T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ...T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ...

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ NEONATOLOJİ BİLİM DALI

ÇUKUROVA BÖLGESİNDE KORDON KANI GLUKOZ 6 FOSFAT

DEHİDROGENAZ AKTİVİTESİ, YAPISI, MOLEKÜLER ÖZELLİĞİ

VE YENİDOĞAN HİPERBİLİRUBİNEMİSİ ÜZERİNE ETKİSİ

Uzm. Dr. FERDA ÖZLÜ

YAN DAL UZMANLIK TEZİ

TEZ YÖNETİCİSİ

Prof. Dr. Mehmet SATAR

ADANA 2007

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ NEONATOLOJİ BİLİM DALI ÇUKUROVA BÖLGESİNDE KORDON KANI GLUKOZ 6

FOSFAT DEHİDROGENAZ AKTİVİTESİ, YAPISI,

MOLEKÜLER ÖZELLİĞİ VE YENİDOĞAN

HİPERBİLİRUBİNEMİSİ ÜZERİNE ETKİSİ

Uzm. Dr. FERDA ÖZLÜ

YAN DAL UZMANLIK TEZİ

TEZ YÖNETİCİSİ

Prof. Dr. Mehmet SATAR

DESTEKLEYEN BİRİM: Çukurova Üniversitesi Bilimsel Projeler Araştırma

Birimi

ADANA 2007

i

TEŞEKKÜR

Neonatoloji yan dal eğitimim sırasında birlikte çalışmaktan büyük mutluluk

duyduğum, birikimiyle eğitimimi pekiştiren başta tez yöneticim Sayın Prof Dr Mehmet

SATAR olmak üzere Prof Dr Nejat NARLI’ya, Doç Dr Hacer Y YAPICIOĞLU’na,

Uzm Dr Kenan ÖZCAN’a, Uzm Dr Erdal TAŞKIN’a ve bütün Yenidoğan Yoğun

Bakım Ünitesi çalışanlarına, araştırma görevlileri ve intörn doktor arkadaşlara ayrı ayrı

teşekkür ederim.

Tez çalışmamda biyokimyasal çalışmaları titizlikle gerçekleştiren Sayın Prof.Dr.

Kıymet AKSOY’a, Dr Şule Menziletoğlu YILDIZ’a, Uzm İsa ÜNLÜKURT’a teşekkür

ederim.

Kordon kanı toplanması sırasında destek veren başta Sağlık Bakanlığı olmak

üzere Adana Doğumevi, Çukurova Kadın Doğum ve Çocuk Hastalıkları Hastanesi

çalışanlarına teşekkür ederim.

Yan dal uzmanlık eğitimim süresince desteğini hep hissettiğim sevgili eşime

teşekkür ederim.

Tez çalışmamı TF2004LTP15No’lu proje olarak destekleyen Çukurova

Üniversitesi Bilimsel Projeler Araştırma Birimi’ne ayrıca teşekkür ederim.

Uzm Dr Ferda Özlü

Adana / 2007

ii

İÇİNDEKİLER

TEŞEKKÜR i

İÇİNDEKİLER ii

ŞEKİL LİSTESİ v

TABLO LİSTESİ vi

KISALTMALAR vii

ÖZET VE ANAHTAR SÖZCÜKLER viii

ABSTRACT-KEY WORDS x

1.GİRİŞ VE AMAÇ 1

2.GENEL BİLGİ 3

2.1. Yenidoğan sarılığı 3

2.2. Yenidoğan sarılığının fizyolojisi 3

2.2.1 Bilirubin sentezi 4

2.2.2 Bilirubinin plazma transportu 4

2.2.3 Bilirubin metabolizması ve karaciğerdeki transportu: 5

2.2.4 Alımı 5

2.2.5 Konjugasyon 6

2.2.6 Atılımı 6

2.2.7 Enterohepatik sirkülasyon 6

2.3 Yenidoğan sarılığının epidemiyolojisi 7

2.3.1 Irk, ailesel ve genetik faktörler. 7

2.3.2 Doğuma ait faktörler 8

2.3.3 Bebeğe ait faktörler 8

2.4 Anne sütü ve sarılık 8

2.5 Fizyolojik sarılık 9

2.6 Yenidoğanda patolojik sarılık 10

2.6.1 Rh uyuşmazlığı 11

2.6.2 ABO uyuşmazlığı 12

2.6.3 Eritrosit membran defektleri 12

iii

2.6.4 Hemoglobinopatiler 12

2.6.5 Polisitemi 13

2.6.6 Azalmış bilirubin atılımı 13

2.6.6.1 Criggler Najjar Sendromu 13

2.6.6.2 Gilbert Sendromu 13

2.6.7 Doğuştan metabolizma hastalıkları 14

2.6.7.1 Galaktozemi 14

2.6.8 Hipotiroidizm 14

2.6.9 Eritrosit enzim defektleri 14

2.6.9.1 Pirüvat kinaz eksikliği: 14

2.6.9.2 Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği ( G6PD enzim eksikliği): 14

2.6.9.2.1 Glukoz 6 fosfat Dehidrogenaz Enziminin Genetik Özellikleri 18

2.6.9.2.3. Türkiye’de Saptanan G6PD Varyantları 20

EÇ 3.GEREÇ VE YÖNTEM 22

3.1. Gereçler 22

3.2. Enzim Kinetik Çalışma 23

3.2.1. G6PD Aktivitesinin Kantitatif Ölçümü 23

3.2.1.1. Hemolizat Hazırlanması 23

3.2.1.2. Yöntem 24

3.2.2. G6PD Enziminin Kısmi Saflaştırılması 24

3.2.2.1. Ayıraçlar 25

3.2.2.2 Yöntem 26

3.2.3. Kısmi saflaştırılan enziminin kinetik özelliklerinin incelenmesi 26

3.2.3.1. Ayıraçlar 27

3.2.4. Moleküler Çalışma 31

3.2.4.1. DNA Eldesi 31

3.2.4.1.1. Ayıraçlar 31

3.2.4.1.2. Yöntem 32

3.2.4.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu 33

3.2.4.2.1. Ayıraçlar 33

iv

3.2.4.3. Amplifiye G6PD Gen Ürününün Restriksiyon Endonükleaz ile

Kesilmesi (RFLP)

34

3.2.4.4. Agaroz Jel Elektroforezi 35

3.2.4.4.1. Ayıraçlar 35

3.2.4.4.2. Yöntem 36

3.2.4.5. Mikroarray çalışma 37

4.BULGULAR 38

5.TARTIŞMA 48

6.SONUÇ ve ÖNERİLER 52

7.KAYNAKLAR 53

8.ÖZGEÇMİŞ 61

v

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil no Sayfa no

Şekil 1: Glukoz- 6-fosfat dehidrogenaz geni 18

Şekil 2: Eritrositlerdeki G6PD’nin oksidan ajanlara karşı ana metabolik rolü 19

Şekil 3: Olguların Gd Akdeniz mutasyonunun elektroforetik görünümü 40

Şekil 4a: BEBEK O.K’nın KmG6P eğrisi 41

Şekil 4b: BEBEK O.K’nın KmNADP eğrisi 41

Şekil 4c: BEBEK O.K’nın pH eğrisi 41

Şekil 5a: BEBEK F’nin KmG6P eğrisi 42

Şekil 5b: BEBEK F’nin KmNADP eğrisi 42

Şekil 5c: BEBEK F’nin pH eğrisi 42

Şekil 6a: BEBEK İ’nin KmG6P eğrisi 43

Şekil 6b: BEBEK İ’nin KmNADP eğrisi 43

Şekil 6c: BEBEK İ’nin pH eğrisi 43

Şekil 7a: BEBEK K’nin KmG6P eğrisi 44

Şekil 7b: BEBEK K’nin KmNADP eğrisi 44

Şekil 7c: BEBEK K’nin pH eğrisi 44

Şekil 8a: BEBEK D’nin KmG6P eğrisi 45

Şekil 8b: BEBEK D’nin KmNADP eğrisi 45

Şekil 8c: BEBEK D’nin pH eğrisi 45

Şekil 9a: BEBEK G’nin KmG6P eğrisi 46

Şekil 9b: BEBEK G’nin KmNADP eğrisi 46

Şekil 9c: BEBEK G’nin pH eğrisi 46

vi

TABLO LİSTESİ

Tablo no Sayfa no

Tablo I: Patolojik indirekt hiperbilirubinemi nedenleri 10

Tablo II: Hemolize yol açan ilaç ve kimyasallar 16

Tablo III: İnsan G6PD’sinin Moleküler Özellikleri 19

Tablo IV: En yaygın gözlenen G6PD varyantlarının kinetik özellikleri 20

Tablo V: Türkiye’de saptanan G6PD varyantları 21

TabloVI: G6PD ölçümü 24

Tablo VII: Kısmi saflaştırılan G6PD ait KmNADP değerinin saptanması 28

Tablo VIII: Kısmi saflaştırılan G6PD ait KmG6P değerinin saptanması 29

Tablo IX: Kısmi saflaştırılan G6PD’ye ait analog çalışması 30

Tablo X: PCR karışımı 34

Tablo XI: RFLP karışımı 35

Tablo XII: Olguların klinik bulguları 39

Tablo XIII: Olguların Kinetik Bulgularının GdB+ ve Gd Akdeniz mutasyonu ile

karşılaştırılması

47

vii

KISALTMALAR

CO Karbonmonoksit DNA Deoksiribonükleik asit Ig İmmünglobulin G6P Glukoz-6-fosfat G6PD Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz Gal-6-P Galaktoz-6-fosfat Gd A- A- tipi glukoz-6-fosfat dehidrogenaz varyantı Gd A+ A+ tipi glukoz-6-fosfat dehidrogenaz varyantı Gd B B tipi glukoz-6-fosfat dehidrogenaz varyantı Gd Akdeniz Akdeniz tipi glukoz-6-fosfat dehidrogenaz varyantı GSH Redükte glutatyon GSSH Okside glutatyon HMY Heksoz monofosfat yolu MgCl2 Magnesyumdiklorür NAD Nikotinamit adenin dinükleotit NADP Nikotinamit adenin dinükleotit fosfat NADPH Redükte nikotinamit adenin dinükleotit fosfat PCR Polimeraz zincir reaksiyonu SDS-PAGE Sodyum dodesül sülfat poliakrilamit jel elektroforezi UDPGT-1 Üridindifosfoglukuronat glukuronil transferaz-1

viii

ÖZET

Çukurova Bölgesinde Kordon Kanı Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz Aktivitesi, Yapısı, Moleküler Özelliği ve Yenidoğan Hiperbilirubinemisi Üzerine Etkisi

Yenidoğan indirekt hiperbilirubinemisinin en sık nedenleri kan grubu uyuşmazlıkları ve eritrosit enzim defektleridir. Daha önce Çukurova bölgesinde yapılan çalışmalarda indirekt hiperbilirubinemi olgularında glukoz 6 fosfat dehidrogenaz (G6PD) eksikliği %10-11,5 arasında tesbit edilmiştir. İlaç alımına bağlı hemolitik anemi, enfeksiyona bağlı hemolitik anemi ve yenidoğan sarılığı, glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği ile ilgili patolojilerdir. Kinetik çalışmalar, glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enzim eksikliği olan yenidoğanlarda şiddetli hiperbilirubinemiye eğilim olduğunu göstermektedir. Gd Akdeniz mutasyonu elektroforetik olarak normal bir hareketliliğe sahip %0-10 arasında bir aktivite gösteren ve Akdeniz bölgesindeki beyazlarda daha sık olarak gözlenen bir mutasyondur. Bu çalışmada glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan hastaların enzim kinetiklerinde ve mutasyondaki farklılıkların yenidoğan döneminde ortaya çıkabilen hiperbilirubinemiye etkisi, glukoz 6 fosfat dehidrogenaz kinetiğindeki farklılıklarının hiperbilirubineminin şiddetindeki rolü ve Çukurova bölgesindeki glukoz 6 fosfat dehidrogenaz varyasyonlarını araştırmayı amaçladık.

Çukurova Üniversitesi Balcalı Hastanesi, Adana Meydan Doğumevi, Çukurova Kadın Doğum ve Çocuk Hastalıkları Hastanesi’nde 1 Kasım 2004- 30 Kasım 2007 tarihleri arasında doğan 200 sağlıklı term erkek bebek alındı. Enzim eksikliği X’e bağlı ressesif geçişli olduğu, heterozigot kızlarda enzim aktivitesi oldukça geniş farklılıklar gösterdiği ve bu nedenle tarama testleri ile tanı alamayabilecekleri için kız bebekler bu çalışmaya alınmadı. Ayrıca prematür doğanlar, konjenital malformasyonu olan, mekonyum aspirasyonu olan, doğumun birinci saattindeki kan gazlarına göre perinatal asfiksisi olan, doğum haftasına göre ağırlığı düşük olan bebekler çalışma dışında tutuldu. Laboratuvara gelen kan örneklerinden glukoz 6 fosfat dehidrogenaz düzeyleri belirlendi. Enzim düzeyi düşük olan örneklerde kinetik çalışma yapıldı. Ayrıca saflaştırılan örneklerin DNA’ları izole edilerek moleküler çalışma yapıldı.

Çalışmaya alınan glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enzim eksikliği saptanan bebeklerin ve annelerinin kan grupları, bebeklerin kord kanında tam kan sayımı, direkt Coombs testi, total bilirubin, direkt bilirubin, retikülosit düzeyleri çalışıldı. Bebeklerin total bilirubin ve direkt bilirubin, hematokrit düzeyleri 3., 5., 7., 10. ve 15. günde kapiller kanda takip edildi. Amerikan Pediatri Akademisinin önerileri doğrultusunda bilirubin düzeylerine göre tedavi alması gerekenlere fototerapi veya kan değişimi uygulandı.

200 erkek bebekten altısında G6PD eksikliği saptandı (%3). Üç olguda Gd Akdeniz mutasyonu saptandı. Gd Akdeniz mutasyonu saptanan iki hastanın hiperbilirubinemi için tedavi gerektirecek kadar bilirubin düzeyleri yükselirken, bir hastanın bilirubin takiplerinde yükselme olmadı. Bu farklı klinik seyirde mutasyonun yanında kinetik farklılığında rolu olduğu düşünüldü. Mutasyonu saptanamayan diğer üç olgudan birinde kan değişimi gerektirecek kadar yükselen hiperbilirubinemi gelişirken, diğer iki olguda tedavi gerekmedi. Tüm olguların takibinde hemoliz saptanmadı. Bu

ix

konuda daha fazla olgu çalışması ve mutasyon analizlerinin yapılmasına ihtiyaç olduğu düşünüldü.

Anahtar Sözcükler: enzim kinetiği ve mutasyonu, glukoz 6 fosfat dehidrogenaz

eksikliği, hiperbilirubinemi, yenidoğan.

x

ABSTRACT

Glucose 6 Phosphate Activity, Structure, Molecular Property and Effect On Neonatal Hyperbilirubinemia in Cord Blood in Çukurova Region

The most common factors in etiology of the neonatal hyperbilirubinemia are blood group incompatibility and erythrocyte enzyme defects. The incidance of glucose 6 phosphate dehydrogenase deficiency in Çukurova region was 10-11, 5% in the former reports. Hemolytic anemia caused by medications and infections and neonatal hyperbilirubinemia are the main pathologies related to G6PD deficiency. Kinetic studies demonstrated a tendency to severe hyperbilirubinemia in G6PD deficient neonates. Gd Mediterranean, a common mutation in white race native to Mediterranean region, has a normal motility in electrophoretic studies and presents 0-10% activity. The aim of this study is to demonstrate the effect of variations in the enzyme kinetics and mutations on the neonatal hyperbilirubinemia in the G6PD deficient patients, the role of kinetic variations on the severity of neonatal hyperbilirubinemia and the glucose 6 phosphate dehydrogenase variations in Çukurova Region.

