tecnicas array
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Tcnica de CGH-array
Mara Rodrguez-Rivera Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Cncer-IMIM. Barcelona
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Introduccin a los microarrays
Arrays genmicos
Condiciones del ADN
Tcnica de CGH-array
Aplicaciones
ndice
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Introduccin
Qu es un microarray?
Tipos de microarrays
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Introduccin
Qu es un microarray?
Tipos de microarrays
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Mikro (del griego,pequeo) y array (del ingls,distribucin ordenada)
Coleccin de biomolculas ordenadas en filas y columnas sobre un soporte slido miniaturizado.
Introduccin: Qu es un microarray?
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Introduccin
Que es un microarray?
Tipos de microarrays
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Tejido (TMA)
Protenas
Clulas
Genmicos
Expresin
miRNA
Metilacin
Introduccin: Tipos de microarrays
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Tejido (TMA)
Protenas
Clulas
Genmicos
Expresin
miRNA
Metilacin
Introduccin: Tipos de microarrays
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Microarrays genmicos
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Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte slido que permiten detectar alteraciones en el genoma
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
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Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
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Array de oligos comerciales:
- Oligonucletido: secuencias pequeas de ADN 50pb
- Agilent TechnologiesTM, NimbleGen (RocheTM), BlueGnomeTM
- Diferentes formatos
- Microarrays prefabricados o custom
Array de BACs:
- BAC: Bacterial Artificial Chromosome
- Puede ser casero
- Perkin ElmerTM, BlueGnomeTM
Microarrays genmicos: Arrays de CGH
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Microarrays genmicos: Arrays de CGH
Estudio de hibridacin comparativa (ADN tumoral vs ADN control) que permite detectar ganancias y/o prdidas de material gentico
Microarrays de CGH
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Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
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Microarrays genmicos: Arrays de SNPs
Contiene adems sondas de oligonucletidos
correspondientes a variantes allicas de SNPs seleccionados
(oligoarray).
SNP ( Single nucleotide polymorphism ):
- Variacin de la secuencia de ADN que afecta a una
sola base
- 1 SNP cada 1000 bases
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Microarrays genmicos: Arrays de SNPs
Permite obtener el nmero de copias de ADN y el
genotipo (seal de fluorescencia para cada alelo)
Hibridacin no competitiva:
- La muestra problema y control (si disponible) se hibridan
en arrays independientes
- Posterior comparacin de resultados
Microarrays de SNP
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Microarrays genmicos: Arrays de SNPs
Prdida de heterocigosidad sin cambio en el nmero de copias (CNN-LOH)
Importancia en genes supresores de tumores:
mutacin heterocigota mutacin homocigota
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Genes supresores de tumores: p53
Mutacin p53
Proliferacin clulas anormales
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CGH SNP Hibridacin competitiva Hibridacin no competitiva
Muestra y control en Muestra y control se hibridan
un mismo array por separado
Ganancias y prdidas Ganancias y prdidas
LOH
CGH vs SNP
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No detecta alteraciones equilibradas
No detecta diferentes clones
>30% clulas tumorales
CGH y SNP:Limitaciones
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Protocolo tcnico
arrays CGH
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ADN:
Sangre perifrica o mdula sea Separacin de poblaciones celulares (microbeads)
Tejido en fresco
Tejido congelado (OCT) Micro-Macrodiseccin del tumor
Parafina Micro-Macrodiseccin del tumor
Microarrays genmicos: ADN
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Extraccin automatizada
Extraccin manual
Kits columnas
Kit manual
ADN: Tipos de extraccin
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Extraccin automatizada
Extraccin manual
Kits columnas
Kit manual
ADN: Tipos de extraccin
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Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
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Cantidad ADN:
500ng
Calidad ADN:
Espectofotmetro
ADN: Criterios de calidad
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Espectofotmetro: NanoDrop 1000
ADN: Criterios de calidad
Ratio ADN/ARN (A260/280) > 1.80
Ratio ADN/alcoholes, fenoles (A260/230) > 1.80
Concentracin
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Integridad ADN
ADN: Criterios de calidad
ADN no degradado ADN degradado (smear)
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Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
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Marcaje del ADN
ADN tumoral
ADN control
Desnaturalizacin
Marcaje
Cy5 -dUTP Cy3 -dUTP
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Marcaje del ADN
Marcaje aleatorio (Random Priming)
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Marcaje del ADN
Marcaje aleatorio (Random Priming)
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Marcaje del ADN
Marcaje aleatorio (Random Priming)
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Marcaje del ADN
Marcaje aleatorio (Random Priming)
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Preparacin del array e hibridacin (muestra y control)
Hibridacin
Muestra (Cy5)
Control (Cy3)
Hibridacin
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Unimos el mixer con el array
Hibridacin: Preparacin del array
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Pipeteamos la muestra dentro del mixer
Hibridacin
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Horneado
Hibridacin
48-72h
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Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
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Lavados de astringencia
Lavados y secado
Secado
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Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
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Plataforma MS200 NimbleGen, ROCHE TM
Escaneado del array
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Preparacin ADN
Marcaje
Hibridacin
Lavados y secado
Escaneado
Anlisis de datos
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Se obtiene una imagen con la lectura de los dos fluorocromos (Cy3 y Cy5)
Se genera un archivo por cada fluorocromo para poder analizar en forma de datos
Visualizacin de datos
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Anlisis
ADN tumoral > ADN control
Ganancia
ADN tumoral < ADN control
Prdida
ADN tumoral = ADN control
Normal
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Software para la visualizacin de los datos
Anlisis paralelo con tablas de datos
Anlisis de datos
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Software para la visualizacin de los datos
Anlisis paralelo con tablas de datos
Anlisis de datos
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Anlisis de datos: Principios
Sonda
Cromosoma Ideograma Cariotipo molecular
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Anlisis visual: Ejemplos
DEVA
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Anlisis visual: Ejemplos
Nexus
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Anlisis visual: Ejemplos
Nexus
Ganancia
Prdida
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Software para la visualizacin de los datos
Anlisis paralelo con tablas de datos
Anlisis de datos
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Anlisis datos: Ejemplos
N sondas: > 5 Log2 Ratio: < - 0.2 (Prdidas) > 0.2 (Ganancias)
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Aplicaciones arrays genmicos
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Oncohematologa Diagnstico
Pronstico
Investigacin
Post-natal y Pre-natal Sndromes asociados a ganancias/prdidas de material gentico:
Deleciones: ej sndrome de Cri-du-chat (5p-)
Aneuploidias: +21 (Sd.Down), +13 (Sd.Patau), +18 (Sd.Edwards), +X/Y (Sd.Turner, )
Alteraciones en genes asociados a retraso mental y autismo
Nuevos sndromes
Aplicaciones arrays genmicos
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Estudio de carcinomas de clulas renales (CCR) mediante arrays de CGH y cariotipo N=24
16 CCR de clulas claras
5 CCR papilares
2 CCR cromfobos
1 Oncocitoma
Tejido fresco: Estudio citogentico
Extraccin ADN
Aplicaciones arrays genmicos: Ejemplos
Poster SEAP- 081. M.Salido
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CCR-CC: Citogentica
45,X,add(X)(p28),der(1)t(1;1)(p36;q12),del(3)(p14),-14
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CCR-CC: CGH-arrays
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CCR-CC: CG vs CGH-arrays
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Buena herramienta complementaria
Diferentes formatos
Limitaciones
Coste cada vez menor
Resumen
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Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Cncer-IMIM. Barcelona
Agradecimientos: Dra.Blanca Espinet Dra.Marta Salido Dra.Anna Puiggros Carme Melero Dra.Silvia de Muga Dra.Nuria Juanpere Dr.Josep Lloreta Dr.Josep M Corominas Prof.Sergi Serrano
Agradecimientos: