T.C. SÜLEYMAN DEM İREL ÜN İVERS İTES İ FEN B İLİMLER İ...
106
T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BOZADAN İZOLE EDİLEN LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS GYL32 SUŞU TARAFINDAN ÜRETİLEN BAKTERİYOSİNİN KARAKTERİZASYONU Gözde KORAL Danışman: Yrd. Doç. Dr. Yasin TUNCER YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ISPARTA - 2011
Transcript of T.C. SÜLEYMAN DEM İREL ÜN İVERS İTES İ FEN B İLİMLER İ...
T.C. SÜLEYMAN DEM İREL ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLER İ ENSTİTÜSÜ
BOZADAN İZOLE ED İLEN LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS GYL32 SUŞU TARAFINDAN ÜRET İLEN BAKTER İYOSİNİN
KARAKTER İZASYONU
Gözde KORAL
Danışman: Yrd. Doç. Dr. Yasin TUNCER
YÜKSEK L İSANS TEZİ GIDA MÜHEND İSLİĞİ ANABİLİM DALI
ISPARTA - 2011
TEZ ONAYI
Gözde KORAL tarafından hazırlanan “Bozadan İzole Edilen Lactococcus lactis
subsp. lactis GYL32 Suşu Tarafından Üretilen Bakteriyosinin
Karakterizasyonu” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği / oy
çokluğu ile Süleyman Demirel Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı’nda
YÜKSEK L İSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir.
Danışman : Yrd. Doç. Dr. Yasin TUNCER
Süleyman Demirel Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Jüri Üyeleri :
Prof. Dr. Zeynep Banu SEYDİM
Süleyman Demirel Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Yrd. Doç. Dr. Seyhan ULUSOY
Süleyman Demirel Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Mustafa KUŞCU Enstitü Müdürü
Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
i
İÇİNDEKİLER
Sayfa İÇİNDEKİLER ..…………………………………………………………………
ÖZET …………………………………………………………………………….
ABSTRACT ……………………………………………………………………...
TEŞEKKÜR ……………………………………………………………………...
ŞEKİLLER DİZİNİ ……………………………………………………………....
ÇİZELGELER DİZİNİ…………………………………………………………..
SİMGELER DİZİNİ …………………………………………………………….
1. GİRİŞ.................................................................................................................
2. KAYNAK ÖZETLERİ ……………………………………………………….
2.1. Laktokokların Taksonomik Özellikleri ……………………………………...
2.2. Bakteriyosinlerin Genel Özellikleri ve Sınıflandırılması ……………………
2.2.1. Grup I : lantibiyotikler …………………………………………………….
2.2.2. Grup II: lantibiyotik olmayan ısı stabil bakteriyosinler …………………...
2.2.3. Grup III: yüksek moleküler ağırlığa sahip ısıya duyarlı bakteriyosinler.….
2.2.4. Grup IV: lipit veya karbonhidrat yan grupları içeren kompleks
bakteriyosinler ........................................................................................................
2.3. Laktokoklar Tarafından Üretilen Bakteriyosinler …………………………...
2.3.1. Diplokoksin ..................................................................................................
2.3.2. Laktokoksin A ..............................................................................................
2.3.3. Laktokoksin B ..............................................................................................
2.3.4. Laktokoksin G ..............................................................................................
2.3.5. Laktokoksin 972 ...........................................................................................
2.3.6. Laktokoksin MN ..........................................................................................
2.3.7. Laktokoksin MMFII .....................................................................................
2.3.8. Laktokoksin MMT24 ...................................................................................
2.3.9. Laktokoksin Q ............................................................................................
2.3.10. Laktokoksin BZ ..........................................................................................
2.3.11.Laktoztrepsinler...........................................................................................
2.3.12. Laktisin 3147...............................................................................................
2.3.13. Laktisin 481.................................................................................................
i
iv
v
vi
vii
ix
x
1
3
3
5
6
8
8
8
9
9
9
10
11
11
11
12
12
13
13
14
14
16
ii
2.3.14. Laktisin FS92..............................................................................................
2.3.15. Laktisin Z....................................................................................................
2.3.16. Laktisin Q....................................................................................................
2.3.17. Laktosiklisin Q............................................................................................
2.3.18. Nisin............................................................................................................
2.3.18.1. Nisinin gıdalarda kullanımı……………………………………………..
3. MATERYAL VE YÖNTEM..............................................................................
3.1. Materyal...........................................................................................................
3.1.1. Fermente gıda örnekleri................................................................................
3.1.2. Mikroorganizmalar........................................................................................
3.2. Yöntem.............................................................................................................
3.2.1. Laktokok suşlarının izolasyonu....................................................................
3.2.2. İzolatların tanısı.............................................................................................
3.2.2.1. Morfolojik tanı ve katalaz testi..................................................................
3.2.2.2. Elliker broth ortamında gelişme.................................................................
3.2.3. İzolatların antibakteriyel aktivite özelliklerinin belirlenmesi.......................
3.2.4. Proteolitik enzim uygulaması........................................................................
3.2.5. Bakteriyosin üreticisi laktokok izolatının fenotipik tanısı............................
3.2.6. Bakteriyosin üreticisi laktokok izolatının genotipik tanısı………………...
3.2.6.1. Genomik DNA izolasyonu.........................................................................
3.2.6.2. Genomik DNA örneklerinin elektroforezi.................................................
3.2.6.3. GYL32 izolatının 16S rDNA bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu
(PZR) ile çoğaltılması ve sekans analizi…….........................................................
3.2.7. GYL32 izolatının plazmid içeriğinin tanımlanması......................................
3.2.7.1. Plazmid DNA izolasyonu...........................................................................
3.2.7.2. Plazmid DNA örneklerinin elektroforezi...................................................
3.2.7.3. Plazmid büyüklüklerinin hesaplanması.....................................................
3.2.8. Bakteriyosin aktivitesi üzerine pH, sıcaklık, ve enzim uygulamalarının
etkisi........................................................................................................................
3.2.8.1. pH’ nın bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi...................
3.2.8.2. Enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin
belirlenmesi.............................................................................................................
17
17
17
18
19
26
29
29
29
29
30
30
31
31
31
32
32
33
33
33
35
36
37
37
39
40
41
41
42
iii
3.2.8.3. Sıcaklık uygulamasının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin
belirlenmesi.............................................................................................................
3.2.9. Bakteriyosin yapısal genlerinin PZR ile çoğaltılması...................................
3.2.10. Hücre liziz ..................................................................................................
3.2.11. Bakteriyosin üretimi....................................................................................
3.2.12. Bakteriyosinin kısmi saflaştırılması…........................................................
3.2.13. Trisin-sodyum dodesilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (Trisin-SDS-
PAGE).....................................................................................................................
3.2.13.1. Bakteriyosinin moleküler büyüklüğünün hesaplanması..........................
3.2.13.2. Aktif protein bantının tespiti....................................................................
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTI ŞMA.................................................
4.1. Laktokok Suşlarının İzolasyonu.......................................................................
4.2. Laktokok İzolatlarının Antibakteriyel Aktivite Özelliklerinin Belirlenmesi...
4.3. Proteolitik Enzim Uygulaması.........................................................................
4.4. Bakteriyosin Üreticisi Laktokok İzolatının Tanısı...........................................
4.5. Plazmid DNA İzolasyonu................................................................................
4.6. Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine pH, Sıcaklık ve Enzim Uygulamalarının
Etkisi…...................................................................................................................
4.7. Bakteriyosin Yapısal Genlerinin Belirlenmesi...............................................
4.8. Hücre Liziz.......................................................................................................
4.9. Bakteriyosin Üretimi........................................................................................
4.10. Trisin-Sodyum Dodesilsülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (Trisin-SDS-
PAGE).....................................................................................................................
5. SONUÇ...............................................................................................................
6. KAYNAKLAR .................................................................................................
ÖZGEÇMİŞ............................................................................................................
42
42
43
43
44
45
48
48
49
49
52
55
57
62
63
66
69
70
72
74
75
94
iv
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
BOZADAN İZOLE ED İLEN LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS GYL32 SUŞU TARAFINDAN ÜRET İLEN BAKTER İYOSİNİN
KARAKTER İZASYONU
Gözde KORAL
Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman: Yrd. Doç. Dr. Yasin TUNCER
Bu çalışmada, farklı fermente gıda örneklerinden bakteriyosin üreticisi Lactococcus
lactis suşlarının izolasyonu ve üretilen bakteriyosinlerin karakterizasyonu
amaçlanmıştır. İzole edilen 50 adet laktokok suşu arasından 1 adedinin (GYL32)
bakteriyosin üreticisi olduğu belirlendi. Bozadan izole edilen bakteriyosin üreticisi
GYL32 izolatı fenotipik olarak API sistemi ve genotipik olarak 16S rDNA dizi
analizi kullanılarak Lactococcus lactis subsp. lactis olarak tanımlandı. Farklı pH,
sıcaklık ve enzim uygulamaları sonucu Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu
tarafından üretilen bakteriyosinin nisin olduğu belirlendi. Spesifik nisin primerleri
kullanılarak yapılan PZR çalışması ve dizi analizi sonucu GYL32 suşunda nisin Z
üretiminin genetik determinantlarının genomik DNA üzerinde kodlu olduğu tespit
edildi. Hücre liziz çalışması sonucu, Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından
üretilen nisin Z’nin Lb. plantarum LMG2003 suşuna karşı bakterisidal etki gösterdiği
belirlendi. GYL32 suşunda bakteriyosin üretimi gelişme fazında başladı ve
maksimum bakteriyosin üretimi (5120 AU/mL) bu fazının sonunda ölçüldü. Trisin-
SDS-PAGE analizi sonucunda; kısmi saflaştırması yapılan nisin Z’nin dimer
formunda (6.7 kDa) bulunduğu tespit edildi.
Anahtar Kelimeler: Fermente gıda, Lactococcus lactis, bakteriyosin, PZR, trisin-
SDS-PAGE, nisin Z
2011, 94 sayfa
v
ABSTRACT
M. Sc. Thesis
CHARACTERIZATION OF BACTERIOCIN PRODUCED BY LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS GYL32 STRAIN ISOLATED
FROM BOZA
Gözde KORAL
Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences
Food Engineering Department
Supervisor: Asst. Prof. Dr. Yasin TUNCER
The purpose of this study, isolation of bacteriocin producer Lactococcus lactis strains
from different fermented foods. The one strain (GYL32) was determined as
bacteriocin producer among the isolated 50 lactoccoccal strains. Bacteriocin
producer GYL32 strain isolated from Boza was identified as Lactococcus lactis
subsp. lactis, phenotypically by API system and genotypically by 16S rDNA
analysis. Bacteriocin produced by Lc. lactis subsp. lactis GYL32 strain was
characterizated as nisin by different pH, enzyme and heat treatments. PCR analysis
using spesific nisin primers and sequence analysis results showed that genetic
determinants of nisin Z production in GYL32 strain are encoded on genomic DNA.
Cell lysis study showed that nisin Z produced by Lc. lactis subsp. lactis GYL32 was
determined as acting bactericidal activity against Lb. plantarum LMG2003 strain.
Bacteriocin production in GYL32 strain started in exponential phase and maximum
bacteriocin production (5120 AU/mL) recorded at the end of the this phase. Tricine-
SDS-PAGE analysis showed that partially purified nisin Z was found as dimer form
(6.7 kDa).
Key Words: Fermented food, Lactococcus lactis, bacteriocin, PCR, tricine-SDS-
PAGE, nisin Z
2011, 94 pages
vi
TEŞEKKÜR
Başta bana bu konuda çalışma imkanı sunan ve çalışmamın her aşamasında bilgi,
yardım ve önerilerini esirgemeyen, bilimsel çalışma disiplinini öğrenmemde ve
akademik gelişimimde büyük emeği geçen Danışman Hocam Sayın Yrd. Doç. Dr.
Yasin TUNCER olmak üzere;
Çalışmalarımın her aşamasında bilgi ve tecrübesini benimle paylaşan sayın Dr. Banu
ÖZDEN TUNCER’e;
Laboratuar günlerini birlikte geçirdiğim çalışma arkadaşım Nazlı YOĞURTÇU’ya;
Beni her konuda destekleyen sevgili aileme ve manevi desteğini benden esirgemeyen
arkadaşım Alper DEVECİ’ye;
2047-YL-09 no’lu proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel
Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı’na;
En içten teşekkürlerimi sunarım.
Gözde KORAL
ISPARTA, 2011
vii
ŞEKİLLER D İZİNİ
Şekil 2.1. Lantibiyotik grubu bakteriyosinlerin yapısında bulunan modifiye
amino asitlerin kimyasal yapısı……………………………………..
7
Şekil 2.2. Laktokoksin A’nın duyarlı hücrelerde por oluşumu ve
dirençlilik mekanizması……………………………………………..
10
Şekil 2.3. Ltnα ve Ltnβ alt ünitelerinin moleküler yapısı …………………..... 15
Şekil 2.4. Laktisin Q’nun antimikrobiyel etki mekanizması………………….. 18
Şekil 2.5. Laktosiklisin Q’nun moleküler yapısı…………………………….... 19
Şekil 2.6. Lc. lactis suşları tarafından üretilen nisin varyantlarının amino asit
dizilimlerinin karşılaştırılması....……………………………………
20
Şekil 2.7. Nisin A, Z ve Q’nun moleküler yapısı………..……………………. 21
Şekil 2.8. Nisin U’nun moleküler yapısı…………………………………….... 22
Şekil 2.9. Nisinin translasyon sonrası modifikasyonu………………………… 23
Şekil 2.10. Nisin A’nın biyosentezi, regulasyonu ve dirençliliğini kodlayan gen
kümesi……………………………………………………………….
24
Şekil 2.11. Nisin por oluşum mekanizması…………………………………….. 25
Şekil 4.1. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun, Lb. plantarum LMG2003
suşuna karşı verdiği inhibisyon zonu………………………………..
54
Şekil 4.2. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen
antibakteriyel maddenin proteinaz K uygulaması sonucu kalan
aktivitesi……………………………………………………………..
55
Şekil 4.3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen
antibakteriyel maddenin α-kemotripsin uygulaması sonucu kalan
aktivitesi……………………………………………………………..
56
Şekil 4.4. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genomik DNA örneği…….. 59
Şekil 4.5. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun PZR ile çoğaltılan 16S
rDNA fragmenti……………………………………………………..
61
Şekil 4.6. Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun
plazmid içeriği………………………………………………………
62
Şekil 4.7. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunda nisin yapısal geninin
genomik ve plazmid DNA kullanılarak PZR amplifikasyonu………
67
viii
Şekil 4.8. Nisin primerleri ile Lc. lactis subsp. lactis GYL32’nin çoğaltılan
gen bölgesi…………………………………………………………..
68
Şekil 4.9. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen
bakteriyosinin Lb. plantarum LMG2003 suşunun gelişmesi üzerine
etkisi…………………………………………………………..……..
69
Şekil 4.10. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından bakteriyosin üretimi
ve kültür yoğunluğundaki değişim………………………………….
71
Şekil 4.11. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen
bakteriyosinin trisin-sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel
elektroforez profili…………………………………………………..
73
ix
ÇİZELGELER D İZİNİ
Çizelge 2.1. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin
sınıflandırılması……………………………………………………
6
Çizelge 2.2. Gıda uygulamalarında kullanılan nisin ve nisaplin miktarları…….. 26
Çizelge 3.1. Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan PZR karışımı…………. 36
Çizelge 4.1. Araştırmada kullanılan laktokok suşlarının izolasyon materyalleri
ve izolasyon materyallerinin sağlandığı iller………………………
50
Çizelge 4.2. İndikatör bakterilere karşı zon veren laktokok izolatları ve zon
çapları………………………………………………………………
53
Çizelge 4.3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun API 50 CH karbonhidrat
fermentasyon test sonuçları………………………………………...
58
Çizelge 4.4. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen
bakteriyosinin aktivitesi üzerine farklı pH, enzim ve sıcaklık
uygulamalarının etkisi…………………………………………….
65
x
SİMGELER D İZİNİ
APS Amonyum Persülfat
Da Dalton
dk Dakika
DNA Deoksiribonukleik Asit
EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit
FAO Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü
g Gram
GRAS İnsan ve Hayvan Tüketiminde Güvenilir
kb Kilobaz
kDa Kilo Dalton
LAB Laktik Asit Bakterisi
log Logaritma
mA Miliamper
mg Miligram
mL Mililitre
mm Milimetre
mM Milimolar
M Molar
N Normal
RNA Ribonukleik Asit
SDS Sodyum Dodesil Sülfat
SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi
TEMED Tetrametil Etilen Daimin
WHO Dünya Sağlık Örgütü
µg Mikrogram
µL Mikrolitre
µm Mikrometre
∆ψ Membran potansiyeli
1
1. GİRİŞ
Fermentasyon gıda üretimi ve korunmasında kullanılan en ekonomik ve en eski
yöntemlerden biridir. Fermentasyon işlemi, taşınacak materyalin hacminin
azaltılmasını, gıdanın tekstürel yapısının iyileştirilmesini, sindirilebilirlik ve besin
değerinin arttırılmasını, pişirme için gerekli olan enerji miktarının azaltılmasını ve
daha güvenli bir ürün üretilmesini sağlar. Laktik asit bakterileri (LAB) grubunda
yer alan Lactococcus (laktokoklar) cinsi üyesi Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis
subsp. lactis biovar. diacetylactis ve Lc. lactis subsp. cremoris başta fermente süt
ürünleri olmak üzere, değişik tip fermente gıdaların üretiminde starter kültür
suşları olarak kullanılmaktadır. Farklı coğrafik bölgelerde bu bakteriler
kullanılarak üretilmiş pek çok fermente gıda sevilerek tüketilmektedir.
Laktokoklar fermentasyon süreçlerinde ürünün yapısal ve aromatik özelliklerini
geliştirmenin yanı sıra ürettikleri asetoin, diasetil, hidrojen peroksit, organik asitler
ve bakteriyosinler gibi antimikrobiyel maddeler yardımıyla ürünün raf ömrünün
uzatılmasını da sağlarlar.
Her geçen gün gelişen modern teknolojinin gıda endüstrisinde kullanılıyor
olmasına rağmen, gıdaların korunması sadece gelişmekte olan ülkeler için değil;
gelişmiş ülkeler için de hala önemli bir sorun oluşturmaktadır. Gıda
bozulmalarından kaynaklanan ekonomik kayıpları azaltarak, gıda işleme
maliyetini düşürerek ve gıda üretim ve taşınması sırasında patojen
mikroorganizma bulaşmasını önleyerek tüketici beklentilerini karşılayabilecek,
tüketime hazır, taze, besin değeri yüksek, vitamince zengin, az işlem görmüş ve
minimum düzeyde kimyasal koruyucu içeren gıdaları üretmek gıda endüstrisinin
en önemli sorununu oluşturmaktadır.
Günümüzde doğal muhafaza yöntemleri kullanılarak güvenilir hale getirilen gıda
maddeleri tüketiciler tarafından daha fazla kabul görmektedir. Bu durum alternatif
gıda muhafaza yöntemlerinin geliştirilmesi çalışmalarına hız kazandırmıştır.
Yukarıda özetlenen sorunların giderilmesinde kullanılacak alternatif gıda koruma
yöntemlerinin başında bakteriyosin üreticisi suşların doğrudan ya da dolaylı bir
2
şekilde gıda endüstrisinde kullanımı gelmektedir. Bakteriyosinler, insan ve çevre
sağlığı üzerinde olumsuz etki içermemelerinin yanı sıra gıda bozulması ya da
Salmonella, Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum ve Clostridium
perfringens gibi gıda kökenli hastalık etmeni mikroorganizmalara karşı güçlü
koruma sağlamaktadır.