200 healthy term male neonates born at Çukurova University Balcalı Hospital, Adana Meydan Maternity Hospital, Çukurova Maternity and Children Hospital between1 November 2004-30 November 2007 were enrolled in this study. The female neonates were not involved in this study because the enzyme is inherited X linked recessive, enzyme activity shows great difference in heterozygote females and the probability of failure to diagnose the enzyme deficient females with this scanning tests. In addition, premature infants, with congenital malformations, meconium aspiration, perinatal asphyxia due to arterial blood gases results at the first hour of life, small neonates for gestational age are excluded in this study. In the laboratory G6PD levels evaluated from blood specimens. Kinetic studies are done in the enzyme deficient neonates. Also DNA of these neonates are purified and molecular studies performed.

Blood groups of the neonates and the mothers, complete blood count, direct coombs, total bilirubin, direct bilirubin levels, reticulocyte counts of the enzyme deficient neonates evaluated. Total bilirubin, direct bilirubin and hemotocrit levels of the neonates were followed in 3rd, 5th, 7th, 10th and 15th days of life from capillary blood. Phototherapy or blood exchange performed according to the American Academy of the Pediatrics protocol for hyperbilirubinemia.

Enzyme deficiency was detected in six out of 200 neonates (3%). Gd Med mutation was being detected in three enzyme deficient neonates. Two of these three enzyme deficient neonates had increased bilirubin levels needed for treatment, but one of neonates did not need treatment because of lower bilirubin levels. It is supposed that kinetic variation can play role in this different clinical progress. One of three enzyme deficient neonates without mutation had severe hyperbilirubinemia and blood exchange was being performed. Two of the neonates without mutation did not need any treatment for hyperbilirubinemia. Hemolysis is diagnosed in none of the enzyme deficient neonates. More studies about this subject for mutation analysis in a larger population is needed.

xi

Key Words: enzyme kinetics and mutation, glucose 6 phosphate deficiency, hyperbilirubinemia, neonate

1

1.GİRİŞ

Yenidoğan indirekt hiperbilirubinemisinin en sık nedenleri kan grubu

uyuşmazlıkları ve eritrosit enzim defektleridir. Daha önce Çukurova bölgesinde yapılan

çalışmalarda indirekt hiperbilirubinemi olgularında glukoz 6 fosfat dehidrogenaz

(G6PD) eksikliği %10-11,5 arasında tesbit edilmiştir 1. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz

pentoz fosfat yolunun ilk ve hız sınırlayıcı enzimidir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz

eksikliği bilinen en yaygın kalıtsal enzim defektidir ve dünyada 400 milyondan fazla

insanı etkilemektedir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eritrositlerin stabilitesinin ve

yaşama kabiliyetinin teminatıdır. Eritrositlerde G6PD eksikliğinin ortaya çıkarılması

hematoloji adına 1950’li yıllarda atılmış büyük bir adımdır.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği, eritrositlerin genel özellikleri ile

çevresel faktörlerin birbirini etkileyerek hemolize nasıl yol açtıklarını araştırmada bir

model oluşturmaktadır. İlaç alımına (ör: antimalaryal ilaçlar) bağlı hemolitik anemi,

enfeksiyona bağlı hemolitik anemi ve yenidoğan sarılığı, G6PD eksikliği ile ilgili

patolojilerdir. Kinetik çalışmalar, G6PD enzim eksikliği olan yenidoğanlarda şiddetli

hiperbilirubinemiye eğilim olduğunu göstermektedir2.

Dünyada da 400 milyon insanda bu enzim eksikliği olduğu bilinmektedir.

Özellikle Akdeniz ülkelerinde bu enzim eksikliğine daha sık rastlanmaktadır.

Dünya Sağlık Örgütünün kriterlerine göre (biyokimyasal, kinetik ve klinik) 442

farklı G6PD varyantı tanımlanmıştır. Dünyada en yaygın olarak bulunan enzim tipi

diğer varyantların tanımlanmasında ölçüt olarak kullanılan GdB+dir. Tüm populasyon

gruplarında çalışılmış en genel enzim tipidir. Gd Akdeniz elektroforetik olarak normal

bir hareketliliğe sahip %0-10 arasında bir aktivite gösteren ve Akdeniz bölgesindeki

beyazlarda daha sık olarak gözlenen bir mutasyondur 3.

Bölgemizden Adana, Balcalı ve Samandağ isimleriyle rapor edilen varyantlar

elektroforezde kat ettikleri yol, optimum pH, Km değerleri, substrat analoglarını

kullanabilme yetenekleri, inhibitörleri ve sıcaklık stabiliteleri normal enzim ile

karşılaştırılarak saptanmıştır 4.

2

Kord kanında enzim mutasyonu araştırmak amacıyla Malezya’dan yapılan bir

çalışmada sarılığı olan olgularda G6PD Viancghan, G6PD Mahidol ve G6PD Akdeniz

mutasyonları sık bulunmuş ancak sarılık kliniği açısından üç mutasyon arasında fark

gösterilememiştir5. Bölgelerindeki G6PD mutasyon farklılıklarını araştırmak amacıyla

Hindistan’dan yapılan başka bir çalışmada G6PD Akdeniz mutasyonu sık bulunmuş ve

G6PD Kerala-Kalyan ve Orissa mutasyonlarının Hint orijinli olgularda belirgin olduğu

gösterilmiştir 6.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz geni 13 eksondan ve 12 introndan oluşmaktadır.

Enzimin fonksiyonunu belirleyen G6PD genini 515 amino asit kodlamakta olup

mRNA’sı 18 500 baz çifti uzunluğundadır. Genel olarak birden fazla alt birimden

oluşan G6PD’nin sentezinden yalnız bir yapısal gen sorumlu olduğu için enzim tek tip

alt birim içermektedir. İnsana ait G6PD enziminin aktif formda iken moleküler

ağırlıkları 59 265 dalton olan 2 veya 4 alt birimden oluşmaktadır7,8.

Ancak son yıllarda bu yöntemlere ilaveten enzimin amino asit dizisinden ve

oligonükleotit probların hazırlanması ile cDNA dizisindeki nükleotit farklılığından

yararlanılarak moleküler düzeyde varyant analizi yapılmaya başlanmıştır4.

Bölgemizde daha önce kord kanındaki enzim düzeyleri ile ilgili çalışma yapılmış

olmasına rağmen ve enzim kinetik farklılığının hiperbilirubinemi üzerine etkisi

hakkında yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır.

Bu çalışmada glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan ve olmayan hastaların

enzim kinetiklerinde ve mutasyondaki farklılıkların yenidoğan döneminde ortaya

çıkabilen hiperbilirubinemiye etkisi, G6PD kinetiğindeki farklılıklarının

hiperbilirubineminin şiddetindeki rolü ve Çukurova bölgesindeki G6PD varyasyonlarını

araştırmayı amaçladık.

3

2. GENEL BİLGİLER

2.1 YENİDOĞAN SARILIĞI

Sarılık yenidoğan döneminin en yaygın sorunlarından biridir. Günümüzde de hala

hekimler ve aileler için önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Sarılıklı bebeklerin

büyük bir kısmı tamamen sağlıklı olmasına karşın, konjüge olmayan bilirubinin santral

sinir sistemine toksik etkileri nedeniyle endişe yaratmaktadır. Yenidoğan bebeklerin

hemen tümünde serum bilirubin düzeyleri erişkinlere göre yüksektir ve bunların

yarısından çoğu da hayatın ilk haftasında klinik olarak sarıdırlar.

Fizyolojik yenidoğan sarılığı bilirubin metabolizmasındaki temel basamakların

aktivite düzeylerindeki normal gelişimsel farklılıklar sonucunda oluşan aşırı bilirubin

yükü nedeniyle ortaya çıkar9. Bu tip sarılıklar bir araştırma ve tedaviyi gerektirmezken,

term bebeklerde 12,9 mg/dl’yi aşan durumlar patolojik olarak kabul edilir ve etiyolojiye

yönelik ileri araştırma yapılması gerekir.

Maisels’in 1981’de ilk tariflediği şekilde, sarılığın hayatın ilk 24 saatinde

başlaması, serum bilirubininin saatte 0,5 mg/dl’den fazla bir artış hızı göstermesi, term

bebekler için serum total bilirubin düzeyinin 12,9 mg/dl’yi aşması ya da sarılığın bir

haftadan daha uzun sürmesi gibi durumlarda patolojik sarılıktan bahsedilir10. Patolojik

sarılıkların çoğunda anne sütü ile beslenme dışında sarılığa yol açan etiyolojik bir faktör

gösterilememiştir11.

2.2 YENİDOĞAN SARILIĞININ FİZYOLOJİSİ

Bilirubin metabolizmasındaki ana basamaklar; bilirubin sentezi, plazmada

taşınması, karaciğere alımı, hepatik konjugasyon, safraya atılması ve barsaktan geri

emilmesidir.

4

2.2.1 Bilirubin sentezi:

Bilirubin hem katabolizması sonucunda oluşan yeşil bir pigment olan

biliverdinin indirgenmesi sonucunda oluşan yeşil-turuncu bir pigmenttir. Ferrik iyonu

çevreleyen bir iyonik halkası olan hem hemoglobin, myoglobin, katalaz, peroksidaz,

nitrik oksit sentetaz ve sitokromlardan oluşan çeşitli hemoproteinlerin non-aminoasit

bölümüdür.

Yenidoğanlarda üretilen bilirubinin yaklaşık %80’i dolaşan eritrositlerin

hemoglobininden gelen eritropoetik hem metabolizmasından kaynaklanır. Kalan %20

ise noneritropoetik hemin yıkılması ile ortaya çıkar. Bilirubin sentezinin büyük

kısmından sorumlu olan eritrositlerin yıkımını arttıran herhangi bir süreç eritropoetik

hem yıkımında ve bilirubin yükünde artışa yol açar. Bir gram hemoglobinin

katabolizması 34 mg bilirubin oluşumuna neden olur. Yenidoğanda doğumu takiben

yıkım altında olan kemik iliği, dalak ve karaciğer dokusundaki eritrosit prekürsörleri

bilirubin oluşumuna erişkindekinden daha fazla oranda katkıda bulunur.

Hem molekülünün katabolik yolundaki ilk basamak aynı zamanda hız kısıtlayıcı

basamak olan biliverdin oluşumudur. Mikrozomal bir enzim olan hem oksijenazın

etkisiyle gerçekleşen bu basamakta hemin alfa metilen bağı açılır, böylece vücutta

yeniden kullanılabilen demir ve solunum yoluyla uzaklaştırılan karbon monoksit (CO)

açığa çıkar12. Sonuçta biliverdin redüktaz aktivitesi ile hemen indirgenecek olan

biliverdin oluşur. Biliverdin suda eriyebilen ve kolayca atılabilen bir moleküldür.

Memelilerde biliverdin enerji gerektiren bir basamak olan sitozolik NADPH bağımlı

biliverdin redüktaz enzimi ile hızla bilirubine dönüştürülür. Sonuçta ortaya çıkan

bilirubin ankonjuge veya indirekt bilirubindir ve lipofilik olduğu için lipid hücre

membranlarını kolayca geçebilme ve normal pH’da suda erimeme özelliklerine

sahiptir13,14.

2.2.2 Bilirubinin plazma transportu:

Hemin yıkılması ile oluşan ankonjuge bilirubin serumda taşınamaz, karaciğer ya

da böbrek tarafından atılamaz, çünkü serbest bilirubinin çözünürlüğü 7,8’in altındaki

pH’larda oldukça düşüktür. Ancak ankonjuge bilirubin plazma albumini veya hepatik

ligandin gibi nonpolar, hidrofobik bileşikler için yüksek afiniteli proteinlere

5

bağlandığında plazma gibi su içeren solüsyonlarda çözünür hale gelir. Albuminin

ankonjuge bilirubin molekülüne yüksek afinitesi olsa da diğer bileşikler bağlanma

bölgeleri için yarışa girerler. Her bir albumin molekülü yüksek afinite ile bilirubinin bir

molekülünü ve daha zayıf bir afinite ile de ikincisini bağlama kapasitesine sahiptir.

Bilirubinin albumine bağlanması reversibldır. Bilirubin bağlanması dinamik bir süreçtir

ve her zaman albumine bağlı olan ve olmayan bilirubin miktarı dengedir. Term bir

yenidoğanın normal serum albumin konsantrasyon sınırları içerisinde (3,5-5 mg/dl)

maksimum 25-30 mg/dl konsantrasyondaki bilirubini taşıyacak albumin bağlanma

bölgesi vardır.

Yenidoğanlar diğer yaş gruplarından daha düşük pH’ya ve özellikle hayatın ilk

günlerinde daha düşük serum albumin konsantrasyonuna sahip oldukları için yenidoğan

döneminde albuminin bilirubine afinitesinin daha düşük olması beklenir. Düşük pH

bilirubinin albumin bağlanma bölgesinden ayrılmasını kolaylaştırır. Ayrıca serbest

bilirubinin çözünürlüğünü de azaltarak kolayca hücrelere girişine olanak sağlar.

2.2.3 Bilirubin metabolizması ve karaciğerdeki transportu:

Hepatik sinüzoidlerde bulunan delikler bilirubin-albumin kompleksinin disse

aralığına geçişine ve böylece hepatosit membranı ile temasına izin verir. Hepatositte

bilirubinin alımı, konjugasyonu ve atılımı olmak üzere 3 ana basamak meydana gelir.

Her bir basamak erişkinle karşılaştırıldığında yenidoğanda yetersiz kapasitededir.

Hepatik alım ve konjugasyon basamakları fizyolojik sarılığın oluşum mekanizmasına

önemli ölçüde katkıda bulunur.

2.2.4 Alımı:

Albuminden ayrılan ankonjuge bilirubinin hepatosit içine alınışı enerji

gerektirmeyen bir basamaktır. Hücre duvarını geçtikten hemen sonra suda erimeyen

ankonjuge bilirubin hücre içi proteinlere bağlanır. Sitoplazmik bu proteinlerin en

önemlisi glutatyon-S transferaz (Y proteini) olarak bilinen ligandindir, diğer bağlayıcı

protein Z-proteinidir. Ligandinin bilirubin bağlama kapasitesi albuminden düşük

olmasına rağmen toplam bilirubin bağlama kapasitesi fazla olduğundan hepatosit içine

alınmada da etkili olmaktadır. Bilirubin bu proteinlere gerek duyulmaksızın membran-

membran transferi ile de endoplazmik retikuluma geçebilir 13,14.

6

2.2.5 Konjugasyon:

Bilirubin konjugasyonu endoplazmik retikulumda üridindifosfat (UDP)-

glukuronil transferaz enziminin katalizörlüğü ile oluşur. Bir dizi enzimatik reaksiyon

sonucunda UDP-glukuronik asitten bilirubine glukuronil asit transfer edilerek

konjugasyon sürecinin ilk aşamasında bilirubin monogluglukuronid oluşur. Oluşan

monoglukuronid ya ekskrete edilir ya da depolanarak diglukuronid haline

dönüştürülür13,14. Konjuge bilirubin suda çözünen bir maddedir.

2.2.6 Atılımı:

Bilirubin konjuge olduktan sonra büyük konsantrasyon farkına karşın enerji

gerektiren aktif bir süreçle safraya atılır. Bilirubinin transhepatik taşınmasında konjuge

bilirubinin hepatositten kanaliküllere taşınması hız kısıtlayıcı bir basamaktır. Artmış

bilirubin yapımı hallerinde ekskresyon kapasitesindeki fizyolojik kısıtlanma nedeniyle

orta derecede konjuge bilirubin artışı görülebilir.

2.2.7 Enterohepatik sirkülasyon:

Barsağa ulaşan konjuge bilirubin geri emilemez. Konjuge bilirubin stabil

olmayan ester olarak intestinal lümende kolayca ankonjuge şekle hidrolize olabilir.

Yenidoğanlarda başlangıçta mukozal bir enzim olarak bulunan ve daha ileri dönemlerde

bakterilerce oluşturulan beta glukuronidaz enzimatik dekonjugasyona, yenidoğanın üst

intestinal sistemindeki alkali pH’da nonenzimatik hidrolize neden olur. Ayrıca

erişkinlerde barsak lümenindeki bakteriler konjuge bilirubini sterkobilin gibi geri

emilemeyen son ürünlere çevirirken yenidoğanların barsak lümeni sterildir. Oluşan

ankonjuge bilirubin muhtemelen pasif mekanizma ile geri emilir. Geri emilen bilirubin

portal sirkülasyon ile tekrar karaciğere gelmektedir. Bilirubin sentezindeki artış ile

birlikte enterohepatik dolaşımdaki artış immatür yenidoğan karaciğerinin metabolize ve

ekskrete edebileceğinin üzerinde bir bilirubin yüküne yol açar.

