Tecniche elettroforetiche - Dipartimento di Chimica ... · • 1983 Hjerten – Elettroforesi...

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29/11/2017 1 TECNICHE ELETTROFORETICHE Le tecniche elettroforetiche permettono la separazione di miscele di ioni che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse velocità. Sono spesso associate alle tecniche cromatografiche, perché sono basate su di una diversa velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria, tranne che nel caso dell’l’elettrocromatografia. Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate soprattutto in campo biologico (separazione di proteine, polinucleotidi e altri biopolimeri), e in generale di ioni, sostanze ionizzabili e anfoliti, (es. aminoacidi e peptidi). Trova applicazione anche in altri campi, dati alcuni vantaggi che mostra rispetto alla cromatografia. PROTOSTORIA DELL’ELETTROFORESI 1886 Lodge – Migrazione di H + in un tubo di fenolftaleina “gelificato” 1892 Smirnow – Frazionamento di una soluzione di tossine di Ditteri per azione di un campo elettrico 1899 Hardy – Migrazione di globuline in un tubo ad “U” al passaggio di corrente elettrica. 1905 Hardy – Studi dettagliati sul movimento di globuline con varie tipologie di tubi ad “U”. 1907 Field e Teangue - Separazione tossina/antitossina via ponti di agar tra campione ed acqua 1923 Kendall e Crittenden – Separazione preparativa di isotopi in tubi ad “U” di agar 2

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TECNICHE ELETTROFORETICHE

Le tecniche elettroforetiche permettono la separazione di miscele di ioni che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse velocità. Sono spesso associate alle tecniche cromatografiche, perché sono basate su di una diversa velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria, tranne che nel caso dell’l’elettrocromatografia. Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate soprattutto in campo biologico (separazione di proteine, polinucleotidi e altri biopolimeri), e in generale di ioni, sostanze ionizzabili e anfoliti, (es. aminoacidi e peptidi). Trova applicazione anche in altri campi, dati alcuni vantaggi che mostra rispetto alla cromatografia.

PROTOSTORIA DELL’ELETTROFORESI

• 1886 Lodge – Migrazione di H+ in un tubo di fenolftaleina “gelificato”

• 1892 Smirnow – Frazionamento di una soluzione di tossine di Ditteri per azione di un campo elettrico

• 1899 Hardy – Migrazione di globuline in un tubo ad “U” al passaggio di corrente elettrica.

• 1905 Hardy – Studi dettagliati sul movimento di globuline con varie tipologie di tubi ad “U”.

• 1907 Field e Teangue - Separazione tossina/antitossina via

ponti di agar tra campione ed acqua

• 1923 Kendall e Crittenden – Separazione preparativa di isotopi in tubi ad “U” di agar

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The Nobel Prize in Chemistry 1948 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius ( 1902 1971)

Uppsala University Sweden

"for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his

discoveries concerning the complex nature of the serum proteins"

•1930 Tiselius – Studi dello strato mobile di proteine

in soluzione

•1937 Tiselius - Apparato migliorato per lo studio

dello strato mobile

•1939 Coolidge – Separazione elettroforetica di

proteine del siero in tubi riempiti di lana di vetro

•1946 Consden – Ionoforesi di amminoacidi e peptidi

su strato di silice; primi esperimenti di “blotting”*

•1950 Haglund e Tiselius – Elettroforesi su colonna di polvere di vetro

•1956 Porath – Elettroforesi su colonna di cellulosa

•1964 Ornstein – Apparato per “disc” elettroforesi

•1965 Tiselius – “free zone elettroforesi di particelle virali in capillari

rotanti di 3 mm I.D.

•*Trasferimento, dopo migrazione, della banda adsorbita su altro materiale

L’era di Hjerten

• 1965 Hjerten – “Particle seiving” elettroforesi di ribosomi in

tubi di gel di poliacrilammide

• 1967 Hjerten – Elettroforesi in soluzione in tubi da mm I.D.

• 1974 Virtenen – Dimostra i vantaggi di tubi di piccolo diametro

• 1979 Mikkers – Elettroforesi in capillari polimerici

• 1981 Jorgenson e Lukacs – Approccio teorico e sperimentale

all’elettroforesi ad alta risoluzione in capillari di vetro (CE)

• 1983 Hjerten – Elettroforesi capillare SDS-PAGE

• 1984 Terabe – Cromatogrfia micellare elettrocinetica per la

separazione di molecole neutre

• 1987 Cohen e Karger – Dimostrano l’elevata efficienza

dell’elettroforesi capillare su gel

• 1989 Prima strumentazione commerciale per CE

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VELOCITA’ DI MIGRAZIONE

ELETTROFORETICA

V = µep x E = µep x V/L

µep = flusso elettroforetico E = campo elettrico

In presenza di flusso elettroosmotico µeo si ha:

