Tecnicas moleculares

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SEMINARIO SEMANA Nº 13 TÉCNICAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR, APLICACIÓN EN MEDICINA 1.- Explique la técnica PCR (Reacción en cadena de polimerasa). Aplicaciones en medicina La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento particular de éste es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. Así se obtienen en cuestión de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN. La PCR es una técnica de biología molecular altamente específica, rápida, sensible y versátil para detectar cantidades ínfimas de un cierto ADN específico, posibilitando su fácil identificación y prescindiendo del uso de radioisótopos, indispensables antes de su invención. Para realizar la PCR se necesita Mezclar en un tubo el ADN que contiene la secuencia a amplificar Ambos cebadores que se alinearán a las cadenas simples del ADN La mezcla de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatados (dNTPs) en cantidades suficientes El tampón de reacción para la polimerasa Agua ultrapura para completar el volumen final de reacción (que normalmente oscila entre 20 y 100µl) La enzima ADN polimerasa termoestable. La reacción consta, por lo regular, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada uno de tres pasos: 1. El primero consiste en la ruptura de los puentes de hidrógeno del ADN para desnaturalizarlo, para lo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95ºC, por un minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. 2. En el segundo ocurre la hibridación de las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los denominados cebadores

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SEMINARIO SEMANA N 13TCNICAS EN BIOLOGA MOLECULAR, APLICACIN EN MEDICINA

1.- Explique la tcnica PCR (Reaccin en cadena de polimerasa). Aplicaciones en medicinaLa PCR es un mtodo in vitro de sntesis de ADN con el que un segmento particular de ste es especficamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a travs de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubacin en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. As se obtienen en cuestin de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN.

La PCR es una tcnica de biologa molecular altamente especfica, rpida, sensible y verstil para detectar cantidades nfimas de un cierto ADN especfico, posibilitando su fcil identificacin y prescindiendo del uso de radioistopos, indispensables antes de su invencin.

Para realizar la PCR se necesita Mezclar en un tubo el ADN que contiene la secuencia a amplificar Ambos cebadores que se alinearn a las cadenas simples del ADN La mezcla de los cuatro desoxirribonuclesidos trifosfatados (dNTPs) en cantidades suficientes El tampn de reaccin para la polimerasa Agua ultrapura para completar el volumen final de reaccin (que normalmente oscila entre 20 y 100l) La enzima ADN polimerasa termoestable.

La reaccin consta, por lo regular, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada uno de tres pasos: 1. El primero consiste en la ruptura de los puentes de hidrgeno del ADN para desnaturalizarlo, para lo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95C, por un minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. 2. En el segundo ocurre la hibridacin de las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los denominados cebadores o iniciadores (ADN sinttico de hebra sencilla), a una temperatura que facilita el apareamiento de las bases nitrogenadas complementarias de ambas clases de ADNs. Esta temperatura depende de la temperatura de fusin (Tm) de los iniciadores, la cual puede calcularse mediante una frmula (ver ms adelante), pero generalmente oscila entre 50 y 60C. 3. El tercer paso se efecta a 72C, temperatura a la que la polimerasa extiende la longitud de los cebadores, aadiendo los diferentes nucletidos libres en el orden que le va dictando la secuencia de nucletidos de la cadena que acta como molde10 (figura3).

2. Explique la tcnica de ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay) directo y sus aplicaciones en medicina.

Es importante saber los siguientes trminos que a continuacin se explicarn para poder entender el desarrollo de esta pregunta:

ELISA: Ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimasComplejo enzimtico: Unin de enzima con el ligando ya sea un antgeno o un anticuerpo.

La prueba ELISA utiliza una enzima como lo dice su nombre , como marcador ante la presencia de un determinado antgeno o anticuerpo. Esta prueba se utiliza para la deteccin de enfermedades autoinmunes, como por ejemplo el VIH /SIDA.

El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.