Distal barsak kesimlerine gelen bilirubin ise burada bir seri hidroksilasyon ve

redüksiyon işlemleri ile ürobilinoidlere (ürobilin, ürobilinojen, sterkobilinojen,

sterkobilin) dönüşür. Bu aşamada E.coli ve Clostridyum perfringens rol oynamaktadır.

Oluşan ürobilinojenin de bir kısmı karaciğer tarafından reabsorbe olup enterohepatik

7

sirkülasyona girer. Böylece total hepatik bilirubin ekskresyonun hemen hepsi fekal yolla

atılırken, çok küçük bir kısmı idrarla ürobilinojen olarak atılır15.

2.3 YENİDOĞAN SARILIĞININ EPİDEMİYOLOJİSİ

Yenidoğan sarılığı bilirubin metabolizmasındaki şu mekanizmalardan bir veya

daha fazlasının sonucu olarak ortaya çıkar:

1. Bilirubinin aşırı yapımı

2. Bilirubinin hepatosit içine yetersiz alımı ve taşınması

3. Hepatik mikrozomlarda yetersiz konjugasyon

4. Bilirubin atılımında yetersizlik

5. Bilirubinin artmış enterohepatik dolaşımı

Her ne kadar yenidoğanların tamamına yakını yukarda tanımlanan

mekanizmalarla fizyolojik sarılığa sahip olsa da epidemiyolojik çalışmalar

hiperbilirubineminin şiddet ve süresinin; gestasyon yaşı, doğum ağırlığı, ırk, coğrafi

bölge, genetik yapı, beslenme durumu ve beslenme tipine göre belirgin olarak

değişebileceğini göstermektedir16.

2.3.1 Irk, ailesel ve genetik faktörler:

Siyah ırkta beyazlara göre fizyolojik sarılığın pik serum bilirubin

konsantrasyonu daha düşüktür. Asya ırkında fizyolojik sarılık daha belirgin ve daha

uzamıştır13. Japon, Çinli, Kızılderili ve Yunanlılarda maksimum bilirubin düzeyinin

diğer milletlere göre iki kat daha fazla olduğu bildirilmiştir 17,18.

Term yenidoğanlarda sarılıklı kardeş öyküsünün hiperbilirubinemi riskini

anlamlı olarak arttırdığı bilinmektedir19.

Criggler-Najjar ve Gilbert sendromu ile de ortaya konulduğu gibi genetik

faktörler de hiperbilirubineminin gelişmesinde etkilidir20.

8

2.3.2 Doğuma ait faktörler

İndüksiyonla doğum sırasında anneye oksitosin verilmesinin hiperbilirubinemi

riskini arttırdığı gösterilmiştir. Ancak mekanizması tam olarak ortaya konulamamıştır21.

Normal spontan vajinal yolla doğanlarda sezaryen ile doğanlara göre daha yüksek

bilirubin düzeyleri tespit edilmiştir22.

2.3.3 Bebeğe ait faktörler:

Doğum ağırlığı ve prematürelik hiperbilirubinemi için kuvvetli risk teşkil eden

faktörlerdir. Kırk haftalık doğanlarla kıyaslandığında 36-38 haftalık doğanlar 7-8 kez,

36 haftadan erken doğanlar ise 13 kez artmış ciddi hiperbilirubinemi riski taşırlar23.

Çalışmalar erkek infantlarda hiperbilirubinemi riskinin kızlardan daha yüksek

olduğunu göstermiştir24.

2.4 ANNE SÜTÜ VE SARILIK

Yenidoğan fizyolojik sarılığının şiddetini ve paternini değiştiren en sık ikinci

değişken beslenme metodudur. Yapılan meta analiz çalışmaları, anne sütü ile

beslenenlerde formüla ile beslenenlere göre 12 mg/dl üzerindeki bilirubin yüksekliği

riski 3 kat, 15 mg/dl üzerindeki bilirubin yüksekliği riski 6 kat arttığını göstermiştir25.

Burada iki farklı fakat ilişkili olay tanımlanmıştır:

Birincisi erken başlangıçlı anne sütü sarılığı; hayatın ilk günlerinde ortaya çıkan

anormal bir durumdur. Bunun oluşumunda sütün kendisi değil yetersiz alımı etkendir.

Dehidratasyon, gecikmiş ve azalmış mekonyum pasajı, buna bağlı artmış intestinal geri

emilim ve azalmış kalori alım mekanizmaları ile sarılığa yol açar26.

İkincisi geç başlangıçlı anne sütü sarılığı; hayatın beşinci gününden sonra

başlayan ve birkaç hafta hatta hayatın üçüncü ayına dek sürebilen ve yenidoğan

fizyolojik sarılığının normal bir varyasyonu olarak kabul edilen bir durumdur27.

Araştırmalar anne sütü içinde ya hepatik glukuronil transferazı inhibe eden ya da

bilirubinin enterohepatik dolaşımını arttıran bir maddeyi tanımlamaya odaklanmıştır.

Anne sütünde bulunan pregnan-3alfa,20beta-diol adlı bir steroidin hepatik glukuronil

9

transferazı inhibe ettiğini belirten ilk çalışmalar daha sonraki bulgularla

desteklenmemiştir27. İkinci teori anne sütündeki serbest yağ asitlerinin hepatik

glukuronil transferazı inhibe ettiği yönünde olmuş ancak bu teoride daha sonraki

çalışmalarda destek görmemiştir28. Sonuç olarak anne sütü sarılığının mekanizması tam

olarak aydınlatılamamıştır. Ancak son yıllarda anne sütü sarılığı ile Gilbert sendromuna

yol açan gen polimorfizmi arasında kurulan ilişki genetik faktörlerin de etkili

olabileceğini göstermektedir29.

2.5 FİZYOLOJİK SARILIK

Yenidoğanda sarılık plazma bilirubin düzeyinin deri ve skleralarda gözle

görülebilir sarı renge neden olacak kadar yükselmesidir. Yaşamın ilk haftasında ortaya

çıkan geçici hiperbilirubinemi fizyolojik sarılık olarak adlandırılır. Fizyolojik sarılık iki

fazda gözlenir. Faz I ilk üç gün içinde pik değerine ulaşan beşinci güne kadar bilirubinin

azaldığı dönemi kapsar. Bu dönemden sonra bilirubinin iki hafta kadar 2 mg/dl

civarında sabit kaldığı dönem faz II olarak adlandırılır. Faz I fazla miktarda olan

bilirubin yapımının konjugasyon eksikliği ile birlikte olması nedeniyle görülür30. Faz II

fizyolojik sarılığın mekanizması daha az bilinmekle birlikte bilirubinin hepatik

alımındaki eksiklik ile birlikte devam eden aşırı bilirubin yükünden kaynaklandığı

düşünülmektedir13.

Fizyolojik sarılık tanı kriterleri:30

1. Sarılığın ilk 24 saatten sonra başlaması

2. Total bilirubin artış hızının günde 5 mg/dl’den fazla olmaması

3. Total bilirubin düzeyinin term bebeklerde 12.9 mg/dl’yi, preterm bebeklerde 15

mg/dl’yi geçmemesi

4. Direkt bilirubin düzeyinin 2 mg/dl’yi geçmemesi

5. Sarılığın term bebeklerde bir haftadan, preterm bebeklerde iki haftadan uzun

sürmemesi

10

2.6 YENİDOĞANDA PATOLOJİK SARILIK Yenidoğanda patolojik indirekt hiperbilirubinemi nedenleri Tablo I’de özetlenmiştir10 Tablo I: Patolojik indirekt hiperbilirubinemi nedenleri A- Artmış bilirubin yapımı

1-Hemolitik hastalıklar

a. İmmün mekanizmalı

Rh uyuşmazlığı

ABO uyuşmazlığı

Subgrup uyşmazlığı

b.Kalıtsal

Eritrosit membran defektleri ( herediter sferositoz, eliptositoz, stomatositoz)

Eritrosit enzim defektleri ( glukoz-6 fosfat dehidrogenaz eksikliği, pirüvat kinaz eksikliği)

Hemoglobinopatiler ( alfa talasemi, beta talasemi)

Anstabil hemoglobin

2- Diğer nedenler

Sepsis

Dissemine intravasküler koagülasyon

Kanama; pulmoner, abdominal, serebral, ekstravazyon

Polisitemi Makrozomik, diabetik anne bebeği

3-Artmış bilirubinin enterohepatik dolaşımı

B-Bilirubin atılımında azalma

1- Prematürite

2-Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği

3- Doğuştan metabolizma hastalıkları

a. Crigler Najjar sendromu tip1 ve tip 2

b. Gilbert sendromu

c. Tirozinemi

d. Hipermetioninemi

11

Tablo I: Patolojik indirekt hiperbilirubinemi nedenleri (DEVAMI) 4-Metabolik nedenler

a. Hipotiroidism

b. Hipopitüiterizm

2.6.1 Rh uyuşmazlığı: Rh immünizasyonun olabilmesi için Rh (-) bir anne Rh (+) bir bebek taşımalıdır.

Maternal immünizasyon için fetal eritrositlerin anne kanına geçmesi gerekmektedir. Rh

sistemindeki antijenler C,c,D,d,E,e olarak isimlendirilir. Eritrositler üzerinde D antijeni

varsa ( homozigot DD veya heterozigot Dd) Rh (+) olarak isimlendirilir. D antijeni fetal

eritrosit üzerinde 11. haftadan itibaren belirmeye başlar. Anti D antikoru 19S ve 7S

yapısında olup 7S yapısında olanlar plasentayı geçerek fetusta hemolize neden olurlar.

Anti D antikoru ile kaplanan eritrositler karaciğer ve dalakta parçalanır. Fetal hücreler

gebeliğin herhangi bir döneminde anne dolaşımına geçebilir. Ancak en fazla geçiş

doğum sırasında ya da anmiyosentez sırasındaki travma ile olur. İlk gebelik sırasında

anti D antikoru oluşan annelerin genellikle Rh (+) annelerden doğdukları saptanmıştır.

Bu anneler fetüs iken kendi annelerinden geçen Rh (+) eritrositlerle sensitize oldukları

düşünülmektedir. Rh (-) annenin Rh (+) gebelik sayısı arttıkça annenin sensitizasyonu

artmaktadır31.

Hastalığın şiddeti klinik bulgu vermeyen minimal hemolizden derin anemi,

eritroblastozis fetalis ve hidrops fetalis tablosuna kadar değişkenlik göstermektedir.

İntrauterin dönemde anemi, doğumdan sonra hiperbilirubinemi önemli sorunlardır.

Etkilenen bebek hemolize eritrosit yapımını arttırarak cevap verir. Bu nedenle kan

periferik yaymasında çekirdekli eritrositler ve retikülosit düzeyinde yükselme görülür.

Kemik iliği dışında aktif eritropoezis olur ve hepatosplenomegali gelişir.

Sarılık genellikle doğumda yoktur, çoğunlukla ilk 24 saat içinde, özellikle de ilk

4-5 saat içinde belirgin olur. Sarılığın ciddiyeti hemolizin ciddiyetini ve karaciğerin

konjugasyon kapasitesini gösterir.

12

2.6.2 ABO uyuşmazlığı:

Anti A ve anti B antikorları Ig A, Ig M, Ig G yapısındadır. A ve B kan grubunda

olanlarda bulunan anti A ve anti B antikorlar çoğunlukla Ig M yapısında, O kan

grubunda olanlarda ise çoğunlukla Ig G yapısındadır. Bu nedenle ABO hemolitik

hastalığı olan bebeklerinin annelerinin hemen tamamı O grubundadır.

ABO hemolitik hastalığında spesifik tanı koydurucu bir test yoktur. Sarılığın ilk

24 saat içinde ortaya çıkması, anne serumunda yüksek titrede Ig G yapısında anti A/B

antikor varlığının gösterilmesi, periferik yaymada sferositlerin görülmesi tanıda

önemlidir. Vakaların ancak %33’ünde Coombs testi pozitifliği saptanabilir32.

Klinik olarak belirgin hemolitik hastalık bulguları göstermeyen bebeklerde ABO

uyuşmazlığı olmayan bebeklere göre hiperbilirubinemi insidansı, maksimum bilirubin

değeri ve retikülosit sayısı daha yüksek, hemoglobin değeri daha düşük bulunmuştur.

Bu bebeklerde takipte uzamış anemi saptanmıştır. Bu durum ABO uyuşmazlıklarında

belirgin hemolitik hastalık bulguları görülmese de eritrosit yıkımının olduğunu

göstermektedir32.

2.6.3 Eritrosit membran defektleri:

Herediter sferositoz, eliptositoz, piropoikilositoz, piknositoz ve stomatositoz

sendromlarının tanıları yenidoğan döneminde zordur, çünkü bu dönemde eritrosit şekil

ve boyutları oldukça farklılık gösterebilir. Herediter sferositozluların %75’i otozomal

dominant kalıtım gösterdiği için ailede anemi, sarılık, safra kesesi taşı varlığı,

splenektomi öykülerinin pozitifliği tanıyı destekler. Ağır anemi ve hidrops fetalis,

herediter sferositoz ile band 3 ve spektrin proteinine ait defektif genler birlikteliğinde

karşımıza çıkabilir10.

2.6.4 Hemoglobinopatiler:

Genellikle yenidoğan döneminde ortaya çıkmazlar. Homozigot alfa talasemi

erken yenidoğan döneminde anemi, hemoliz, hidrops fetalis, ölü doğum veya doğumdan

kısa bir süre sonra ölüme neden olabilir.

Hemoglobin F’de beta zinciri bulunmadığı için beta talasemi yenidoğanlarda

kendini göstermez.

13

Orak hücreli anemi de, hemoglobin F’in Hb S üzerinde polimerizasyonu ve

oraklaşmada inhibitör etkisi olduğundan yenidoğan döneminde klinik bulgu vermez 10 .

2.6.5 Polisitemi:

Bir gram hemoglobinin yıkımı sonucunda 35 mg bilirubin açığa çıkar. Bu bilgi

ışığında yüksek hemotokrit değerleri yenidoğan sarılığı için bir risk faktörüdür. Artmış

eritrosit hacmi karaciğere artmış bilirubin yüküne neden olur10.

2.6.6 Azalmış bilirubin atılımı

2.6.6.1 Criggler Najjar sendromu:

Tip 1 ve 2 UGT1A1 geni üzerindeki beş eksonundan herhangi birinde bir veya

daha fazla mutasyon ile veya genin kodonlamayan veya intron bölgelerindeki

mutasyonlar ile ortaya çıkar. Tip 1’de uridindifosfoglikuronat glukuronil transferaz

aktivitesi hemen tamamen yoktur. Yaşamın ilk 2-3 gününde ağır hiperbilirubinemi

neden olur ve genellikle etkilenen bebeklerde kan değişimine ihtiyaç vardır. Beyin

hasarı riski vardır. Karaciğer transplantasyonu tek tedavi yöntemidir. Fenobarbital

tedavisi tip 1’de etkisizdir veya çok az etki gösterir. Tip 2’de ise fenobarbital tedavisi

total serum bilirubin konsantrasyonunu %30-80 oranında azaltabilir. Tip 2 hafif

hiperbilirubinemi ile karakterizedir. Enzim eksikliği parsiyeldir. Ancak bu tipte de

kernikterus geliştiğini bildiren yayınlar vardır10.

2.6.6.2 Gilbert sendromu:

Gilbert sendromu olanlarda hafif, benign, kronik, tekrarlayan indirekt

hiperbilirubinemi vardır, ancak karaciğer hastalığı veya aşırı hemolizi destekleyen

kanıtlar yoktur. Otozomal dominant veya resesif olarak kalıtım gösterir. Tipik olarak

klinik bulguları puberteden sonra ortaya çıkar ve açlık veya araya giren hastalıklarla

bulgular belirir. UGT1A1 promotor bölgesindeki mutasyonun neden olduğu

gösterilmiştir10.