V = (µep + µeo) x V/L

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In assenza di flusso elettroosmotico

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µeo

µep +

µep - effetto netto

+O

-

L’origine del flusso elettroosmotico non è

di facile comprensione

The observed mobility of water was due to the fact that the solid

substrates such as glass, silicon, polymeric materials, minerals of

various kinds, etc.) acquire a surface charge when in contact with

an electrolyte. The immobile surface charge in turn attracts a cloud

of free ions of the opposite sign creating a thin (1–10 nm under

typical conditions, e.g., univalent electrolyte at a concentration of

1–100 mol per m3) Debye layer of mobile charges next to it. The

thickness of this electric double layer (EDL) is determined by a

balance between the intensity of thermal (Brownian) fluctuations

and the strength of the electrostatic attraction to the substrate. In

the presence of an external electric field, the fluid in this charged

Debye layer acquires a momentum which is then transmitted to

adjacent layers of fluid through the effect of viscosity. If the fluid

phase is mobile (such as in a packed bed of particles or in a narrow

capillary), it would cause the fluid to flow (electroosmosis)

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Doppio strato che origina il flusso

elettroosmotico µeo

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Electroosmotic flow occurs because the walls of the capillary tubing are electrically charged.

The surface of a silica capillary contains large numbers of silanol groups (–SiOH). At pH levels

greater than approximately 2 or 3, the silanol groups ionize to form negatively charged silanate

ions (–SiO–). Cations from the buffer are attracted to the silanate ions. As shown here, some of

these cations bind tightly to the silanate ions, forming a fixed layer. Because the cations in the

fixed layer only partially neutralize the negative charge on the capillary walls, the solution

adjacent to the fixed layer—what we call the diffuse layer—contains more cations than anions.

Together these two layers are known as the double layer. Cations in the diffuse layer migrate

toward the cathode. Because these cations are solvated, the solution is also pulled along,

producing the electroosmotic flow.

http://www.kirbyresearch.com/index.cfm/wra

p/textbook/microfluidicsnanofluidicsch6.html

Micro- and Nanoscale Fluid Mechanics:

Transport in Microfluidic Devices

Brian J. Kirby

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ELETTROOSMOSI

Il valore del potenziale elettroosmotico è dato

dall’equazione di Helmholtz

ζ = 4πη µeo /ε

η = viscosità; ε = costante dielettrica

La velocità elettroosmotica è quindi:

VVVVeoeoeoeo = E µeo = E ε ζ / 4πη

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LA RISOLUZIONE IN ELETTROFORESI

• L’allargamento della banda di migrazione è dovuto

alla sola diffusione longitudinale:

σ2 = 2Dm t; t = L/V V V V = L2 / (µeo + µep) V

σ2 = 2Dm L2 / (µeo + µep) V

N = L2/σ2 = (µeo + µep) V/2Dm

RRRR = (µeo+µep1)-(µeo +µep2)=(µep1- µep2) ¼N1/2

= ¼ x ½½ (µep1- µep2) [V/Dm (µeo + µep)] 1/2

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Classificazione delle tecniche

•• elettroforesi priva di elettroforesi priva di carriercarrier, in cui , in cui

gli ioni migrano in una soluzione gli ioni migrano in una soluzione

tampone. Non viene più usata. tampone. Non viene più usata.

•• elettroforesi mediante elettroforesi mediante carriercarrier, più , più

comunemente utilizzata, in cui gli comunemente utilizzata, in cui gli

ioni migrano su un supporto di ioni migrano su un supporto di

carta, un gel o un polimero. Un carta, un gel o un polimero. Un

esempio comune èesempio comune è

•• L’elettroforesi classicaL’elettroforesi classica (es. su carta (es. su carta

per la separazione delle proteine per la separazione delle proteine

del siero)del siero)

•• elettroforesi capillareelettroforesi capillare

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Le tecniche elettroforetiche si classificano in:

Elettroforesi su carta

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1) A long strip of filter paper is moistened with a suitable buffer

solution of the desired p H and the sample is applied transversely

across the central part of the strip.

2) Ends are fixed to dip in buffer solutions in two troughs fitted

with electrodes.

3)Electric field of about 20 volts/cm is established.

4)The charged particles of sample migrate along the strip towards

respective electrodes of opposite polarity, according to net

charges, sizes and interactions with the solid matrix.

5)Homogeneous group of particles migrate as a separate band

6)The electrophoresis is carried out for 16-18 hours.

