insieme di tecniche che permettono di separare i soluti contenuti in un miscuglio omogeneo in base alla loro diversa distribuzione fra due fasi immiscibili:

una fase fissa (o stazionaria)

una fase mobile che la attraversa con un flusso continuo e provoca la migrazione dei soluti

TECNICHE CROMATOGRAFICHE

Solida

Liquida

Liquida

Gassosa

Una sostanza si ripartisce tra le due fasi a seconda della sua diversa affinità per l’una o per l’altra.

Riferendosi ad una specifica tecnica cromatografica, si indicano entrambe le fasi, citando per prima la fase mobile

Di adsorbimento Di ripartizione A scambio ionico Per filtrazione molecolare Di affinità

Liquido – solido gas - liquido

Liquido – liquido gas - liquido

Liquido – solido Liquido – solido Liquido – solido

In relazione al diverso supporto per la fase fissa, la cromatografia si distingue in

Cromatografia su colonna La fase stazionaria, come tale o attaccata ad una matrice insolubile, è impaccata in una colonna. La fase mobile passa nella colonna per gravità o applicando pressione.

Cromatografia planare su strato sottile: la fase stazionaria solida viene stratificata su vetro, metallo o plastica su carta: la fase stazionaria liquida si lega alle fibre di cellulosa La fase mobile attraversa la fase fissa per capillarità

Durante l’eluizione, in ogni punto del supporto, la sostanza è coinvolta in un processo dinamico di trasferimento dalla fase stazionaria a quella mobile e viceversa

Si avrà un meccanismo di estrazione-trascinamento-estrazione…. reversibile : ogni componente della miscela tende a distribuirsi tra

le due fasi passando attraverso una serie infinita di stati di equilibrio che si realizzano in ogni strato di spessore

infinitesimale della fase stazionaria

Adsorbimento → cromatografia di adsorbimento

Ripartizione → cromatografia di ripartizione

Dimensioni molecolari → cromatografia per filtrazione molecolare

Carica elettrica → cromatografia a scambio ionico

Affinità di legame → cromatografia di affinità

La distribuzione dei composti fra la fase fissa e la fase mobile può avvenire in base a principi diversi:

Si definisce COEFFICIENTE DI DISTRIBUZIONE, Kd, il rapporto all’equilibrio tra la concentrazione CA di quella sostanza nella fase A e la concentrazione CB nella fase B

Kd = CA CB

Concentrazione nella fase A Concentrazione nella fase B =

Kd è costante per un dato soluto, ad una determinata temperatura, e dipende solo dai solventi usati

se la sostanza è egualmente solubile nelle due fasi, Kd è uguale a 1 se è più solubile nella fase A Kd sarà > 1 se è più solubile nella fase B Kd sarà < 1

Zone A, B, C, D, E hanno altezza = 1 cm fase fissa = materiale solido granulare volume fase mobile = 1 ml per ogni zona

Ogni ml di solvente aggiunto sposta un volume corrispondente nella zona sottostante e provoca l’uscita dalla colonna di 1 ml di liquido.

Esempio: campione X con c = 32 mg/ml Kd = 1

(stadio 3, 4 e 5) Si aggiunge ogni volta 1 ml distribuendo il composto X lungo la colonna. X è sempre contenuto metà nella fase fissa e metà nel solvente.

(stadio 2) L’aggiunta di 1 ml di solvente provoca lo spostamento del solvente (con la quantità totale di X in esso contenuta = 16 mg) nella zona B. In A e in B X è distribuito nelle due fasi: 8 mg nella fase fissa e 8 mg nella fase mobile

(stadio 1) Distribuzione dei 32 mg di X nelle due fasi: 16 mg nella fase fissa della zona A e 16 mg nella fase mobile

Conc. soluto

Se i componenti di una miscela hanno un diverso coefficiente di distribuzione Kd si ripartiscono in maniera diversa tra la fase fissa e la fase mobile I vari componenti si separano in bande di migrazione e potranno essere eluiti separatamente , e quindi analizzati

D A B C

conc

Volume eluito

E’ una cromatografia liquido – solido, su colonna o su strato sottile

Principio della separazione Alcuni materiaIi solidi hanno la proprietà di trattenere molecole sulla loro superficie tramite la formazione di legami deboli – (Forze di Van Der Waals, legami idrogeno)

CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO

Prima cromatografia 1906

Ca(OH)2

I soluti vengono eluiti utilizzando solventi che abbiano le stesse caratteristiche di polarità

H 2 O

1- P ropanolo

1- B utanolo

Etanolo

Metanolo

Alta polarità

Esano

Eptano

Toluene

Acetonitrile

Etere etilico

Cloroformio

Bassa polarità

Acido acetico

Diclorometano

Piridina

Media polarità

Eluenti

E’ una cromatografia liquido – liquido

Può essere effettuata su: carta, strato sottile, colonna

In genere si ha: fase fissa: polare fase mobile: più apolare della fase fissa e con questo tipo di polarità la cromatografia viene definita CROMATROGRAFIA IN FASE NORMALE

Principio della separazione: Diversa solubilità delle sostanze in un sistema di solventi non miscibili e con polarità diverse

La cromatografia di ripartizione su

carta può essere ascendente o discendente a seconda della direzione del solvente nel

percorrere la carta

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE O TLC

Supporto:

lastrina di metallo, vetro o plastica

in strato sottile (0,25 – 2 mm)

di materiale adatto:

gel di silice, agarosio, poliammide,ecc.