Yenidoğan döneminde anne sütü, G6PD eksikliği, ABO uyuşmazlığı ve pilor

stenozu gibi yenidoğan sarılığında etkili faktörlerin Gilbert sendromlu vakalarda

hiperbilirubinemi şiddetini etkilediği düşünülmektedir.

14

2.6.7 Doğuştan metabolizma hastalıkları

2.6.7.1 Galaktozemi

Nadir görülen bu hastalıkta sarılık yenidoğan döneminde ilk bulgu olabilir.

Galaktozemi olgularında genellikle sarılılığa emmeme, kusma, kilo kaybı, irritabilite ve

letarji gibi diğer bulgular da eşlik eder. Aile öyküsünün pozitifliği, eşlik eden diğer

bulgular, idrarda redüktan madde pozitifliği ve E coli sepsisi tanıyı destekler10.

2.6.8 Hipotiroidizm:

Uzamış indirek hiperbilirubinemi konjenital hipotiroidizmin bulgularından

biridir. Patogenezi tam olarak bilinmemekle birlikte term ve preterm bebeklere

iodotironin verilmesi tepe serum bilirubin düzeylerini azaltmamaktadır33.

2.6.9 Eritrosit enzim defektleri

2.6.9.1 Pirüvat kinaz eksikliği:

Otozomal resesif olarak geçiş gösterir. Klinik olarak sarılık, anemi ve

retikülositoz vardır.

2.6.9.2 Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği ( G6PD enzim eksikliği):

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği dünyada en sık rastlanan eritrosit enzim

eksikliğidir ve dünyada 400 milyondan fazla insanı etkilemektedir. Bu enzim eksikliği

insidansı Akdeniz ülkelerinde, Afrika’da ve Çin’de daha yüksek olmakla birlikte bütün

ırklarda ve etnik gruplarda tanımlanmıştır34,35. Kernikterus gelişen yenidoğan bebeklerin

% 31,5’inde hiperbilirubineminin nedeninin G6PD eksikliği olduğu son yapılan

çalışmalarda bildirilmiştir10.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz geni X kromozomu üzerinde bulunur ve etkilenen

erkek bebeklerde enzim eksikliği komplettir. Tarama testleri ile enzim eksikliği olan

erkek bebekler bulunabilirler. Fakat heterozigot kızlarda enzim aktivitesi oldukça geniş

farklılıklar gösterir, bu nedenle tarama testleri ile tanı alamayabilirler. Glukoz 6 fosfat

dehidrogenaz eksikliği olan bazı bebeklerdeki hemoliz çok belirgin değildir, anemi ve

retikülositoz gelişmeyebilir. Yapılan çalışmalarda G6PD eksikliği olan bebeklerde hem

döngüsünde belirgin bir artış olmasına rağmen, akut hemolizi olanlar dışında,

15

hiperbilirubinemiden sorumlu tek mekanizma hemoliz değildir. Glukoz 6 fosfat

dehidrogenaz eksikliği olan bebeklerde bozulmuş konjugasyon da hiperbilirubinemi

patogenezinde rol oynar10.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz pentoz fosfat yolunun ilk ve hız sınırlayıcı enzimidir.

Eritrositlerin temel enerji kaynağı glukozdur. Glukoz heksokinaz ile fosfatlanıp

glukoz 6 fosfatı oluşturduktan sonra iki metabolik yoldan birini seçer:

a. Embdem Meyerhof yolu

b. Pentoz Fosfat yolu

Pentoz fosfat yolunun temel görevi organizmaya NADPH ve riboz fosfatları

sağlamaktır. Bu metabolik yolda ATP ne üretilir ne de kullanılır. Sitozolde gerçekleşen

pentoz fosfat yolunda her bir glukoz 6 fosfata karşılık 2 mol NADPH üretilir.

GLUKOZ 6 FOSFAT DEHİDROGENAZ EKSİKLİĞİNİN KLİNİK BULGULARI: Yenidoğan Sarılığı

Klinik çalışmalar G6PD eksikliği olan yenidoğanlarda şiddetli

hiperbiluribinemiye eğilim oluğunu göstermiştir. Sarılık oldukça ciddidir ve eğer tedavi

edilmezse kernikterus ile sonuçlanabilir. Yenidoğan sarılığı ölüme veya kalıcı nörolojik

hasarlara neden olabilmektedir36,37.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan yenidoğanın immatur karaciğerleri

bilurubini yetersiz olarak metabolize eder. Bu nedenle yenidoğanda anemi görülmez,

CO düzeyinde artış ve eritrosit ömürleri kısalır. Yenidoğanda üridindifosfoglukuronat

glukuronil transferaz 1 (UDPGT-1) geninin promotor yöresindeki bir mutasyon

yetişkinlerde Gilbert sendromu ile ilişkilidir38,39.

İlaç Alımına Bağlı Hemolitik Anemi

İlaçların bir kısmı ve bazı kimyasallar G6PD enzim eksikliği olan bireylerde

hemolitik anemiye yol açmaktadır (Tablo II). Kloramfenikol gibi bazı ilaçlar G6PD

16

Akdeniz varyantında ılımlı hemolize neden olurken G6PD A- ve G6PD Kanton

varyantlarında etkisizdir. Yani farklı G6PD varyantı taşıyan bireylerde aynı ilaç farklı

reaksiyon göstermektedir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksik olan bireylerde ilaç

alımına bağlı olarak hemoliz, ilaç alımından 1-3 gün sonra başlar. Eritositlerde oksidan

varlığında özellikle hemoglobin ve stromal proteinlerin denatürasyonu sonucu Heinz

cisimcikleri görülür. Hemoglobin düzeyi hızlı bir şekilde azalır. İdrar rengi koyulaşır

hatta siyah olabilir. 4-6 gün sonra retikülosit sayısında artış olur10.

Tablo II: Hemolize yol açan ilaç ve kimyasallar

Akotanilid Anilin Antistin Asetil salisilik asit Asetofenitidin Askorbik asit ( 1500mg ) Bakla Benemid Daraprim Diaminodifenilsülfan Dimerkaprol Fenilhidrazin Furaltadone Furazoladon Kinakrin ( Atabrin ) Kinin Kloramfenikol Klorokin Kuinidin Kuinosidin Metilen mavisi Naftalan Nitrit

Nitrofurantian Nitrofurazon Pamakin Paraaminobenzoik asit Paraaminofenol Parahidroasetanilid Pentakuin Pnimakin Primakin Salisilazosülfapiridin Sülfametoksipiridazin Sülfadiazin Sülfamerazin Sülfametaksazol (Bactrim ) Sülfanitamid Sülfapiridin Sülfasetamid Sülfisoksazol Sülfokzon Sülfotiozol Tiazolsülfan Trinitrotoluen Vitamin K1

Favizm

Bakla ( vicia faba ) bitkisinin neden olduğu hemolitik anemi favizm olarak

adlandırılır ve G6PD eksikliği olan bireylerde hemolitik anemiye yol açan tek bitkidir.

M.Ö. 2000 yıllarında Heredot’un yazdığına göre ‘istenmeyen bir takım etkilerinden

dolayı bakla yenilmesi Mısırlı rahipler tarafından yasaklanmıştır. Hatta Yunanlı

matematikçi Pythagoras’un bakla tarlasından geçerek kaçmayı reddettiği için

öldürüldüğü düşünülmektedir. Bakla bitkisinin polenlerinin teneffüsü bile bazı kişilerde

hemolize yol açabilmektedir. Favizm oluşumuna özellikle ilkbaharda Akdeniz

ülkelerinde rastlanmaktadır. Süt veren annelerin bebeklerinde de hemoliz rapor

17

edilmiştir. Favizm’li tüm bireyler G6PD enzim eksikliğine sahipken, her G6PD

eksikliği olan bireyde bakla yenilmesi sonrasında hemoliz görülmeyebilir. Hemolitik

krize neden olan G6PD enzim eksikliği ile birlikte genetik faktörlerin varlığı söz

konusudur. Favizm sadece Akdeniz tipini etkiler, Afrika tipi genelde etkilenmez.

Yetişkinlere göre çocuklarda daha sık favizm olgusuna rastlanmaktadır40,41.

Bakla, kuru ağırlığının yaklaşık % 2’sini oluşturan iki glikozidik bileşik olan visin

ve konvisinden zengindir. Bakla yenilmesinden sonra glikozidler enzimatik olarak

hidroliz olur, pirimidin aglikon, divisin ve izouramil oluşur. Favizm nedeni olarak öne

sürülen mekanizmada bu yeni bileşikler redoks siklüsüne girip redükte glutatyonu

tüketir, bu sayede serbest radikal ve H2O2 oluşumuna yol açar42.

Enfeksiyona Bağlı Hemolitik Anemi

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan hastalarda spontan veya enfeksiyona

bağlı hemolizin mekanizması çok anlaşılır değildir. Hemolitik reaksiyonların bu tipinde

rol alan lökositlerin fagositozu ile H2O2’in oluşumu tartışmalıdır.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği gözlenen bireylerde ateşli hastalık sonrası

hafif anemi aniden gelişebilir. Hatta bazı olgularda ağır anemi yani hemoglobin düzeyi

3-4g/dL’ye düşebilir. Birçok virüs ve bakterinin hemolize neden olduğu rapor edilmişse

de en önemli olanları hepatit, pnömoni ve tifodur. Üst solunum yolları veya sindirim

sistemini etkileyen viral enfeksiyonların G6PD eksikliği olan çocuklarda bakteriyel

enfeksiyonlara göre daha şiddetli hemolize neden olduğu rapor edilmiştir38,43.

Herediter Non-Sferositik Hemolitik Anemi

Herediter non-sferositik hemolitik anemi, G6PD eksikliğinin oldukça nadir

gözlenen bir sonucudur ve nadir mutasyonlara sahip bireylerde ortaya çıkmıştır. İlk defa

yenidoğan ve çocukluk çağında rapor edilmiştir. Gd Akdeniz varyantını taşıyan bazı

hastalarda da herediter non-sferositik hemolitik anemiye rastlanmış ve bazılarında da

hemoliz gözlenmiştir. Oldukça hafif seyreden olguların olmasına rağmen transfüzyona

bağımlı hastalar da rapor edilmiştir. Morfolojik olarak anemi, normokrom ve

normositerdir. Retükülositoz gözlenirken aşırı miktarda sferosite rastlanmadığı için

herediter non-sferositik hemolitik anemi adını almıştır39,44,45.

18

Diyabetik Ketoasidoz

Diyabetik ketoasidozun G6PD eksikliği olan bireylerdeki hemolizin bir nedeni

olabileceği düşünülmektedir. Ancak G6PD eksikliği olan diyabetik ketoasidozlu 36

olgudan sadece 10’unda hemoliz görülmüştür38.

2.6.9.2.1 Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz Enziminin Genetik Özellikleri

G6PD’nin yapısını oluşturan gen X kromozomunun subtelomerik yöresinde q28

lokusunda yerleşmiştir. G6PD geninin X kromozomu üzerindeki genel yerleşimi Şekil

1’de gösterilmiştir46,47.

Şekil 1: Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz geni

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz geni 13 eksondan ve 12 introndan oluşur. Enzimin

fonksiyonunu belirleyen G6PD geninin bu genin kodladığı mRNA amino asit dizisi ve

büyüklüğüdür. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz geni 18,5 kb ve genin kodladığı mRNA ise

2269 baz çifti uzunluğundadır 48,49.

Kodlama dizisi ekson 2’den başlar, ekson 2 ve 3 arasındaki intron 9857 baz

çiftinden oluşmuş olup çok uzundur. Bir düzenleme fonksiyonu olduğu düşünülen

sitidinlerin metilasyonu 3ı ucunda gerçekleşmektedir. Genin kodlama dizilimi 1545 baz

çifti uzunluğunda olup 515 amino asitlik G6PD proteinini üretmektedir. Aktif enzim

formunda her biri 59,265dalton moleküler ağırlığa sahip 2 veya 4 aynı alt birimden

oluşabilir. G6PD sülfidril gruplarınca zengindir ve her alt birim 11 sülfidril grubu

içerir50,51.

19

Tablo III’de insan G6PD’sinin moleküler özellikleri verilmiştir.

Tablo III: İnsan G6PD’sinin Moleküler Özellikleri

DNA Gen uzunluğu 18,5 Ekson sayısı 13 Kodlanan eksonlar 12 mRNA Nükleotit sayısı 2269 5ı kodlanmayan bölge 69 Kodlanan bölge 1545 3ı kodlanmayan bölge 655 Protein Amino asit sayısı 515 Moleküler ağırlık 59,265 Aktif enzimin moleküllerinin subünit sayısı 2 veya 4 Her subünitteki NADP’ye bağlanan molekül sayısı 1 Moleküler spesifik aktivite ( IU/ nmol ) 13

G6P NADP GSH H2O2

KATALAZ

6PG NADPH GSSG H2O

GSSG Redüktaz Glutatyon Peroksidaz Şekil 2: Eritrositlerdeki G6PD’nin oksidan ajanlara karşı ana metabolik rolü

Eritrositlerdeki oksidan ajanlara karşı G6PD’nin oynadığı metabolik rol Şekil

2’de verilmiştir.

Dünya Sağlık Örgütü (WHO), G6PD enzim eksikliklerini hemoliz düzeyine göre

beş sınıfa ayırmıştır52.

Sınıf I: G6PD aktivitesi normalin %10 kadar altında ve kronik hemolitik

anemiye neden olan varyantlar

Sınıf II: Şiddetli enzim eksikliği olan ve ılımlı hemoliz görülen varyantlar

Sınıf III: Normalin %10-60’ının altında aktiviteye sahip, ilaçlarla ve

enfeksiyonla birlikte ılımlı hemoliz görülen varyantlar

Sınıf IV: Enzim eksikliği olan fakat hemoliz görülmeyen varyantlar

Sınıf V: Enzim aktivitesi yüksek olan varyantlar

Sınıf IV ve V varyantları klinik olarak belirti vermezler. Bunun için daha çok

biyologların, genetikçilerin ve antropologların ilgisini çekmiştir.

20

Tablo IV: En yaygın gözlenen G6PD varyantlarının kinetik özellikleri

Kinetik Özellikler Gd B+ Gd A+ Gd A- Gd Akdeniz

% Eritrosit aktivitesi

100

90±10

14±6

<10

Elektroforetik göç 100 110 110 100 Km NADP (µM) 2,9-4,4 2,9-4,4 2,9-4,4 1,4±0,2 Km G6P (µM) 60±10 60±10 60±10 22,5±3,5 Analog kullanımı 2dG6P <4 <4 <4 25±2 Gal6P 7-15 - - 20 dNADP 55-60 55 55 350 Ki NADP 9 6,7 13 16 Isı kararlılığı Normal Normal Normal Düşük pH kararlılığı Normal Normal Normal Bifazik

2.6.9.2.3. Türkiye’de Saptanan G6PD Varyantları

G6PD enzim eksikliği dünya genelinde yaygın olduğu için en çok çalışılan

kalıtsal hastalıklardan birisidir. Türkiye’de G6PD üzerine ilk çalışmalar 1949 yılında

Demirağ, 1951 yılında Fakacelli ve Konstantinidu tarafından yapılmış ve favizm

olguları olarak bildirilmiştir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği ile ilgili tarama

çalışmalarında Türkiye genelinde enzim eksikliği %0,5, Eti Türklerinde ise %8,2 olarak

saptanmıştır. Sipahioğlu Ege bölgesinde enzim eksikliğinin %2-9 oranında olduğunu

rapor etmiştir. Çukurova’da 1979 yılında sıtmanın yaygınlaşması ve 30 000 dolayında

sıtma olgusunun görülmesini takiben hastalığa karşı koruyucu bir ilaç olarak primakinin

kullanımı sonucu ortaya çıkan hemolitik anemi olguları dikkati G6PD enzimi üzerine

çekmiştir. Bölgede yapılan kalitatif tarama çalışmalarında G6PD enzim eksikliğinin

yaygın olduğu gözlenmiştir. Bu güne kadar değişik araştırma gruplarının yaptığı tarama

çalışmalarında enzim eksikliğinin frekansı farklı olarak rapor edilmiştir. Yüregir ve

arkadaşlarının sayıca büyük bir grup üzerinde yaptığı çalışmada ise G6PD eksikliğinin

%8,2 olduğunu bildirilmiştir. Tufanbeyli (%3,7) ve Ceyhan (%1,2) yörelerinde oran

düşük olmasına karşılık Tarsus ve Antakya’da %17’ye varan enzim eksikliği

saptanmıştır. Akoğlu ve arkadaşları tarafından yürütülen çalışmalarda da benzer

sonuçlar alınmıştır52.