Lactococcus lactis suşları tarafından üretilen nisin doğal bir antimikrobiyel madde
olması, geniş aktivite spektrumuna sahip olması, toksik olmaması ve sindirim
enzimleri tarafından kolayca parçalanması nedeniyle gıda sanayinde en çok
uygulama alanı bulan ve üzerinde en çok çalışılan bakteriyosin olmuştur. Nisin, 1953
yılından beri Nisaplin ticari adıyla hazır preparat olarak piyasada satılmaktadır. Gıda
ve Tarım Örgütü/Dünya Sağlık Örgütü (FAO/WHO) ve Amerika Gıda ve İlaç
Dairesi (FDA) onaylı olan nisin 1996 yılından itibaren Avrupa birliği ülkeleri, Çin ve
Amerika’nın da arasında bulunduğu 50’den fazla ülkede gıda katkısı olarak
kullanılmaktadır.
Bakteriyosin üreten suşların doğrudan ya da dolaylı bir şekilde gıda endüstrisinde
kullanımının artması, bakteriyosin üretme yeteneği yüksek ya da konakçı
spektrumu geniş yeni bakteriyosin üreticilerinin tanımlanması ile mümkün
olacaktır. Bu nedenle bakteriyosin üreticisi yeni suşların tanımlanması ve üretilen
bakteriyosinlerin karakterizasyonu son yıllarda pek çok araştırmanın odak noktası
olmuştur. Bu doğrultuda tasarlanan tezde, farklı fermente gıda örneklerinden
bakteriyosin üretim yeteneğine sahip Lactococcus lactis suşlarının izolasyonu,
tanısı ve üretilen bakteriyosinlerin karakterizasyonu amaçlanmıştır.
3
2. KAYNAK ÖZETLER İ
2.1. Laktokokların Taksonomik Özellikleri
Nükleik asit hibridizasyonu, fizyolojik testler, karşılaştırmalı serolojik çalışmalar,
süperoksit dismutaz enzim varlığının tanımlanması, lipoteikoik asid yapılarındaki
benzerlik, lipit, yağ asidi ve menakinon kompozisyonlarının belirlenmesi sonucu
1985 yılında Streptococcus lactis subsp. lactis, Streptococcus lactis subsp. cremoris,
Lactobacillus hordniae, Lactobacillus xylosus, Streptococcus garvieae,
Streptococcus plantarum ve Streptococcus raffinolactis türleri, Lactococcus cinsi
altında sınıflandırılmıştır. Bu yeni sınıflandırmada S. lactis subsp. lactis, S. lactis
subsp. cremoris, S. plantarum, S. garvieae ve S. raffinolactis’in sadece cins adları
değiştirilmi ştir. Lb. xylosus ve Lb. hordniae ise sırasıyla Lc. lactis subsp. lactis ve Lc.
lactis subsp. hordniae olarak adlandırılmıştır (Schleifer et al., 1985). Bu
sınıflandırmadan beş yıl sonra alabalıklardan izole edilen Lactococcus piscium’un
tanımlanmasıyla Lactococcus cinsi uzun süre beş tür içermiştir (Williams et al.,
1990).
Yakın zamanda aktif çamur köpüğünden izole edilen Lactococcus chungangensis
(Cho et al., 2008) ve son olarak lahanadan izole edilen Lactococcus fujiensis’in (Cai
et al., 2010) tanımlanmasıyla günümüzde Lactococcus cinsi; Lc. lactis, Lc.
raffinolactis, Lc. garvieae, Lc. plantarum, Lc. piscium, Lc. chungangensis ve Lc.
fujiensis olmak üzere yedi tür içermektedir.
Gram pozitif, katalaz negatif, fakültatif anaerob, endospor oluşturmayan hareketsiz
koklar olarak tanımlanan Lactococcus cinsi üyesi bakteriler küresel ve oval şekilli
olup, ortalama 0.5-1.2 x 0.5-1.5 µm boyutlarındadır (Schleifer, 1987; Holt et al.,
1994). Laktokoklar sıvı besi ortamlarında tek, çift veya kısa zincirler halinde üreme
gösterirler. Benzer morfolojik yapı göstermelerinden dolayı streptokok, enterokok ve
leukonostok cinslerinden ayrımları zordur. Hücre çiftlerinin temas yönünde uzaması
morfolojik tanıda laktobasillerle de karıştırılmalarına yol açmaktadır. Gelişmeleri
4
için başta azot kaynakları olmak üzere çok sayıda besin maddesine gereksinim
duyarlar. Optimum gelişme sıcaklıkları 30 oC olan laktokoklar, 10 oC’nin altında ve
45 oC’nin üzerindeki sıcaklıklarda, % 6.5 NaCl varlığında ve ortam pH’sının 9.6
olması halinde gelişme gösteremezler. Homofermentatif özellikte olan laktokoklar,
şeker katabolizması sonucu ana ürün olarak L(+) laktik asit üretirler (Schleifer, 1987;
Holt et al., 1994; Boumerdassi et al., 1997; Samaržija et al., 2001). Lactococcus cinsi
üyesi bakteriler, Lancefield serolojik N grubunda yer alırlar. Zayıf α-hemolitik
aktivite gösteren bazı Lc. lactis subsp. lactis suşları hariç, laktokoklar hemolitik
aktivite göstermemektedir (Schleifer, 1987; Holt et al., 1994; Boumerdassi et al.,
1997; Casalta and Montel, 2008).
Lactococcus lactis türü; Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis
subsp. hordinae ve Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis olmak üzere üç alt tür
ve bir biyovaryete içermektedir. Lc. lactis subsp. hordinae dışındaki Lc. lactis türü
üyesi bakteriler başta fermente süt ürünleri olmak üzere farklı fermente gıdalarda tek
başlarına veya Streptococcus ve Lactobacillus gibi diğer laktik asit bakterileriyle
beraber starter kültür suşları olarak kullanılmaktadır (Özer, 2007). Lc. lactis subsp.
hordinae ise bitkisel habitatını değiştirmemiş bir alt tür olup, laktozu fermente etme
yeteneği içermemesinden dolayı süt endüstrisinde starter kültür suşu olarak
kullanılmamaktadır (Schleifer, 1987).
Lc. lactis subsp. lactis suşları arjinin hidrolizi sonucu amonyak oluşturmaları,
maltozu ve ribozu fermente etmeleri, 40 oC inkübasyon sıcaklığında, pH’nın 9.2
olması halinde ve % 4 NaCl varlığında gelişebilme özellikleri ile Lc. lactis subsp.
cremoris suşlarından belirgin bir şekilde ayrılırlar (Schleifer, 1987; Stiles and
Holzapfel, 1997; Axelsson, 1998). Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis
suşlarının sitrat metabolizması sonucu, diaestil ve asetoin oluşturma yetenekleri, bu
suşları Lc. lactis subsp. lactis suşlarından ayıran tek farklılıktır. Bu suşlarda sitrat
metabolizmasının ana enzimi olan sitrat permeaz aktivitesinin 8 kilobaz büyüklükteki
bir plazmid tarafından kodlandığı saptanmıştır (Özer, 2007).
5
2.2. Bakteriyosinlerin Genel Özellikleri ve Sınıflandırılması
Bakteriyosinler farklı bakteri grupları tarafından üretilen, antimikrobiyel aktiviteye
sahip, ribozomal olarak sentezlenen, peptitler veya proteinlerdir (Jack et al., 1995;
Cotter et al., 2005; Zendo et al., 2010). İlk bakteriyosin 1925 yılında Gratia
tarafından tanımlanmıştır. Escherichia coli tarafından üretilen protein yapısındaki
bu inhibitör madde kolisin olarak isimlendirilmiştir (Gratia, 1925). Kolisinin
bulunmasını takiben 1928 yılında çeşitli laktik streptokokların (laktokokların) bazı
laktik asit bakterileri üzerine inhibitör etki gösterdiği belirlenmiştir (Rogers and
Whittier, 1928). Bundan beş yıl sonra Whitehead (1933), protein yapısında
inhibitör bir madde tanımlamıştır. Bu inhibitör madde 1947 yılında nisin veya
grup N inhibitory substance (-in son eki antibiyotik özelliğini belirtmektedir)
olarak adlandırılmıştır (Mattick and Hirsch, 1947).
Bakteriyosinlerin genel özellikleri, ribozomal olarak sentezlenen protein yapısındaki
bileşikler olmaları ve özellikle yakın akraba türlere karşı antibakteriyel aktivite
göstermeleridir (Gillor et al., 2005). Benzer aktivite göstermelerinden dolayı
bakteriyosinler, birçok kaynakta antibiyotikler ile karıştırılmaktadır. Ancak
bakteriyosinleri antibiyotiklerden ayıran bazı farklılıklar bulunmaktadır.
Bakteriyosinler ribozomal olarak sentezlenen ürünlerdir, antibiyotikler ise enzimatik
işlenme aracılığıyla aktif formlarını kazanırlar. Bakteriyosinler genellikle gelişme
fazında üretilen birincil metabolitlerdir, antibiyotikler ise durma fazında üretilen
ikincil metabolitlerdir. Her bakteriyosinin kendi dirençlilik proteini vardır.
Dirençlilik proteinini kodlayan genler, bakteriyosinin yapısal genleri ile bağlantılıdır.
Antibiyotik dirençliliği yöneten genler ise, yapısal antibiyotik genleri ile bağlantılı
değildir. Bakteriyosinlerin etki spektrumları antibiyotiklere göre çok daha dardır
(Chen and Hoover, 2003; Gillor et al., 2005).
Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler, amino asit dizilimleri, etki
mekanizmaları, biyolojik aktiviteleri, ısı toleransları, modifiye aminoasit varlıkları ve
salgı mekanizmaları göz önünde bulundurularak dört ana grup altında
6
sınıflandırılmıştır (Çizelge 2.1.) (Klaenhammer, 1993; Diep and Nes, 2002;
Jeevaratnam et al., 2005; Zendo et al., 2010).
Çizelge 2.1. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin
sınıflandırılması
Grup I. Lantibiyotikler
Ia: Nisin benzeri lantibiyotikler. Katyonik özellik içerirler.
Ib: Duramisin benzeri lantibiyotikler. Globüler proteinler olup düşük
negatif yük içerirler.
Grup II. Lantibiyotik olmayan ısı stabil bakteriyosinler
IIa: Antilisteriyal etkili pediosin benzeri bakteriyosinler
IIb: İki bileşenli (iki peptitli) bakteriyosinler
IIc: Siklik bakteriyosinler
IId: Diğer grup II bakteriyosinler
Grup III. Yüksek moleküler ağırlığa sahip ısıya duyarlı bakteriyosinler
Grup IV. Lipit veya karbonhidrat yan grupları içeren kompleks bakteriyosinler
2.2.1. Grup I: lantibiyotikler
Lantibiyotikler, lantiyonin (Ala-S-Ala), β-metillantiyonin (Abu-S-Ala),
dehidroalanin ve dehidrobütirin gibi nadir bulunan amino asitleri içeren (Şekil 2.1.),
ribozomal olarak sentezlenen, ısı stabil, küçük (<5 kDa), birden fazla halka yapısı
içeren ve membran üzerinde aktivite gösteren peptitlerdir (Cintas et al., 2001; Gillor
et al., 2005; Jeevaratnam et al., 2005; de Vuyst and Leroy, 2007; Todorov, 2009).
Lantibiyotikler translasyon sonrası modifiye olmuş peptitlerin amino asit
kompozisyonu ve etki mekanizmaları esas alınarak iki alt gruba ayrılmışlardır. Grup
Ia nisin ve benzerlerini ve grup Ib ise duramisin ve benzerlerini içerir. Grup Ia
lantibiyotikler katyonik, lineer ve düzgün olmayan şekillidirler. Bu grup üyesi
lantibiyotikler hedef hücre membranlarında porlar oluşturur ve membran
potansiyelini bozarak duyarlı bakterileri inhibe etmektedirler. Grup Ia üyesi
7
bakteriyosinlerinden bazıları nisin, subtilin, Pep5, epiderminin ve gallidermin’dir.
Grup Ib lantibiyotikler, yüksüz veya negatif yüklü globular peptitlerdir. Bu grup
üyesi bakteriyosinler enzim inhibitörü olarak görev yaparlar. Grup Ib üyesi
bakteriyosinlerden bazıları mersasidin ve sinnamisin’dir (Gillor et al., 2005;
Reunanen, 2007; Todorov, 2009).
Şekil 2.1. Lantibiyotik grubu bakteriyosinlerin yapısında bulunan modifiye amino
asitlerin kimyasal yapısı (Reunanen, 2007)
Günümüzde 30 farklı bakteri tarafından üretilen yaklaşık 50 adet lantibiyotik grubu
bakteriyosin tanımlanmıştır (Patton and van der Donk, 2005; Breukink and Kruijff,
2006). Lantibiyotik grubu bakteriyosinlerin üretiminden sorumlu gen kümeleri,
plazmidler veya transpozonlar gibi hareketli elemanlar üzerinde veya bakteri
kromozomu üzerinde lokalize olmuş olabilir (Gillor et al., 2005). Pek çok
lantibiyotik için yapısal genleri içeren gen kümelerinin DNA dizisi belirlenmiştir.
Lantibiyotik gen kümeleri çeşitli korunmuş genler içermektedir. Korunmuş bu
genlerin translasyon ürünleri olan; öncü protein LanA, öncü proteinin
modifikasyonundan sorumlu enzimler LanM veya LanB ve LanC, lider peptidin
uzaklaştırılması için gerekli proteaz LanP, modifiye öncü peptidin taşınmasını
sağlayan protein LanT, biyosentezi düzenleyen proteinler LanK ve LanR, dirençliliği
sağlayan LanI ve LanFEG proteinleri farklı lantibiyotiklerin biyosentezinde benzer
aktiviteleri gerçekleştirmektedir (Reunanen, 2007).
8
2.2.2. Grup II: lantibiyotik olmayan ısı stabil bakteriyosinler
Grup II bakteriyosinler küçük moleküler ağırlığa sahip (<10 kDa), ısı stabil,
lantiyonin, β-metillantiyonin, dehidroalanin ve dehidrobütirin gibi modifiye olmuş
amino asit kalıntıları içermeyen peptitlerden oluşmaktadır. Bu grup üyesi
bakteriyosinler, grup IIa, grup IIb, grup IIc ve grup IId olmak üzere dört alt gruba
ayrılmıştır (Cintas, 2001; Jeevaratnam et al., 2005; de Vuyst and Leroy, 2007;
Todorov, 2009).
Grup IIa üyesi bakteriyosinler, Listeria türlerine karşı aktivite gösteren pediosin
benzeri bakteriyosinlerdir. Pediosin PA-1 bu grubun en önemli temsilcisidir. Grup
IIb bakteriyosinler, iki peptit içerirler. Tam aktivite gösterebilmeleri için bu iki
peptide birden ihtiyaçları vardır. Grup IIc bakteriyosinleri siklik bakteriyosinlerdir.
Grup IId üyesi bakteriyosinler ise, söz edilen ilk üç grup içerisinde yer almayan diğer
grup II üyesi bakteriyosinleri içerir (Jeevaratnam et al., 2005; de Vuyst and Leroy,
2007; Todorov, 2009).
2.2.3. Grup III: yüksek moleküler ağırlı ğa sahip ısıya duyarlı bakteriyosinler
Grup III üyesi bakteriyosinler, ısıya duyarlı ve büyük moleküler ağırlığa sahip
bakteriyosinlerdir. Bu grubun üyeleri 30 kDa ve üzerinde moleküler büyüklüğe
sahiptirler. Bu grubun bazı üyeleri Lb. helveticus tarafından üretilen helvetisin J ve
helvetisin V-1829 ve Lb. acidophilus tarafından üretilen laktisin B’dir (Chen and
Hoover, 2003; Jeevaratnam et al., 2005; de Vuyst and Leroy, 2007; Todorov, 2009).
2.2.4. Grup IV: lipit veya karbonhidrat yan gruplar ı içeren kompleks
bakteriyosinler
Grup IV altında sınıflandırılan bakteriyosinlerin biyolojik aktiviteleri için, polipeptit
yapısı dışında karbonhidratlar veya lipitler gibi ilave bazı yapılar içermeleri
gerekmektedir. Plantarisin S, laktosin 27 ve leukonosin S bu grubun bazı üyeleridir
(Ennahar et al., 2000; Nes and Holo, 2000; Jeevaratnam et al., 2005).
9
2.3. Laktokoklar Tarafından Üretilen Bakteriyosinler
2.3.1. Diplokoksin
Lc. lactis subsp. cremoris tarafından üretilen diplokoksin, laktokoklarda tanımlanan
ilk protein benzeri inhibitör maddedir. Diplokoksin laktokok suşlarına karşı güçlü
bakterisidal etki göstermektedir. Moleküler ağırlığı 5300 Da olan diplokoksin, 51
amino asit kalıntısı içerir. Diplokoksin lantiyonin, β-metillantiyonin, dehidroalanin
ve dehidrobütirin gibi nadir bulunan amino asitleri içermez. Tripsin, pronaz ve α-
kemotripsin enzimleri diplokoksinin aktivitesini tamamen inhibe etmektedir (Davey
and Richardson, 1981). Lc. lactis subsp. cremoris 346 suşunda diplokoksin üretimi
ve dirençliliğini determine eden genler 81 kb büyüklükteki konjugatif plazmid
üzerinde bulunmaktadır (Davey, 1984).
2.3.2. Laktokoksin A
Laktokoksin A, bazı Lc. lactis suşları tarafından üretilen dar etki spektrumuna sahip
bir bakteriyosindir. Hidrofobik bir peptit olan laktokoksin A 54 amino asit
içermektedir. Yapılan genetik analizler sonucu, Lc. lactic subsp. lactis LMG2130
suşunda 55 kb büyüklükteki plazmidin laktokoksin A üretiminden sorumlu olduğu
belirlenmiştir (Holo et al., 1991). Laktokoksin A primer etkisini sitoplazmik
membran üzerinde göstermektedir. Bu bakteriyosin Lc. lactis hücrelerinde
sitoplazmik membranın geçirgenliğini değiştirmektedir. Laktokoksin A ile muamele
edilen duyarlı hücrelerde hücre içi iyonların dışarı sızması ve proton itici gücün
azalmasını takiben hücre ölümü gerçekleşmektedir (Klaenhammer, 1993).
Laktokoksin A’nın hedefi tanıması ve hedef yapı üzerinde aktivite gösterebilmesi
için özel bir membran reseptörüne gereksinim duymaktadır. Laktokoksin A hücre
membranında bulunan mannoz fosfotransferaz (man-PTS) sistemi bileşenleri olan
IIC ve IID proteinlerini tanıyarak bu proteinlere bağlanmakta ve duyarlı hücrelerde
por oluşumuna neden olmaktadır. Üretici hücrelerde laktokoksin A dirençlilik
proteini LciA, reseptör proteinler IIC ve IID ile kompleks oluşturarak bakteriyosinin
10
bağlanıp por oluşturmasını engellemektedir. LciA proteini sadece laktokoksin A
varlığında reseptör proteinlere bağlanmaktadır. Ortamda bakteriyosin olmadığı
zaman reseptör proteinler ile interaksiyona girmemektedir (Şekil 2.2.) (Diep et al.,
2007).
Şekil 2.2. Laktokoksin A’nın duyarlı hücrelerde por oluşumu ve dirençlilik
mekanizması (Diep et al., 2007)
2.3.3. Laktokoksin B
Laktokoksin B, Lc. lactis subsp. cremoris 9B4 suşu tarafından üretilen 47 amino asit
kalıntısı içeren hidrofobik bir bakteriyosindir. Diplokoksin üretiminden sorumlu
genler p9B4 plazmidi üzerinde yer alan ve 1.2 kb büyüklükte olan bir bölge üzerinde
yer almaktadır (Nettles and Barefoot, 1993). Laktokoksin B, duyarlı laktokok
suşlarının hücre membranında porlar açmaktadır. Duyarlı hücrelerde oluşan porlar,
öncelikle proton itici güçte kayba neden olmaktadır. Daha sonra hücre içi iyonların
ve amino asitlerin hücre dışına kontrolsüz akışı meydana gelmektedir (Venema et al.,
1993). Laktokoksin B, laktokoksin A gibi duyarlı hücrelerin sitoplazma
membranında bulunan man-PTS sistemi bileşenleri IIC ve IID proteinlerine
bağlanarak por oluşumuna neden olmaktadır (Diep et al., 2007).
