaticamente o DNA no vetor
plasmidial
Transformação (misturar
S.cerevisiae com plasmídeos)
Seleção em meio de cultura seletivo
com antibiótico
Célula transformada
Células que não incorporam o
plasmídeo, não cresce na presença
do antibiótico
APLICAÇÕESDATECNOLOGIADODNARECOMBINANTE
ManipulaçãodoDNA–DNArecombinanteTECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
PRODUÇÃO DE INSULINA HUMANA
ESTUDODIRIGIDO1. Oqueétransformaçãobacteriana?2. Qualoprincípiodatransformaçãobacteriana?3. Quaisasaplicaçõesdatransformaçãobacteriana?4. Comosefazaseleçãodeumabactériatransformada?
BIBLIOGRAFIACapítulo14–TécnicasdeGenéticaMolecular.Snustad,D.P.;Simmons,M.J.FundamentosdeGenética.7aedição.EditoraGuanabaraKoogan.Capítulo11–Manipulandoogene/TécnicasdeBiologiaMolecular(páginas197a241).Menck,C.F.M.;VanSluys,M.A.GenéticaMolecularBásica:dosgenesaosgenomas.EditoraGuanabaraKoogan,2017.Capítulo5-TécnicasdeGenéticaMolecular(páginas171-222).Lodishetal.BiologiaCelulareMolecular.7aedição.EditoraArtmed,2014.