21

Dünyada en yaygın gözlenen Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enziminin

varyantların kinetik özellikleri Tablo IV’de verilmiştir.

Aksoy ve arkadaşları 1987’de Çukurova bölgesinde yaptıkları kinetik çalışmada

Gd Adana, Gd Samandağ ve Gd Balcalı varyantlarını tarif etmişlerdir. Daha sonra Gd

Adana varyantının Gd Akdeniz ve 1311 polimorfik yöre mutasyonu taşıdığını

göstermişlerdir. Aynı çalışma grubu 1989 yılında birisi ısıya dayanıklı üç yeni varyant

daha tanımlamıştır. Türkiye’de ve Türk ailelerinde saptanan varyantlar Tablo V’de

gösterilmiştir4,53,54.

Tablo V: Türkiye’de saptanan G6PD varyantları

Varyant Yıl Yazar G6PD-B- 1967 Berkal G6PD-B- 1973 Altay G6PD-Ankara 1975 Kohn G6PD-Tarsus 1976 Gahr G6PD-Antalya 1979 Sipahioğlu G6PD-Mersin 1981 Akoğlu G6PD –Samandağ 1987 Aksoy G6PD-Balcalı 1987 Aksoy G6PD-Adana 1987 Aksoy G6PD-Antakya 1988 Aksoy Isıya dayanıklı G6PD 1988 Aksoy G6PD –Hacettepe 1989 Kuş G6PD-Korkuteli 1989 Alıcıgüzel G6PD-Aksu 1989 Alıcıgüzel G6PD-Serik 1989 Yücel G6PD-Çorum 1989 Kuş Gal6P- kullanımı yüksek 1989 Dikmen G6PD-Siirt 1992 Dikmen

22

3. GEREÇ ve YÖNTEM

3.1. Gereçler Çukurova Üniversitesi Balcalı Hastanesi, Adana Meydan Doğumevi, Çukurova

Kadın Doğum ve Çocuk Hastalıkları Hastanesi’nde 1 Kasım 2004-30 Kasım 2007

tarihleri arasında doğan 200 sağlıklı term erkek bebek alındı. Enzim eksikliği X’e bağlı

ressesif geçişli olduğu, heterozigot kızlarda enzim aktivitesi oldukça geniş farklılıklar

gösterdiği ve bu nedenle tarama testleri ile tanı alamayabilecekleri için kız bebekler bu

çalışmaya alınmamıştır. Ayrıca prematür doğanlar, konjenital malformasyonu olan,

mekonyum aspirasyonu olan, doğumun birinci saattindeki kan gazlarına göre perinatal

asfiksisi olan, doğum haftasına göre ağırlığı düşük olan bebekler çalışma dışında

tutuldu. Bebeklerin kordon kanları alınarak 5 ml EDTA içeren iki tüpte buz içinde

transport edildi.

Laboratuvara gelen kan örneklerine protokol numarası verilerek G6PD düzeyleri

belirlendi. Enzim düzeyi düşük olan örnekler DE-52 iyon değiştirici kolonuyla kısmi

olarak saflaştırılıp kinetik çalışma yapıldı. Ayrıca saflaştırılan örneklerin DNA’ları izole

edilerek moleküler düzeyde çalışıldı.

Çalışmaya alınan G6PD enzim eksikliği saptanan bebeklerin ve annelerinin kan

grupları, bebeklerin kord kanında kan gazı, tam kan sayımı, direkt Coombs testi, total

bilirubin, direkt bilirubin, retikülosit düzeyleri çalışıldı. Bebeklerin total bilirubin ve

direkt bilirubin, hematokrit düzeyleri 3., 5., 7., 10. ve 15. günde kapiller kanda takip

edildi. Amerikan Pediatri Akademisinin önerileri doğrultusunda bilirubin düzeylerine

göre tedavi alması gerekenlere fototerapi veya kan değişimi uygulandı55.

Bu çalışma için Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulundan onay alındı.

Çalışmaya katılan bebeklerin aileleri konu ile ilgili bilgilendirildi ve ailelerin rızaları

alındı.

23

3.2. Enzim Kinetik Çalışma 3.2.1. G6PD Aktivitesinin

Kantitatif Ölçümü

Glukoz 6 fosfat, G6PD varlığında 6-fosfoglukolaktona dönüşmektedir. Yöntem

bu dönüşüm sırasında indirgenen NADP’nin 340nm’deki absorbans değişikliğinin

belirli bir süre (5dak) ölçümü temeline dayanmaktadır. Reaksiyon 37°C’de, ışık yolu

1cm olan kuvartz küvetlerde gerçekleştirilmekte ve hesaplamalar absorbans artışının 5

dakika boyunca doğrusal olduğu zaman aralığında OD değerleri dikkate alınarak

yapılır56.

3.2.1.1. Hemolizat Hazırlanması

1. EDTA’lı tüpe alınan 5 mL kan, 5 dakika boyunca 2500-3000 devirde

santrifüj edilir.

2. Plazma atılır, serum fizyolojik eklenir ve yavaşça karıştırılır. 5 dakika daha

2500-3000 devirde santrifüj edilir. İşlemler iki kere daha tekrarlanır.

3. 1 hacim eritrosit pelleti

2 hacim 5 mM sodyum fosfat tamponu

1 hacim % 0,02 Digitonin

Eritrositler hemoliz edilir.

4. Hazırlanan hemolizata ait G6PD aktivitesi saptanır ve hemoglobin içeriği

siyanmethemoglobin yöntemi ile ölçülür.

24

3.2.1.2. Yöntem: G6PD aktivite tayini ( Tablo VI)

TabloVI: G6PD ölçümü

Ayıraç Örnek (mL) Kör ( mL ) Saf su 1,65 3,0

1 M Tris tamponu 0,3 _ 0,1 M MgCl2 0,3 _ 2 mM NADP 0,3 _ 6 mM G6P 0,3 _ Hemolizat 0,15 _ Toplam Hacim 3,0 3,0

Hazırlanan örnek tüpündeki tepkime, 1 cm ışık yollu kuvars küvetlerde,

37oC’de, spektrofotometrede 340 nm dalga boyunda 5 dakika boyunca takip edilir.

Oluşan NADPH’ ın oluşturduğu optik dansite farkından yola çıkılarak örneğin G6PD

aktivitesi saptanır.

Enzim aktivitesi (Ü/mL) = × ×

Bu formüle göre hesaplanan G6PD aktivitesi Ü/gHb olarak verilir. >5.1Ü/grHb bulunan

değerler enzim eksikliği olarak kabul edilir.

*1µmol NADP, 1cm ışık yoluna sahip küvette 6,22 OD340 değeri vermektedir.

3.2.2. G6PD’nin Kısmi Saflaştırılması

G6PD’nin kısmi saflaştırılmasında kullanılan anyon değiştirici dietilaminoetil

(DEAE)’in fonksiyonel grubu CH2CH2NH(C2H5)2 olup zayıf iyon değiştiricidir57,58.

∆OD toplam hacim 1

Zaman (dk) hemolizat/elüsyon hacmi 6,22*

25

3.2.2.1. Ayıraçlar

1. 50 mM Sodyum Fosfat Tamponu: pH 7,0

NaH PO4.2H2O 3,12 g

NaH2PO4.2H2O 5,34 g

Son hacim 1litre ve pH 7,0 olacak şekilde saf suda çözünür.

2. 5 mM Sodyum Fosfat Tamponu: pH 7,0

50 mM Sodyum Fosfat Tamponu: pH 7,0 100 mL

Na-EDTA 0,372 g

β-NADP 0,0157 g

2-merkaptoetanol 0,07 mL

Son hacim 1 litre ve pH 7,0 olacak şekilde saf suda çözünür.

3. % 0,9 NaCl

NaCl 9 g

Son hacim 1litre olacak şekilde saf suda çözünür.

4. % 0,02 digitonin

Digitonin 0,2 g

Son hacim 1 litre olacak şekilde saf suda çözünür.

5. 0,25 M KCl içeren 5 mM Sodyum Fosfat Tamponu pH 7,0

KCl 18,64 g

Son hacim 1 litre ve pH 7,0 olacak şekilde 5 mM Sodyum Fosfat tamponunda

çözünür.

26

3.2.2.2. Yöntem

Anyon Değiştirici Reçinenin (DE-52) Hazırlanması: 5 mM sodyum fosfat

tamponunda bir gece şişirilen 25 g DE-52 anyon-değiştirici reçine pH’sı 7,0 olana kadar

tamponla yıkanır.

Hemolizatın anyon değiştirici reçineye bağlanması

Hazırlanan hemolizat ile anyon değiştirici reçine 1:3 oranında karıştırılarak

+4oC’de, bir gece boyunca düşük devirli çalkalayıcı ile karıştırılır.

Bağlanmayan proteinlerin anyon değiştirici reçineden sökülmesi

1.Hemolizat ve anyon değiştirici reçine karışımına ait süpernatan her seferinde protein aktivitesi ölçülerek (280 nm’deki optik dansite okunarak) aspire edilir.

2.Karışım, protein aktivitesi sıfır olana kadar 5 mM sodyum fosfat tamponu ile

yıkanır.

Bağlanan proteinlerin anyon değiştirici reçineden sökülmesi

1.Hemolizat ve anyon değiştirici reçine karışımı, ucuna cam pamuğu yerleştirilmiş kolona aktarılır.

2.Kolon 0,25 M KCl içeren 5 mM sodyum fosfat tamponu ile yıkanır.

3.Elüsyonlar toplanarak protein konsantrasyonları ölçülür.

4.Protein konsantrasyonu yüksek olan elüsyonların G6PD aktiviteleri ölçülür. En

yüksek aktiviteye sahip elüsyonun G6PD kinetiği çalışılır.

3.2.3. Kısmi saflaştırılan enziminin kinetik özelliklerinin incelenmesi

Glukoz 6 fosfatın 6 fosfoglukonata dönüşümü sırasında oluşan NADPH miktarı,

tepkimeyi katalizleyen G6PD aktivitesi ile doğru orantılıdır. In vitro koşullarda

gerçekleştirilen tepkime sırasında oluşan NADPH’a ait 340 nm dalga boyundaki optik

dansite farkından hesaplanır.

27

3.2.3.1. Ayıraçlar

1. 0,1 M MgCl2

MgCl2.6H2O 2,033 g

Son hacim 100 mL olacak şekilde saf suda çözünür.

2. 1 M Tris tamponu: pH 8,0

Tris-HCl 8,84 g

Tris Baz 5,30 g


3. 2 mM NADP

β-NADP 15,3 mg


4. 400 μM NADP

β-NADP 3,06 mg


5.6 mM G6P

D-glukoz 6-fosfat 16,9 mg


6.2 mM G6P

D-glukoz 6-fosfat 5,6 mg


7. 2 mM deamino-NADP

Deamino-NADP 15,8 mg

28


8.6 mM Galaktoz 6 fosfat

D-galaktoz-6-fosfat 18,2 mg


9.2 mM NAD

NAD 13,3 mg


Kısmi saflaştırılan G6PD ‘ne ait Km NADP değerinin saptanması


37oC’de, spektrofotometrede 340 nm dalga boyunda 5 dakika boyunca takip edilir. Kör

olarak saf su kullanılır. Oluşan NADPH’ın yarattığı optik dansite farkından yola

çıkılarak her bir örnekte G6PD saptanır. Hesaplanan enzim aktiviteleri arasındaki fark,

her tüpün farklı NADP konsantrasyonuna sahip olmasından kaynaklanmaktadır.

Lineweawer-Burke grafiğine dönüştürülen bu değerlerle KmNADP değeri saptanır

(TabloVII) Tablo VII: Kısmi saflaştırılan G6PD ait Km NADP değerinin saptanması

Ayıraçlar 1 2 3 4 5 6 7 8

Saf su 1,75 1,80 1,85 1,90 1,95 1,975 2,0 2,025 0,1M MgCl2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 1M Tris tamponu

0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

6mM G6P 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 400 µM NADP 0,3 0,25 0,2 0,15 0,10 0,075 0,050 0,025 Elüsyon 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 Tüm hacimler mL olarak verilmiştir.

29

Kısmi saflaştırılan G6PD enzimine ait Km G6P değerinin saptanması



olarak saf su kullanılır. Oluşan NADPH’ın yarattığı optik dansite farkından yola

çıkılarak her bir örneğin G6PD aktivitesi saptanır. Hesaplanan enzim aktiviteleri

arasındaki fark, her tüpün farklı NADP konsantrasyonuna sahip olmasından

kaynaklanmaktadır. Lineweawer-Burke grafiğine dönüştürülen bu değerlerle KmG6P

değeri saptanır (Tablo VIII). Tablo VIII: Kısmi saflaştırılan G6PD ait Km G6P değerinin saptanması

Ayıraçlar 1 2 3 4 5 6 7 8

Su (mL) 1,75 1,80 1,85 1,90 1,95 1,975 2,0 2,025

0,1M MgCl2 (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

1M Tris tamponu (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

2mM NADP (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

2mM G6P (mL) 0,3 0,15 0,12 0,09 0,075 0,060 0,045 0,050

Elüsyon (mL) 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050 0,050

Kısmi saflaştırılan G6PD ‘ye ait analog çalışması



olarak saf su kullanılır. Oluşan optik dansite farkından yola çıkılarak her bir örneğin

G6PD aktivitesi tespit edilir. Hesaplanan enzim aktiviteleri arasındaki fark, her tüpün

farklı substrat içermesinden kaynaklanmaktadır. Analog çalışması yapılan elüsyonun

bilinen G6PD aktivitesi % 100 kabul edilerek, diğer analogların ne ölçüde kullanıldığı

yüzde olarak hesaplanır (Tablo IX).

30

Tablo IX: Kısmi saflaştırılan G6PD’ye ait analog çalışması

Ayıraçlar 1 2 3 4 0,1M MgCl2 (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 1M Tris tamponu (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 2mM NADP (mL) -- -- 0,3 0,3 6mM G6P (mL) 0,3 0,3 -- -- 2mM d-NADP (mL) 0,3 -- -- -- 2mM NAD (mL) -- 0,3 -- -- 6mM Gal-6-P (mL) -- -- 0,3 -- 6mM 2-d-G6P (mL) -- -- 0,3 Elüsyon (mL) 0,050 0,050 0,050 0,050

Kısmi saflaştırılan G6PD’nin pH stabilitesinin incelenmesi

pH stabilitesi çalışılacak olan elüsyondan yaklaşık 200’er μl membranlara

aktarılır. Membranlar farklı pH’lara ayarlanmış 5 mM sodyum fosfat tamponu

içerisinde, bir gece boyunca, +4oC’de diyaliz edilir ve diyaliz sonucunda G6PD

aktivitesi saptanır.

Kısmi saflaştırılan G6PD’nin ısı stabilitesinin incelenmesi

Isı stabilitesi çalışılacak olan elüsyon, 46oC’ye ayarlanmış su banyosunda

bekletilir. 0., 10., 20. ve 60. dakikada, elüsyonun G6PD aktivitesi saptanır. Sıfırıncı

dakikadaki enzim aktivitesi % 100 kabul edilir ve diğer dakikalardaki yüzde değişim,

elüsyonun ısı stabilitesini belirler.