11
2.3.4. Laktokoksin G
Laktokoksin G, ilk kez Lc. lactis LMG2081 suşundan izole edilmiş olan grup IIb
üyesi bir bakteriyosindir (Nissen-Meyer et al., 1992). Bu bakteriyosin 39 amino asit
içeren α ve 35 amino asit içeren β olarak adlandırılan iki alt birim içermektedir (Nes
and Holo, 2000). Bu bakteriyosin, pH değişimine karşı yüksek düzeyde direnç
göstermektedir (McAuliffe et al., 2001). Laktokoksin G, özellikle Lc. lactis suşlarına
karşı inhibitör etki göstermektedir (Nissen-Meyer et al., 1992; Zendo et al., 2006).
Laktokoksin G, duyarlı hücrelerde ATP konsantrasyonunu düşürmekte, Na+, K+, Li+,
Cs+ ve Rb+ gibi tek değerli katyonların sızması ile membran potansiyelinin
değişimine yol açmakta ve amino asit birikimini engellemektedir (Moll et al., 1996;
Zendo et al., 2010).
2.3.5. Laktokoksin 972
Laktokoksin 972, Lc. lactis subsp. lactis IPLA 972 suşu tarafından üretilen tek
peptitden oluşan bir bakteriyosindir (Martinez et al., 1996). Laktokoksin 972,
şimdiye kadar söz edilen bakteriyosinlerden farklı olarak, hidrofobik özellik
içermemektedir (Martinez et al., 1999). Laktokoksin 972 ile muamele edilen duyarlı
hücrelerde, sitoplazmik içerikte sızma ve DNA/RNA gibi makro moleküllerin
sentezinde önemli bir azalma tanımlanmamıştır (González et al., 1996, Martinez et
al., 1996, Martinez et al., 1999). Laktokoksin 972, lipit II molekülüne bağlanarak
duyarlı hücre membranlarında por oluşumuna neden olduğu belirlenen ilk
lantibiyotik grubuna dahil olmayan bakteriyosindir (Martinez et al., 2008)
2.3.6. Laktokoksin MN
Laktokoksin MN, laktokoksin M ve laktokoksin N alt ünitelerinden oluşan grup IIb
üyesi bir bakteriyosindir. Laktokoksin M alt birimi 48 amino asit, laktokoksin N alt
birimi ise 47 amino asit içermektedir. Lc. lactis subsp. cremoris 9B4 suşunda
laktokoksin MN üretimi p9B4 plazmidi üzerinde yer alan 1.8 kb büyüklükte olan
bölge tarafından kodlanmaktadır (van Belkum et al., 1991; Nettles and Barefoot,
12
1993; Nes and Holo, 2000). Laktokoksin M alt ünitesi 4325 Da ve laktokoksin N alt
ünitesi ise 4377 Da moleküler ağırlığa sahiptir (Zendo et al., 2010).
2.3.7. Laktokoksin MMFII
Tunus’ta üretilen geleneksel bir fermente süt ürününden izole edilen Lc. lactis subsp.
lactis MMFII suşu tarafından üretilen laktokoksin MMFII, proteinaz K, tripsin ve
papain enzimleri ile muamele edildiğinde aktivitesini tamamen kaybetmektedir. Bu
bakteriyosin glukoamilaz, lipaz, α-amilaz ve lizozim enzimlerinden ise
etkilenmemektedir. Laktokoksin MMFII ısı uygulamasına duyarlıdır. 80 ˚C’de ve
100 ˚C’de 30 dakika ısı uygulaması sonucu, sırasıyla % 42 ve % 75 oranında aktivite
kaybına uğramaktadır. Bakteriyosin pH 5.0-8.0 arasında tam aktivite gösterirken,
daha düşük ve yüksek pH’larda aktivitede önemli oranda azalma olmaktadır. 37
amino asit içeren laktokoksin MMFII’nin moleküler ağırlığı 4143 Da’dur. N-uç
bölgesinde YGNGV konsensüs serisi içermesi ve Listeria’ya karşı aktivite
göstermesinden dolayı, laktokoksin MMFII IIa alt grubu bakteriyosinlere dahil
edilmiştir (Ferchichi et al., 2001).
2.3.8. Laktokoksin MMT24
Laktokoksin MMT24, Tunus’ta üretilen geleneksel bir peynir olan Rigouta’dan izole
edilen Lc. lactis subsp. lactis MMT24 suşu tarafından üretilmektedir. Dar bir
inhibitör spektrumuna sahip olan laktokoksin MMT24 genellikle yakın akraba türler
üzerine bakterisidal etki göstermektedir. Grup IIb üyesi bir bakteriyosin olan
laktokoksin MMT24, pepα ve pepβ olmak üzere iki alt üniteden oluşmaktadır.
Bakteriyosinin tam antibakteriyel aktivite gösterebilmesi için her iki alt protein
ünitesine de ihtiyaç duymaktadır. Saflaştırılmış pepα alt ünitesi 3765 Da ve pepβ alt
ünitesi ise 3255 Da moleküler büyüklüğe sahiptir. Laktokoksin MMT24’ün inhibitör
etkisi tripsin, proteinaz K ve pronaz E ile tamamen kaybolmaktadır. Laktokoksin
MMT24’ün, pH 3.0-10.0 arasında aktivitesinde bir değişim olmamaktadır. Bu
bakteriyosin 65 ºC’de 30 dakika ve 100 ºC’de 15 dakika ısı uygulamasına,
liyofilizasyona ve -20 ºC’de 6 ay depolanmaya karşı dirençlidir. Laktokoksin
13
MMT24 duyarlı hücrelerde K+ iyonlarının sızmasına ve dolayısıyla membran
potansiyelinin değişmesine neden olmaktadır (Ghrairi et al., 2005).
2.3.9. Laktokoksin Q
Laktokoksin Q mısırdan izole edilen Lc. lactis subsp. lactis QU 4 suşu tarafından
üretilen iki bileşenli bir bakteriyosindir. Laktokoksin Q sadece Lc. lactis suşları
üzerine inhibitör etki göstermektedir. Bakteriyosin α ve β olarak adlandırılan iki alt
birim içermektedir. Biyokimyasal analizler sonucu α alt biriminin 39 amino asitten
(4260 Da) ve β alt biriminin ise 35 amino asitten (4018 Da) oluştuğu belirlenmiştir.
Laktokoksin Q, laktokoksin G ile yüksek oranda yapısal benzerlik göstermektedir.
İki bakteriyosinin α ve β alt birimleri arasında sırasıyla 6 ve 3 amino asit farkı
bulunmaktadır (Zendo et al., 2006).
2.3.10. Laktokoksin BZ
Boza’dan izole edilen Lc. lactis subsp. lactis BZ suşunda tanımlanan laktokoksin BZ
çeşitli Gram pozitif ve Gram negatif gıda patojenlerine karşı geniş etki spektrumuna
sahiptir. Moleküler büyüklüğü 5500 Da olan laktokoksin BZ; lipaz, katalaz, α-amilaz
ve pankreatin enzimleri ile muamele edildiğinde aktivitesini korumaktadır. Ancak bu
bakteriyosinin aktivitesi papain ve pepsin uygulaması ile tamamen tripsin
uygulamasıyla ise kısmen kaybolmaktadır. 90 ºC’de 30 dakika ısı uygulamasına
dirençli olan bakteriyosin 110 ve 121 ºC’de 15 dakika ısı uygulamaları sonucunda ise
aktivitesini tamamen kaybetmektedir. Laktokoksin BZ asidik ve nötral pH (2.0-
7.0)’da aktivitesini korumakta ancak, bazik pH (8.0-12.0)’da bakteriyosin aktivitesi
önemli oranda azalmaktadır. Listeria monocytogenes’e karşı bakterisidal etki
gösteren laktokoksin BZ üretimi logaritmik fazda başlamakta ve bakteriyosin üretimi
erken durma fazında maksimum düzeye ulaşmaktadır (Şahingil et al., 2010).
14
2.3.11. Laktoztrepsinler
Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris ve Lc. lactis subsp. lactis biovar.
diacetylactis suşları tarafından üretilen laktoztrepsinlerin Las 1, Las 2, Las 3, Las 4
ve Las 5 olmak üzere tanımlanmış beş türü bulunmaktadır. Laktoztrepsinler sadece
asidik pH’larda aktivite göstermektedirler (Kozak et al., 1977). Proteolitik enzimlere
karşı duyarlı olan laktoztrepsinler, 100 oC’de 10 dakika sıcaklık uygulamasına
dirençlidirler. Sadece laktoztrepsin 1 121 oC’de 10 dakika ısı uygulaması sonucu
aktivitesini kaybetmektedir (Bardowski et al., 1979).
Dar konakçı etkinliğine sahip olan laktoztrepsinler; Lactococcus, Lactobacillus ve
Leuconostoc cinsi üyesi bazı bakterilere karşı inhibitör etki göstermektedir.
Laktoztrepsinler duyarlı hücrelerde hücre duvarı, DNA, RNA ve protein sentezi
üzerine etki göstermektedir. Las 5 kullanılarak yürütülen çalışmalarda, bu
bakteriyosinin duyarlı bakterilerde protein, DNA ve RNA gibi makromoleküllerin
sentezinde kayda değer bir farklılık yaratmasının dışında ATP, K+, Ca+2 ve Mg+2
iyonlarının hücre dışına sızmasına da neden olduğu belirlenmiştir (Kozak et al.,
1978; Zajdel et al., 1985; Klaenhammer 1993).
2.3.12. Laktisin 3147
Laktisin 3147 ilk kez, İrlanda’da Kefir danesinden izole edilen Lc. lactis subsp. lactis
DPC3147 suşunda tanımlanmıştır. Gram pozitif bakterilere karşı geniş etki
spektrumuna sahip olan laktisin 3147 Acetobacter, Bacillus, Clostridium,
Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Pneumococcus,
Propionibacterium, Staphylococcus ve Streptococcus suşlarına karşı antibakteriyel
aktivite göstermektedir (Ryan et al., 1996; Ryan et al., 1999; O’Sullivan et al., 2003;
Martín et al., 2004). İki bileşenli bir bakteriyosin olan laktisin 3147’nin tam
antibakteriyel aktivitesini gösterebilmesi için Ltnα ve Ltnβ (Şekil 2.3.) alt
ünitelerinin sinerjik etkisine ihtiyaç duymaktadır (McAuliffe et al., 1998).
15
Şekil 2.3. Ltnα ve Ltnβ alt ünitelerinin moleküler yapısı (Piper et al., 2009)
Laktisin 3147, hedef hücrelerin sitoplazmik membranlarında iyon spesifik porlar
oluşturarak, potasyum ve fosfat iyonlarının sızmasına neden olmaktadır. Ancak ATP
gibi büyük moleküller oluşan bu porlardan sızmamaktadır. Açılan porlardan
iyonların sızması sonucu membran potansiyeli (∆ψ) zarar görmekte fakat pH
değişimi (∆pH) olmamaktadır. pH’nın değişmemesi oluşan porlardan protonların
sızmadığını ve porların seçici geçirgen davrandığını düşündürmüştür (McAuliffe et
al., 1999). Translasyon sonrası modifiye edilen Ltnα ve Ltnβ alt üniteleri nadir
bulunan lantiyonin (Ala-S-Ala) ve β-metillantiyonin (Abu-S-Ala) amino asitlerini
yüksek oranda içermektedir (McAuliffe et al., 2000). Ltnα ve Ltnβ alt ünitelerinin
moleküler ağırlıkları sırasıyla 3306 ve 2847 Da olarak belirlenmiştir (Morgan et al.,
2005).
Lc. lactis subsp. lactis C01 suşunda laktisin 3147 üretim ve dirençlilik genlerinin
genetik determinantları, moleküler büyüklüğü 60.2 kb olan konjugatif özellikteki
pMRC01 plazmidi üzerinde bulunmaktadır (Dougherty et al., 1998). Farklı organize
olmuş iki ayrı gen kümesinde toplam 10 gen tarafından determine edilen laktisin
16
3147 üretimi ve dirençliliği pMRC01 plazmidinde 12.6 kb büyüklükteki bölge
üzerinde bulunmaktadır (McAuliffe et al., 2000).
Bu bakteriyosin gıda ve biyomedikal alanlarında uygulanabilme potansiyeline
sahiptir. Laktisin 3147 üreticisi Lc. lactis subsp. lactis DPC3147 suşunun, Cheddar
peynirlerinde olgunlaşma sırasında starter olmayan LAB sayısını azaltarak peynir
kalitesini olumlu yönde etkilediği belirlenmiştir (Ross et al., 1999). Laktisin 3147
üreticisi transkonjugant Lc. lactis subsp. lactis DPC4275 suşu kullanılarak üretilen
Cottage peynirinde, L. monocytogenes sayısının önemli seviyede düştüğü buna
karşılık kontrol peynirinde ise L. monocytogenes sayısının (104 kob/g) değişmeden
kaldığı belirlenmiştir. Ayrıca laktisin 3147’nin sağım makinelerinde kullanılan emzik
contalar aracılığıyla sığırlara bulaşan mastitis etmeni mikroorganizmaların
(streptokoklar ve stafilokoklar) kontaminasyon sıklığını azalttığı görülmüştür (Ryan
et al., 1999; O’Sullivan et al., 2003a; Gillor et al., 2005; Klostermann et al., 2010).
2.3.13. Laktisin 481
Lc. lactis’in bazı suşları tarafından üretilen laktisin 481 tek peptit zincirinden oluşan
bir lantibiyotiktir. Grup Ia üyesi bir bakteriyosin olan laktisin 481 duyarlı hücrelerin
sitoplazma mebranında porlar oluşturarak antibakteriyel aktivite göstermektedir
(O’Sullivan et al., 2003b; Güzel-Seydim and Ekinci, 2007). Laktisin 481 orta
düzeyde bir inhibisyon spektrumuna sahiptir. Özellikle Lactococcus, Lactobacillus
ve Leuconostoc cinsi üyesi bakteriler başta olmak üzere Pediococcus pentosaceus,
Pediococcus acidipropionici, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus carnosus
ve Emmental peynirlerinde geç şişmeden sorumlu Clostridium tyrobutyricum
türlerine karşı bakterisidal etki göstermektedir (Mackay et al., 1996; O’Sullivan et
al., 2002). Laktisin 481’in üretimi, dirençliliği ve transportundan sorumlu gen
kümesi (lctAMTFEG) plazmidler üzerinde kodludur (O’Sullivan et al., 2003b; Tükel
and Akçelik, 2004). Son yıllarda laktisin 481 üreticisi suşlar peynir olgunlaşmasını
hızlandırıcı ajanlar olarak kullanılmaktadır. Laktisin 481’in peynir üretiminde
kullanılan starter kültürleri lize etmesi sonucu yardımcı enzimler peynir matriksine
17
salınmakta ve bunun neticesinde de peynirin olgunlaşması hızlanmaktadır
(O’Sullivan et al., 2002; O’Sullivan et al., 2003b; Güzel-Seydim and Ekinci, 2007).
2.3.14. Laktisin FS92
Lc. lactis subsp. lactis FS92 tarafından üretilen laktisin FS92, Bacillus, Clostridium
ve Listeria’ya karşı inhibitör etki gösteren geniş aktivite spektrumlu bakteriyosindir.
Laktisin FS92, 100 oC’de 20 dakika veya 121 oC’de 15 dakika ısı uygulamasına karşı
dirençlidir. Bu bakteriyosin α-kemotripsin, pepsin, pronaz E ve proteinaz K
enzimlerine karşı duyarlıdır. Laktisin FS92 polipeptidi 32 amino asit içermektedir.
Saflaştırılmış laktisin FS92’nin Trisin-SDS-PAGE analizi sonucu moleküler
büyüklüğü yaklaşık 3500 Da olarak tanımlanmıştır (Mao et al., 2001).
2.3.15. Laktisin Z
Lc. lactis QU 14 suşu tarafından üretilen laktisin Z başta Bacillus ve Lactobacillus
cinsi üyesi bakteriler olmak üzere çeşitli Gram pozitif bakterilere karşı inhibitör
etkiye sahiptir. 53 amino asit kalıntısı içeren bakteriyosinin moleküler ağırlığı
5969 Da’dur. Laktisin Z’nin amino asit dizisi Lc. lactis QU 5 suşu tarafından
üretilen laktisin Q ile % 94 gibi yüksek oranda benzerlik göstermektedir. Laktisin
Z, erken ve geç logaritmik faza kadar geliştirilen Bacillus coagulans JCM 2257T
kültürü üzerine litik etki göstermekte ancak durma fazına kadar geliştirilen kültür
üzerine ise litik etki göstermemektedir. Geniş pH aralığında aktivitesini koruyan
laktisin Z diğer laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin aksine
asidik pH (2.0 ve 4.0)’da aktivitesinde azalma olurken alkali pH (8.0 ve 10.0)’da
aktivitesini korumaktadır (Iwatani et al., 2007).
2.3.16. Laktisin Q
Laktisin Q grup IId üyesi, katyonik, 53 amino asit içeren, tek pepitten oluşan ve
Gram pozitif bakterilere karşı geniş etki spektrumuna sahip olan bir bakteriyosindir
(Fujita et al., 2007). Laktisin Q’nun antimikrobiyel özellikleri nisin ile benzerlik
18
göstermektedir. Nisin A ve laktisin 3147’nin aksine laktisin Q duyarlı hücre
membranlarında por oluşturmak için lipit II molekülüne ihtiyaç duymamaktadır
(Yoneyama et al., 2009a; Yoneyama et al., 2010). Laktik asit bakterilerince üretilen
diğer pek çok bakteriyosinin aksine laktisin Q duyarlı hücre membranlarında büyük
por oluşumuna neden olmaktadır (Şekil 2.4.). Laktisin Q tarafından oluşturulan
porların ortalama büyüklüğü 4.6-6.6 nm çapındadır. Oluşan bu porlardan iyonlar ve
ATP’nin yanı sıra hücre için yapısal öneme sahip olan proteinlerde sızmaktadır
(Yoneyama et al., 2009b; Zendo et al., 2010).
Şekil 2.4. Laktisin Q’nun antimikrobiyel etki mekanizması. Laktisin Q’nun hücre
membranına bağlanması ve por oluşumu (a), açılan 4.6-6.6 nm çapındaki porlardan
iyonların, ATP’nin ve küçük proteinlerin sızması (b), peptit translokasyonu ve lipit
flip-flop hareketi (lipitlerin membranda yer değiştirmesi) (c) (Zendo et al., 2010)
2.3.17. Laktosiklisin Q
Lactococcus spp. QU12 suşu tarafından üretilen laktosiklisin Q, laktokoklarda
tanımlanan ilk siklik bakteriyosindir (Şekil 2.5.). 61 amino asit kalıntısı içeren
19
bakteriyosinin moleküler ağırlığı 6063 Da’dur. Gram pozitif bakterilere karşı geniş
etki spektrumuna sahip olan laktosiklisin Q özellikle Bacillus, Lactococcus ve
Enterococcus cinsi üyesi bakterilere karşı güçlü inhibitör etki göstermektedir.
Laktosiklisin Q pepsin ve proteinaz K uygulaması sonucu aktivitesini tamamen
kaybetmektedir (Sawa et al., 2009).