En esta tcnica se utilizan enzimas marcadores que detectaran por medio de un proceso cataltico si la muestra presenta la presencia de la enfermedad. En el caso de la deteccin del VIH se utilizan los denominados lectores de Elisa , que son maquinas especializadas que van a detectar si los pocillos poseen el antgeno-anticuerpo especficos del VIH. Son los llamados espectofotometros.Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase slida en los cuales se adsorbe un antgeno o un anticuerpo sobre un soporte slido.

Todas las pruebas ELISA se requiere de un paso de separacin para eliminar el conjugado enzimtico libre antes de proceder a determinar la cantidad de conjugado enzimtico enlazado.Existen dos tipos de Elisa:

En esta pregunta nos enfocaremos en la prueba Elisa de modo directo.Modo directo: Esta consta de dos etapas, las cuales consisten en primer lugar , las placas Elisa se preparan llenando los pocillos con la muestra en la cual se quiere detectar el antgeno. Luego se procede a lavar la placa para eliminar a los antgenos que no se han adherido.Despus de hacer esto se realiza el ingreso a los pocillos de los anticuerpos conjugados es decir marcados con una enzima, estos anticuerpos se van a unir a los antgenos ya presentes en los pocillos , se proceder a un lavado para eliminar los complejos enzimticos libres , es decir aquellos que no se unieron a la determinada muestra.Por ultimo se aadir un sustrato que le dar la coloracin a la muestra , luego las placas son llevadas al lector de Elisa y se procede a la deteccin del antgeno o anticuerpo de la enfermedad segn la respuesta del artefacto.

3.- Explique la tcnica de ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay) indirecto y sus aplicaciones en medicina.

Es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn esta tcnica, protenas recombinantes de la envoltura y el ncleo del VIH se absorben como antgenos en fase slida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas vricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin.

Es el ensayo ms popular, ya que un anticuerpo secundario , como ya lo explicaremos mejor en los siguientes prrafos , permite cuantificar una gran variedad de antgenos, por eso es un mtodo ms polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisin por tener un eslabn ms con respecto al mtodo directo.

El mtodo indirecto se realiza como en el mtodo directo , la fijacin del antgeno a los pocillos de la placa de Elisa , se lava la placa para eliminar aquellos que no se pudieron absorber , despus de esto se aade los anticuerpos especficos para este antgeno , se procede a lavar para eliminar aquellos anticuerpos que no se unieron a los antgenos . El paso siguiente ser incorporar a un anti-anticuerpo , es decir un anticuerpo secundario que ser capaz de reconocer el primer complejo antgeno anticuerpo ya mencionado anteriormente, este anticuerpo secundario se uniera al anticuerpo primario y gracias a este se podr obtener un seal mas amplificada , y una gran capacidad de reconocer los antgenos presentes en la muestra. Finalmente se agregar el sustrato que le dar la coloracin , se colocar en el lector de Elisa , y se obtendr los resultados.

Como podemos ver , las enzimas son muy importantes en esta muestra ya que , por su gran accin cataltica , actuaran en las muestras , dando como resultado un producto final que ser llevado finalmente al calormetro o al lector de Elisa.

4.- Explique la tcnica de microarrays y sus aplicaciones en medicinaLos microarrays de ADN son una herramienta que permite realizar anlisis genticos diversos basados en la miniaturizacin de procesos biolgicos. La primera aplicacin de esta tecnologa fue para medir simultneamente el nivel de expresin de miles de genes.

El funcionamiento de los microarrays de expresin se basa en la capacidad de las molculas complementarias de ADN de hibridar entre s. Pequeas cantidades de ADN, correspondientes a diversos genes cuya expresin se desea medir, son depositadas en una base de cristal. Para ello se utilizan robots de precisin que usan unas agujas especiales para obtener las molculas de sus recipientes y depositarlas en las coordenadas adecuadas. A estas muestras de ADN depositadas en el microarray las denominaremos dianas.

De las clulas que queramos medir su expresin obtendremos una muestra de ARN que se convertir en ADN complementario (ADNc) y se marcar con una molcula fluorescente. A esta muestra marcada la denominaremos sonda y se enfrentar a las dianas del microarray. Cada molcula de ADNc marcada de la sonda se mover por difusin hacia la diana que contenga su molcula complementaria para hibridarse con ella y quedar fijada all. Despus de un tiempo para que la mayora de las cadenas complementarias hibriden, el microarray se lava y se procede a hacer una medicin relativa de la cantidad de ADN de la sonda que ha quedado fijada en cada diana.

Se distinguen tres tipos de microarrays:

1. Microarrays para determinar la expresin gnica: detectan secuencias especficas de ARN.2. Microarrays para determinar el genotipo: detectan secuencias Especficas de ADN.3. Microarrays para determinar la resecuenciacin.

La expresin gnica, ms que la propia dotacin gnica, y los polimorfismos existentes en ellos es lo que explica y condiciona las diferencias de los individuos en la respuesta a los tratamientos.Esta tcnica permite analizar el comportamiento, es decir, la induccin o represin de todos los genes que se expresan en un tejido como consecuencia, por ejemplo, de una enfermedad o un tratamiento.Detecta prdidas o gananciascromosmicas,polimorfismos,mutacionesy cambiosen los niveles de expresin de los genes. Estos resultadosnos pueden permitir establecer si una persona tiene un patrno perfilde enfermedad, es susceptible de desarrollarla, o puede responder o no a un tratamiento.

El microarray es un soporte al que se han unido fragmentos de genes, oligonucletidos (fragmentos Cortos de ADN), o productos procedentes de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), por lo que el encuentro con material procedente del tejido del enfermo permite identificar, gracias a la complementariedad, aquellosgenes que estnpresentes.

Con ello se consigue la identificacin de genes presentes en los tejidos normales o enfermos comparando la carga y la expresividad de cada una de las muestras.Actualmente existen dos tipos de microarrays para determinar la expresin gnica, nos estamos refiriendo entonces, al microarrays de oligonucelotidos de ADN en los que se inmovilizan pequeos fragmentos de ADN sintetizados qumicamente (oligonucletidos) especficos para cada gen expresado. Actualmente por su homogeneidad, reproducibilidad y robustezson los ms usados., y al microarrays de ADN complementario, el cual ya se explico al inicio de la pregunta.

Sus aplicaciones en medicina como ya lo hemos mencionado antereiormente se utiliza para la clasificacin de enfermedades, conocimientos de los mecanismos fisiopatolgicos de las enfermedades , una vez determinada la expresin de un gen, si se conoce su funcin, se puede obtener mucha informacin sobre los mecanismos patognicos de una determinada enfermedad , asi como tambin la investigacin de nuevos frmacos.

5.- Marcadores celulares: protena verde fluorescente.La medusa bioluminiscente Aequorea victoria provee una herramienta til para la biologa celular, una protena que tiene la propiedad de emitir luz verde. La protena verde fluorescente (GFP, por sus siglas en ingles) ha sido modificada para emitir colores en muchas y diversas longitudes de onda. La GFP, junto con protenas derivadas de otros organismos, ofrece nuevas variedades de protenas fluorescentes. Entre otras caractersticas que la hacen, sin duda, especial, la protena fluorescente destaca por no necesitar intermediarios para su expresin en cualquier organismo vivo, ser susceptible de modificacin para mejorar su intensidad, cambiar colores de emisin, construir quimeras con otras protenas y servir de gen reportero, sensor bioqumico y medidor sensible de pH intra e intercelular, etc.

Desde su descubrimiento en 1962, la protena ha sufrido muchos cambios y sus aplicaciones involucran todas las reas de la biologa. La neurociencia ha sido una de las mas beneficiadas por los mltiples usos de la GFP. Uno de ellos ha sido marcar neuronas in vivo hasta con 90 colores fluorescentes, lo que ha permitido visualizar las redes de la arquitectura neural de un mismo organismo de una manera sin precedentes.