31

3.2.4. Moleküler Çalışma

3.2.4.1. DNA Eldesi

DNA’sı izole edilmek istenen kan örneği EDTA’lı tüpe alınıp önce plazması

uzaklaştırılır ve daha sonra şekilli elemanlar yıkanır. Eritrositleri hemoliz edilerek saf

lökositler elde edilir. Lökosit pelleti süspanse edilir. Sodyum dodesül sülfat (SDS) ve

Proteinaz K ile hücre zarları ve proteinler hidroliz edilir. Bir gece inkübe edildikten

sora, bu homojen karışım fenol ile ekstre edilir ve sulu fazda bulunan DNA alkol

varlığında çöktürülür59.

3.2.4.1.1. Ayıraçlar

1. Parçalayıcı Tampon

NH4Cl 131 mM

NH4HCO3 0,9 mM

2.NaCl 4 mM

3. Na2EDTA 0,5 mM pH 7,5

4. SDS ayıracı % 10’luk

5. Proteinaz K 1mg / mL

6.Doymuş fenol ayıracı: 250 g kristalize fenol 50 mL saf suda çözünür. Son

derişimi % 0,1 olacak şekilde 8-hidroksikinolin ilave edilir. Eşit hacimda 0,5 M Tris-

HCl tamponu (pH 8,0) eklenerek manyetik karıştırıcıda 15 dakika çalkalanır. Ayıraç iki

faza ayrıldığında üst faz aspire edilir. Üzerine eşit hacimde 0,1 M Tris-HCl tamponu

eklenerek aynı işlem tekrarlanır. Bu işleme fenol fazının pH’sı 8,0 olana kadar devam

edilir. En son % 0,2’lik β-merkaptoetanol içeren 0,1 M Tris-HCl tamponu (pH 8,0)

eklenir.

7.Saf, soğuk etanol

32

8.% 70’lik etanol

3.2.4.1.2. Yöntem

1. EDTA’lı tüpe alınan kanın plazması atılır.

2. 5 mL’lik tüpe aktarılan çökeltiye eşit miktarda 4mL parçalayıcı tampon

eklenir.

3. Tüpler 10 dakika buzda bekletildikten sonra +4oC’de 5000 rpm’de santrifüj

edilir. Lökosit tabakasına dikkat edilerek üst faz aspire edilir.

4. Parçalayıcı tampon ile yıkama işlemi iki kere daha tekrar edilir.

5. Elde edilen lökosit pelleti, üzerine % 10’luk SDS ayıracından 300 μL ve

Proteinaz K ayıracından 75 μL ilave edilerek 37 oC’de bir gece inkübe edilir.

6. Ertesi gün vizköz bir hal alan ayıraca 1 mL fenol eklenir.

7. 10 dakika boyunca şiddetle çalkalanan karışım, +4 oC’de 5000 rpm’de 10

dakika santrifüj edilir.

8. Dipteki berrak faz atılır. Fenol ekleme aşaması tekrarlanır.

9. Ayıraç üzerine 1mL kloroform eklenir.

10. Karıştırılır +4 oC’de 5000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir.

11.Dipteki berrak faz atılır. Kloroform ekleme aşaması tekrarlanır.

12. Üstteki berrak faz ile soğuk etanol içine aktarılır ve DNA’nın hava

kabarcıkları şeklinde presipite olduğu gözlenir.

13. DNA’lar bir ependorf tüpüne alınıp 13000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir.

14.Elde edilen DNA pelletine 100 μL steril saf su ilave edilerek bir gece 37oC’de

bekletilir.

15.Ertesi gün, 20 μL DNA ayıracı 980 μL steril saf su ile çözülerek 260 ve 280

nm dalga boylarındaki optik dansiteleri spektrofotometrede okunur.

16.Elde edilen DNA’nın derişimi aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır.

DNA derişimi (μg / mL) = OD260 x sulandırma faktörü (50) x50 *

*1cm ışık yollu küvette 1 OD’ye karşılık gelen µg / mL biriminden DNA miktarı.

33

3.2.4.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu

PCR, in vitro şartlarda DNA çoğaltma yöntemidir60.


1. 20X PCR Tamponu (pH: 8,8)

Tris-HCl 680 mM

Amonyum sülfat 166 mM

MgCl2 68 mM

BSA 1700 μg/mL

2. 2,5 mM dNTP Karışımı

100 mM stok dATP, dCTP, dGTP, dTTP’de son derişim 2,5 mM olacak şekilde

dNTP karışımı hazırlanır.

3. % 50 Dimetilsülfoksit (DMSO)

4. Genomik DNA

Genomik DNA’lar amplifikasyonda son derişimi 1μg/100 μL olacak şekilde

kullanılır.

5. Taq Polimeraz Enzimi ( 5 Ü / mL)

Nükleotit dizileri verilmiş olan B ve J primerleri G-6-PD genine ait ekson 6’yı

amplifiye etmek amacıyla kullanılmaktadır.

Primer B ⇒ ACTCCCCGAAGAGGGGTTCAAGG-

Primer J ⇒ CCAGCCTCCCAGGAGCGCGGAAG-

Taq DNA polimeraz eklenmeksizin son hacim 100 µL olacak şekilde

amplifikasyon tüpü içerisinde hazırlanan PCR karışımı vorteks yarıdımıyla karıştırılır

ve santrifüj edilir. Bu karışım 6 dakika 99oC’de inkübe edilerek DNA’nın

denatürasyonu sağlanır. Sıcaklık 56 oC’ye ulaşınca Taq DNA polimeraz ilave edilir Her

bir döngü için aşağıdaki sıcaklıklar uygulanır.

94 oC 45 saniye

56 oC 45 saniye

34

72 oC 45 saniye Tablo X’da PCR karışımı verilmiştir.

Tablo X: PCR karışımı

Ayıraç Miktar(µL) Son Derişim 10X Tampon 5 1XPCR tamponu dNTP (2,5mM) 10 0,250 nM DMSO (%50) 10 %5 DNA Değişken 1 µL Primer (150ngl/µL) 1 150ng/100µL Primer (150ng/µL) 1 150ng/100µL Taq Polimeraz (5Ü/µL) 0,4 2Ü/100µL Steril distile su 50µL’ye tamamlanır Toplam hacim (µL) 50 µL

3.2.4.3. Amplifiye G6PD Gen Ürününün Restriksiyon Endonükleaz ile

Kesilmesi (RFLP)

Restriksiyon endonükleazlar, genom içinde var olan kesim yerlerini ortadan

kaldırır veya yeni kesim yerleri oluşturur. Bu değişim jel elektroforezi ile gösterilir61,62.

Ayıraçlar

1. 10X PCR Tamponu (pH: 8,8)

Tris-HCl 6 mM NaCl 50 mM MgCl2 6 mM DTT 1mM

2. MboII Restriksiyon Enzimi

Enzimin son derişimi 0,5 Ü / 20µL olacak şekilde kullanılır. Enzimin tanıdığı

özgün dizi ve kesim yeri aşağıdaki gibidir.

35

5’…GAAGA(N)8…3’

3’…CTTCT(N)7…5’

3.Amplifiye Genomik DNA

Tablo XI: RFLP karışımı

Ayıraç Miktar(µL) Son Derişim 10X Tampon 2 1XPCR tamponu Amplifiye DNA 10 6 µg/ 20µL MboII Enzimi (0,5Ü/mL) 1 0,5 Ü/20µL Steril distile su 7

Tablo XI’deki karışım 37°C’de bir gece inkübe edilir.

3.2.4.4. Agaroz Jel

Elektroforezi

DNA molekülünün tanımlanması için agaroz jel kullanılarak nükleotidin baz

çifti sayısının logaritması ile ters orantılı olarak anoda doğru göç etmesidir61.


1. 5X Tris –Borat ( TBE ) Tamponu (pH: 8,3)

Tris-Baz 54 g

Borik Asit 27,5 g

0,5 M EDTA pH :8,0 20 mL

Bir miktar distile suda çözülüp pH’sı 8,3’e ayarlanarak 1000mL’ye distile su ile

tamamlanır.

2. 1X Tris –Borat ( TBE ) Tamponu (pH: 8,3)

5X TBE Tamponu 200mL

Distile su 800mL

3. Yükleme Tamponu

36

Bromfenol mavisi % 0,25

Ksilen Siyanol FF % 0,25

Sukroz %40

Distile suda çözülülerek +4 °C’de saklanır.

4. %2’lik agaroz jel

2g agaroz tartılarak 100 mL distile su eklenerek mikrodalga fırında homojen bir

ayıraç olana kadar ısıtılır.

5. Stok Etidiyum Bromür (EtBr) Ayıracı

10 mg/ mL olacak şekilde EtBr tartıtıp distile suda çözülerek oda sıcaklığında

koyu renkli şişede saklanır.

6. Etidiyum Bromür Çözeltisi

0,5 µg/mL olacak şekilde stok EtBr distile su içinde çözülür.

7. φ X 174 HaeIII Markeri

Jel kuyusuna 100-500 ng/10 µL derişiminde uygulanır.

3.2.4.4.2 Yöntem

%2 oranında hazırlanan agaroz jel ayıracı elekroforez kaplarına dökülerek

polimerize olması sağlanır. Elektroforez tarakları yardımı ile oluşan kuyulara

restriksiyon enzimi ile kesilen PCR ürününden 20 µL DNA ve 2 µL yükleme tamponu

karıştırılıp agaroz jele yüklenir.

Elektroforez 1-5 V/cm (elektrotlar arasındaki uzaklık) akım şiddetinde yükleme

tamponundaki bromfenol mavisi ve ksilen siyanol FF uygun uzaklığa erişinceye kadar

yürütülür. Elektroforez bitiminde jeller EtBr ile oda sıcaklığında boyanır ve boya

artıkları distile suyla temizlenerek UV ışık altında değerlendirme yapılır.

37

3.2.4.5. Mikroarray çalışma:

Nanogen® marka cihaz kullanılarak örneklerde Gd Union, Gd San, Gd Akdeniz,

Gd SanAntonio mutasyonları araştırıldı.

38

4.BULGULAR

200 erkek bebekten altısında G6PD eksikliği saptandı (%3). Glukoz 6 fosfat

dehidrogenaz aktivitesi 194 bebekte normal sınırlar içinde bulundu. Bu bebeklerin

ortalama enzim aktivitesi 8,3± 2,1 U/grHb ( 5,2-12,7 U/grHb) olarak ölçüldü. Glukoz 6

fosfat dehidrogenaz eksikliği saptanan olguların klinik takibi, enzim kinetik ve genetik

çalışması yapıldı. Olguların klinik özellikleri Tablo XII’de verildi. Olguların üç

tanesinde Gd Akdeniz mutasyonu saptandı (Şekil 3). Mutasyon saptanan bu olgulardan

ikisinde hiperbilirubinemi patolojik düzeylere yükseldi ve fototerapi ile tedavi edilirken

birinde hiperbilirubinemi için tedaviye gerek duyulmadı. Mutasyon saptanan olguların

hiçbirinde hemotokrit düşüşü ve retikülosit cevabı oluşturabilecek bir hemoliz

bulgusuna saptanmadı. Mutasyon saptanmayan olgulardan birinde hiperbilirubinemi

için kan değişimi yapılırken diğer iki olguda tedaviye gerek duyulmadı. Gd Akdeniz

mutasyonu dışında bakılan Gd Union, Gd San, Gd Akdeniz, Gd SanAntonio

mutasyonlarından hiçbiri olgularımızda saptanmadı. Bu olguların enzim kinetik

çalışmalarından elde edilen değerlerin GdB+ ve Gd Akdeniz mutasyonlarında saptanan

ortalama değerler ile karşılaştırılması Tablo XIII’de verildi. Bu sonuçlara olguların göre

KmG6P değerleri 6,8-555,7 µM arasında, KmNADP değerleri 10,6-167,8 µM arasında idi.

Analog kullanımı açısından olguların değerleri dNADP için 46,5-94 arasında, NAD için

0-182 arasında, Gal6P için 18-142 arasında, 2dG6P için 6,8-100 arasında bulundu.

Optimum pH değeri 6-8, ilk 20 dakikada değişim %68-250 arasında saptandı. Glukoz 6

fosfat dehidrogenaz eksikliği saptanan olguların klinik bulguları ve kinetik

çalışmalarına ait KmG6P, KmNADP eğrileri ve pH eğrileri ile ilgili sonuçlar aşağıda

ayrıntılı şekilde sunuldu.

39

Tablo XII: Olguların klinik bulguları Bebek adı BEBEK O.K. BEBEK F BEBEK İ BEBEK K BEBEK D BEBEK G

Bebek kan grubu A Rh(+) O Rh(+) A Rh(-) A Rh(+) O Rh(+) A Rh(+) Anne kan grubu A Rh(+) O Rh(+) A Rh(-) A Rh(+) O Rh(+) A Rh(+)

Direk coombs (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Total bilirubin (mg/dl) Kord kanı 3 5 4 4,3 4 3,6

2.gün 20 18 20

3.gün 11,2 35 22 11 10.8 11

5.gün 17,2 20 22 8,4 7 6.5

7.gün 14,2 18 25,7 6 6 5.5

10.gün 10,2 15 11 4,2 3 3

15.gün 13,6 10 5 2,7 2 3

Hemotokrit (%) Kord kanı 50 47 45 50 56 60

2.gün 48 48 50

3.gün 49 58 53 52 54 57

5.gün 46 53 54 55 54 56

7.gün 48 54 57 53 55 54

10.gün 49 55 54 54 55 56

3. gün retikülosit % 3 3 2,8 2,5 3 3

Tedavi Fototerapi fototerapi Kan değişimi fototerapi yok yok yok

Gd Akdeniz mutasyonu (+) (-) (+) (+) (-) (-)

40

Şekil 3: Olguların Gd Akdeniz mutasyonunun elektroforetik görünümü

1. Erkek, hemizigot bir olgu olduğu için 3 bant, BEBEK O.K.

2. Erkek, hemizigot bir olgu olduğu için 3 bant, BEBEK İ

3. Erkek, hemizigot bir olgu olduğu için 3 bant, BEBEK K

4. Erkek, normal bir olgu olduğu için 2 bant, BEBEK G

5. Erkek, normal bir olgu olduğu için 2 bant, BEBEK D

6. Erkek, normal bir olgu olduğu için 2 bant, BEBEK F

7. Marker

1 2 3 4 5 6 7

41

OLGULARIN KLİNİK VE KİNETİK BULGULARI

BEBEK O.K.; 3000 gr ağırlığında NVY ile doğdu. Anne ile bebek arasında kan

grup uygunsuzluğu yoktu. Total bilirubin düzeyi ikinci günde yüksek olduğu için (20

mg/dl) hospitalize edilerek fototerapi başlandı. Üç gün hospitalize edilen hastanın

takibinde tekrar yükselme olmadı. Onbeş günlükken bakılan total bilirubin düzeyi 13,6

mg/dl idi. İndirekt hiperbilirubinemi süresince hemotokrit değerlerinde düşme

saptanmadı. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz düzeyi düşük olduğu için enzim kinetik

çalışması yapıldı (Şekil 4a,4b,4c). Şekil 4a: BEBEK O.K’nın KmG6P eğrisi

Şekil 4b: BEBEK O.K’nın KmNADP eğrisi

Şekil 4c: BEBEK O.K’nın pH eğrisi

42

BEBEK F: 3200 gr ağırlığında NVY ile doğan bebeğin anne ile arasında kan

grup uygunsuzluğu yoktu. 3. Günde total bilirubini 35 mg/dl’ye yükselen bebek

hospitalize edildi ve fototerapi başlandı. Ancak total bilirubin düzeyleri yüksek devam

ettiği için tam kan kullanılarak kan değişimi yapıldı. Bilirubinin yükselme döneminde

hemotokrit düşüşü saptanmadı(Şekil 5a,5b,5c). Şekil 5a: BEBEK F’nin KmG6P eğrisi

Şekil 5b: BEBEK F’nin KmNADP eğrisi

Şekil 5c: BEBEK F’nin pH eğrisi

43

BEBEK İ: 2500 gr ağırlığında NVY ile doğan bebek ile anne arasında kan grubu

uygunsuzluğu yoktu. Üçüncü gün bakılan total bilirubin değeri yüksek olduğu için (20

mg/dl) hospitalize edilerek fototerapi uygulandı. Yedinci gün bakılan bilirubin düzeyi

hala yüksek (22 mg/dl) seyreden bebeğin hemotokrit düşüşü olmadı. Hastanın bilirubin

düzeyi kan değişim sınırına kadar yükselmesine rağmen kan hazırlatıldığı anda düşme

gözlendiği için kan değişimi yapılmadı. Dokuzuncu gün total bilirubini düşmeye

başladı(Şekil 6a,6b,6c).