Şekil 2.5. Laktosiklisin Q’nun moleküler yapısı (Sawa et al., 2009)
2.3.18. Nisin
Nisin, Lc. lactis suşlarında tanımlanan ilk bakteriyosindir. İlk kez 1928 yılında
İngiltere’de Rogers ve Whitter’in çeşitli laktik streptokokların bazı laktik asit
bakterilerini inhibe ettiğini belirlemeleriyle keşfedilmiştir. Ancak bu inhibitör
maddenin tanımlanması ve nisin isminin verilmesi 1944 yılında Mattick ve Hirsch
tarafından yapılmıştır. Nisin 1969 yılında FAO/WHO gıda katkı maddeleri uzman
komitesi tarafından güvenli doğal bir gıda katkısı olarak kabul edilmiştir
(FAO/WHO, 1969). 1983 yılında Avrupa Ekonomik Topluluğu (European Economic
Community, EEC) tarafından gıda katkı maddeleri listesine alınmış ve E234 kodu
verilmiştir. Amerika Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından 1988 yılında nisin,
GRAS (insan ve hayvan tüketiminde güvenilir) statüsünde kabul edilmiştir.
Günümüzde pek çok lantibiyotik grubu bakteriyosin tanımlanmış olmasına rağmen,
gıda katkısı olarak kullanımına izin verilen tek lantibiyotik grubu üyesi bakteriyosin
nisindir. Nisin 1996 yılından itibaren Avrupa Birliği ülkeleri, Çin ve Amerika’nın da
arasında bulunduğu 50’den fazla ülkede gıda katkısı olarak kullanılmaktadır
(Reunanen, 2007).
20
Nisinin moleküler ağırlığı yaklaşık 3350 Da’dur. Üretim ortamlarında dimer (6700
Da) veya tetramer (13400 Da) halinde bulunabilmektedir (Liu and Hansen, 1990).
Isıl işleme dayanıklı (121 ºC’de 15 dakika) olan nisin, α-kemotripsin ve proteinaz K
uygulamalarına karşı ise duyarlıdır (De Vuyst and Vandamme, 1994). Geniş pH (2.0-
10.0) aralığında aktivite gösterebilen nisin molekülünün çözünürlüğü, stabilitesi ve
biyolojik aktivitesi ortam pH’sına göre değişmektedir. Asidik ortamlarda nisinin
çözünürlüğü artmakta ve bu nedenle inhibisyon etkinliği yükselmektedir. Nisin
molekülünün çözünürlüğü pH 2’de 57 mg/mL, pH 6’da 1.5 mg/mL ve pH 8.5’de ise
0.25 mg/mL dır (Liu and Hansen, 1990).
Bugüne kadar nisinin; nisin A (Gross and Morell, 1971), nisin Z (Mulders et al.,
1991), nisin Q (Zendo et al., 2003), nisin U (Wirawan et al., 2006) ve nisin F (de
Kwaadsteniet et al., 2008) olmak üzere beş doğal varyantı tanımlanmıştır.
Streptococcus uberis tarafından üretilen nisin U dışında tüm nisin varyantları Lc.
lactis suşları tarafından üretilmektedir. Nisin varyantları bir birinden amino asit
dizilimlerindeki farklılıklar esas alınarak ayrılmaktadır (Şekil 2.6.).
Şekil 2.6. Lc. lactis suşları tarafından üretilen nisin varyantlarının amino asit
dizilimlerinin karşılaştırılması (de Kwaadsteniet et al., 2008)
Nisin A, Z ve Q 34 amino asitten oluşmaktadır (Şekil 2.7.). Peptit zincirinde yer alan
amino asitlerden 8 tanesi nadir bulunan amino asitlerdir. Bu moleküllerin hepsi 1
lantiyonin, 4 β-metillantiyonin, 2 dehidroalanin ve 1 dehidrobütirin amino asiti
21
içermektedir. Nisinin yapısında bulunan lantiyonin ve β-metillantiyonin amino
asitleri A, B, C, D ve E olarak isimlendirilen 5 adet halka yapıyı oluştururlar. Lc.
lactis suşları tarafından üretilen nisin türlerinin birincil yapıları incelendiğinde
aminoasit dizilimlerinin farklılığı göze çarpmaktadır. Nisin A’da 27. pozisyonda
histidin amino asiti bulunurken, nisin Z, Q ve F’de aynı pozisyonda asparajin amino
asiti bulunmaktadır. Nisin Q’da 15. pozisyonda valin amino asiti varken nisin Z, A
ve F’de alanin amino asiti bulunmaktadır. Nisin Q’nun 21. pozisyonunda lösin amino
asiti bulunurken nisin A, Z ve F’de metiyonin amino asiti bulunmaktadır. Nisin A ve
nisin Z’nin 30. pozisyonunda izolösin amino asiti bulunurken nisin Q ve nisin F’de
aynı pozisyonda valin amino asiti yer almaktadır (Gross and Morell, 1971; Mulders
et al., 1991; Zendo et al., 2003; de Kwaadsteniet et al., 2008).
Şekil 2.7. Nisin A, Z ve Q’nun moleküler yapısı. A-E: lantiyonin köprüleri, Dha:
dehidroalanin; Dhb: dehidrobütirin; Ala-S-Ala: lantiyonin; Abu-S-Ala: β-
metillantiyonin (Reunanen, 2007)
22
Nisin U’nun yapısı diğer nisin varyantlarından farklıdır (Şekil 2.8.). 31 aminoasit
içeren nisin U 1 lantiyonin, 4 β-metillantiyonin, 1 dehidroalanin ve 2 dehidrobütirin
amino asiti içermektedir (Wirawan et al., 2006).
Şekil 2.8. Nisin U’nun moleküler yapısı. A-E: lantiyonin köprüleri, Dha:
dehidroalanin; Dhb: dehidrobütirin; Ala-S-Ala: lantiyonin; Abu-S-Ala: β-
metillantiyonin (Reunanen, 2007)
Nisin biyosentezi eksponensiyel gelişme fazında meydana gelmektedir. Hücreler
durma fazına girdiği zaman ise, nisin üretimi de tamamen durmaktadır (van der Meer
et al., 1993; Kim et al., 1997; Cheigh et al., 2002; de Arauz et al., 2009). Nisin
üretimi, olgunlaşması, dirençliliği ve regülasyonu için gerekli olan genler büyük
konjugatif transpozonlar (~70 kb) üzerinde kodludur. Değişik çalışmalarda, sakkaroz
fermentasyon yeteneği ile nisin üretimi özelliklerini kodlayan gen kümesinin
(nisA/Z/Q BTCIPRKFEG) yakın ilişkili olduğu belirlenmiştir. Tn5276 (Rauch and de
Vos, 1992), Tn5301 (Dodd et al., 1990), Tn5307 (Buchman et al., 1988), Tn5481
(Immonen et al., 1998) transpozonları üzerinde nisin üretiminden sorumlu genlerin
yanı sıra sakkaroz fermentasyon yeteneğinin genetik determinantları da
bulunmaktadır. Nisin biyosentezinden sorumlu gen kümesi nisA/Z/QBTCIPRK, nisI,
nisRK ve nisFEG olmak üzere 4 operon içermektedir (Qiao et al., 1996; Ra et al.,
1996; Li and O’Sullivan 2006; Lubelski et al., 2008). Nisin gen kümesinde bulunan
NisA/Z/Q genleri 57 amino asitlik nisin öncü peptidinin sentezinden, nisB geni
dehidrasyondan, nisT geni öncü peptidin taşınmasından, nisC geni halka oluşum
reaksiyonlarından, nisP geni 23 amino asitlik lider peptidin uzaklaştırılması için
gerekli olan serin proteazın sentezlenmesinden (Şekil 2.9.), nisRK genleri
23
düzenlemeden, nisI (lipoproteini kodlar) ve nisFEG (ABC sınıfı taşıyıcı proteinleri
kodlar) genleri dirençlilik sisteminden sorumludurlar (Engelke et al., 1994;
Reunanen, 2007).
Şekil 2.9. Nisinin translasyon sonrası modifikasyonu (Breukink and de Kruijff, 2006)
Nisin biyosentezi nisR ve nisK genleri tarafından regüle edilmektedir. Hücre dışında
olgunlaşmış nisin birikiminin kritik seviyeye ulaşmasıyla, hücre membranına bağlı
histidin sensör kinaz olan NisK proteininde histidin fosforilize edilerek aktif hale
geçer (van der Meer et al., 1993; Engelke et al., 1994; Kuipers et al., 1995; Lubelski
et al., 2008). Daha sonra fosfat NisR proteinine transfer edilir ve hücre içi yanıtı
düzenleyici NisR proteini, nisA/Z/Q/FBTCIP ve nisFEG genlerinin
24
transkripsiyonunun başlamasını sağlar (Şekil 2.10.) (Kuipers et al., 1995; de Ruyter
et al., 1996; Qiao et al., 1996; Lubelski et al., 2008).
Şekil 2.10. Nisin A’nın biyosentezi, regulasyonu ve dirençliliğini kodlayan gen
kümesi (Zendo et al., 2010)
Nisin Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Pediococcus,
Lactobacillus, Listeria ve Mycobacterium türlerinin dahil olduğu Gram pozitif
bakterilere karşı bakterisidal etki göstermektedir (Sahl et al., 1995). Nisinin hedef
hücreler üzerinde bakterisidal etki gösterebilmesi için başlangıç reseptörlerine ihtiyaç
duymaktadır. Nisin, membrana bağlı hücre duvarı öncüsü lipit II molekülüne
bağlanarak duyarlı hücre membranlarında por oluşumuna neden olmaktadır
(Breukink et al., 1999). Nisin porlarının çapı yaklaşık 2-2.5 nm büyüklüğündedir.
Açılan bu porlar nedeniyle membran geçirgenliği artmakta ve porlardan küçük
iyonlar ve ATP hücre dışına sızmaktadır (Wiedemann et al., 2004). Yapılan çeşitli
araştırmalarda, nisinin duyarlı hücrelere bağlanması ve por oluşturması için,
bakteriyosinin N-uç bölgesinin yanında, C-uç bölgesinin de negatif yüklü membran
yüzeyi ile etkileşiminin gerekli olduğu belirlenmiştir (Demel et al., 1996; Breukink et
al., 1997; van Kraaij et al., 1998; Breukink et al., 2003; Hsu et al., 2004). Duyarlı
hücrelerde por oluşumu için 8 adet nisin ve 4 adet lipit II molekülüne gereksinim
vardır (Şekil 2.11.) (Hasper et al., 2004).
25
Şekil 2.11. Nisin por oluşum mekanizması. Nisinin sitoplazma membranına ulaşması
(a), nisinin N- uç bölgesindeki iki halkası (A ve B) aracılığı ile lipit II molekülüne
bağlanması (b), nisin-lipit II por oluşumu (c), nisin-lipit II kompleksinin üstten
görünümü (Breukink and de Kruijff, 2006)
Nisin Gram pozitif bakterilerin vejatatif formları yanında Clostridium ve Bacillus
cinsi üyesi bakteriler tarafından üretilen sporlara karşı da inhibitör etki
göstermektedir. Nisinin bakteriyel sporlara karşı aktivitesi protein kalıntılarındaki
sülfidril gruplarına bağlanarak olmaktadır (Morris et al., 1984). Bakteri sporları ısıl
işlem uygulamasından sonra nisine çok daha duyarlı hale gelmektedir. Bu durum ısıl
işlem görmüş gıdalarda nisin kullanımı açısından önemli bir faktördür. 121 oC’de 3
dakika ısıl işleme maruz bırakılmış Clostridium sporları ısıl işlem uygulanmamış
sporlara oranla nisine 10 kat daha hassas hale gelmektedir (de Arauz et al., 2009).
Normalde, Gram negatif bakteriler hücre duvarında yer alan lipopolisakkarit (LPS)
kompozisyonundan dolayı nisine karşı dirençlidir. LPS nisine karşı bariyer görevi
görmekte ve nisinin stoplazma mebranına ulaşmasını engellemektedir. Bu tabaka
sadece 600 Da ve altındaki moleküler büyüklüğe sahip olan maddelerin geçişine izin
vermektedir. Oysaki laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin
birçoğunun moleküler ağırlığı çok daha büyüktür. Diğer yandan EDTA gibi çelat
oluşturucu ajanlar LPS tabakasında bulunan magnezyum iyonlarını bağlayarak bu
tabakanın stabilitesini bozmaktadır. Bundan dolayı nisin LPS katmanından geçmekte
26
ve sitoplazma membranında nisin porlarını oluşturabilmektedir (Chung and Hancok
2000; Millette et al., 2004; de Lima Grisi and Lira, 2005).
2.3.18.1. Nisinin gıdalarda kullanımı
Nisin doğal bir antimikrobiyel madde olması, toksik olmaması, sindirim enzimleri
tarafından kolayca parçalanması ve üretici bakteri Lactococcus lactis’in GRAS
statüsünde bir mikroorganizma olması nedeniyle gıda sanayinde en çok uygulama
alanı bulan ve üzerinde en çok çalışılan bakteriyosindir. Nisin, 1953 yılından beri
Nisaplin (Applin & Barret Ltd., UK) ticari adıyla hazır preparat olarak piyasada
satılmaktadır. Nisaplin yaklaşık olarak % 2.5 oranında nisin içermektedir (Delves-
Broughton, 2005). Nisin ve Nisaplin’in uygulama alanları ve miktarları Çizelge
2.2.’de özetlenmiştir.
Çizelge 2.2. Gıda uygulamalarında kullanılan nisin ve nisaplin miktarları (Delves-
Broughton, 2005)
Gıda Uygulamaları Hedef organizmalar Nisin miktarı
(mg/kg – mg/L)
Nisaplin miktarı
(mg/L)
İşlem görmüş peynirler Clostridium spp.
Bacillus spp.
5.0-15.0 200-600
Pastörize süt ve
Süt ürünleri
Clostridium spp.
Bacillus spp.
0.25-10.0 10-400
Pastörize çorbalar B. cereus
C. pasteurianum
2.5-6.25
100-200
Fıstık B. cereus 4.0-6.25 150-250
Konserve gıdalar
(yüksek asitli)
C. botulinum
C. thermosaccharolyticum
2.5-5.0 100-200
Pişirilmi ş sosisler Laktik asit bakterileri
Brohothrix thermosphacta
Listeria monocytogenes
5.0-25.0 200-1000
Dip soslar Laktik asit bakterileri 1.25-6.25 50-250
Salata sosları Laktik asit bakterileri 1.25-5.0 50-200
Bira Pediococcus spp.
Lactobacillus spp.
25.0-37.5 10-50
27
Nisin, özellikle peynir, sıvı yumurta ürünleri, düşük asitli konserve gıdalar, çeşitli
pastörize süt ürünleri ve salata soslarının mikrobiyel kontaminantlardan korunması
amacı ile 50’den fazla ülkede kullanılmaktadır. Peynirlerde nisin kullanımının temel
amacı; peynir üretimi ve olgunlaşması sırasında ciddi problemlere neden olan L.
monocytogenes kontaminasyonlarından korunmakdır (Delves-Broughton, 1996).
Peynir üretiminde karşılaşılan bir diğer önemli sorun Clostridium cinsi üyesi
bakterilerden kaynaklanan bütirik asit fermentasyonudur. Nisin özellikle C.
tyrobutiricum sporlarının gelişimini engellemek amacıyla pastörize peynir
üretiminde kullanılmaktadır (Schillinger et al., 1996). Salata sosları, bira, şarap,
elma suyu gibi ısıl işlem uygulanamayan gıdalarda nisin kullanılarak istenmeyen
LAB’lerinin gelişimine engellenmektedir. Bunun dışında mayalar nisine karşı
dirençli mikroorganizmalar olmalarına karşın alkol fermentasyonu sırasında nisin
eklendiğinde aktivite gösterebilmektedir (Delves-Broughton, 2005). Nisin medikal
uygulamalarda da kullanılmaktadır. Nisinin Helicobacter pylori’nin gelişmesini ve
kolonizasyonunu engelleyerek ülseri tedavi edici özelliğe sahip olduğu belirlenmiştir
(Gillor et al., 2005). Ayrıca, sığır mastitis tedavisinde nisin, mastitis etmeni
Streptococcus ve Staphylococcus türlerine karşı güçlü bakterisidal etki
göstermektedir (Sears et al., 1995; Cao et al., 2007; Wu et al., 2007).
Bazı gıda katkı maddelerinin nisine karşı antagonistik etki gösterdiği belirlenmiştir.
Sodyum metabisülfit (antioksidan, ağartıcı ve antimikrobiyel) ve titanyum dioksit
(beyazlatıcı) gibi gıda katkıları nisinin antimikrobiyel etkisini düşürmektedir
(Delves-Broughton et al., 1996). Nisinin amfipatik özellikte olması nedeniyle bazı
gıda maddelerinde kullanımı sınırlıdır. Nisinin özellikle yağlar ile interaksiyona
girmesinden dolayı antimikrobiyel aktivitesi azalmaktadır. Yüksek oranda yağ içeren
etlerde nisin, fosfolipitler ile güçlü bir etkileşime girmekte ve bu durum nisinin
antimikrobiyel aktivitesini sınırlamaktadır (Deegan et al., 2006; Taylor et al., 2007).
Son yıllarda mikroorganizmaların inaktivasyonunda, bakteriyosinler ile birlikte farklı
engel parametrilerinin beraber oluşturduğu sinerjik etkiden yararlanma eğilimi
giderek artmaktadır. Osmotik şok, düşük pH, deterjan ve çelat ajanlarının varlığı, ısıl
işlem içermeyen yüksek hidrostatik basınç ve dalgalı elektrik alan gibi farklı engel
28
parametreleri ile kombine edilen nisin uygulamaları sonucu bakteriyel inaktivasyon
seviyesi artmaktadır. Escherichia coli ve Salmonella Typhimurium gibi nisine
dirençli Gram negatif bakteriler bu proseslerin ardından letal değerin altında hasara
uğramalarından dolayı duyarlı hale gelmektedirler (Jeevaratnam et al., 2005; de
Vuyst and Leroy, 2007; Reunanen, 2007; Pathanibul et al., 2009).
29
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Fermente gıda örnekleri
Yüksek lisans tez çalışması kapsamında Antalya, Isparta ve Tekirdağ illerinden
temin edilen geleneksel olarak üretilmiş Boza (5 adet), Beyaz Peynir (5 adet), Tulum
Peyniri (5 adet), Kefir (5 adet) ve Tarhana (5 adet) örnekleri kullanılmıştır.
3.1.2. Mikroorganizmalar
Araştırma kapsamında Türkiye’nin değişik illerinden sağlanan Boza, Beyaz Peynir,
Tulum Peyniri ve Kefir örneklerinden izole edilen 50 adet muhtemel laktokok izolatı
kullanılmıştır. Ayrıca, laktokok izolatlarının antibakteriyel aktivitelerinin
belirlenmesi için 26 adedi (Lactococcus lactis subsp. lactis SIK83, Lactobacillus
sakei NCDO2714, Lactobacillus plantarum LMG2003, Lc. lactis subsp. lactis
IL1403, Lc. lactis subsp. lactis 105, Lc. lactis subsp. lactis LMG2908, Lc. lactis
subsp. lactis T1, Lc. lactis subsp. lactis 731, Lc. lactis subsp. lactis 2, Lc. lactis
subsp. lactis LMG2912, Listeria innocua LMG2813, Listeria monocytogenes
ATCC19115, L. monocytogenes ATCC15813, Escherichia coli LMG3083 CFAI
(ETEC), Salmonella enterica serotype Typhimurium SL1344, Pseudomonas
fluorescens P1, Enterecococcus faecalis LMG2708, Enterecococcus faecalis
LMG2602, Staphylococcus aureus FRI100, Staphylococcus aureus ATCC6538,
Staphylococcus carnosus LMG2709, Pediococcus pentosaceus LMG2001, Bacillus
cereus LMG2732, Lc. lactis subsp. lactis JC17, Lc. lactis subsp. cremoris LMG2132
ve Lc. lactis subsp. lactis LMG2088) Prof. Dr. Ingolf F. Nes’den (Department of
Genetics and Biochemistry, Agricultural University of Norway, Ås/Norway) ve 1
adedi ise (Micrococcus luteus RSK1123) Refik Saydam Hıfzısıhha Enstitüsü Kültür
Koleksiyonundan olmak üzere toplam 27 adet indikatör bakteri kullanılmıştır.