7) Separated Proteins are fixed to a solid support using a fixative

such as Acetone or Methanol

8)Proteins are stained (bromophenol blue) to make them visible

9) The separated proteins appear as distinct bands

Scan of normal

serum proteins

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ELETTROFORESI SU GEL• L’ elettroforesi su gel è senza dubbio una delle tecniche maggiormente

utilizzate nei laboratori di biologia molecolare, che permette

• la separazione la visualizzazione e la purificazione di molecole di interesse biologico quali acidi nucleici e proteine.

• Tale separazione dipende dal peso molecolare e dalla carica elettrica di cui sono dotate tali macromolecole.

• Tali molecole poste in un campo elettrico generatosi dalla d.d.p. applicata tra due elettrodi, si muoveranno in direzione dell'elettrodo di carica opposta.

• Gli acidi nucleici migrano naturalmente verso il polo positivo per la presenza nella loro molecola delle cariche negative dei gruppi fosfato (PO4

- - ) Il numero di gruppi fosfato è uguale al numero di nucleotidi per cui, se le catene sono completamente svolte, la separazione dipende dal PM.

• Le proteine si muovono tutte verso il polo positivo e vengono separate in base al PM solo dopo essere state complessate con sodio dodecil solfato (SDS)

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Formazione del gel di poliacrilammide

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GEL DI POLIACRILAMMIDE

• Variando la concentrazione di acrilamide e di bisacrilamide si creano nel gel maglie di diversa grandezza.

• La concentrazione di bis-acrilamide può variare dal 3% al 20% rispetto al volume totale del gel.

• Comunemente si usano i cosiddetti gel piatti ottenuti per polimerizzazione del gel tra due lastre di vetro, che consentono il caricamento di più campioni-

• Prima del caricamento le proteine in genere sono denaturate, ridotte ed alchilate

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STOCK SOLUTIONS FOR POLYACRYLAMIDE GEL PREPARATION

Monomer solution

30% T, 2.5% C Mix 29.25 g of acrylamide and 0.75 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml.

30% T, 3% C Mix 29.10 g of acrylamide and 0.90 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml.

30% T, 4% C Mix 28.80 g of acrylamide and 1.20 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml.

Initiator solution

40% (w/v) ammonium persulphate This reagent is stable at 4°C for no more than 1 week

Catalyst

TEMED This reagent is used undiluted. It is stable at 4°C for several months.

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Strumento per elettroforesi su gel

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Caricamento del

campione per una

corsa di

elettroforesi su gel

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VASCHETTA PER GEL

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AZIONE DI SDS SULLE PROTEINE

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IL MERCAPTOETANOLO RIDUCE I

PONTI DISOLFURO

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SDS-PAGE di

miscele di

proteine

ridotte ed

alchilate in

urea 6

mol/L

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Elettroforesi su Gel di Poliacrilammide.

Isoelettrofocalizzazione

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ANFOLINEsostanze anfolitiche usate in isoelettrofocalizzazione

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Additive Purpose Concentration Limitations

Sucrose,

Glycerol

To improve the mechanical

properties of low %T gels and to

reduce water transport and drift.

5-20% The increased viscosity slightly slows

the focussing process.

Glycine,

Taurine

To change the dielectric constant

of the medium. This increases the

solubility of some proteins (e.g.

globulins) and reduces ionic

interactions

0.1-0.5 M Glycine is zwitterionic between pH 4

and 8, Taurine between pH 3 and 7.

Their presence somewhat slows the

focussing process and shifts the

resulting gradient.

Urea Disaggregation of supramolecular

complexes.

2-4 M Unstable in solution especially at

alkaline pH.

Urea Solubilisation of water-insoluble

proteins, denaturation of

hydrophilic proteins.

6-8 M Urea is soluble at >10°C; it

accelerates

polyacrylamidepolymerisation, so

reduce the amount of TEMED added.

Non-ionic

and

zwitterionic

detergents

Solubilisation of amphiphilic

proteins.

0.1-1% To be added to the polymerising

solutions just before thè catalysts to

avoid foaming; they interfere with

polyacrylamide binding substrata;

they are precipitated by to reactive

TCA and require a specific staining

protocol.

COMMON ADDITIVES FOR IEF

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OFF-GEL

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il gradiente di pH necessario alla focalizzazione può essere formato dal passaggio della

corrente in una miscela di sostanze anfotere, gli anfoliti trasportatori (CA): CA-IEF,

oppure preformato attraverso la copolimerizzazione in una matrice di PAA di

acrilamidoacidi e acrilamidobasi, formando gradienti di pH immobilizzati: IPG39

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ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE

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ESTRATTO DI PROTEINE VEGETALI…

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…STRESS SALINO

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GEL D’AGAROSIO

• L'agarosio è un polimero lineare naturale di galattosio e 3,6 anidro galattosio.

• L' agarosio è sciolto in opportuno tampone: Tris BoratoEDTA (TBE) oTris Acetato (TAE) e fatto gelificare su un supporto di vetro o di plastica.

• Si crea così una matrice gelificata le cui maglie permettono la separazione di macromolecole a diverso PM.

• Anche per l'agarosio è possibile intervenire sulla concentrazione per favorire la migrazione di materiale più o meno grande.

• In linea di massima il range di concentrazione varia tra lo 0,3% - 2%.

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45doppie eliche fasci di doppie eliche

unità strutturale L-galattosil-3,6-anidro-L-galattosio

UTILIZZAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO

PER LA SEPARAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

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CAPACITA’ SEPARATIVA

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Separazione elettroforetica di

frammenti di DNA

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ESEMPIO DI SEPARAZIONE

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EVIDENZIAZIONE DELLE BANDE

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ELETTROFORESI CAPILLARE

Due grossi svantaggi dell’elettroforesi classica sono:

••convezione di caloreconvezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al dovuta alla resistenza del tampone al

flusso di corrente elettrica: crea un gradiente radiale di flusso di corrente elettrica: crea un gradiente radiale di

temperatura che porta all’allargamento dei picchitemperatura che porta all’allargamento dei picchi--

••difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi.difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi.

Questi svantaggi sono superati grazie all’avvento della

tecnica capillare, derivata da elementi della GC capillare. In

questa tecnica, la migrazione degli ioni avviene in un

sistema miniaturizzato, un capillare appunto, nel quale il

calore di Joule è più facilmente disperso con vantaggi

evidenti sulla risoluzione.52

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PROFILO PIATTO DEL FLUSSO

ELETTROOSMOTICOIl profilo piatto del flusso è vantaggioso dal

momento che non contribuisce direttamente alla

dispersione del soluto (cosa che avverrebbe nel

caso di flusso laminare dove le componenti che

si trovano al centro del tubo migrano ad una

velocità maggiore di quelle che si trovano ai

bordi.

Effetto del gradiente di temperatura

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schema del gradiente di temperatura in un capillare, dal centro all'ambiente

esterno.

La dissipazione termica del calore attraverso le pareti del capillare può dar luogo a

temperature più alte nel centro del capillare piuttosto che alle pareti

Tali gradienti di temperatura causano differenze locali di viscosità nel buffer e

quindi una migrazione non uniforme.

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Le 4 modalità in cui può essere

condotta l’elettroforesi capillare

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ELETTROFORESI CAPILLARE SU GEL

• Separazione per elettroforesi

capillare su gel in presenza di

sodio dodecilsolfato (SDS-CGE)

di una serie di proteine:OG:

colorante Orange-G(rif.)

• 1)β-lattalbumina(PM 14200 Da

2)Anidrasicarbonica (PM 29000

Da) 3)Ovalbumina(PM 45000)

4)Albumina di siero bovino (PM

66000) 5)FosforilasiB (PM

97400) 6)β-galattosidasi(PM

116000) 7) miosina(PM 205000)

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La CEC è una tecnica ibrida derivante dalla combinazione fra CE e HPLC.

Rispetto alla tipica CZE il capillare è impaccato con una fase stazionaria

tipica per l’HPLC in fase inversa (C18, C8): La presenza di gruppi silanolici

sulla superficie delle particelle di impaccamentosi traduce in un forte

incremento del flusso elettroosmotico, rispetto all’elettroforesi capillare

convenzionale.

Poiché il flusso

elettroosmotico ha un

profilo piatto, non

parabolico,

l’allargamento di banda è

decisamente inferiore

rispetto all’HPLC e quindi

l’efficienza molto

superiore, anche se

inferiore rispetto alla

CZE.

RIVELAZIONE OTTICA

La configurazione tipica prevede la

presenza di un’apertura nel

rivestimento di poliimmide (non

trasparente alla radiazione UV) posto

intorno al capillare di silice,

attraverso la quale passa il fascio

della radiazione incidente che

attraverso perpendicolarmente il

flusso di analita e raggiunge poi il

rivelatore.

Il fascio della radiazione deve essere

estremamente focalizzato, data

l’esiguità dell’ampiezza di banda.

Il rivelatore può essere un singolo

fototubo fotomoltiplicatore o

un DAD (DiodeArrayDetector).

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While in general small fragments can find their way through the gel matrix more easily than

large DNA fragments, a threshold length exists above 30–50 kb where all large fragments will

run at the same rate, and appear in a gel as a single large diffuse band.

However, with periodic changing of field direction, the various lengths of DNA react to the

change at differing rates. That is, larger pieces of DNA will be slower to realign their charge

when field direction is changed, while smaller pieces will be quicker. Over the course of time

with the consistent changing of directions, each band will begin to separate more and more

even at very large lengths. Thus separation of very large DNA pieces using PFGE is made possible

PULSED FLOW

ELETTROPHORESIS