Şekil 6a: BEBEK İ’nin KmG6P eğrisi

Şekil 6b: BEBEK İ’nin KmNADP eğrisi

Şekil 6c: BEBEK İ’nin pH eğrisi

44

BEBEK K: 3300 gr ağırlığında NVY ile doğdu. Anne ile bebek arasında kan

grup uygunsuzluğu yoktu. Total bilirubin düzeyleri takip edilen hastaya tedavi

gerekmedi(Şekil 7a,7b,7c).

Şekil 7a: BEBEK K’nin KmG6P eğrisi

Şekil 7b: BEBEK K’nin KmNADP eğrisi

Şekil 7c: BEBEK K’nin pH eğrisi

45

BEBEK D: 3000 gr ağırlığında NVY ile doğdu. Anne ile bebek arasında kan


gerekmedi(Şekil 8a,8b,8c).

Şekil 8a: BEBEK D’nin KmG6P eğrisi

Şekil 8b: BEBEK D’nin KmNADP eğrisi

Şekil 8c: BEBEK D’nin pH eğrisi

46

BEBEK G: 3000 gr ağırlığında NVY ile doğdu. Anne ile bebek arasında kan


gerekmedi(Şekil 9a,9b,9c)..

Şekil 9a: BEBEK G’nin KmG6P eğrisi

Şekil 9b: BEBEK G’nin KmNADP eğrisi

Şekil 9c: BEBEK G’nin pH eğrisi

47

Tablo XIII: Olguların Kinetik Bulgularının GdB+ ve Gd Akdeniz mutasyonu ile karşılaştırılması

No OLGU

G6PD aktivite

(U/gHb)

Km (µM)

Analog Kullanımı

Opt pH

İlk 20dak. değişim

(%)

G6P NADP

dNADP

NAD Gal6P

2dG6P

1 BEBEK O. K. 0 6,8 42,4 27 0 142 87 8 68 2 BEBEK F 0 229,3 23,8 46,5 0 18 16 8 82 3 BEBEK İ 0 172 15,1 81 119 44 100 8 250 4 BEBEK K 0 72,5 10,6 66 10 32 6,8 8 44 5 BEBEK D 0 555,7 77,1 94 112 71 77 8 81 6 BEBEK G 0 78,2 167,8 82 182 59 29 6-8 100 Gd B+ 8,3±3,3 50-70 2-4 55-60 <1 7-15 <4 Gd Akdeniz 0-7 19-26 1,2-1,6 350 20 23-37

48

4.TARTIŞMA

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliğinden dünyada yaklaşık 400 milyon

insanın etkilendiği düşünülmektedir. Akdeniz’in bazı bölgeleri, Papua Yeni Gine,

Tropikal ve subtropikal Asya’da yüksek oranda G6PD eksikliği görülmektedir. G6PD

eksikliği Plasmodium falciparum’un neden olduğu sıtmanın coğrafik dağılımına

benzerlik göstermektedir. G6PD eksik kişilerin eritrositlerinde sıtma paraziti

yaşayamadığı ve bu tip eritrositlerin sıtmaya karşı daha dirençli olduğu

varsayılmaktadır63, 64,65.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enzimi eksik olan kişilerin büyük bir kısmı

asemptomatiktir. Klinik bulgu saptananlarda en sık karşılaşılan yenidoğan sarılığı

dışında hemolitik anemidir. Akut hemolitik anemiye bazı ilaçlar, enfeksiyon ve bakla

yenmesi neden olmaktadır. Bugün hala hemolizin mekanizması tam olarak

açıklanamamıştır. G6PD eksik eritrositlerde direkt veya indirekt olarak oksidatif hasarın

oluştuğu düşünülmektedir. Bu akut hemoliz olaylarında eritrositlerin yıkımı

hemoglobinüriye neden olmaktadır. Ancak bazı G6PD’si eksik kişilerin kronik

hemolitik anemisi olduğu bilinmektedir66, 67, 68, 69.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliğinin yenidoğanlarda tanımlanması ve

yenidoğan sarılığında ortaya çıkan bilirubin ile ilişkileri büyük önem taşımaktadır.

Yenidoğan döneminde ağır kernikterus riski taşıyan indirekt hiperbilirubineminin

önemli nedenlerinde birisi G6PD eksikliğidir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği

dünyada X’e bağlı geçiş gösteren en yaygın enzimopatidir. Sıklığı bölgesel farklılık

göstermekle birlikte yapılan çalışmalarda %2-27 arasında olduğu bildirilmiştir70,71.

Hiperbilirubinemili olgularda ise sıklığı %10,5 -%22,1 olarak bildirilmiştir1,72. Bu

çalışmada da sağlıklı term erkek bebeklerde sıklığı %3 olarak bulundu.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliğinde ortaya çıkan neonatal

hiperbilirubinemide hemolizden çok karaciğerdeki bozulmuş konjugasyonun rol

oynadığı bildirilmiştir73,74. Olgularımızda da hastaneye yatış gerektiren yüksek bilirubin

değerlerine ulaşılmasına rağmen belirgin hemotokrit düşüklüğü saptanmadı.

Gelişen moleküler tanı yöntemleri sonucu DNA düzeyindeki çalışmalar çok hızlı

kullanım alanı bulmuştur. G6PD eksikliği genetik olarak heterojeniteye sahiptir. Aynı

mutasyon faklı kişilerde farklı klinik belirti gösterdiği için bazı mutasyonlar kronik

49

hemolitik anemiye neden olurken bazılarında hemoliz gözlenmemektedir44,75.

çalışmamızda Gd Akdeniz mutasyonu saptanan olguların ikisinde patolojik

hiperbilirubinemi saptanırken bir olguda hemoliz ve hiperbilirubinemi gözlenmedi. Gd

Akdeniz mutasyonu dışında mutasyonu olan bebeklerden birinde patolojik

hiperbilirubinemi gözlenirken, diğer ikisinde hemoliz bulgusu ve hiperbilirubinemi

yoktu.

Bugüne kadar biyokimyasal yöntemler kullanılarak 400’ün üzerinde

biyokimyasal, 140 tane moleküler varyant bildirilmiş, bunların Hindistan’dan

Sardinya’ya kadar uzanan geniş bir coğrafik dağılım gösterdiği gözlenmiştir. Akdeniz

Ülkeleri, Orta Asya ve Hindistan Bölgelerinde en sık Gd Akdeniz mutasyonuna

rastlanırken Afrika Bölgelerinde en sık Gd A- mutasyonuna rastlandığı bildirilmiştir6.

Biyokimyasal olarak saptanan bazı varyantların moleküler çalışma sonucunda aynı

mutasyonu içerdiği gösterilmiştir. Örneğin Gd Akdeniz ile Gd Dallas moleküler

düzeyde aynı mutasyonu taşımaktadır. Ancak bazen de bunun tam tersi gözlenmiştir.

Tek varyant olarak düşünülen Gd A- genetik olarak heterojen bir yapı göstermektedir.

Ayrıca enzim eksikliği olmaksızın birkaç tane de yapısal varyant gösterilmiştir76.

140’ın üzerindeki bu mutasyonlardan bugüne kadar en detaylı ve en fazla üzerinde

çalışılanı Gd Akdeniz’dir. İlk kez Vulliamy ve arkadaşları tarafından Gd Akdeniz

varyantına enzimin 6. eksonunda 563. nükleotitteki C→T dönüşümünün neden olduğu

bildirilmiştir3, 53,76.

Bölgemizde en sık rastlanan Gd Akdeniz varyantı ileri derecede enzim

eksikliğine neden olmasına rağmen hemoliz bazen görülmektedir. Bu nedenle, diğer bir

çalışmada belirtildiği gibi, bu çalışma sırasında G6PD enzim düzeyi düşük olan olgular

moleküler düzeyde incelenerek özellikle ekson 6’daki 563. nükleotitdeki C→T

mutasyonunu taşıyanların fenotip-genotip ilişkisi kurulmaya çalışılmıştır77.

Akut hemolitik kriz gelişmesi açısından glukoz 6 fosfat dehidrogenaz aktivitesinin

düşük prediktif değere sahip olduğu bildirilmiştir. Bugüne kadar bulunmuş moleküler

varyantlar arasında en ağır fenotipe Gd Akdeniz mutasyonunun ve A- mutasyonunun

neden olabileceği bildirilmiştir78. Olgularımızdan üçünde Gd Akdeniz mutasyonu

saptanmış ve bu üç olgunun ikisinde bilirubin düzeylerinin yüksek seyrettiği,

kliniklerinin ağır olduğu gözlenmiştir. Kan değişimi yapılan bir olgu da ise Gd Akdeniz

mutasyonu saptanmadı. Bu olgunun hiperbilirubinemiye neden olan diğer bir mutasyona

sahip olabileceği düşünüldü

50

Neonatal sarılığı olan bebeklerde G6PD mutasyonların saptanması amacıyla

yapılan diğer çalışmalarda G6PD Viancghan, G6PD Mahidol ve G6PD Akdeniz

mutasyonları sık bulunmuş ancak sarılık kliniği açısından üç mutasyon arasında fark

gösterilememiştir5.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enziminin varyant analizlerinde birçok parametre

kullanılmaktadır; bunlardan eritrosit G6PD aktivitesi, kısmi saflaştırılan enzimde

kinetik çalışmalar, substrat analoglarının kullanımı, ısı inaktivasyonu ve pH en çok

kullanılan kriterlerdir52. Bu çalışmada da düşük enzim aktivitesi olan olgularda kinetik

çalışma yapıldı ve bulgular Tablo XIII’de özetlendi

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enziminin substratlarına karşı ilgisini

değerlendirmek için Km değerleri ölçüldüğünde, olguların KmG6P değerleri 6,8-

555,7µM arasında KmNADP değerleri ise 10,6-167,8 µM arasında bulunmuştur. KmG6P

değeri bir olgu dışında tüm olgularda Gd B+ ve Gd Akdeniz’den yüksek olarak

saptanmıştır. KmNADP değeri ise tüm olgularda yüksek olduğu belirlenmiştir.

Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enziminin kinetik özelliklerinin belirlenmesinde

ayrıca substrat analogları olarak dNADP, NAD, Gal6P ve 2dG6P kullanılmıştır. Bu

kinetik özellikler WHO’nun GdB+ için belirlenen kinetik özellikler ile

karşılaştırılmıştır52. GdB+’nin dNADP kullanım yüzdesinin %55-60 arasında

bildirilmiştir. Ancak iki olgunun dNADP kullanım yüzdesi bu sınırların altında, diğer

dört olgunun ise belirtilen aralığın üzerinde olduğu saptanmıştır. GdB+’nin NAD

kullanım yüzdesinin %1’in altında olduğu belirtilmiştir. Olgularımızdan ikisinin

NAD’yi hiç kullanmadığı diğer olguların ise NAD’yi yüksek oranda kullandığı

gözlenmiştir. GdB+’nin Gal6P kullanım yüzdesi 7-15 olarak belirtilmiştir. Tüm

olgularımızın Gal6P kullanım değerlerinin belirlenen aralıktan oldukça yüksek olduğu

saptanmıştır. Kinetik olarak incelenen bütün olgularımızın Gal6P kullanımı % 18-142

arasında olduğu belirlenmiştir. 2dG6P kullanımının Gd B+ tipinde % 4’ün altında

olduğu belirtilmiştir. Tüm olgularımızın 2dG6P kullanımının yüksek olduğu

saptanmıştır. Çalışmamızın bütününde 2dG6P kullanımının % 6,8-100 arasında olduğu

gözlenmiştir.

Isı stabilitesi, eritrosit G6PD özelliklerinin araştırılmasında kullanılan diğer bir

parametredir. Tüm olgularımızın G6PD’sinin ısıya oldukça dayanıklı olduğu

saptanmıştır.

51

Olguların optimum pH’larının 8 olduğu ve bir bebeğin bifazik, diğer olguların

monofazik özellik gösterdiği bulunmuştur (Şekil 9c). Bifazik özellik Gd Akdeniz

mutasyonun bir özelliği olabileceği halde bu olgunun moleküler çalışmasında Gd

Akdeniz mutasyonu içermediği saptanmıştır79.

Gd Akdeniz mutasyonu saptanan olgular değerlendirildiğinde ise G6P ve NADP

için WHO tarafından önerilen Km değerleri 19-26 µM ve 1,2-1,6 µM arasında

değişiklik gösterirken, mutasyon saptanan olgularda değerlerin bu aralıkta olmadığı

görülmüştür. Analog kullanımı açısından da önerilen değerlerin olgularda bulunan

değerlerle uyumlu bulunmaması aynı mutasyonun farklı kinetik varyantlarının

olabileceğini düşündürmüştür. Gd Akdeniz mutasyonu saptanan olguların klinik

seyirleri, maksimum total bilirubin düzeyleri ve bilirubin düşme hızları da farklılık

gösterdiği için kinetik farlılıkların da mutasyondan bağımsız olarak hiperbilirubinemiyi

etkilediği söylenebilir. Bu olgularda diğer bir olasılık da saptanamayan G6PD

mutasyonlarının varlığı olabilir. Bu çalışmada G6PD eksikliği saptanan olgulardaki Gd

Akdeniz mutasyonun kinetik özelliklerinin, WHO tarafından bu mutasyon için

tariflenen kinetik özelliklerden farklı olduğunu göstermiştir. Enzim aktivitesinin sıfır

olması yaşamla bağdaşan bir durum olmadığı için, olgularımızın takibinde fatal sorunlar

ile karşılaşılmadığından bulduğumuz sonuçlar eritrosit içinde G6PD aktivitesini inhibe

eden bazı proteinlerin olabileceğini ve değişik kinetik özelliklere yol açabileceğini

düşündürmektedir. Daha fazla olgu çalışmalarının ve özellikle mutasyon analizlerinin

yapılması G6PD eksikliği olan olgularda klinik izlemdeki farklılıklara açıklık

getirecektir.

52

6. SONUÇLAR

1.G6PD eksikliğinin sıklığı erkek bebeklerde %3 olarak saptandı.

2.Enzim eksikliği olan olgulardan üçünde Gd Akdeniz mutasyonu saptandı.

3.Gd Akdeniz mutasyonu saptanan olguların ikisinde hiperbilirubinemi için tedavi

gerekirken, birinde tedavi gerekmedi.

4.Gd Akdeniz mutasyonu saptanmayan olgulardan birinde hiperbilirubinemi ağır

seyretti ve kan değişimi gerekti. Bu olguda bakılamayan diğer bir mutasyonun bu

kliniğe neden olabileceği düşünüldü.

5.Enzim eksikliği olan olguların hiçbirinde hemotokrit düzeyinde düşme saptanmadı.

ÖNERİLER

1. G6PD eksikliği, sarılıkla başvuran tüm yenidoğan bebeklerde araştırılmalıdır.

2. Enzim eksikliği olan yenidoğanların klinik seyirleri farklı olabileceği için her olgu

ayrı değerlendirilmelidir.

3. Daha fazla olgu saptanarak, diğer mutasyonların da araştırılmasına gerek vardır.

53

7.KAYNAKLAR

1. Satar M, Atici A, Oktay R. The influence of clinical status on total bilirubin binding capacity in newborn infants. J Trop Pediatr. 1996 ;42:43-5.

2. Tuncel P. Heksoz monofosfat yolu. Tokullugil A, Dirican M, Ulukaya E. Biyokimya 2. baskı, İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd Şti. 1997: 111-117.

3. Vives-Corrons JL, Kuhl W, Pujades MA, Beutler E. Molecular genetics of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) Mediterranean variant and description of a new G6PD mutant, G6PD Andalus1361A. Am J Hum Genet. 1990 ;47:575-9.