30
Bakteriler; M17 broth, Luria Bertani broth (LB), de Man Rogosa Sharpe broth
(MRS), GM17 broth (% 5 glukoz) ve Triptik Soy broth (% 0.5 maya ekstraktı)
ortamlarına % 20 oranında steril gliserol ilave edilerek –20 oC’de saklanmıştır.
Çalışma materyalleri gliserol ilave edilmemiş M17, LB, MRS, GM17 ve TSB broth
ortamlarında +4 °C’de ve haftalık transferler yapılarak korunmuştur.
3.2. Yöntem
3.2.1. Laktokok suşlarının izolasyonu
Laktokok suşlarının izolasyonu için Boza, Beyaz Peynir, Kefir, Tarhana ve Tulum
Peyniri örneklerinin tamponlanmış peptonlu su (Merck, Darmstadt, Almanya)
kullanılarak 10-7 seviyesine kadar seri dilüsyonları hazırlanmıştır. Dilüsyonlardan
mikropipet yardımıyla 0.1 mL alınarak Neutral Red Chalk Lactose Agar (NRCLA)
ortamlarına aktarılmış ve drigalski spatülü ile yayılmıştır. 30 oC’de 48 saat
inkübasyona bırakılan petri kutularında tipik laktokok kolonileri; koyu kırmızı renkte
ve çevrelerinde berrak zon oluşumu kriterlerine göre seçilmiştir (Harrigan and
McCance, 1966).
Neutral Red Chalk Lactose Agar
Laktoz 10 g
Pepton 3 g
Lablemco et ekstraktı 3 g
Maya ekstraktı 3 g
Agar 15 g
CaCO3 15 g
Neutral red (% 1’lik çözelti) 5 mL
Destile su 1000 mL
pH 6.8 ± 0.02 (sterilizasyondan önce)
Laktoz, CaCO3 ve neutral red ayrı ayrı 121 oC’de 15 dakika sterilize edilmiştir. Diğer
bileşenler bir başka erlenmayer içerisinde sterilize (121 oC’de 15 dakika) edilmiş ve
sıcaklığı 45 oC’ye soğuduktan sonra ayrı sterilize edilen laktoz, CaCO3 ve neutral red
sırasıyla bu erlenmayere ilave edilmiştir.
31
3.2.2. İzolatların tanısı
3.2.2.1. Morfolojik tanı ve katalaz testi
Seçilen kolonilerin mikroskobik morfolojileri, Gram boyama yöntemi ile hazırlanan
preparatların 1000 X büyütme ile ışık mikroskobunda (Zeiss, Almanya) incelenmesi
sonucunda belirlenmiştir. Katalaz testi için, M17 agar (Laboratorios Conda, Spain)
ortamında geliştirilen bakteri kolonileri lam üzerine aktarılmış ve % 3’lük hidrojen
peroksit çözeltisinden bir damla ilave edilerek, mikroskop altında 1000 X büyütmede
gaz çıkışı olup olmadığı incelenmiştir. Gaz çıkışı gözlenen lamlarda test pozitif
olarak değerlendirilmiştir. S. aureus FRI100 suşu katalaz testlerinde pozitif kontrol
olarak kullanılmıştır.
3.2.2.2. Elliker broth ortamında gelişme
İzolatlar Elliker broth ortamında 30 oC’de 18 saat geliştirildikten sonra, % 6.5 NaCl
ilave edilerek ve pH’sı 9.6’ya yükseltilerek hazırlanan iki ayrı Elliker broth ortamına
inoküle edilmiş ve 30 oC’de 18 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. Bu testlere ek
olarak izolatların Elliker broth ortamında 10 ve 45 oC’de gelişme özellikleri de
incelenmiştir.
Elliker Broth
Tripton 20 g
Maya ekstraktı 5 g
Jelatin 2.5 g
Glukoz 5 g
Laktoz 5 g
Sakkaroz 5 g
Sodyum klorür 4 g
Sodyum asetat 1.5 g
Askorbik asit 0.5 g
Destile su 1000 mL
pH 6.8 ± 0.02 (sterilizasyondan önce)
32
3.2.3. İzolatların antibakteriyel aktivite özelliklerinin b elirlenmesi
Antibakteriyel aktivite özellikleri test edilen laktokok izolatları M17 broth (Merck,
Darmstadt, Almanya) ortamında 30 oC’de 18 saat geliştirilmi ştir. Aktif kültürden
M17 agar ortamına öze yardımıyla sürme yapılmış ve 30 oC’de 18 saat inkübasyona
tabi tutulmuştur. İnkübasyon süresi sonunda oluşan koloniler, steril kürdan
aracılığıyla bir petride 5 farklı izolat olacak şekilde M17 agar ortamlarına nokta ekim
yapılmış ve 30 oC’de 18 saat inkübe edilmişlerdir. MRS (Merck, Darmstadt,
Almanya), GM17 (% 0.5 glukoz), TSB (% 0.5 maya ekstraktı) veya LB broth
ortamlarında geliştirilen indikatör bakterilerden 100 µL alınarak, % 0.7 oranında agar
içeren 5 mL yumuşak agar (MRS, GM17, TSB veya LB) ortamlarına inoküle
edilmiştir. Sonrasında bu ortamlar antibakteriyel aktivitesi test edilecek laktokok
kolonileri üzerine homojen bir şekilde yayılmıştır. Petri kutuları indikatör
bakterilerin gelişmesi için uygun olan inkübasyon sıcaklığında 18 saat inkübasyona
bırakılmıştır. Süre sonunda, laktokok izolatlarının indikatör bakterilere karşı
verdikleri inhibisyon zonları incelenmiştir (van Belkum et al., 1989).
Luria Bertani Broth
Tripton 10 g
Maya ekstraktı 5 g
NaCl 10 g
Destile su 1000 mL
pH 7.0 ± 0.02 (sterilizasyondan önce)
Ortam içerikleri 1000 mL destile su içerisinde çözülmüş ve 121 oC’de 15 dakika süre
ile sterilize edilmiştir.
3.2.4. Proteolitik enzim uygulaması
Laktokok izolatları tarafından üretilen antibakteriyel maddelerin protein yapısında
olup olmadığı proteolitik enzim uygulamasıyla test edilmiştir. 30 oC’de 18 saat
süreyle geliştirilen laktokok izolatları 10000 devirde 5 dakika süre ile santrifüj
33
(Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya) edilmiştir. Çöken katı fazın
karışmamasına dikkat edilerek yeni tüplere aktarılan kültür üst sıvıları 0.45 µm por
çaplı membran filtreden (Sartorius, Almanya) geçirilerek sterilize edilmiştir. Sterilize
edilen kültür üst sıvılarından 20 µL alınarak M17 agar ortamlarına damlatılmıştır.
Damlatılan üst sıvıların yaklaşık 1 cm uzağına son enzim konsantrasyonu 50 mg/mL
olacak şekilde hazırlanan pepsin (pH 3.0 Sigma Chem. Co., ABD), proteinaz K (pH
7.0 Amresco, Solon, Ohio, ABD), α- kemotripsin (pH 7.0 Sigma Chem. Co., ABD)
veya tripsin (pH 7.0 Sigma Chem. Co., ABD) enzim solüsyonundan 20 µL
damlatılmıştır. Damlatılan sıvıların agara nüfuz etmesi için petri kutuları 30 dakika
oda sıcaklığında tutulmuştur. Süre sonunda steril kültür üst sıvısı ve enzim
damlatılarak hazırlanan petri kutularının üzerine üst tabaka olarak 100 µL indikatör
bakteri ilave edilmiş yumuşak agar dökülmüş ve petriler 30 oC’de 18 saat
inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda zon şekilleri incelenmiştir.
Denemelerde GYL14 ve GYL41 suşları için L. innocua LMG2813 ve GYL32 suşu
için ise Lb. plantarum LMG2003 indikatör bakteri olarak kullanılmıştır (Ryan et al.,
1996).
3.2.5. Bakteriyosin üreticisi laktokok izolatının fenotipik tanısı
Proteolitik enzim uygulaması sonucunda bakteriyosin üreticisi olduğu tespit edilen
GYL32 izolatının fenotipik tanısında API 50 CH karbonhidrat sitripleri ve API 50
CHL karbonhidrat fermentasyon besiyeri (Biomerieux, Marcy-I’Etaile, Fransa)
kullanılmıştır. Deneme üretici firma tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır.
3.2.6. Bakteriyosin üreticisi laktokok izolatının genotipik tanısı
3.2.6.1. Genomik DNA izolasyonu
Genomik DNA izolasyonu için Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu M17 broth
besiyerinde 30 oC’de 18 saat süre ile geliştirilmi ştir. Aktif GYL32 kültüründen 0.5
mL alınarak steril Eppendorf tüplerine aktarılmıştır. Hücrelerin çöktürülmesi için
tüpler 10000 devirde 5 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya)
34
edilmiştir. Üst faz dökülmüş ve hücre çökeltisi 0.5 mL liziz çözeltisi ile çözülmüştür.
Tüpler su banyosu içerisinde 37 oC’de 30 dakika inkübasyona bırakılmıştır. Süre
sonunda tüplere 30 µL %10’luk sodyum dodesil sülfat (SDS) ilave edilmiş ve 80
°C’de 5 dakika tutulmuştur. Lize olan hücre süspansiyonu üzerine 0.7 mL fenol-
kloroform (1:10) ilave edilerek 13000 devirde 5 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor
No:12148, Almanya) işlemine tabi tutulmuştur. Üst faz alınarak yeni steril
Eppendorf tüplerine aktarılmış ve üzerine 0.7 mL 2-propanol ilave edildikten sonra
tüpler bir kez daha santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148 Almanya) edilmiştir
(13000 devir/dk. 5 dakika). Oluşan çökelti 50 µL Tris-EDTA (pH 8.0) içerisinde
çözülmüştür. İzole edilen genomik DNA örnekleri – 20 oC’de muhafaza edilmiştir
(Cancilla et al., 1992).
Liziz Çözeltisi
NaCl 250 mM
EDTA 10 mM
Tris HCl 10 mM
Lizozim 100 mg
Destile su 50 mL
pH 8.0± 0.02
SDS (%10)
SDS 10 g
Destile su 100 mL
Tris- EDTA
Tris 0.121 g
EDTA 0.037 g
Destile su 100 mL
pH 8.0 ± 0.02
35
3.2.6.2. Genomik DNA örneklerinin elektroforezi
Genomik DNA örneklerinin elektroforezi % 0.7 agaroz oranı ile hazırlanan jellerde
yapılmıştır. Agaroz 35 mL tris-asetat elektroforez tamponu içerisinde mikro dalga
fırında çözülmüştür. Hazırlanan ortamın 45 ˚C’ye kadar soğuması beklenmiş ve
yatay elektroforez plakasına dökülmüştür (Thermo Minicell®Primo EC320, ABD).
Daha sonra, jel tarağı yerleştirilmi ş ve jelin polimerizasyonu için 30-45 dakika
beklenmiştir. Jelin polimerizasyonunu takiben jelin üzerini kapatacak biçimde
elektroforez tankına tampon çözelti ilave edilmiş ve jele zarar verilmeden tarak
ortamdan alınmıştır. 15 µL genomik DNA örneği, 2 µL marker boya çözeltisi ile
karıştırılmış ve mikropipet yardımıyla örneğin tamamı jel kuyucuğuna aktarılmıştır.
Elektroforez, 65 voltta 1.5-2 saat süreyle yapılmıştır. Süre sonunda elektrik akımı
kesilmiş ve ortamdan alınan jel, kullanılan elektroforez tamponunun yeni hazırlanmış
0.2 µg/mL etidyum bromit içeren çözeltisinde 1 saat boyanmıştır. Boyama işleminin
sonunda jeller, 366 nm dalga boyunda ultraviyole ışık altında incelenmiştir. Jel
fotoğrafının çekiminde UviTec DBT-08 (Cambridge, İngiltere) jel görüntüleme
sistemi kullanılmıştır.
Tris-Asetat Tampon (1X)
Tris 4.84 g
Sodyum asetat 4.08 g
EDTA 0.37 g
Destile su 1000 mL
pH 8.0 ± 0.02
Marker Boya
Brom fenol blue 0.25 g
Sakkaroz 40 g
Destile su 100 mL
36
3.2.6.3. GYL 32 izolatının 16S rDNA bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu
(PZR) ile çoğaltılması ve sekans analizi
Bakteriyosin üreticisi GYL32 izolatında 16S rDNA bölgesinin polimeraz zincir
reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılması Techne Genius (Cambridge, İngiltere) termal
döngü cihazında yapılmıştır. Toplam 50 µL PZR karışımı (Çizelge 3.1.) kullanılan
çalışmada, 1 döngü 94 ºC’de 120 saniye başlangıç denatürasyonu, 30 döngü 94 ºC’de
30 saniye / 55 ºC’de 60 saniye / 72 ºC’de 90 saniye çoğaltma ve 1 döngü 72 ºC’de 10
dakika son uzama aşamalarından oluşan PZR protokolü kullanılmıştır. GYL32
izolatında 16S rDNA bölgesinin çoğaltılmasında pA (ileri) 5’-AGA GTT TGA TCC
TGG CTC AG-3’ ve pE’ (geri) 5’- CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3’ genel
bakteriyel primerler kullanılmıştır (Edwards et al., 1989). Çoğaltılan 16S rDNA PZR
fragmentlerinin elektroforezi Thermo Minicell®Primo EC320 cihazında % 1 agaroz
oranı ile hazırlanan jelde yapılmış ve fragmentin büyüklüğü O’GeneRulerTM 100-bp
DNA marker (Fermentas #SM1153, Litvanya) kullanılarak hesaplanmıştır. PZR
ürünlerinin DNA dizi analizi ABI PRISM 3730XL (Perkin Elmer, ABD) otomatik
gen sekans cihazı kullanılarak REFGEN Gen Araştırmaları ve Biyoteknoloji Ltd. Şti.
(Ankara, Türkiye)’inde yaptırılmıştır. 16S rDNA dizi benzerliği National Center for
Biotechnology Information (NCBI) BLAST programı kullanılarak tespit edilmiştir.
Çizelge 3.1. Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan PZR karışımı
Madde adı Hacim
PCR master mix (Fermentas #K0171, Litvanya) 25 µL
İleri primer 1 µL
Geri primer 1 µL
Kalıp DNA 3 µL
Nükleaz içermeyen H2O 20 µL
Toplam hacim 50 µL
37
3.2.7. GYL32 izolatının plazmid içeriğinin tanımlanması
3.2.7.1. Plazmid DNA izolasyonu
M17 broth ortamında 30 oC’de 18 saat geliştirilen GYL32 kültüründen, 10 mL’lik
M17 broth ortamlarına birer mL inokülasyonlar yapılmış ve tüpler 30 oC’de 3-3.5
saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi bitiminde santrifüj tüplerine
aktarılan bakteri kültürleri, 6000 devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor
No: 12141, Almanya) işlemine tabi tutulmuştur. Elde edilen hücre çökeltisi
kurutulduktan sonra 379 µL sakkaroz tamponunda çözülmüştür. 37 oC’ye kadar
ısıtılan bu ortama 96.5 µL lizozim ilave edilmiş ve su banyosunda 37 oC’de 5 dakika
bekletilmiştir. 48.2 µL Tris-EDTA-1 uygulamasından sonra, tüplere % 20 SDS
çözeltisinden 27.6 µL aktarılarak karıştırılmıştır. Bu aşamada ortamda viskozitenin
artışı lizizin başladığını göstermektedir. Lizizin tamamlanması için santrifüj tüpleri
37 oC su banyosunda 10 dakika süre ile tutulmuştur. Süre sonunda tüpler mekanik
karıştırıcıda, yüksek devirde 30 saniye karıştırılarak kromozomal DNA’nın kırılması
sağlanmıştır. Ortama yeni hazırlanmış 3 N NaOH çözeltisinden 27.6 µL ilave
edilmiş ve tüpler düz bir zemin üzerinde 10 dakika süre ile yavaşça çevrilerek
kromozomal DNA’nın alkali denatürasyon koşulları oluşturulmuştur. Denatürasyon
aşamasının sonunda santrifüj tüplerine 49.6 µL Tris-HCl çözeltisi aktarılarak, 3
dakika süre ile yine düz bir zeminde hafifçe karıştırılmıştır. Ortam pH’sının 8.5-9.0
arasına düşüşü ile nötralizasyonun sağlandığı belirlenmiştir. Tüplere, 4 oC’de tutulan
5 M NaCl çözeltisinden 71.7 µL ve % 3 NaCl ile doyurulmuş fenol çözeltisinden 700
µL ilave edilerek, 4 oC’de 15000 devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor
No: 12148, Almanya) işlemi uygulanmıştır. Tüplerde oluşan üst faz, mikropipet
yardımıyla yeni tüplere aktarılmış ve deproteinasyonun sağlanması için 700 µL
kloroform/izoamilalkol (24:1) çözeltisi ilave edilmiştir. Bu ortamlara 4 oC’de 15000
devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya) işlemi
uygulanmış, oluşan üst faz yeni tüplere alınmış ve üzerine eşdeğer hacimde soğuk
etil alkol aktarılmıştır. Etil alkol ilave edilen tüpler -20 oC’de bir gece bekletildikten
sonra, 15000 devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya)
uygulanarak plazmid DNA çöktürülmüş ve sıvı faz dökülerek çökeltiler
38
kurutulmuştur. Kurutulan çökeltiler 20 µL Tris-EDTA-2 içerisinde çözülmüş ve
RNaz A stok çözeltisinden 2 µL ilave edilerek su banyosunda 37 °C’de 45-50 dakika
inkübe edilmiştir (Anderson and McKay, 1983).
Sakkaroz Çözeltisi
Tris 0.655 g
EDTA 0.0372 g
Sakkaroz 6.7 g
Destile su 100 mL
pH 8.0 ± 0.02
Lizozim Çözeltisi
Tris 0.3 g
Lizozim 0.1 g
Destile su 10 mL
pH 8.0± 0.02
Tris-EDTA-1
Tris 0.6 g
EDTA 9.31 g
Destile su 100 mL
pH 8.0± 0.02
SDS Çözeltisi
Tris 0.6 g
EDTA 0.74 g
SDS 20 g
Destile su 100 mL
pH 8.0 ± 0.02
Tris-HCl
Tris-HCl 31.52 g
Destile su 100 mL
pH 7.0 ± 0.02
39
Tris-EDTA-2
Tris 0.121 g
EDTA 0.037 g
Destile su 100 mL
pH 7.5 ± 0.02
%3 NaCl ile Doyurulmuş Fenol Çözeltisinin Hazırlanışı: 100 g fenol üzerine 20
mL destile su ve 3 g NaCl aktarılarak 45 oC’deki su banyosunda çözülmüştür.
Ortama 0.1 g hidroksiguinolin ilave edilmiş ve karıştırılmıştır. Oda sıcaklığında
tutulmuştur.
RNaz A Çözeltisi: 5 mL steril destile su içerisinde hazırlanan 0.05 M sodyum asetat
çözeltisinin pH’sı asetik asit ile 5.0’a ayarlanmış ve üzerine 5 mg RNaz A ilave
edilmiştir. Kaynar su içerisinde ortam 5 dakika tutulduktan sonra -20 oC’de
saklanmıştır.
3.2.7.2. Plazmid DNA örneklerinin elektroforezi
Plazmid DNA örneklerinin elektroforezi % 0.7 agaroz oranı ile hazırlanan jellerde
yapılmıştır (Meyers et al., 1976). Yatay jel sistemi (Thermo Minicell®Primo EC320,
ABD) için agaroz, 35 mL tris-asetat elektroforez tamponu içerisinde çözülmüştür. 37
°C’de 45-50 dakika RNaz uygulanan DNA örnekleri su banyosundan alınarak 2 µL
marker boya çözeltisi ile karıştırılmış ve mikropipet yardımıyla jel kuyucuklarına
aktarılmıştır (20 µL). Elektroforez, 65 voltta 1.5-2.0 saat süreyle yapılmıştır.
Elektroforez işlemi sonunda, jel yeni hazırlanmış etidyum bromit (0.2 µg/mL) içeren
çözeltide 1 saat boyanmıştır. Boyama işleminin sonunda jeller, 366 nm dalga
boyunda ultraviyole ışık altında incelenmiştir (Macrina et al., 1982). Fotoğrafların
çekiminde UviTec DBT-08 (Cambridge, İngiltere) jel görüntüleme sistemi
kullanılmıştır.
40
3.2.7.3. Plazmid büyüklüklerinin hesaplanması
GYL32 suşundan izole edilen plazmidlerin büyüklüklerinin saptanmasında,
moleküler büyüklükleri bilinen ccc DNA marker’larının elektroforetik hareketleri ile,
büyüklüklerinin logaritmaları arasında belirlenen doğrusal ilişkiden yararlanılmıştır
(Macrina et al., 1978; Southern, 1979; Schaffer and Sederoff, 1981). Marker
cccDNA moleküllerinin agaroz jel fotoğrafı üzerinde ölçülen göç aralıkları ile
bilinen büyüklüklerinin logaritmik değerlerine bağlı olarak eğrileri çıkarılmıştır.
İstatistik analizlerle jel için korelasyon katsayısı ve eğrinin eğimi belirlenerek,
GYL32 suşundan izole edilen plazmidlerin büyüklükleri hesaplanmıştır (Campbell,
1974; Elder and Southern, 1983; Elder et al., 1983).
A
G = Ortalama X = (3.1)
N
C
H = Ortalama Y = (3.2)
N
E – ( G . C )
Eğrinin Eğimi (I) = (3.3)
B – ( G . A )
E – ( G . C )
Korelasyon Katsayısı (J) = (3.4)
√ [ D - ( H . C ) ] . [ B – ( G . A ) ]
Moleküler Büyüklük (W) = Antilog10 [ I . ( α – G ) + H ] (3.5)
41
X = Marker DNA moleküllerinin agaroz jel üzerindeki göç aralığı (mm)
Y = Marker DNA moleküllerinin büyüklüğü (kilobaz)
A = X1 + X2 + X3 + ........................ + Xn
B = X12 + X2
2 + X32 + ........................ + Xn
2
C = log10Y1 + log10Y2 + log10Y3 + ........................ + log10Yn
D = ( log10Y1 )2 + ( log10Y2 )
2 + ( log10Y3 )2 + ........................ + ( log10Yn )
2
E = X1 ( log10Y1 ) + X2 ( log10Y2 ) + X3 ( log10Y3 ) + ........................ + Xn ( log10Yn )
α = Moleküler büyüklüğü bilinmeyen plazmidin jel üzerindeki göçü (mm)
3.2.8. Bakteriyosin aktivitesi üzerine pH, sıcaklık ve enzim uygulamalarının
etkisi
3.2.8.1. pH’nın bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi
30 oC’de 18 saat geliştirilen Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu 6000 devirde 15
dakika süreyle santrifüj edilmiş (Sigma 2-16P, Rotor No: 12141, Almanya) ve kültür
üst sıvısının pH’sı 6 N NaOH veya 6 N HCl kullanılarak 2.0-11.0 değerleri arasında
ayarlanmıştır. pH’ları ayarlanan kültür üst sıvıları 0.45 µm por çaplı membran
filtrelerden (Sartorius, Almanya) geçirilerek sterilize edilmiştir. Bu şekilde
hazırlanan ortamlar +4 oC’de 24 saat bekletilmiştir. pH değişimlerinin bakteriyosin
aktivitesi üzerine etkisi, membran filtreden geçirildikten sonra hiçbir işleme tabi
tutulmayan kültür üst sıvısının inhibisyon aktivitesi ile farklı pH değerlerine
ayarlanan kültür üst sıvılarının inhibisyon aktivitelerinin karşılaştırılması sonucu
tanımlanmıştır. Denemelerde nisin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis SIK83 pozitif
kontrol olarak kullanılmıştır. Bakteriyosin aktivitesindeki değişmeler, kritik
dilüsyon yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Denemelerde indikatör bakteri olarak
Lb. plantarum LMG2003 suşu kullanılmıştır. Kültür üst sıvıları kuyucuklara 50 µL
olacak şekilde aktarılmıştır. Bakteriyosin aktivitesi, aşağıdaki formül kullanılarak
arbitrary ünite (AU) cinsinden hesaplanmıştır. D değeri inkübasyon süresi sonunda
indikatör bakterinin gelişiminin engellendiği en yüksek dilüsyon oranını
göstermektedir (Franz et al., 1997).
Bakteriyosin aktivitesi (AU/mL) = 1000 x 50-1 x D-1 (3.6)
42
3.2.8.2. Enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin
belirlenmesi
Enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisini belirlemek için,
nötralize edilmiş kültür üst sıvılarına, son enzim konsantrasyonu 1 mg/mL olacak
şekilde proteinaz K, tripsin, α-kemotripsin, pepsin, α-amilaz (pH 7.0 Sigma Chem.
Co., ABD), lipaz (pH 7.0 Sigma Chem. Co., ABD), katalaz (pH 7.0 Sigma Chem.
Co., ABD) ve lizozim (pH 7.0 Sigma Chem. Co., ABD), enzimleri ilave edilmiş ve
37 oC’de 2 saat inkübasyona bırakılmıştır. Enzim aktiviteleri, 100 oC’de 5 dakika ısı
uygulaması ile sonlandırılmıştır. Kontrol olarak, enzim ilave edilmemiş kültür üst
sıvıları kullanılmıştır. Farklı enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine
etkisi, kritik dilüsyon yöntemi kullanılarak formül 3.6’ya göre hesaplanmıştır (Franz
et al., 1997).
3.2.8.3. Sıcaklık uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin
belirlenmesi
Bakteriyosin aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisi, nötralize edilmiş kültür üst
sıvılarının 100 oC’de 5, 10, 15 ve 20 dakika tutulmasından sonra, bu ortamlardan
alınan örneklerin Lb. plantarum LMG2003 indikatör bakterisine karşı denenmesi
suretiyle belirlenmiştir. Kontrol olarak sıcaklık uygulanmamış kültür üst sıvısı
kullanılmıştır. Sıcaklığın bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisi, pH ve enzim
uygulamalarının etkisinin belirlendiği testlerde olduğu gibi kritik dilüsyon yöntemi
kullanılarak formül 3.6’ya göre hesaplanmıştır (Franz et al., 1997).
3.2.9. Bakteriyosin yapısal genlerinin PZR ile çoğaltılması
Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunda nisin yapısal genlerinin PZR ile çoğaltılması
Techne Genius (Cambridge, İngiltere) termal döngü cihazında yapılmıştır. PZR
denemelerinde GYL32 suşundan izole edilen plazmid DNA ve genomik DNA
örnekleri kalıp olarak kullanılmıştır. Çizelge 3.1.’de verilen karışımın kullanıldığı
PZR reaksiyonu, 1 döngü 94 ºC’de 120 saniye başlangıç denatürasyonu, 30 döngü
43
94 ºC’de 45 saniye / 52.5 ºC’de 45 saniye / 72 ºC’de 60 saniye çoğaltma ve 1 döngü
72 ºC’de 10 dakika son uzama aşamalarından oluşmaktadır. Nisin yapısal genlerinin
çoğaltılmasında pA (ileri) 5’-AAG AAT CTC TCA TGA GT-3’ ve pE’ (geri) 5’-
CCA TGT CTG AAC TAA CA-3’ primerleri kullanılmıştır (Rodriguez et al., 1995).
Çoğaltılan PZR fragmentlerinin elektroforezi O’GeneRulerTM 100-bp DNA marker
(Fermentas #SM1153, Litvanya) kullanılarak % 1 agaroz oranı ile hazırlanan jelde
yapılmıştır. PZR ürünlerinin DNA dizi analizi REFGEN Gen Araştırmaları ve
Biyoteknoloji Ltd. Şti. (Ankara, Türkiye)’inde yaptırılmıştır. Çoğaltılan bölgenin
DNA dizi benzerliği BLAST programı kullanılarak tespit edilmiştir.
3.2.10. Hücre liziz
Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu M17 broth besiyerinde 30 oC’de 18 saat süre ile
geliştirilmi ş ve kültür 6000 devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No:
12141, Almanya) edilmiştir. Çöken katı fazın karışmamasına dikkat edilerek yeni
tüplere aktarılan kültür üst sıvısının pH’sı 6.0’a ayarlanmış ve 0.45 µm por çaplı
membran filtreden (Sartorius, Almanya) geçirilerek sterilize edilmiştir. Steril kültür
üst sıvısından 20 mL alınarak erken gelişme fazına kadar geliştirilen 100 mL Lb.
plantarum LMG2003 kültürüne ilave edilmiştir. Bakteriyosin ilave edilen ve
edilmeyen Lb. plantarum LMG2003 kültürlerinin optik yoğunluğu, 1cm ışık yoluna
sahip küvetler kullanılarak 600 nm dalga boyunda birer saat aralıklarla 9 saat
boyunca ölçülmüştür (Shimadzu UV-1600-V spectrophotometer, Japan). Kültürlerin
optik yoğunluğunun ölçülmesinde şahit olarak steril MRS broth besiyeri
kullanılmıştır (Todorov and Dicks, 2005).
3.2.11. Bakteriyosin üretimi
Bakteriyosin üretimi için; bir gecelik aktif Lc. lactis subsp. lactis GYL32
kültüründen, 100 mL M17 broth ortamına % 1 oranında ekim yapılmış ve 30 oC’de
inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyona bırakılan kültürden birer saat arayla 9 saat
boyunca aseptik koşullarda örnek alınmış ve optik yoğunluğu ve bakteriyosin üretim
miktarı ölçülmüştür. Bakteriyosin üretim miktarı kritik dilüsyon yöntemi kullanılarak
44
Lb. plantarum LMG2003 indikatör suşuna karşı belirlenmiştir. Spektrofotometrik
ölçümlerde şahit olarak steril M17 broth besiyerleri kullanılmıştır (Todorov and
Dicks, 2005).
3.2.12. Bakteriyosinin kısmi saflaştırılması
Bir gecelik aktif Lc. lactis subsp. lactis GYL32 kültüründen, 100 mL M17 broth
ortamlarına % 1 oranında ekim yapılmış ve 30 oC’de 18 saat süreyle inkübe
edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda, kültür 15000 devirde 20 dakika santrifüj
(Sigma 3K 30, Rotor No: 12155, Almanya) işlemine tabi tutulmuştur. Çöken katı
fazın karışmamasına dikkat edilerek, yeni tüplere aktarılan kültür üst sıvısının pH’sı
10 N NaOH kullanılarak 6.5’e ayarlanmıştır. Kültür üst sıvısına, son konsantrasyon
oranı % 40 olacak şekilde yavaş yavaş amonyum sülfat ilave edilmiş ve eriyinceye
kadar karıştırılmıştır. Amonyum sülfat ilave edilmiş kültür üst sıvısı santrifüj
tüplerine aktarılmış ve +4 oC’de 1 gece manyetik karıştırıcıda karıştırılmıştır. Daha
sonra örnekler +4 oC’de 15000 devirde 30 dakika süreyle santrifüj (Sigma 3K 30,
Rotor No: 12155, Almanya) edilmiştir. İşlem sonunda üst faz dökülmüş ve çökelti
oda sıcaklığında kurutulmuştur. Kurutulan çökelti 5 mL sodyum fosfat tampon (pH
7.0) içerisinde çözülmüş ve üzerine 75 mL metanol/kloroform (1:2 v/v) çözeltisi
ilave edilerek +4 oC’de 1 saat bekletilmiştir. Bu süre sonunda örnekler +4 oC’de
15000 devirde 45 dakika santrifüj (Sigma 3K 30, Rotor No: 12155, Almanya)
edilmiş, üst faz dökülmüş ve çökelti kurutulmuştur. Son aşamada kurutulan çökelti 1
mL steril ultra saf suda çözülmüş ve – 20 oC’de saklanmıştır (Moreno et al., 2003).
Sodyum Fosfat Tampon
NaH2PO4 .H2O 0.55 g
Na2HPO4 .7H2O 1.61 g
Destile su 100 mL
pH 7.0 ± 0.02
45
3.2.13. Trisin-sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (Trisin-SDS-
PAGE)
Trisin-SDS-PAGE denemeleri Schägger ve von Jagow (1987) tarafından önerilen
yöntem kullanılarak yapılmıştır. Dikey jel elektroforez sisteminde, iki adet 10x10 cm
ebatlarında cam plaka kullanılmıştır. Elektroforez plakaları % 70’lik etanol çözeltisi
ile yıkanıp kurutulduktan sonra, plakalar arasına jel tarağının yerleştirildi ği üst kısım
hariç, 0.8 mm kalınlığında ayırıcılar konulmuştur. Bu aşamadan sonra, jel tarağının
0.5 cm altına kadar gelecek şekilde % 16.5’lik ayırıcı jel dökülmüş ve üzerine 1 mL
destile su ilave edilmiştir. Ayırıcı jelin polimerizasyonu için 45 dakika beklenmiş ve
destile su filtre kağıdı aracılığı ile ortamdan alınmıştır. Plakanın geri kalan kısmı %
9.8’lik toplayıcı jel dökülerek tamamlanmış ve tarak yerleştirilmi ştir. Toplayıcı jelin
polimerizasyonu için 45 dakika daha beklendikten sonra cam plakalar elektroforez
tankına yerleştirilmi ştir. Tarak çıkarılmış ve tank haznelerine tris-trisin-SDS tampon
ilave edilmiştir. Son aşamada, bakteriyosin örnekleri 10 µL olacak şekilde
kuyucuklara aktarılmıştır. Jel sistemine, toplayıcı jel için 30 volt ve ayırıcı jel için ise
90 volt elektrik akımı uygulanmıştır. Bakteriyosin örneklerinin elektroforetik
ayrımının tamamlanmasının ardından jel, 2 ayrı parçaya bölünmüştür. Jellerden biri
Commasie brillant blue R250 boya çözeltisine alınarak, burada bir saat boyanmıştır.
Bu süre bitiminde jel, fazla boyanın geri alındığı çözeltide protein bantları netlik
kazanıncaya kadar (30-60 dak) bekletilmiş ve fiksasyon çözeltisi (% 10’luk asetik
asit) içine alınmıştır. Boyanmamış jel parçası aktif protein bandının tespiti için
kullanılmıştır.
Akrilamid/Bis-akrilamid Çözeltisi
Akrilamid 30 g
Bis-akrilamid 0.8 g
Destile su 100 mL
Whatman No.1 ile filtre edilen çözeltinin bulunduğu erlenmayer, alüminyum folyo
ile kaplanarak +4 oC’de tutulmuştur.
46
Tris.Cl/SDS, pH 8.45
Tris 182 g
SDS 1.5 g
Destile su 500 mL
pH 8.45 ± 0.02’ye ayarlanır. +4 oC’de saklanır.
Tris.Cl/SDS, pH 6.8
Tris 6.05 g
SDS 0.4 g
Destile su 100 mL
pH 6.8 ± 0.02’ye ayarlanır. +4 oC’de saklanır.
Örnek Tamponu
Tris.Cl/SDS, pH 6.8 2 mL
Gliserol 2.4 mL
SDS 0.8 g
Dithiothreitol 0.31 g
Commasie brillant blue R250 2 mg
Destile su 10 mL
APS (% 10)
Amonyum persülfat 0.1 g
Destile su 1 mL
Ayırıcı Jel
Akrilamid/Bis-akrilamid 8.75 mL
Tris.Cl/SDS, pH 8.45 5 mL
Gliserol 1.58 mL
Destile su 165 µL
Dökmeden hemen önce, 100 µL % 10 amonyum persülfat ve 20 µL tetrametil etilen
diamin (TEMED) ilave edilmiştir.
47
Toplayıcı Jel
Akrilamid/Bis-akrilamid 1.66 mL
Tris.Cl/SDS, pH 8.45 1.55 mL
Destile su 2.22 mL
Dökmeden hemen önce, 25 µL % 10 amonyum persülfat ve 5 µL TEMED ilave
edilmiştir.
Tris-Trisin-SDS Tampon (1X)
Tris 12.11 g
Trisin 17.92 g
SDS 1 g
Destile su 1000 mL
pH 8.3 ± 0.02’ye ayarlanır. +4 oC’de saklanır.
Commasie Brilliant Blue Boya Çözeltisi
Commasie brilliant blue R250 1 g
Metanol 400 mL
Glasiyel asetik asit 100 mL
Destile su 500 mL
Boya Geri Alma Çözeltisi
Metanol 400 mL
Glasiyel asetik asit 100 mL
Destile su 500 mL
Jel Fiksasyon Çözeltisi
Glasiyel asetik asit 100 mL
Destile su 900 mL
48
3.2.13.1. Bakteriyosinin moleküler büyüklüğünün hesaplanması
Beyaz ışık kaynağı üzerine yerleştirilerek alınan jel fotoğraflarında Lc. lactis subsp.
lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin moleküler büyüklüğü; 42, 26,
17, 10, 4.6 ve 1.7 kDa’luk proteinleri içeren marker karışımı (Fermentas #SM1861,
Litvanya) kullanılarak, UviTec (Cambridge, İngiltere) Photo programı yardımıyla
hesaplanmıştır.
3.2.13.2. Aktif protein bantının tespiti
Aktif protein bantının belirlenmesinde kullanılan boyanmamış jel parçası indikatör
mikroorganizmanın gelişimini inhibe edebilecek kimyasallardan arındırılmak için
aseptik koşullarda steril ultra saf su ile 3 saat boyunca yıkanmıştır. Birer saat
aralıklarla jelin yıkandığı steril ultra saf su değiştirilmi ştir. Yıkanan jel, besiyeri ile
jel arasında hava boşluğu kalmayacak şekilde içerisinde MRS agar bulunan petri
kutusuna (Ø 14 cm) yerleştirilmi ştir. Daha sonra, bir gecelik aktif Lb. plantarum
LMG2003 kültürü % 0.7 oranında agar içeren 20 mL MRS yumuşak agar besi ortamı
içerisine inoküle edilmiştir. Hazırlanan ortam jel yüzeyini tamamen kaplayacak
şekilde homojen olarak yayılmış ve 37 ºC’de 18 saat süre ile inkübasyona
bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda jel üzerinde oluşan inhibisyon zonu
incelenmiştir (Tuncer and Özden, 2010).
49
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTI ŞMA
4.1. Laktokok Suşlarının İzolasyonu
Araştırma kapsamında kullanılan Lc. lactis suşları; Antalya, Isparta ve Tekirdağ
illerinden sağlanan geleneksel yollarla üretilmiş Boza, Beyaz Peynir, Kefir ve Tulum
Peyniri örneklerinden izole edilmiştir (Çizelge 4.1.). Araştırmada kullanılan Tarhana
örneklerinin hiç birinden laktokok suşu izole edilememiştir.