Fase mobile: solvente organico

Su strato sottile, a seconda del tipo di supporto usato, è possibile effettuare, oltre la cromatografia di Ripartizione, anche cromatografia di Adsorbimento e per Filtrazione Molecolare

Per l’ identificazione dei composti si calcola Rf = rapporto rispetto al fronte del solvente

Rf = 1 sostanza solubile nel solvente apolare Rf = 0 sostanza solubile in H2O

Fronte del solvente apolare

deposizione del campione

A

B

1 ≥ Rf ≥ 0

dF

dA Rf

A =

dF

dB Rf

B =

dF dA dB

distanze percorse dai composti A e B e dal fronte del solvente

Rf = rapporto rispetto al fronte del solvente

CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONALE

su strato sottile

sostanze che hanno lo stesso Rf in un solvente possono essere separate con un seconda corsa in un solvente diverso fatto scorrere in direzione ortogonale

E’ una cromatografia liquido – solido che si può effettuare su colonna e su strato sottile

Fase stazionaria materiale poroso costituito di polimeri a struttura tridimensionale reticolata che in H2O si rigonfia formando un gel che funziona da setaccio molecolare.

Destrano polimero del glucosio con legami α (1->6) Agarosio polimero del galattosio con legami β (1->4) Poliacrilammide copolimero della acrilammide e della bisacrilamide

Principio della separazione: dimensioni delle molecole

Vt = Volume totaleVi = Volume inclusoV0 = Volume escluso

Vt = V0 + Vi

Le molecole più grandi percorrono solo il volume escluso, quindi viaggiano più velocemente e vengono eluite prima. Le molecole più piccole percorrono il volume totale e vengono eluite dopo.

Determinazione del peso molecolare

Applicazioni della gel filtrazione

Separazione di proteine e acidi nucleici a scopo preparativo.

Desalificazione di una soluzione proteica.

il volume escluso è una funzione lineare del logaritmo del peso molecolare

La fase fissa è una resina costituita da polielettroliti insolubili che dissociano in uno ione fisso che rimane legato alla matrice e un controione di segno opposto a quello dei gruppi legati

I contro-ioni possono scambiarsi con qualsiasi ione dello stesso segno presente in soluzione

Per una resina solfonica lo scambio ionico può essere così schematizzato:

R - SO3- H+ + Na+ R -SO3

- Na+ + H+

Scambiatori cationici: Ione fisso negativo Resine acide Es: R-SO3

- H+

Controione positivo

Scambiatori anionici: Ione fisso positivo Resine basiche Es: R- N+ (CH3)3OH- Controione negativo

Scambiatori forti

-SO3H -N(CH3)3OH Resine solfoniche Resine trimetilaminiche

Scambiatori deboli

-COOH -N(CH2CH3)3OH Carbossimetilcellulosa (CMC) Dietilaminoeticellulosa (DE-cellulosa)

Applicazioni della cromatografia a scambio ionico

Separazione di polielettroliti macromolecolari a scopo preparativo: proteine e acidi nucleici

Separazione di miscele di aminoacidi per analisi qualitative e quantitative

Preparazione di acqua deionizzata

Deionizzatori : Colonne a “letto misto”

Resina acida: +−− HSOR 3 + Na+Cl- +−− NaSOR 3 + HCl

Resina basica: ( ) HClOHCHNR +− +

33 ( ) OHClCHNR 233 +− −+

Preparazione di acqua deionizzata

-

Aminoacidi = elettroliti anfoteri

R

CH - N + H 3

COO -

Anfione pH = P.I. R

CH - NH 2

COO -

Anione pH > P.I.

R

CH - N + H 3

COOH

Catione pH < P.I.

R R

R -SO3- Na+ + CHNH3

+ R - SO3- CHNH3

+ + Na+ | | COOH COOH

Comportamento di una resina a scambio cationico nei confronti di un aminoacido carico positivamente e di uno carico negativamente

Gli aminoacidi possono essere separati sia con una resina a scambio cationico che con una resina a scambio anionico

Posso separare una miscela di aminoacidi in base alla loro

differenza di P.I.