4. Yalın S, Yalın E, Aksoy K. Türkiye’de saptanan glukoz 6 fosfat dehidrogenaz varyantları. Arşiv, 2002;11:1-4.

5. Ainoon O, Yu YH, Amir Muhriz AL, Boo NY, Cheong SK, Hamidah NH. Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) variants in Malaysian Malays. Hum Mutat. 2003; 21:101.

6. Sukumar S, Mukherjee MB, Colah RB, Mohanty D. Molecular basis of G6PD deficiency in India. Blood Cells Mol Dis. 2004;33:141-5.

7. Beutler E, Kuhl W, Ramirez E, Lisker R Some Mexican glucose-6-phosphate dehydrogenase variants revisited. Hum Genet. 1991 ;86:371-4.

8. Liu Y, Phelan J, Go RC, Prchal JF, Prchal JT. Rapid determination of clonality by detection of two closely-linked X chromosome exonic polymorphisms using allele-specific PCR. J Clin Invest. 1997 ;99:1984-90.

9. McMahon JR, Stevenson DK, Oski FA. Physiologic Jaundice. In Taeusch HW, Ballard RA,eds. Avery’s Disease of the Newborn, 7th ed. Philadelphia, WB Saunders, 1998:1003-1007.

10. Maisels MJ. Neonatal Jaundice. In Avery GB, Fletcher MA, MacDonald MG ed. Neonatology, Pathophysiology and Management of the Newborn, 5th ed. Philadelphia JB Lippincott, 1999: 765-819.

11. Newman TB, Easterling MJ, Goldman ES, Stevenson DK. Laboratory evaluation of jaundice in newborn. AJDC 1990;144:364-368.

12. McMahon JR, Stevenson DK, Oski FA.Management of neonatal hyperbilirubinemia. In Taeusch HW, Ballard RA, eds. Avery’s Disease of the Newborn, 7th ed. Philadelphia, WB Saunders, 1998:1033-1043.

13. Gartner LM. Neonatal Jaundice. Pediatr Rev 1994; 15:442-432.

54

14. McMahon JR, Stevenson DK, Oski FA. Bilirubin Metabolism. In Taeusch HW, Ballard RA,eds. Avery’s Disease of the Newborn, 7th ed. Philadelphia, WB Saunders, 1998:995-1002.

15. Cowford JL, House SC, Gollan JL. Formation, hepatic metabolism and transport of bile pigments: A status report. Sem Liver Dis 1998:8: 105-118.

16. Bracci R, Buonocore G,Garosi G, Bruchi S, Berni S. Epidemiologic study of neonatal jaundice. Acta Pediatr Scan 1989;360: 87-92.

17. Linn S, Schoenbaum SC, Monson RR. Epidemiology of neonatal hyperbilirubinemia. Pediatrics 1985;75: 770-778.

18. Johnson JD, Angelus P, Aldrich M, Skipper BJ. Exagerated jaundice in Navajo neonates; the role of bilirubin production. Am J Dis Child 1986;140:889-891.

19. Khoury MJ, Calle EE, Joesoef RM. Recurrence risk of neonatal hyperbilirubinemia in siblings. Am J Dis Child. 1988; 142:1065-9.

20. Bancroft JD, Kreamer B, Gourley GR. Gilbert syndrome accelerates development of neonatal jaundice. J Pediatr. 1998;132:656-60.

21. Maisels MJ. Neonatal Jaundice. In Sinclair JC, Bracken MB, eds. Effective care of the newborn infant. Oxford, Oxford University Press, 1992:507-518.

22. Yamauchi Y, Yamanouchi I. Difference in TcB readings between full term newborn infants born vaginally and by cesarean section. Acta Paediatr Scand. 1989;78:824-8.

23. Maisels MJ, Gifford K . Neonatal jaundice in full-term infants. Role of breast-feeding and other causes. Am J Dis Child. 1983 ;137:561-2.

24. Gale R, Seidmann DS, Dollberg S, Stevenson DK. Epidemiology of neonatal jaundice in the Jerusalem population. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1990;10:82-85.

25. Schreider AP. Breast milk Jaundice in the newborn. A real entity. JAMA 1986;255:3270-3278.

26. Lascari AD. “Early” breastfeeding jaundice: clinical significance. J Pediatr 1986; 108:156-158.

27. Hamosh M. Breast milk Jaundice. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1990; 11: 145-149.

28. Forsyth JS, Donnet L, Ross PE.A study of the relationship between bile salts, bile salt-stimulated lipase, and free fatty acids in breast milk: normal infants and those with breast milk jaundice. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1990;11: 205-10.

55

29. Monaghan G, McLellan A, McGeehan A, Li Volti S, Mollica F, Salemi I, Din Z, Cassidy A, Hume R, Burchell B. Gilbert's syndrome is a contributory factor in prolonged unconjugated hyperbilirubinemia of the newborn. J Pediatr. 1999 ; 134:441-6.

30. Rosenthal P, Sinatra F. Jaundice in infancy Pediatr Rev. 1989 ; 11:79-86.

31. Doyle JJ, Schmidt B, Blanch V,Zipursk A. Hematology. In Avery GB, Fletcher MA, McDonald MG eds. Neonatology, pathophysiology and the management of the Newborn, Philadelphia, JB Lippincott Company1999:1045-1092.

32. Falterman CG, Richardson CJ. Transfusion reaction due to unrecognized ABO hemolytic disease of the newborn infant. J Pediatr. 1980 ;97:812.

33. Singh B, Ezhilarasan R, Kumar P, Narang A. Neonatal hyperbilirubinemia and its association

with thyroid hormone levels and urinary iodine excretion. Indian J Pediatr 2003 ; 70: 311-5.

34. Beutler E, Westwood B, Prchal JT, Vaca G, Bartsocas CS, Baronciani L. New glucose-6-

phosphate dehydrogenase mutations from various ethnic groups. Blood. 1992; 1;80:255-6.

35. Calabrò V, Giacobbe A, Vallone D, Montanaro V, Cascone A, Filosa S, Battistuzzi G.

Genetic heterogeneity at the glucose-6-phosphate dehydrogenase locus in southern Italy: a study on a population from the Matera district. Hum Genet 1990;86:49-53.

36. Satar M, Kılınç Y, Tanyeli A, Tok M, Etiz L. Yenidoğan bebeklerde hiperbilirubinemi ile

glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enzim eksikliği arasındaki ilişki. Cerrahpaşa Tıp Fak Derg 1990; 21: 51-54.

37. Kaplan M, Hammerman C, Vreman HJ, Stevenson DK, Beutler E. Acute hemolysis and severe neonatal hyperbilirubinemia in glucose 6 phosphate dehydrogenase-deficient heterozygotes. J Pediatr 2001;139:137-40.

38. Beutler E. Glucose 6-phosphate dehydrogenase deficiency and other red cell abnormalities

metabolism. Williams Hematology 6th. Ed., New York: Mc Graw-Hill Medical Publishing, 2001;527-545.

39. Vulliamy TJ, Kaeda JS, Ait-Chafa D, Mangerini R, Roper D, Barbot J, Mehta AB,

Athanassiou-Metaxa M, Luzzatto L, Mason PJ. Clinical and haematological consequences of recurrent G6PD mutations and a single new mutation causing chronic nonspherocytic haemolytic anaemia. Br J Haematol, 1998; 101:670–675.

56

40. http://www.rialto.com/g6pd/ (Erişim tarihi: 21.10 . 2007)

41. http://www.rialto.com/favizm/ (Erişim tarihi: 21.10. 2007)

42. Beutler E. G6PD deficiency. Blood, 1994; 84: 3613-3636.

43. Vives-Corrons JL, Feliu E, Pujades M A, Cardellach F, Rozman C, Carreras A, Jou

JM, Vallespi MT, Zuazu FJ. Severe glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency associated with chronic hemolytic anemia granulocyte dysfunction and increased susceptibility to infections: description of a new molecular variant (G6PD Barcelona). Blood 1982; 59: 428-434.

44. Bruggen R, Bautista JM, Petropoulou T, Boer M, Zwieten R, Gomez-Gallego F,

Belohradsky BH, Hartwig NG, Stevens D, Mason PJ, Roos D. Deletion of leucine 61 in glucose-6-phosphate dehydrogenase leads to chronic nonspherocytic anemia granulocyte dysfunction and increased susceptibility to infections. Blood, 2002; 100: 1026-1030.

45. Elizondo J, Saenz GF, Paez CA, Ramon M, Garcia M, Gutierrez, Estrada M. G6PD Puerto Limon: a new deficient variant of glucose-6-phosphate dehydrogenase associated with congenital nonspherocytic hemolytic anemia. Hum Genet, 1982; 62: 110-112.

46. Leninger AL, Nelson DL, Cox MM. Principles of Biochemistry. 3rd Ed., New York : Worth

Publishers 2000.

47. http://www.rialto.com/g6pd/index.htm (Erişim tarihi: 21.10. 2007)

48. Luzatto L. Glucose-6-phosphate dehydrogenase: Genetic haematological aspects. Cell Bio Fun,

1987; 5: 101-107.

49. Beutler E, Westwood B, Melemed A, Dal Borgo P, Margolis D. Three new exon 10 glucose-

6-phosphate dehydrogenase mutations. Blood Cells Mol Dis, 1995; 21: 64–72.

50. Beutler E, Kuhl W, Gelbart T, Forman L. DNA sequence abnormalities of human glucose-6-

phosphate dehydrogenase variants. J Biol Chem, 1991; 266:4145–4150.

http://www.rialto.com/g6pd/

http://www.rialto.com/favizm/

http://www.rialto.com/g6pd/index.htm

57

51. Yıldız ŞM. Anamur bölgesinin Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enzim yapısı ve moleküler özelliği. Doktora tezi, Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya ABD, Adana 2004.

52. World Healthy Organization. Scientific group on the standardization of procedures for the study

of glucose-6-phosphate dehydrogenase. WHO Techn Rep Ser No 366, 1967; Genava .

53. Aksoy K, Yuregir GT, Dikmen N, Unlukurt I. Three new G6PD variants G6PD Adana,

G6PD Samandag, and G6PD Balcalı in Cukurova Turkey. Hum Genet, 1987; 76: 199-201.

54. Aksoy K. Yuregir GT, Dikmen N, Unlukurt I. Türkiye’de saptanan yeni bir G6PD B +

varyantı: G6PD Antakya. Ç.Ü. Tıp Fak. Dergisi, 1990; 15: 186 -191.

55. American Academy of Pediatrics Management of hyperbilirubinemia in the newborn infant 35

or more weeks of gestation. Subcommittee on Hyperbilirubinemia. Pediatrics. 2004 ;114:297-316.

56. Beutler E. Red cell metabolism: A manuel of Biochemical Methods, 3rd Ed, Orlanda: Grune &

Stratton Inc, 1984; : 68-71.

57. Petrucci RH. General Chemistry 5th Ed., New York: Mc Millan Publishing Company,1989.

58. Skoog DA, Leary JJ. Principles of instrumental analysis. 4th Ed. Fort Wort: Saunders College

Publishing, 1992: 654-660.

59. Poncz M, Solowiejzk D, Harpel B, Mory Y, Schwartz E, Surrey S. Construction of human

gene library from small amounts of peripheral blood. Analysis of β-like globin genes. Hemoglobin,1982; 6:27-36.

60. Saiki RK. The design and optimization of the PCR. New York : Stocton, 1989.

61. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manuel. New York:

Cold Spring Harbor Laboratory,1989.

62. Weatherall DJ. New genetics and clinical practise. Oxford Unıversity, Oxford, 1991.

63. Ganczakowski M, Town M, Bowden DK, Vulliamy TJ, Kaneko A, Clegg JB, Weatherall

DJ, Luzzatto L. Multiple glucose6-phosphate dehydrogenase-deficient variants correlate with malaria endemicity in the Vanuatu archipelago (southwestern Pacific). Am J Hum Genet 1995; 56: 294–301.

58

64. Beutler E, Westwood B, Prchal JT, Vaca G, Bartsocas CS, Baronciani L. New glucose-6-phosphate dehydrogenase mutations from various ethnic groups. Blood 1992; 80: 255-256.

65. Vulliamy TJ, Othman A, Town M, Nathwani A, Falusi AG, Mason PJ, Luzzatto L.

Polymorphic sites in the African population detected by sequence analysis of the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene outline the evolution of the variants A and A-. Proc Nat Acad Sci, 1991; 88: 8568-8571.

66. Glader B, Lukens JN. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of

hexose monophosphate shunt and glutathione metabolism. Wintrobe’s Clinical Hematology. 10th, egypt: Mass Publishing, 1999; 1176-1190.

67. Gaetani GF, Galiano S, Melani C, Miglino M, Forni GL, Napoli G, Perrone L, Ferraris

AM. A new glucose-6-phosphate dehydrogenase variant with congenital nonspherocytic hemolytic anemia (G6PD Genova). Biochemical characterization and mosaicism expression in the heterozygote. Hum Genet 1990; 84:337-40.

68. Beutler E, Luzzatto L. Hemolytic anemia. Semin Hematol. 1999; 36:38-47.

69. Kılınç Y. The incidence of glucose 6 phosphate dehydrogenase defgiciency in cord blood in

midsouth part of Turkey. Ç.Ü Tıp Fak Dergisi, 1982;3: 229-232.

70. Niazi GA, Adeyokunnu A, Westwood B, Beutler E. Neonatal jaundice in Saudi newborns with

G6PD Aures. Ann Trop Paediatr 1996;16:33-7.

71. Kwok CJ, Martin AC, Au SW, Lam VM. G6PDdb, an integrated database of glucose-6-

phosphate dehydrogenase (G6PD) mutations. Hum Mutat 2002;19:217-24.

72. Nuchprayoon I, Sanpavat S, Nuchprayoon S. Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)

mutations in Thailand: G6PD Viangchan (871G>A) is the most common deficiency variant in the Thai population. Hum Mutat 2002;19:185.

73. Beutler E. G6PD: population genetics and clinical manifestations . Blood Rev 1996; 10:45-52.

74. Kaplan M, Herschel M, Hammerman C, Hoyer JD, Heller GZ, Stevenson DK. Neonatal

hyperbilirubinemia in African American males: the importance of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. J Pediatr 2006;149:83-8.

59

75. Maffi D, Pasquino MT, Caforio MP, Sorrentino F, Cappabianca MP, Salvatti AM. Identification of G6PD Mediterranean mutation by amplification refractory mutation system. Clinica Chimica Acta, 2002; 321: 43-47.

76. Luzzatto L, Mehta A, Vulliamy TJ. Glucose 6-phosphate dehydrogenase deficiency The

Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 8th edition. Scriver C R Beaudet A L Sly W S and Valle D Eds McGraw-Hill New York, 2001; 4517–4553.

77. Glader B, Lukens JN. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of

hexose monophosphate shunt and glutathione metabolism. Wintrobe’s Clinical Hematology.10th, Egypt: Mass Publishing, 1999;1176-1190.

78. Pietrapertosa A, Palma A, Campanale D, Delios G, Vitucci A, Tannoia N. Genotype and

phenotype correlation in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Haematologica 2001; 86:30-5.

79. Corcoran CM, Calabro V, Tamagnini G, Town M, Haidar B, Vulliamy TJ, Mason PJ,

Luzzatto L. Molecular heterogeneity underlying the G6PD Mediterranean phenotype. Hum Genet. 1992;88: 688-90.

60

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı: Ferda ÖZLÜ

DoğumYeri ve Tarih: Gaziantep, 1972

Medeni Durumu: Evli, 2 çocuklu

Adres: Sümer mah. 43. Sok. Er sitesi C blok kat:5 daire:10

Telefon: 05327685190

E-posta: [email protected]

Mezun olduğu Tıp Fakültesi: Hacettepe Üniversitesi İng Tıp Fakültesi

Görev Yerleri: Adana Çukurova Kadın Doğum ve Çocuk Hastanesi

Yabancı Diller: İngilizce, Almanca

mailto:[email protected]

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ...T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ...

Documents

Transcript of T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ...T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ...