TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE · 2019. 4. 9. · TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE •La...
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MARTÍN ESPARIZ - [email protected] BIOTECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS 2019 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
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M A R T Í N E S P A R I Z - E S P A R I Z @ I B R - C O N I C E T . G O V . A R
B I O T E C N O L O G Í A D E L O S A L I M E N T O S 2 0 1 9
TECNOLOGÍA DEL ADNRECOMBINANTE
• Alfa-amilasa
• Quimosina
• Lipasas
• Proteasas
Producción de proteínas
de interés
• E. coli
• Bacterias lácticas
• Levaduras
Expresión de proteínas
recombinantes en diferentes huéspedes
• Replicación del DNA
• Transcripción
• Traducción
• Métodos para detectar las proteínas
Clonado, vectores de expresión, modificación del
genoma
REPRESENTACIÓN DE UN GEN PROCARIOTA
Se representa la región promotora (p), el sitio de iniciación y dirección de la
transcripción (flecha curvada), y la secuencia de terminación para la ARN
polimerasa (t).
Un gen codificante procariota se transcribe en
ARNm y luego directamente en proteína.
TECNOLOGÍA DEL ADNRECOMBINANTE
• La tecnología ADN recombinante, que también se
llama clonación génica o clonación molecular, es
un término general que abarca una serie de
protocolos experimentales que conducen a la
transferencia de información genética (ADN) de un
organismo a otro.
• No hay un solo conjunto de métodos que puedan
usarse para cumplir este objetivo
Molecular biotechnology : principles and applications of
recombinant DNA /
Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, and Cheryl L. Patten. — 4th ed.
Capítulo 3 (p47-86)
CLONACIÓN DE ADN
El ADN de un organismo
fuente se escinde con una
endonucleasa de restricción y
se inserta en un vector de
clonación. La construcción se
introduce en una célula. Al
crecer, el vector con el gen
insertado se replica. El gen
clonado puede expresarse
(transcribirse y traducirse) en
la célula huésped,
produciendo la proteína
recombinante.
ADN Y LAS HERRAMIENTAS DE LA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)
Corte que genera extremos cohesivos en un fragmento corto de ADN
mediante la endonucleasa de restricción tipo II EcoRI.
Las flechas grandes muestran los sitios de escisión en la cadena
principal del ADN. S, azúcar desoxirribosa; P, grupo fosfato; OH, grupo
hidroxilo.
La secuencia de
reconocimiento de EcoRI se
resalta mediante la línea
discontinua.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)
Corte que genera extremos romos en un fragmento corto de ADN por
la endonucleasa de restricción de tipo II HindII.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)
Isosquizómeros. Endonucleasas de restricción se unen al mismo
sitio de reconocimiento.
Neoisosquizómeros son isosquizómeros que cortan en diferentes
posiciones del mismo sitio.
Con flechas se indican los sitios de corte de las enzimas.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)
Mapa de endonucleasa de restricción
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA
Digestiones de endonucleasas de
restricción y separación electroforética
de fragmentos. Un trozo de ADN
purificado y lineal se corta con EcoRI y
BamHI por separado (digestiones
simples) y luego con ambas enzimas
juntas (digestión doble).
LIGASAS
Los cuatro fragmentos que se generan por la digestión con BamHI
pueden aparearse entre sí para formar cualquiera de las seis
moléculas de ADN diferentes. Unión inestable.
LIGASAS
La enzima T4 ADN ligasa forma enlaces fosfodiéster uniendo grupos 5
'fosfato y 3' hidroxilo en nicks en la cadena principal del ADN bicatenario.
Ligación de ADN con
extremos cohesivos
Ligación del ADN de
extremos romos.
VECTORES PLASMÍDICOS
Vector de clonado
Vector de expresión
CLONADO DE GENES EUCARIOTAS
CLONADO DE GENES EUCARIOTAS
SELECCIÓN DE CLONES POSITIVOS
Vector de clonado
SELECCIÓN DE CLONES POSITIVOS
Vector de expresión
RESUMEN DE ALGUNAS “HERRAMIENTAS”