Conclusiones

La tcnica de PCR marco un hecho revolucionario, el ms grande de los ltimos 30 aos en el campo de la ciencia, que ha permitido estudiar y analizar muestras de ADN a grandes escalas en mltiples mbitos cientficos. La protena verde fluorescente cumple un rol importante en el campo de la neurociencia debido a su versatilidad y usos en los experimentos in vivo. La prueba Elisa consiste bsicamente en la deteccin de antgenos o anticuerpos presentes en una muestra, para ello se utilizan ciertos complejos enzimticos , que se unirn respectivamente a un antgeno ,ya sea un anticuerpo , y estos a su vez desarrollaran una serie de reacciones , gracias al ingreso de un determinado sustrato generar como producto final una muestra con un caracterstico color, como paso final , las muestras son llevadas al lector de Elisa. Esta prueba es generalmente usada para detectar enfermedades autoinmunes,como por ejemplo el VIH/SIDA. Existen dos tipos de Elisa, que son el mtodo directo y el mtodo indirecto, el mas usado ,ya que utiliza un anticuerpo secundario, que permite obtener una amplia sealizacin del antgeno. La tcnica microarrays nos ayuda a la lectura de la expresin de determinados genes , esto es un gran aporte a la ciencia ya que permite la deteccin de genes que expresan algn tipo de patologa , asi como tambin la investigacin de ciertos frmacos , ante la respuesta del individuo.

Bibliografa

Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986;51 Pt 1:26373.

Miesenbck G, De Angelis DA, Rothman JE. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 1998 jul 9;394(6689):1925.

http://www.sc.ehu.es/ccwbayes/doctorado/UsoDeChipsDeADN.pdf

http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf

http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043o.pdf

Resumen PDFLa reaccin en cadena de la polimerasa mltiple(PCR mltiple) es una modificacin de lareaccin en cadena de polimerasacon el fin de detectar rpidamentedelecionesoduplicaciones en un grangen.Este procesoamplifica muestras de ADN genmico usando mltiplescebadoresy una temperatura mediada porla ADN polimerasaen unciclador trmico.La PCR mltiple fue descrita por primera vez en 1988 como un mtodo para detectar deleciones en elgen de distrofina.Tambin se ha utilizado con elgen del esteroide sulfatasa.En 2008, se utiliz para el anlisis demicrosatlitesySNP. La PCR mltiple se compone de conjuntos de cebadores variados dentro de una nica mezcla de PCR para producirampliconesde diferentes tamaos que son especficos para diferentes secuencias de ADN.Al dirigirse a varios genes a la vez, informacin adicional puede ser obtenida de una prueba nica que de otro modo requeriran varias veces los reactivos y ms tiempo a realizar.Temperaturas de recocido para cada uno de los conjuntos de cebadores deben ser optimizadas para funcionar correctamente dentro de una sola reaccin, y tamaos de amplificacin, es decir, su longitud par de base, debe ser lo suficientemente diferentes para formar bandas distintas cuando se visualizaron porelectroforesis en gel.

Comentario PDFAl poder amplificar ms de un locus es una misma reaccin, la PCR mltiple se est convirtiendo en un ensayo de cribado rpido y conveniente, tanto en la clnica como en los laboratorios de investigacin. Si bien numerosos artculos y manuales discuten en detalle condiciones que influyen en la calidad de la PCR en general, relativamente poco se ha publicado sobre los factores experimentales importantes y las dificultades comunes que con frecuencia se encuentran en la PCR mltiple. Se ha examinado varias condiciones de la PCR mltiple, utilizando un gran nmero de pares de cebadores. Son de especial importancia para un ensayo de PCR mltiple exitoso las concentraciones relativas de los cebadores en los diferentes ADN, la concentracin del tampn de PCR, las temperaturas de ciclismo y el equilibrio entre el cloruro de magnesio y las concentraciones de desoxinucletidos. No hay duda de que la PCR mltiple podra convertirse en un mtodo tan estandarizado como la PCR normal.