FASI DEL MECCANISMO DI SCAMBIO IONICO

1) Caricamento del campione

2) Spiazzamento dello ione al sito di scambio

3) Diffusione del controione attraverso la resina

6) Rigenerazione della resina con ripristino dei controioni

4) Lavaggio

5) Eluizione selettiva distacco selettivo ad opera di un eluente con diverso pH o forza ionica

Analizzatore di Aminoacidi

porpora di Ruheman

C C

O

O O

O H O H

O

O

O

O

O

O

O

H O H

O H

O H

H

H O

H

+

NINIDRINA IDRINDANTINA

R

CH NH 2 COOH

+ + NH 3

N + 3 H 2 O

R

CHO

+ CO 2 NH 3 +

ALDEIDE

+

O

O

Max assorbimento = 570 nm per tutti gli aminoacidi = 440 nm per prolina e idrossiprolina

Reazione della ninidrina

NINIDRINA IDRINDANTINA

Il principio su cui si fonda è la reazione reversibile tra M, una macromolecola, generalmente una proteina,ed un ligando specifico L,

M + L Complesso ML

E’ una cromatografia liquido – solido

Il ligando - che può essere un substrato o un inibitore competitivo o un coenzima se la proteina da separare è un enzima - viene immobilizzato su una matrice insolubile di agaroso o poliacrilammide, polistirene, cellulosa, silice, e costituisce la fase fissa che viene impaccata in una colonna.

Questa tecnica è stata sviluppata inizialmente per la purificazione degli enzimi, ma, in seguito, è stata anche applicata ai nucleotidi, agli acidi nucleici, alle immunoglobuline, ai recettori di membrana, a cellule o a frazioni subcellulari.

A = la soluzione in esame viene caricata su una colonna nella quale un ligando specifico è immobilizzato sulla fase fissa. La proteina ricercata reagisce con il ligando e resta fissata sulla colonna B = la colonna viene lavata con un tampone e vengono allontanate le proteine che non hanno affinità per il ligando C = si fa percolare sulla colonna una soluzione contenente un ligando diverso da quello immobilizzato e per il quale la proteina ricercata abbia una affinità maggiore. D = la proteina reagisce con il nuovo ligando e il complesso proteina-ligando viene eluito. L’eluato viene poi dializzato per allontanare il ligando

Ligando immobilizzato

Proteina da isolare

Proteine diverse

Complesso proteina - ligando

Ligando per la eluizione

A B C D

Con il termine high pressure liquid chromatography, HPLC, (ma anche high performance liquid chromatography), o cromatografia ad alta risoluzione, si definiscono quelle metodiche di cromatografia liquido-liquido o liquido-solido che utilizzano colonne di diametro molto piccolo, materiali di supporto a particelle molto fini, ed elevate pressioni per mantenere sufficiente velocità di flusso della fase mobile.

COLONNE in acciaio inossidabile, con diametro interno da 2 a 9 mm e lunghezza di 3 - 30 cm, che sopportare pressioni fino a 300 atm.

Poiché la separazione cromatografica tra fase fissa e fase mobile è un fenomeno di superficie, l’uso di particelle molto piccole, aumentando l’area superficiale disponibile, permette di ottenere in tempi brevi una separazione ottimale delle sostanze in esame.

In HPLC possono essere sfruttati praticamente tutti i diversi principi che sono alla base dei diversi metodi di cromatografia liquido-solido o liquido-liquido:

cromatografia di adsorbimento, di ripartizione, a scambio ionico, per esclusione molecolare, di affinità.

Nella HPLC in fase inversa la fase stazionaria è un idrocarburo inerte e le interazioni con il soluto sono unicamente di tipo idrofobico.

CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA Fase fissa: apolare Fase mobile: più polare della fase fissa

E’ inoltre possibile effettuare, oltre alle cromatografia in Fase Normale, anche

Le fasi stazionarie più comunemente usate sono costituite da molecole di n-butano, n-ottano, n-octadecano unite con legame covalente su un supporto di particelle sferiche di silice, di diametro inferiore a 25 µm; queste fasi vengono indicate semplicemente come C4 ,C8 e C18..

La fase mobile è generalmente una soluzione acquosa, addizionata di un solvente organico: i primi composti ad essere eluiti saranno quelli più polari e successivamente quelli meno polari

Rappresentazione schematica di un apparecchiatura per HPLC S, S1 – solventi per l’eluizione P = pompa CM = camera di mescolamento I = iniettore S = siringa C = colonna R = sistema di analisi dell’effluente collegato ad un sistema di elaborazione dati e di registrazione, RG PC = precolonna

Permette la separazione di sostanze volatili o che possono essere vaporizzate senza essere decomposte.

Vantaggi: • Rapidità e riproducibilità delle analisi • Elevata sensibilità (1pg di sostanza)

Fase mobile: Eluente: He N2 H2

Fase stazionaria

Gas – liquido (GLC) o Liquido a bassa tensione di vapore (elevata temperatura di ebollizione): oli di silicone squalene, poliglicoli poliesteri, cere

Cromatografia di ripartizione

gas – solido (GSC) gel di silice allumina carbone vegetale

Cromatografia di adsorbimento

Sostanze analizzate: • Idrocarburi • Alcoli • Aldeidi • Acidi grassi (esteri metilici) • Steroidi

come tali (quelle apolari) o derivatizzate (quelle polari)

Colonna: contenitore di metallo di 0,5 – 1 cm di diametro e 2 – 3 metri di lunghezza a forma di spirale.