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TECNICAS BASADAS EN ADN FINGERPRINTING SECUENCIACIÓN
Nombre: Dra. Claudia Etchebehere Institución: Grupo de Ecología Microbiana. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Montevideo, Uruguay
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
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CONTENIDO
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
‣ Clonado y secuenciación de SANGER
‣ Secuenciación masiva
‣ Técnicas de fingerprinting (DGGE, T-RFLP)
‣ Análisis de datos
‣ Ejemplos de nuestro laboratorio
‣ Desafíos y futuro
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CARACTERIZACION DE UN AISLAMIENTO
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APLICACION A COMUNIDADES MICROBIANAS
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BIBLIOTECA DE CLONES
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! DNA extraction
! PCR of the desired gene (16S rRNA gene Bacteria, Archea, a group, functional gene)
! Cloning the PCR product ● (Topo TA cloning kit)
! Pick the colonies (100 colonies)
! PCR of the gene cloned or plasmid extraction
! Sequencing
! Analysis
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RESULTADO
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ES POSIBLE INFERIR LA FUNCION DEL MICROORGANISMO
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VENTAJAS Y DESVENTAJAS
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VENTAJAS DESVENTAJAS
! Da información certera de los microorganismos que están presentes. Secuencias largas
! Podemos correlacionar con otros métodos (T-RFLP)
! Alto costo (800 dólares 100 secuencias)
! Laborioso
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PREGUNTAS QUE PODEMOS RESPONDER
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‣ ¿Qué microorganismos están en el reactor? ‣ Si, se logra buena identificación.
‣ ¿La comunidad cambia la cambiar el tipo de operación? ‣ Si, pero si son muchas muestras es caro y complicado
el análisis.
‣ ¿Porqué el reactor funciona mal? ‣ No siempre podemos responder esta pregunta
utilizando esta técnica.
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MÉTODOS DE SECUENCIACION MASIVA
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! Mas secuencias ! Mas rápido ! Menor costo
! Métodos disponibles ! 454 pyrosequence ! Ion Torrent ! Illumina Mi-seq ! Pac-Bio
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SECUENCIACIÓN DE SANGER
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Resultado: Fragmentos de diferente tamaño
según donde se incorpora ddNTP
ELECTROFORESIS CAPILAR
96 capilares simultaneamente 1000 nucleótidos de largo
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ION TORRENT
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PCR en emulsión en beads
Detecta cambios en el pH al adicionar una base
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ILLUMINA
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Amplificación en fase sólida
Detección de incorporación de nucleótido marcado
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PAC-BIO
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Se detecta la incorporación de nucleótidos en una sola molécula
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APLICACION AL ANALISIS DE COMUNIDADES MICROBIANAS
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ANÁLISIS DE DATOS
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! QIIME
! MOTHUR (https://www.mothur.org)
! Otros análisis
! PICRUSt permite inferir la función
! STAMP permite comparar pares de muestras
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RESULTADOS
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1er operac. 2da operac. Parada
Filo/Días 15 57 271 306 334 356 383 439 531 Promedio %
Acidobacteria 1,9 1,2 2,7 1,3 0,4 1 1,5 1,8 1,7 1,5Chloroflexi 19 23 13 24 11 9,9 13 21 12 16Firmicutes 19 17 14 21 26 56 52 49 48 33,5Hyd24-12 8 10 17 5,6 1,3 7,1 6,5 1,3 2,6 6,7OD1 0,2 0,4 0,4 0,3 1,8 0,8 1,6 1,8 3,5 1,2OP8 3,2 3 6,3 4,6 0,6 1,8 3,6 2,1 2,9 3,1Proteobacteria 8 8 14 6,6 2,2 3,1 4,2 4,9 5,5 6,3Synergistetes 7,5 5 4,4 8,7 2,9 4,1 3,5 4,5 7,5 5,3TM7 1,2 0,8 0,6 0,3 0,4 0,1 0,2 0,3 0,1 0,4TPD-58 2,5 0,6 0,2 0,1 0 0 0 0 0 0,4Thermotogae 3,3 3,4 5 1 0,1 0,3 0,5 0,4 0,6 1,6Verrucomicrobia 11 14 3,1 2,1 46 6 4,8 5,7 3,6 6,2*
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SECUENCIACIÓN MASIVA VS SANGER
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‣ Secuenciación masiva
! Extracción de ADN (2h) ! PCR de región ARNr16S (3h) ! Purificación (0,5h) ! Secuenciación masiva (10 h) ! Tiempo tot 13,5h
! 40 muestras simultáneas ! Resultado ◦ 10000 reads
! Costo ◦ 50-70 dólares
Cloning library
! Extracción de ADN (2h) ! PCR ARNr de 16S (3h) ! Clonado (5h) ! Repique de 100 colonias (3h) ! Crecer las colonias (24h) ! Extraer plásmido (2h) ! Secuenciación (12h) ! Tiempo tot 41h
! 1 muestra ! Resultado ◦ 100 secuencias
! Costo ◦ 700 dólares
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AUMENTA LA COBERTURA DE LA COMUNIDAD
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Cloning library Secuenciación masiva
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PROBLEMAS Y LIMITACIONES
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! Secuencias cortas que limitan la identificación (200-400nt).
! Cobertura de los primers.
! Análisis de gran cantidad de datos requiere capacidad informática importante.
! No se puede comparar muestras on line (BLAST)
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PRIMERS PARA SECUENCIACIÓN MASIVA
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COBERTURA DE LOS PRIMERS
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Cuidado al elegir los primers
Check primers en base Silva
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PREGUNTAS QUE PODEMOS RESPONDER
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‣ ¿Qué microorganismos están en el reactor? ‣ Si, pero puede haber dificultad en la identificación
‣ ¿La comunidad cambia la cambiar el tipo de operación? ‣ Si, pero si son muchas muestras es complicado el
análisis.
‣ ¿Porqué el reactor funciona mal? ‣ No siempre podemos responder esta pregunta
utilizando esta técnica.
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MÉTODOS DE FINGERPRINTING
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‣ Permiten tener una “foto” de la comunidad.
‣ Comparar comunidades diferentes.
‣ Las más utilizadas DGGE, T-RFLP
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BASES DE LOS METODOS
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DGGE
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PCRDGGE
MUESTRA
DNA
PCR
M 1 2 3 4 5 6
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DGGE
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A=TC≡G
Según la secuencia va a ser diferente la capacidad de migrar en el gel desnaturalizante.
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DGGE
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‣ Extracción de ADN
‣ PCR con un primer con GC clamp
‣ Detección por electroforesis en gel de agarosa
‣ Separación por electroforesis en gel de poliacrilamida
‣ Detección de bandas ‣ ‣ Análisis de perfiles
‣ Extracción de bandas del gel
‣ PCR y secuenciación de ADN de las bandas
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RESULTADOS
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Es posible obtener la secuencia a partir delas bandas
Análisis de perfiles mediante Gel compare
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T-RFLP Terminal-Restriction Fragment Length Polymorfisms
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MÉTODO T-RFLP
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‣ Extracción de ADN (3hs) ‣ PCR (2-3hs) ‣ Purificación y cuantificación PCR (0,5h) ‣ Digestión con enzimas de restricción (3hs) ‣ Precipitación de fragmentos (1,5h) ‣ Separación por electroforesis capilar (secuenciador
automático) ‣ Análsis de perfiles ‣ Identificación de T-RF
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ANÁLISIS DE RESULTADOS
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Análisis con Peak scannerCromatograma de T-RF
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ES POSIBLE CONOCER LA IDENTIDAD DE LOS T-RF
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Correlación con secuencias de bases de datos (MICA)
Clonado o aislamiento y secuenciación
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VENTAJAS Y DESVENTAJAS MÉTODOS FINGERPRINTING
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‣ Se pueden analizar muchas muestras simultáneamente
‣ Bajo costo (T-RFLP 10 dólares)
‣ Métodos rápidos
‣ Equipamiento de bajo costo
‣ Análisis relativamente fácil
‣ Se puede conocer la identidad de los organismos
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PREGUNTAS QUE PODEMOS RESPONDER
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
‣ ¿Qué microorganismos están en el reactor? ‣ No siempre, solo en el caso de que se logren identificar
los picos.
‣ ¿La comunidad cambia la cambiar el tipo de operación? ‣ Si, es el tipo de pregunta que respondemos.
‣ ¿Porqué el reactor funciona mal? ‣ No siempre podemos responder esta pregunta
utilizando esta técnica.
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ANÁLISIS DE DATOS
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‣ Comparación entre las muestras ‣ Análisis de Cluster ‣ Análisis de PCA
‣ Correlación con variables ambientales ‣ CCA
‣ Determinación de los índices de diversidad.
‣ Composición de géneros y especies de las diferentes comunidades.
PAST PAleontological STatistics
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EJEMPLO DE NUESTRO LABORATORIO
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
Inhibir la metanogénesis
Seleccionar los microorganismos productores de hidrógeno.
GLUCOSE
Fermentative bacteria
VOLATILE FATTY ACIDS, ALCOHOLS, H2 AND CO2
ACETATE
Acetogenic bacteria
METHANE
Methanogenic archaea
Methanogenic archaea
Producción de hidrógeno a partir de aguas residuales industriales
¿Que microorganismos se seleccionan en reactores de alta y baja producción de hidrógeno?
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EJEMPLO DE NUESTRO LABORATORIO
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
‣ 5 research groups
‣ 30 samples
‣ 20 reactors
‣ 5 different configurations: UASB, EGSB, CSTR, FBR, SBR
‣ Different OLR, HRT
‣ Different inoculum, with and without treatment
‣ Different substrates
16S rRNA gene massive sequencing
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REACTORES DE PRODUCCION DE HIDROGENO
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
▪ Low diversity
▪ High dominance
‣ High instability
▪ Lactic acid bacteria and propionic acid bacteria are the main competitors.
▪ Interactions between fermenters could enhance the hydrogen production.
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CORRELACIÓN CON VARIABLES AMBIENTALES
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
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MICROORGANISMOS SELECCIONADOS SEGUN LA PERFORMANCE DEL REACTOR
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
Group 1 High H2 production
Group 2 Middle H2 production
Group 3 Low H2 production
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DESAFÍOS Y FUTURO
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
‣ Mejorar la identificación, secuencias mas largas.
‣ Comparación con muestras en bases de datos.
‣ Análisis de gran cantidad de datos.
‣ Trabajar con ARN y expresión de genes.
‣ Conocer la gran mayoría no cultivable.
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DESAFÍOS Y FUTURO
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
‣ Single Cell Genomics
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GRUPO DE ECOLOGIA MICROBIANA
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
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TRATAMIENTO Y RECICLAJE DE AGUAS INDUSTRIALES M E D I A N T E S O L U C I O N E S S O S T E N I B L E S FUNDAMENTADAS EN PROCESOS BIOLÓGICOS. RED TEMÁTICA 316RT0508Financiado por:
3er curso RED TRITÓN Valparaíso (Chile) 26-julio-2017
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