Técnicas moleculares y su utilidad - seapcongresos.com · de electroforesis Electroforesis ......

Federico RojoIIS-Fundación Jiménez Díaz

IMIM-Hospital del Mar

Técnicas Moleculares (TEAP)

XXV Congreso de la Sociedad Española de Anatomía Patológica y División Española de la Academia Internacional de Patología (SEAP-IAP)

Zaragoza, Mayo 2011

Técnicas molecularesy su utilidad

• Electroforesis: concepto y aplicaciones

• Técnicas moleculares complejas: perfiles de expresiónde proteínas y de genes, identificación de dianas

• Utilidad de las técnicas moleculares en el manejo del paciente con cáncer

Guión



• Utilidad de las técnicas moleculares al manejo del paciente con cáncer

Guión

Núcleo

GENES

Ribosomas

Polipéptido

Procesos postraducionales

Fosforilación

Ubiquitinación

Aminoácidos

Aminoacil tRNA

Daño

Glicosilación

ARNm

PROTEÍNAS

ModificacionesPostraducionales

Del gen a la proteína

Ánodo+ Cátodo-Soporte

Componente en Migración ( )

Componente en Migración (+)

Mezclaaplicada

Cubeta con los electrodos y el tampón de electroforesis

Electroforesis

Es un transporte bajo la acción de un campo eléctrico mediante el que se pueden separar moléculas en función de su tamaño, forma y

carga eléctrica

Tampón de electroforesis

Electroforesis

•Separa moléculas de acuerdo a su carga y masa•Diferencia de potencial entre los extremos del gel de ~ 200V•Las proteínas ‘caen’ o migran en el gel•Se agrupan en bandas en función de su masa y sucarga

SDS-PAGE

• El SDS (sodium dodecyl sulfate) es un detergente utilizado en el pretratamientode la muestra de proteínas, previa a sumigración (desnaturalización)

• El mercaptoetanol rompe los puentes disulfuro

• Tratamiento con calor (3-5 min., 90°C).

• Tampones de alto pH (~10)

• PAGE = polyacrylamide gel elecrophoresis

• Se emplean proteínas estándar paraconocer el tamaño de la proteína diana

•El gel crea túneles a través de los que migran las proteínas•Se confirma la migración del gel mediante una tinción de coomasie•Se separan las proteínas de acuerdo a su masa, no su forma o carga, debido al proceso de desnaturalización

Gel de poliacrilamida

Detectando proteínas específicas: Western blot

../../2005/3EIMMBLOT.MOV

0

0.2 2 20

20

0

MAb Erbitux [nM]

0

25

50

75

100

Re

lati

ve c

ell

nu

mb

er

(%)

0

25

50

75

100

Re

lati

ve c

ell

nu

mb

er

(%)

0

0.0

00

10

.00

1

0.0

1

0.1 1

10

TKI Iressa [M]

R

K

R

K

PI3K

ShcGrb2

Sos

AktMAPK

survival proliferation

TGF MAb

Efficient biological dose (EBD)

Activated EGFR

Activated MAPK

TKI

Pharmacodynamics: a paradigm of bench to

bedside research

648

Scaltriti M. et al. JNCI 2007

Sensitivity to HER2 therapies:p95 HER2 fragments have different subcellular localization in human breast cancer

Southern Blot

• Permite el estudio de fragmentosde DNA

• El DNA es desnaturalizado y transferido a una membrana, y separado por electroforesis

• El DNA posee carga negativa y los fragmentos más pequeños de DNA migran más rápido que los de mayor tamaño

• La electroforesis se realiza en gelesde agarosa de 1% al 3%

• Se emplean marcadores paraestimar el tamaño de los fragmentos de DNA

• Identifica y cuantificafragmentos de RNA en función de su tamaño o mediante la utilización de sondas específicas con marcaje radiactivo o enzimático

• El RNA es separado mediantemigración en un gel de agarosa por electroforesis

• Pueden aparecer smears de RNA correspondientes a moléculas de diferentetamaño

Nothern Blot

• Prueba inmunológica de alta sensibilidad

• Sobre un soporte rígidocon un anticuerpo o un antígeno unidos

• Se realiza sobre placas de 96 pocillos, con unamuestra diluida en sólo100-200l de muestra

• Se realizan baterías de diluciones para estableceruna recta-patrón

• Útil en la identificación de infecciones, cuantificaciónde anticuerpos, etc

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Dot Blot

• Reacción sobre un soporte rígido, sin migración, parala detección de DNA o proteínas

• Permite marcaje con sondas o anticuerpos

• Test cualitativo, no permite cuantificación

• Complejo en su interpretación

Detección de proteínas en muestras tisulares mediante Agilent



• Utilidad de las técnicas moleculares al manejo del paciente con cáncer

Guión

DNA

RNA

PROTEINS

Metabolites

Interactions

Protein-DNA, Protein-RNA, Protein-Protein

Genome

Transcriptome

Proteome

Metabolome

Interactome

-Omics

Técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas de proteínas altamente complejas

1. Las proteínas se separan según su punto isoeléctrico

2. Las proteínas se separan según su masa molecular.

Electroforesis bidimensional (2-DE)

urea 8M,CHAPS 2%, TCEP 1% anfolitos 0.2 % azul de bromofenol

Proteínas

+

IPGphor

Carga de la primera dimensión

Carga de la segunda dimensión

Gradiente de pH

Mezcla de

proteínas

Tira de

electroenfoque

3 103000 volt/16hr.

Primera

dimensión

Proteinas

focalizadas

en sus pI+ -

Tira

electroenfoque

Segunda

dimensión

(PAGE-SDS)

-

+PM

70 bandas

100 bandas

pH

103

10

20

33

50

160

MW(Kda)

TreatedControl

Captura y análisis de imagen

DIGE: differential in gel electrophoresis

DIGE: differential in gel electrophoresis

25 mg A + 25 mg B 50 mg A

Cy2 Cy3 Cy5

50 mg B

l = 488 nm l = 532 nm l = 633 nm

Análisisinformático

Selección de spots de interés

Protein IDPeptide mass /sequence analysis

MALDI-ToF MS

MS/MS

Extracto proteínas

Mezcla péptidos

Masa peptídica

Análisis secuencias

Células, tejido

Búsqueda en bases datos

Separación péptidos

Digestión

Preparación muestra

Espectrometría masas

HPLCCromatografía bidimensional

Bioinformática

Espectrometría de masas e identificación de proteínas

Picker

Digestor

Recorta las proteínas de interés (seleccionadas mediante análisis informático de las imágenes 2-DE escaneadas) y las deposita en placas de 96 pocillos. MALDI-ToF/ToF

mass spectrometer


Direct Analysis of IRESSA in tissue by MALDI-MS

Breast cancer patient treated with Iressa 12 mm section frozen tissue MALDI matrix: 0.25 mL sat. Soln. HCCA in 50% acetonitrile- 0.1% TFA

+ 0.1 pmol internal std. peptide (bradykinin 1-7)

1 mm

Inte

ns. [a

.u.]

Inte

ns. [a

.u.]

756.97

Normal tissue

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

447.06

756.85

Tumor

0

2000

4000

6000

8000

450 500 550 600 650 700 750m/z

Bradykinin 1-7

Iressa

MALDI Imaging

Healthy Tumoural

• Permite la detección de proteínas pocoabundantes

• Disponibles de forma comercial o diseñadas por el usuario

• Identifica cientos de marcadores, en suformal total o activa (fosforilada)

• Permiten estudiar pathways de forma integral

• Compara muestras problema (tumor) con referencias (normal)

Perfiles proteómicos en muestras de tejido o celulares mediante arrays de proteínas

DNA microarrays



• Utilidad de las técnicas moleculares en el manejodel paciente con cáncer

Guión

- TGF- + TGF-

SMAD4

SNAIL1

SMAD3

TGF- effects on SNAIL1 and SMAD3/4

Loss of CAR correlates with co-expression of SNAIL1 and SMAD3/4 in human breast cancer

SMAD3

SNAIL1

S3+SNAIL1

CAR

Combined anti-EGFR treatment with Gefitinib and CetuximabRationale for combination

P. Matar et al Clin Cancer Res 2004;10:6487-6501

0

500

1000

1500

2000

2500

Tumor Volume (mm3)

0 5 10 15 20 25 30 35 40Days

Gefitinib(100mg/Kg/day) + Cetuximab (1.5mg/mouse/twice per week)

Gefitinib (50mg/Kg/day) + Cetuximab (1.5mg/mouse/twice per week)

Cetuximab(1.5mg/mouse/twice per week)

Cetuximab (1 mg/mouse/twice per week)

Gefitinib (100mg/Kg/day)

Gefitinib(50mg/Kg/day)

CONTROLTreatment

-2.5873944 -1.3245479 HOXC10

-2.4191496 -1.4567467 PRKR

-1.7614335 -2.4474001 PSMC6

-1.7510861 1.26159601 PTPN6

-1.700843 -2.2365112 SMARCA5

-1.6823758 -1.155286 ESTs

-1.6777177 -2.1939034 OAT

-1.6183235 -1.005038 ESTs

-1.5930041 -2.9195581 DKFZP564O0463

-1.5664514 -2.4225056 CARD12

-1.5154539 -2.3173886 CRSP6

-1.4842663 -1.9082497 TDG

-1.4770821 -2.6675217 NET1

-1.4474364 -2.4996914 RECQL

-1.4282515 -1.9099038 TRAF3

-1.3858297 -2.2241437 CAPZA2

-1.3206517 -2.4049385 PLAU

-1.2792072 -1.6586391 E2F5

-1.2489797 -1.8858958 PSMD10

-1.2192551 -1.8298812 TP53BPL

-1.1746655 -1.8413323 ITM2B

-1.0988542 -1.7120799 RRN3

-1.0320408 -1.5642813 CLU

-1.021543 -1.6514691 CDK7

1.0181852 1.64347556 GSTP1

1.03921921 1.94632145 TLN1

1.55886933 2.06730321 COL4A1

2.24233216 9.62809248 ENG

-2.0516007 1.25461959 ENO1

-1.9158704 1.28676625 ZNFN1A1

-1.7706143 1.28275887 MCM5

-1.6888018 1.25353302 HOXD8

-1.4943313 1.22306409 IGHG3

-1.4920025 1.39353574 EMS1

-1.4763144 1.73688231 AMY

-1.4414292 1.45296505 NTRK2

-1.4275092 1.28098182 JAK1

-1.421831 1.35331717 CSF1

-1.4063932 1.25331582 SOX22

-1.3526138 1.50446443 PIK3CD

-1.3363056 1.54702874 HSPB2

-1.0794153 1.57898777 ZNF212

1.03741994 -1.5572494 MFAP1

1.19168257 -1.5669944 PPP1CC

1.84069424 -1.1381968 EIF4A2

Genes are differentially regulated by Cetuximab and Gefitinib

P. Matar et al Clin Cancer Res 2004;10:6487-6501

Gefitinib + Cetuximab

Gefitinib or Cetuximab

DailyGefitinib

w1 w2 w3 w4 w5

Cycle 1 Cycle 2

Skin and tumor biopsies day -1

Skin and tumor biopsies day +14

Cetuximab + Gefitinib Phase I StudyHead&Neck, NSCLC, Colon EGFR +ve tumorsSample Collection Timepoints

WeeklyCetuximab

Baselga et al, ASCO meeting, 2006

Group 0a 0b 1 2a 2b 3 4 5 -1 Part B

Daily Gefitinib (mg) - 250 100 100 250 250 500 500 100 RD

Loading Cetuximab (mg/m2) 400 - 320 400 320 400 320 400 250 RD

Weekly Cetuximab (mg/m2) 250 - 200 250 200 250 200 250 160 RD

Patients planned 5 5 3-6 3-6 3-6 3-6 3-6 3-6 3-6 20

Patients included 7 7 3 5Not

done 6 6 6Not

done 3+

• Pharmacodynamics: EGFR, pEGFR, pERK, pAKT, Ki67, p27, TUNEL • Pharmacogenomics

PKsDLT period

Cetuximab + Gefitinib Phase I StudyDifferentially expressed genes betweentherapies

G+C

G+C

G+C

G+C

G+C

G+CGG C CC C

Cetuximab221

Gefitinib111

Cetuximab + Gefitinib 311

132

26

7

56

228

20

58

EMR 62202-045 study – Predictive biomarkers

TGFA 205016_at

PPP1R9A 221088_s_at

PPP1R9A 228494_at

QPCT 205174_s_at

ZDHHC2 222731_at

RPL22L1 225541_at

TPD52 201691_s_at

INSIG2 209566_at

C7orf46 228600_x_at

SLC25A27 230624_at

ERAP1 209788_s_at

RABEP1 225092_at

KIF21A 226003_at

SOCS6 227542_atCAST 212586_at

NGRN 217722_s_at

SKP1 200719_atSLC25A46 212833_at

NRIP1 202599_s_at

CHD1 204258_atDIP2B 224872_at

RPA1 201529_s_at

ZNF654 241348_at

DCP2 235258_at

CAST 208908_s_at

PHGDH 201397_at

USP4 202682_s_at

ZFYVE26 37943_at

SH3BP2 209370_s_at

GOSR2 213144_at

GBA 210589_s_at

EXOSC10 207541_s_at

KLHL21 203068_at

MIDN 225954_s_at

BSDC1 218004_at

BSDC1 222200_s_at

C1orf144 212002_at

CAPZB 37012_at

GLT25D1 218473_s_at

PPAN 221649_s_at

MAN1B1 218636_s_at

NA 224890_s_at

URM1 208101_s_atCDC42 208728_s_at

KPNB1 208974_x_at

LSM12 212529_atKPNA6 212101_at

ECSIT 218225_at

ARIH2 216008_s_at

SSH3 219919_s_at

DNAJC8 205545_x_at

IMPDH1 204169_at

DHCR7 201791_s_at

TNFRSF1B 203508_at

ADAMDEC1 206134_at

EREG 205767_at

AREG 205239_at

-3 -2.4 -1.8 -1.2 -0.6 0 0.6 1.2

PD SD PR

0101-0

001

0101-0

011

0101-0

013

0101-0

025

0102-0

012

0101-0

037

0101-0

041

0102-0

029

0101-0

016

0101-0

023

0102-0

006

0102-0

013

0102-0

023

0101-0

042

0101-0

012

0101-0

026

0101-0

028

0101-0

039

0101-0

035

32.41.8

Panel B – AREG; KRAS wild-type

Panel A - AREG all patients Panel C - EREG all patients

Panel D – EREG; KRAS wild-type

Panel E - TGFA all patients

Panel F – TGFA; KRAS wild-type

Tabernero, J et al. J Clin Oncol 2010

EMR 62202-045 study – Predictive biomarkers

• Disponemos de herramientas de biología molecular sencillas y de fácil interpretación

• Existen herramientas sofisticadas que permitenanálisis complejos y altamente informativos

• La aplicabilidad de estas herramientas en el ámbitoasistencial se está incrementándo

Conclusiones

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