Fermente gıda örneklerinin peptonlu su kullanılarak hazırlanan seri dilüsyonlarından
Neutral Red Chalk Lactose Agar (NRCLA) ortamlarına yayma ekim yapılmış ve 30
°C’de 48 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. İnkübasyon süresi sonunda NRCLA
ortamlarında koyu kırmızı renkte ve çevrelerinde berrak zon oluşumu gösteren
koloniler muhtemel laktokok izolatı olarak seçilmiştir. Seçilen izolatlardan, Gram
pozitif, kok morfolojisine sahip, katalaz negatif, Elliker broth ortamında 30 °C’de
gelişme gösterebilen ancak 10 oC ve 45 oC inkübasyon sıcaklığında, pH’sı 9.6’ya
ayarlanmış ve % 6.5 NaCl içeren Elliker broth ortamlarında 30 °C’de gelişemeyen 50
adet izolat Lactococcus cinsi üyesi olarak tanımlanmış ve çalışma materyali olarak
seçilmiştir. Seçilen Lactococcus izolatları M17 broth ortamlarına % 20 oranında
gliserol ilave edilerek -20 °C’de muhafaza edilmiştir.
Farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda Beyaz Peynir (Durlu-Özkaya et
al., 2001; Dağdemir and Özdemir, 2008), Boza (Hancıoğlu and Karapınar, 1997;
Gotcheva et al., 2000; Tuncer and Özden, 2010), Kefir (Frengova et al., 2002, Kojic
et al., 2007; Chen et al., 2008), Tarhana (Dağlıoğlu et al., 2002) ve Tulum Peyniri
(Tükel et al., 2007; Tuncer vd., 2008) gibi farklı fermente gıda örneklerinden
Lactococcus lactis suşları izole edilmiştir. Araştırma kapsamında kullanılan Tarhana
örneklerinin hiç birinden laktokok suşu izole edilememesi, söz konusu örneklerde
laktokok suşu olmadığını düşündürmüştür. Tarhana örnekleri dışında tez çalışması
kapsamında kullanılan diğer fermente gıda örneklerinden elde edilen sonuçlar
literatür verileri ile uyum göstermiştir.
50
Çizelge 4.1. Araştırmada kullanılan laktokok suşlarının izolasyon materyalleri ve
izolasyon materyallerinin sağlandığı iller
Bakteri No İzolasyon Materyali İl
GYL1 Beyaz peynir Isparta
GYL2 Beyaz peynir Isparta
GYL3 Tulum peyniri Isparta
GYL4 Tulum peyniri Isparta
GYL5 Beyaz peynir Tekirdağ
GYL6 Beyaz peynir Tekirdağ
GYL7 Boza Tekirdağ
GYL8 Tulum peyniri Tekirdağ
GYL9 Tulum peyniri Tekirdağ
GYL10 Beyaz peynir Antalya
GYL11 Beyaz peynir Antalya
GYL12 Beyaz peynir Antalya
GYL13 Tulum peyniri Antalya
GYL14 Tulum peyniri Antalya
GYL15 Tulum peyniri Antalya
GYL16 Kefir Isparta
GYL17 Kefir Isparta
GYL18 Kefir Isparta
GYL19 Kefir Isparta
GYL20 Tulum peyniri Isparta
GYL21 Tulum peyniri Isparta
GYL22 Tulum peyniri Isparta
GYL23 Boza Tekirdağ
GYL24 Boza Tekirdağ
GYL25 Boza Tekirdağ
51
Çizelge 4.1. (devam)
Bakteri No İzolasyon Materyali İl
GYL26 Kefir Tekirdağ
GYL27 Kefir Tekirdağ
GYL28 Kefir Tekirdağ
GYL29 Boza Isparta
GYL30 Boza Isparta
GYL31 Boza Isparta
GYL32 Boza Isparta
GYL33 Beyaz peynir Tekirdağ
GYL34 Beyaz peynir Tekirdağ
GYL35 Beyaz peynir Tekirdağ
GYL36 Kefir Isparta
GYL37 Kefir Isparta
GYL38 Boza Antalya
GYL39 Boza Antalya
GYL40 Boza Antalya
GYL41 Kefir Antalya
GYL42 Kefir Antalya
GYL43 Kefir Antalya
GYL44 Beyaz peynir Isparta
GYL45 Beyaz peynir Isparta
GYL46 Beyaz peynir Isparta
GYL47 Kefir Isparta
GYL48 Kefir Isparta
GYL49 Tulum peyniri Tekirdağ
GYL50 Tulum peyniri Tekirdağ
52
4.2. Laktokok İzolatlarının Antibakteriyel Aktivite Özelliklerinin Belirlenmesi
Fermente gıda örneklerinden izole edilen laktokok izolatlarının antibakteriyel
aktivitelerinin belirlenmesinde van Belkum vd. (1989), tarafından önerilen yöntem
kullanılmıştır. Toplam 27 adet Gram pozitif ve Gram negatif indikatör bakteriye
karşı antibakteriyel aktivite özellikleri araştırılan 50 adet laktokok izolatından 3
adedinin (GYL14, GYL32 ve GYL41) çeşitli indikatör bakterilere karşı inhibisyon
zonu oluşturduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.2.).
Antibakteriyel aktivite testleri sonucu, indikatör bakterilere karşı inhibisyon zonu
oluşturduğu tespit edilen laktokok izolatlarının birbiri ile aynı aktivite spektrumu
göstermediği belirlenmiştir. GYL14 izolatının denemelerde kullanılan indikatör
bakterilerden 2 adedine karşı (L. innocua LMG2813 ve M. luteus RSK1123); GYL32
izolatının indikatör bakterilerden 22 adedine karşı (Lb. sakei NCDO2714, Lb.
plantarum LMG2003 (Şekil 4.1.), Lc. lactis subsp. lactis IL1403, Lc. lactis subsp.
lactis 105, Lc. lactis subsp. lactis LMG2908, Lc. lactis subsp. lactis T1, Lc. lactis
subsp. lactis 731, Lc. lactis subsp. lactis 2, Lc. lactis subsp. lactis LMG2912, Lc.
lactis subsp. lactis JC17, Lc. lactis subsp. cremoris LMG2132, L. innocua
LMG2813, L. monocytogenes ATCC19115, L. monocytogenes ATCC15813, M.
luteus RSK1123, E. faecalis LMG2708, E. faecalis LMG2602, S. aureus
ATCC6538, S. aureus FRI100, S. carnosus LMG2709, P. pentosaceus LMG2001 ve
B. cereus LMG2732); GYL41 izolatının ise, indikatör bakterilerden 3 adedine karşı
(Lc. lactis subsp. lactis IL1403, L. innocua LMG2813 ve M. luteus RSK1123)
inhibisyon zonu oluşturduğu belirlenmiştir. Laktokok izolatlarından hiçbiri
denemelerde kullanılan Gram negatif (P. fluorescens P1, E. coli LMG3083 CFAI
(ETEC) ve S. enterica serotype Typhimurium SL1344) bakterilere karşı
antibakteriyel aktivite göstermemiştir.
53
Çizelge 4.2. İndikatör bakterilere karşı zon veren laktokok izolatları ve zon çapları
İndikatör Suşlar Sıcaklık
(°C)
Besiyeri* Test Edilen Bakteriler **
(Ømm)
GYL14 GYL32 GYL41 SIK83
Lb. sakei NCDO2714 37 MRS - 19 - 15
Lb. plantarum LMG2003 37 MRS - 25 - 21
Lc. lactis subsp. lactis IL1403 30 GM17 - 22 2 15
Lc. lactis subsp. lactis 105 30 GM17 - 11 - 6
Lc. lactis subsp. lactis LMG2908 30 GM17 - 13 - 8
Lc. lactis subsp. lactis T1 30 GM17 - 8.5 - 6
Lc. lactis subsp. lactis 731 30 GM17 - 7 - 5
Lc. lactis subsp. lactis 2 30 GM17 - 4 - 8
Lc. lactis subsp. lactis LMG2912 30 GM17 - 12 - 8
Lc. lactis subsp. lactis JC17 30 GM17 - 13 - 10
Lc. cremoris LMG2132 30 GM17 - 2 - 4
Lc. lactis subsp. lactis LMG2088 30 GM17 - - - -
Lc. lactis subsp. lactis SIK83 30 GM17 - - - -
E. faecalis LMG2708 37 GM17 - 9 - 9
E. faecalis LMG2602 37 GM17 - 10 - 9
L. innocua LMG2813 30 LB 4 6 4 9
L. monocytogenes ATCC19115 37 LB - 13 - 5
L. monocytogenes ATCC15813 37 LB - 10 - 6
P. fluorescens P1 37 LB - - - -
E. coli LMG3083 CFAI (ETEC) 37 LB - - - -
S. Typhimurium SL1344 37 LB - - - -
M. luteus RSK1123 30 TSB 3 24 4 21
S. aureus FRI100 37 TSB - 11 - 5
S. aureus ATCC6538 37 TSB - 10 - 5
S. carnosus LMG2709 37 TSB - 9 - 5
P. pentosaceus LMG2001 37 TSB - 12 - 11
B. cereus LMG2732 37 TSB - 10.5 - 6
*MRS: de Man Rogosa Sharpe Broth; GM17: Glukoz M17 Broth (% 5 glukoz); LB:
Luria Bertani Broth; TSB: Triptik Soy Broth (% 0.5 maya ekstraktı)
** GYL: Lc. lactis izolatı; SIK83: Lc. lactis subsp. lactis (nisin üreticisi)
54
Şekil 4.1. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun, Lb. plantarum LMG2003 suşuna
karşı verdiği inhibisyon zonu
Bakteriyosin üreticisi suşların belirlenmesinde ilk aşama olarak indikatör bakterilere
karşı inhibisyon zonu oluşturan suşların seçilmesi gelmektedir. Bu amaçla kullanılan,
farklı araştırmacılar tarafından önerilen birçok yöntem bulunmaktadır (Gratia, 1946;
Kékessy and Piguet, 1970; Tagg and McGiven, 1971; Tagg et al., 1976; Geis et al.,
1983; van Belkum et al., 1989). Bu yöntemler doğrudan ve dolaylı olmak üzere iki
ana sınıf altında toplanmaktadır. Doğrudan ve dolaylı yöntemlerin ortak amacı,
bakteriyosin üretim özellikleri araştırılan suşların indikatör bakterilere karşı
inhibisyon zonu oluşturup oluşturmadığının belirlenmesidir. Uygulanan yönteme
göre kuyucuk veya koloni etrafında berrak ve keskin hatlı inhibisyon zonunun
gözlenmesi test edilen bakterinin bakteriyosin üreticisi olduğuna dair güçlü bir kanıt
olarak değerlendirilmektedir (De Vuyst and Vandamme, 1994; Degaan et al., 2006).
Farklı araştırıcılar tarafından yapılan birçok araştırmada laktokoklar tarafından
üretilen bakteriyosinlerin başta yakın akraba türler olmak üzere çeşitli Gram pozitif
gıda patojenlerine karşı da inhibitör etki gösterdiği belirlenmiştir. Antibakteriyel
aktivite özellikleri araştırılan laktokok suşlarının hiçbirinin Gram negatif bakterilere
karşı inhibisyon zonu oluşturmaması literatür verileri ile uyum göstermektedir (Geis
55
et al., 1983; Ryan et al., 1996; Mao et al., 2001; Iwatani et al., 2007; Tuncer and
Akçelik, 2007; Özkalp et al., 2007; Özden and Akçelik, 2008; Tuncer, 2009).
4.3. Proteolitik Enzim Uygulaması
Çeşitli indikatör bakterilere karşı antibakteriyel aktivite gösterdiği tespit edilen
GYL14, GYL32 ve GYL41 izolatları tarafından üretilen antibakteriyel maddelerin
protein yapısında olup olmadığı proteolitik enzim uygulaması sonucu tespit
edilmiştir. Proteolitik enzim uygulamasında, GYL14 ve GYL41 suşları için L.
innocua LMG2813 ve GYL32 suşu için ise, Lb. plantarum LMG2003 indikatör
bakteri olarak kullanılmıştır. Proteolitik enzim uygulaması sonucu, GYL14 ve
GYL41 izolatları tarafından üretilen antibakteriyel maddelerin α-kemotripsin, pepsin,
proteinaz K ve tripsin enzimlerinden etkilenmediği, buna karşı GYL32 izolatı
tarafından üretilen antibakteriyel maddenin pepsin ve tripsin enzimlerinden
etkilenmez iken proteinaz K (Şekil 4.2.) ve α-kemotripsin (Şekil 4.3.) enzimleri ile
muamele edilmesi sonucu aktivitesini kaybettiği belirlenmiştir.
Şekil 4.2. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen antibakteriyel
maddenin proteinaz K uygulaması sonucu kalan aktivitesi
56
Şekil 4.3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen antibakteriyel
maddenin α-kemotripsin uygulaması sonucu kalan aktivitesi
Bakteriyosinlerin tümünde antibakteriyel etkinlik ana protein yapıdan
kaynaklanmaktadır. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin
tripsin, α-kemotripsin, pepsin ve proteinaz K gibi proteolitik enzimler ile muamele
edilmeleri sonucu aktivitelerini ya tamamen ya da kısmen kaybettikleri belirlenmiştir
(van Belkum et al., 1989; Piard et al., 1990; Dieye et al., 2001; Tuncer and Akçelik,
2007; Özden and Akçelik, 2008; Tuncer, 2009; Tuncer and Özden, 2010). Proteolitik
enzim uygulaması sonucu inhibitör etkinin tamamen veya kısmen ortadan kalkması
üretilen antibakteriyel maddenin bakteriyosin olduğunu, proteolitik enzim
uygulamasından etkilenmemesi ise üretilen antibakteriyel maddenin bakteriyosin
dışında başka bir inhibitör madde olabileceğini işaret etmektedir. GYL32 izolatı
tarafından üretilen antibakteriyel maddenin proteolitik enzimler α-kemotripsin ve
proteinaz K’dan etkilenmesi, GYL32 izolatı tarafından üretilen inhibitör maddenin
bakteriyosin olduğunun güçlü delili olarak değerlendirilmiştir
GYL14 ve GYL41 izolatları tarafından üretilen antibakteriyel maddelerin
denemelerde kullanılan proteolitik enzimlerden etkilenmemesi ise, bu izolatların
bakteriyosin dışında başka bir inhibitör madde ürettiklerini işaret etmektedir. Farklı
57
araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda, laktokok cinsi üyesi bakterilerin
bakteriyosinler dışında; başta laktik asit olmak üzere, diasetil, asetoin ve hidrojen
peroksit gibi farklı antimikrobiyel maddeler ürettikleri tespit edilmiştir (Jay, 1982;
McKay, 1983; Condo, 1987; Hugenholtz and Starrenburg, 1992; Morita et al., 1997;
Hsu et al., 2002; Devlieghere et al., 2004).
4.4. Bakteriyosin Üreticisi Laktokok İzolatının Tanısı
Proteolitik enzim uygulaması sonucunda bakteriyosin üreticisi olduğu tespit edilen
GYL32 izolatının tür düzeyinde tanısında API 50 CH (Biomerieux, Marcy-I’Etaile,
Fransa) karbonhidrat fermantasyon testinin yanı sıra 16S rDNA dizi analizi
kullanılmıştır. API 50 CH karbonhidrat testi üretici firma tarafından önerilen
yönteme göre yapılmıştır. Karbonhidrat fermantasyon testi sonucunda, GYL32
izolatının 49 karbonhidrat içerisinden L-arabinoz, riboz, D-ksiloz, galaktoz, glukoz,
fruktoz, mannoz, mannitol, N-asetil-glukozamin, amigdalin, arbutin, eskulin, salisin,
sellobioz, maltoz, laktoz, sukroz, trihaloz, nişasta, gentiobioz ve glukonat’ı fermente
ettiği ancak geri kalan 28 karbonhidrattan hiçbirini fermente edemediği tespit
edilmiştir (Çizelge 4.3.). GYL32 izolatının karbonhidrat fermantasyon profilinin
üretici firma veri bankası ile kıyaslanması sonucu bakteriyosin üreticisi GYL32
izolatının Lc. lactis subsp. lactis 1 ile % 99.8 oranında benzerlik gösterdiği
belirlenmiştir.
Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genetik tanısında, 16S
rDNA dizi analizi yöntemi kullanılmıştır. Genomik DNA izolasyonu için GYL32
suşu M17 broth besiyerinde 30 oC’de 18 saat geliştirilmi ş ve aktif GYL32
kültüründen genomik DNA örnekleri Cancilla vd. (1992), tarafından önerilen
yönteme göre izole edilmiştir. Genomik DNA örneklerinin elektroforezi tris-asetat
elektroforez tamponu kullanılarak % 0.7 agaroz oranı ile hazırlanan jelde yapılmıştır.
Jel fotoğrafı UviTec DBT-08 (Cambridge, İngiltere) jel görüntüleme sistemi
kullanılarak çekilmiştir (Şekil 4.4).
58
Çizelge 4.3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun API 50 CH karbonhidrat
fermentasyon test sonuçları
Karbonhidrat GYL32* Karbonhidrat GYL32
0 Kontrol**
1 Gliserol
2 Eritritol
3 D-Arabinoz
4 L-Arabinoz
5 Riboz
6 D-Ksiloz
7 L-Ksiloz
8 Adonitol
9 β-Metil-D-Ksilozid
10 Galaktoz
11 Glukoz
12 Fruktoz
13 Mannoz
14 Sorboz
15 Ramnoz
16 Dulsitol
17 Inositol
18 Mannitol
19 Sorbitol
20 α-Metil-D-Mannozid
21 α-Metil-D-Glukozid
22 N-Asetil-Glukozamin
23 Amigdalin
24 Arbutin
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
-
-
-
+
+
+
25 Eskulin
26 Salisin
27 Sellobioz
28 Maltoz
29 Laktoz
30 Melibioz
31 Sukroz
32 Trihaloz
33 Inulin
34 Melezitoz
35 Rafinoz
36 Nişasta
37 Glikogen
38 Ksilitol
39 Gentiobioz
40 D-Turanoz
41 D-Lyxoz
42 D-Tagatoz
43 D-Fukoz
44 L-Fukoz
45 D-Arabitol
46 L-Arabitol
47 Glukonat
48 2-Keto-Glukonat
49 5-Keto-Glukonat
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
*GYL32: Lc. lactis subsp. lactis GYL32
**Karbonhidrat içermeyen test kuyucuğu
59
Şekil 4.4. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genomik DNA örneği
1-2 Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu
3 O’GeneRuler DNA Marker (bç) : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700,
600, 500, 400, 300, 200, 100
60
Bakteriyosin üreticisi GYL32 suşunda 16S rDNA bölgesinin PZR ile çoğaltılması
genel bakteriyel primerler kullanılarak Techne Genius (Cambridge, UK) termal
döngü cihazında yapılmıştır. Çoğaltılan PZR fragmentinin elektroforezi % 1 agaroz
oranı ile hazırlanan jelde yapılmış ve söz konusu fragmentin moleküler büyüklüğü
yaklaşık 900 bç bulunmuştur (Şekil 4.5.). GYL32 suşunda PZR ile çoğaltılan 16S
rDNA gen bölgesinin DNA dizisi BLAST programında analiz edilmiş ve Lc. lactis
subsp. lactis genomundaki bölge ile % 100 oranında homoloji gösterdiği
belirlenmiştir.
Bakterilerin koloni morfolojileri, kültürel ve biyokimyasal özellikleri gibi fenotipik
karakterleri incelenerek tür ve alt tür düzeyinde tanısı yapılabilmektedir. Ancak
fenotipik karakterler kullanılarak yapılan tanımlama çalışmalarında izolatların tür ve
alt tür düzeyinde kesin bir ayrımının yapılamaması nedeniyle günümüzde bakteriyel
tanımlama çalışmaları, nükleik asit homolojisi, genomik DNA restriksiyon analizi
veya restriksiyon fragment boy polimorfizmi (restriction fragment length
polymorphism, RFLP), değişken alanlı jel elektroforezi (pulsed field gel
electrophoresis, PFGE), 16S rDNA genlerini tanımlayıcı PZR uygulamaları ve DNA
dizi analizleri gibi moleküler genetik yöntemler ile desteklenerek yapılmaktadır
(Brown, 2001; Samaržija et al., 2001; Pu et al., 2002; Ben Amor et al., 2007). API 50
CH karbonhidrat test sonucu ve 16S rDNA dizi analizinden elde edilen veriler
ışığında tez çalışması kapsamında izole edilen bakteriyosin üreticisi GYL32
izolatının Lc. lactis subsp. lactis olduğu kesinlik kazanmıştır.
61
Şekil 4.5. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun PZR ile çoğaltılan 16S rDNA
fragmenti
1-2 Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genomik DNA’sı
3 Negatif kontrol
4 O’GeneRuler DNA Marker (bç) : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700,
600, 500, 400, 300, 200, 100
62
4.5. Plazmid DNA İzolasyonu
Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun, Anderson ve McKay
(1983) tarafından önerilen alkali denatürasyon yöntemi kullanılarak yapılan plazmid
izolasyonu çalışması sonucu moleküler büyüklükleri 37.2 ve 25.1 kb olan 2 adet
plazmid içerdiği belirlenmiştir (Şekil 4.6.).
Şekil 4.6. Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun plazmid
içeriği
1 ccc Plazmid DNA Marker (kb) : 16.2, 14.1, 12.2, 10.2, 8.0, 7.2, 6.0, 5.0, 4.0,
2.9, 2.1
2-3 GYL32 (kb) : 37.2, 25.1
63
Pek çok laktokok suşunda laktoz fermentasyonu, proteolitik aktivite, faj dirençlilik
özellikleri, ekzopolisakkarit ve bakteriyosin üretimi gibi endüstriyel öneme sahip
özelliklerin genetik determinantları plazmidler üzerinde kodludur (Gasson and
Davies, 1984; von Wright and Sibakov, 1993; Hill and Ross, 1998; Samaržija et al.,
2001). Çeşitli araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda, Lactococcus cinsi suşların
moleküler büyüklükleri genellikle 1-100 kb arasında değişen 1-11 adet plazmid
içerdiği belirlenmiştir (Klaenhammer et al., 1978; Kuhl et al., 1979; Davies et al.,
1981; von Wright et al., 1986; Lucey et al., 1993; Liu et al., 1997; Tükel ve Akçelik,
2000; Özden and Akçelik, 2008; Tuncer, 2009). Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis
subsp. lactis GYL32 suşunun içerdiği plazmidlerin sayı ve büyüklükleri, bu literatür
verileri ile tam uyum göstermektedir.
4.6. Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine pH, Enzim ve Sıcaklık Uygulamalarının
Etkisi
Proteolitik enzim uygulaması sonucu bakteriyosin üreticisi olduğu belirlenen Lc.
lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin tanısında etki
spektrumunun belirlenmesine ek olarak bakteriyosinin farklı pH, sıcaklık ve enzim
uygulamalarına karşı davranışı esas alınmıştır. Denemelerde nisin üreticisi Lc. lactis
subsp. lactis SIK83 suşu pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.
Aktivite belirleme çalışmaları sonucu, Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun kültür
üst sıvısının Lb. plantarum LGM2003 suşuna karşı 5120 AU/mL aktivite gösterdiği
belirlenmiştir. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin
aktivitesinin pH 2.0-4.0 değerleri arasında arttığı, pH 5.0-8.0 değerleri arasında
stabilitesini koruduğu ve pH 9.0, 10.0 ve 11.0 değerlerinde ise aktivitesinin, sırasıyla
% 50, % 87.5 ve % 93.75 oranlarında azaldığı belirlenmiştir. Enzim uygulamaları
sonucu söz konusu suş tarafından üretilen bakteriyosin α-kemotripsin ve proteinaz K
ile tamamen inaktive olmuştur. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından
üretilen bakteriyosin denemede kullanılan diğer enzimlerden etkilenmemiştir.
GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosin, 100 ºC’de 5, 10, 15 ve 20 dakika
sıcaklık uygulamalarında aktivitesini koruduğu tespit edilmiştir. Farklı pH, enzim ve
64
sıcaklık uygulamaları sonucu, GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin
denemelerde kontrol olarak kullanılan SIK83 tarafından üretilen nisin ile tamamen
aynı davranışı gösterdiği belirlenmiştir (Çizelge 4.4.).
Tez çalışmasında elde edilen verilere benzer olarak, standart nisin molekülünün α-
kemotripsin ve proteinaz K enzimleri ile tamamen inaktive olmakta, ancak α-amilaz,
katalaz, lipaz, lizozim, pepsin ve tripsin enzimlerinden ise etkilenmemektedir
(Delves-Brougton, 1990; de Vuyst and Vandamme, 1994). Nisin molekülünün
çözünürlüğü, stabilitesi ve biyolojik aktivitesi ortam pH’sına göre değişmektedir.
Asidik ortamlarda nisinin çözünürlüğü artmakta ve bu nedenle inhibisyon etkinliği
yükselmektedir. Nisin molekülünün asidik ortamlarda çözünürlüğünün arttığı ve bu
nedenle inhibisyon etkinliğinin yükseldiği farklı araştırıcılar tarafından yürütülen
çalışmalarda da belirlenmiştir (Olasupo et al., 1999; Noonpakdee et al., 2003;
Akçelik et al., 2006; Tuncer, 2009).
Liu ve Hansen (1990), tarafından yapılan çalışmada, nisin çözünürlüğünün pH 2’de
57 mg/mL, pH 6’da 1.5 mg/mL ve pH 8.5’de ise 0.25 mg/mL olduğu belirlenmiştir.
Nisin pH 2’de 115.6 ºC ısıl işleme dayanıklıdır. Ancak, aynı sıcaklık değerinde pH
5’de % 40 oranında ve pH 6.8’de ise % 90 oranında aktivitesini kaybetmektedir
(Tramer, 1966). Yapılan başka bir çalışmada ise, nisinin pH 2’de 121 ºC’de 15
dakika ısıl işleme dayanıklı olduğu belirlenmiştir (Vessoni Penna et al., 2005).
Konakçı etkinliğine ilave olarak pH, sıcaklık ve enzim muamelelerine karşı
gösterdiği tam uyuşmaya göre Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen
bakteriyosin nisin olarak tanımlanmıştır (Franz et al., 1997; Ross et al., 1999;
McAulifee et al., 2001; Twomey et al., 2002; Liu et al., 2005; Akçelik et al., 2006;
Tuncer, 2009).
65
Çizelge 4.4. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin
aktivitesi üzerine farklı pH, enzim ve sıcaklık uygulamalarının etkisi
Bakteriyosin Aktivitesi (AU/mL)
Muamele GYL32* SIK83**
Kontrol 5120 5120
pH 2 10240 10240
pH 3 10240 10240
pH 4 10240 10240
pH 5 5120 5120
pH 6 5120 5120
pH 7 5120 5120
pH 8 5120 5120
pH 9 2560 2560
pH 10 640 640
pH 11 320 320
Proteinaz K 0 0
Tripsin 5120 5120
α-Kemotripsin 0 0
Pepsin 5120 5120
α –Amilaz 5120 5120
Lipaz 5120 5120
Katalaz 5120 5120
Lizozim 5120 5120
100 ˚C’de 5 dakika 5120 5120
100 ˚C’de 10 dakika 5120 5120
100 ˚C’de 15 dakika 5120 5120
100 ˚C’de 20 dakika 5120 5120
*GYL32: Lc. lactis subsp. lactis GYL32
**SIK83: Lc. lactis subsp. lactis SIK83 (nisin üreticisi)
66
4.7. Bakteriyosin Yapısal Genlerinin Belirlenmesi
Konakçı etkinliğinin yanı sıra farklı pH, enzim ve sıcaklık uygulamalarına karşı
gösterdiği tam uyuşmaya göre nisin üreticisi olduğu tespit edilen Lc. lactis subsp.
lactis GYL32 suşunda, nisin üretiminin genetik determinantı PZR yöntemi
kullanılarak araştırılmıştır. Nisin yapısal genlerinin çoğaltılmasında Lc. lactis subsp.
lactis GYL32 suşundan izole edilen plazmid ve genomik DNA örnekleri
kullanılmıştır.
Spesifik primerler kullanılarak yürütülen PZR denemeleri sonucunda, GYL32
suşunun genomik DNA’sı üzerinde yaklaşık 1060 bç’lik nisin genine özgül
bölgelerin çoğaltılması sağlanmıştır. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun plazmid
DNA örnekleri üzerinde yürütülen PZR çalışmalarında ise, söz konusu suşun
plazmidlerinde nisin genine özgül herhangi bir bölgenin çoğaltılmadığı tespit
edilmiştir (Şekil 4.7.).
Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunda spesifik nisin primerleri kullanılarak
çoğaltılan PZR ürününün DNA dizi analizi ABI PRISM 3730 XL (Perkin Elmer,
ABD) otomatik gen sekans cihazı kullanılarak tespit edilmiştir (REFGEN, Ankara).
BLAST programı kullanılarak yapılan DNA dizi benzerliği çalışması sonucu, PZR
ürünün nisin Z yapısal geni ile % 100 oranında uyum gösterdiği tespit edilmiştir
(Şekil 4.8.). PZR denemesi ve sekans analiz sonuçları, Lc. lactis subsp. lactis GYL32
suşu tarafından üretilen bakteriyosinin nisin Z olduğuna kesinlik kazandırmıştır.
Bu güne kadar yapılan çalışmalarda Lc. lactis subsp. lactis suşlarının nisin A (Gross
and Morell, 1971), nisin Z (Mulders et al., 1991), nisin Q (Zendo et al., 2003) ve
nisin F (de Kwaadsteniet et al., 2008) olmak üzere dört farklı nisin varyantı ürettiği
belirlenmiştir.
67
Şekil 4.7. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunda nisin yapısal geninin genomik ve
plazmid DNA kullanılarak PZR amplifikasyonu
1 Negatif kontrol
2 O’GeneRuler DNA Marker (bç) : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700,
600, 500, 400, 300, 200, 100
3 Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genomik DNA’sı
4 Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun plazmid DNA’sı
68
1
41
81
121
161
201
241
281
321
361
401
441
481
521
561
601
641
681
721
761
801
AAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATAGAT
AAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATAGAT
AAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATATTTATGGGGAG
GACAAGTGAACTTATCATGATTAATTGTAAACGATTGAGT
TCTGAATGTTTCAAATTATGAGGAACAACAGGAGTTGGAC
TATTCTTTAAACGCCTCGACGATACCATCACTCTTCATTAG
CCTAAAATTAACAAGTTAAAATCATTAGAATAATCTCTTTT
ACAAAAAATATTTATTTAAGTTATAGTTGACGAATATTTAA
TAATTTTATTAATATCTTGATTTTCTAGTTCCTGAATAATA
TAGAGATAGGTTTATTGAGTCTTAGACATACTTGAATGAC
CTAGTCTTATAACTATACTGACAATAGAAACATTAACAAA
TCTAAAACAGTCTTAATTCTATCTTGAGAAAGTATTGGTA
ATAATATTATTGTCGATAACGCGAGCATAATAAACGGCTC
TGATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAATGATTTCGTTC
GAAGGAACTACAAAATAAATTATAAGGAGGCACTCAAAAT
GAGTACAAAAGATTTTAACTTGGATTTGGTATCTGTTTCG
AAGAAAGATTCAGGTGCATCACCACGCATTACAAGTATTT
CGCTATGTACACCCGGTTGTAAAACAGGAGCTCTGATGGG
TTGTAACATGAAAACAGCAACTTGTAATTGTAGTATTCAC
GTAAGCAAA TAACCAAATCAAAGGATAGTATTTTGTATCT
CAAAAAT
Şekil 4.8. Nisin primerleri ile Lc. lactis subsp. lactis GYL32 genomunda çoğaltılan
gen bölgesi
Altı çizigi bölge nisin Z yapısal genini göstermektedir (nisZ)
69
4.8. Hücre Liziz
Hücre liziz denemelerinde, Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun steril nötralize
kültür üst sıvısından (5120 AU/mL) 20 mL alınarak erken gelişme fazına kadar
geliştirilen Lb. plantarum LMG2003 kültürüne (100 mL) ilave edilmiş ve kültürün
optik yoğunluğu 9 saat boyunca ölçülmüştür. Nötralize edilmiş kültür üst sıvısının
ilave edilmesini takip eden ilk 1 saatin sonunda Lb. plantarum LMG2003 kültürünün
optik yoğunluğu (600 nm) 0.054 değerinden 0.044 seviyesine ve ikinci saatin
sonunda ise kültür yoğunluğunun 0.021 değerine düştüğü belirlenmiştir. Daha
sonraki ölçümlerde ise Lb. plantarum LMG2003 kültürünün gelişiminin tamamen
durduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.9.).
Bakteriyosin
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Zaman (saat)
OD
(60
0 nm
)
Şekil 4.9. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin Lb.
plantarum LMG2003 suşunun gelişmesi üzerine etkisi. Bakteriyosin ilave edilmemiş
(●) ve bakteriyosin ilave edilmiş (∆). Ok aktif bakteriyosin içeren nötralize edilmiş
steril kültür üst sıvısının ilave edildiği noktayı göstermektedir
70
Daha önce yapılan çalışmalarda da nisinin güçlü bakterisidal etki gösterdiği ve
duyarlı hücreleri kısa bir süre içinde inhibe ettiği tespit edilmiştir. Mattick ve Hirsch
(1947), 150 IU/mL düzeyinde nisin ilave edilmiş Streptococcus agalactiae
kültürünün 10-15 dakika gibi kısa bir sürede inhibe olduğunu belirlemişlerdir.
Benzer olarak Ogden ve Waites (1986), nisin ile muamele edilmiş Lactobacillus
suşlarının kısa sürede inhibe olduklarını tespit etmişlerdir. Yapılan bir diğer
çalışmada ise, Bozadan izole edilen Lc. lactis subsp. lactis YBD11 suşu tarafından
üretilen nisin benzeri bakteriyosinin Micrococcus luteus kültürü üzerine bakterisidal
etki gösterdiği belirlenmiştir (Tuncer and Özden, 2010).
4.9. Bakteriyosin Üretimi
Bakteriyosin üretiminin belirlenmesi amacıyla 30 ºC’de 18 saat geliştirilen aktif Lc.
lactis subsp. lactis GYL32 kültüründen 100 mL M17 broth ortamına % 1 oranında
ekim yapılmış ve 30 ºC’de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi boyunca
kültürden birer saat aralıklarla aseptik koşullarda örnek alınmış ve optik yoğunluğu
ve bakteriyosin aktivitesi ölçülmüştür. Yapılan ölçümler sonucu Lc. lactis subsp.
lactis GYL32 suşunun inkübasyonun 2. saati sonunda 40 AU/mL düzeyinde
bakteriyosin ürettiği tespit edilmiştir. İnkübasyonun ilerleyen saatlerinde,
bakteriyosin aktivitesinin hücre yoğunluğunun artışına paralel olarak yükseldiği
belirlenmiştir. En yüksek bakteriyosin aktivitesi (5120 AU/mL) kültür yoğunluğunun
1.747 değerine ulaştığı 8. saatin sonunda tespit edilmiştir (Şekil 4.10.). Bakteriyosin
üretiminin gelişme fazında başlamış ve gelişme fazının sonunda maksimum seviyeye
ulaşmış olması Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin
primer metabolit kinetiğine sahip olduğuna işaret etmektedir.
De Vuyst ve Vandamme (1992), Lc. lactis subsp. lactis NIZO22186 suşunda nisin
üretiminin bakteriyel gelişme ile arttığını ve maksimum nisin üretimine gelişme
fazının sonunda ulaşıldığını belirtmişlerdir. Tez çalışmasında elde edilen sonuçlara
benzer olarak Lc. lactis subsp. lactis NIZO22186 suşunda nisin üretiminin primer
metabolit kinetiğine sahip olduğunu belirtmişlerdir. Farklı araştırıcılar tarafından
yapılan çalışmalarda da nisin biyosentezinin gelişme fazında gerçekleştiği ve
71
hücrelerin durma fazına girdiği zaman nisin biyosentezinin tamamen durduğu tespit
edilmiştir (van der Meer et al., 1993; Kim et al., 1997; Cheigh et al., 2002; Tuncer
and Özden, 2010).
Boza’dan izole edilen farklı bakteriyosin üreticisi suşların kullanıldığı çalışmalarda
da, Pediococcus acidilactici (Nieto-Lozano et al., 2002), Lactobacillus paracasei
subsp. paracasei M3 (Atanasovva et al., 2003), Pediococcus pentosaceus ST18
(Todorov and Dicks, 2005) Lactobacillus plantarum ST194BZ (Todorov and Dicks,
2006) ve Lc. lactis subsp. lactis BZ (Şahingil et al., 2010) suşları tarafından üretilen
bakteriyosinlerin primer metabolit kinetiğine sahip oldukları saptanmıştır.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Zaman (saat)
Bak
teriy
osin
Akt
ivite
si (
AU
/mL
)
0
0.5
1
1.5
2
OD
(60
0 nm
)
Şekil 4.10. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından bakteriyosin üretimi ve
kültür yoğunluğundaki değişim (●)
72
4.10. Trisin-Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (Trisin-SDS-
PAGE)
Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin moleküler
büyüklüğü, trisin-sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (trisin-SDS-
PAGE) sisteminde belirlenmiştir. Amonyum sülfat (% 40) kullanılarak kısmi
saflaştırması yapılan Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun kültür üst sıvısının
trisin-SDS-PAGE analizi sonucu moleküler büyüklükleri 49.3, 46.8, 45.3, 38.1, 10.8
ve 6.7 kDa olan 6 protein bantı içerdiği belirlenmiştir (Şekil 4.5.).
Trisin-SDS-PAGE sistemi ile elde edilen jelde aktif protein bantının (antibakteriyel
aktivite gösteren) belirlenmesi amacıyla jel üzerine Lb. plantarum LMG2003
indikatör bakteri olarak yayılmış ve 37 ºC’de 18 saat inkübasyona bırakılmıştır.
İnkübasyon süresi sonunda yaklaşık 6.7 kDa büyüklüğe sahip olan bant etrafında
inhibisyon zonu meydana geldiği belirlenmiştir (Şekil 4.12.). Bu sonuç antibakteriyel
aktiviteden 6.7 kDa büyüklüğe sahip olan proteinin (bakteriyosin) sorumlu olduğunu
göstermiştir.
Yapılan çalışmalar nisin monomerinin moleküler ağırlığının yaklaşık 3350 Da
olduğunu göstermiştir. Ancak, nisin üretim ortamlarında sadece monomer halinde
değil dimer (6700 Da) veya tetramer (13400 Da) halinde de bulunabilmektedir (Liu
and Hansen, 1990). Değişik araştırmalarda, üretim ortamlarından ekstrakte edilerek
hazırlanan preparatlar üzerinde yürütülen analizler, çeşitli Lactococcus lactis suşları
tarafından üretilen nisinin çoğunlukla monomer halinde bulunduğunu göstermiştir
(Gross and Morell, 1967; Gross, 1977; Mulders et al., 1991, Akçelik et al., 2006;
Tuncer, 2009). Yapılan tez çalışmasında, üretim ortamından ekstrakte edilerek kısmi
saflaştırması yapılan bakteriyosinin 6.7 kDa moleküler büyüklüğe sahip olması, Lc.
lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen nisin Z’nin dimer halinde
bulunduğuna işaret etmektedir.
73
Şekil 4.11. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin
trisin-sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez profili
1 Protein marker (kDa) : 42.0, 26.0, 17.0, 10.0, 4.6, 1.7
2 GYL32* (kDa) : 49.3, 46.8, 45.3, 38.1, 10.8, 6.7
3 Protein marker ** (kDa) : 42.0, 26.0, 17.0, 10.0, 4.6, 1.7
4 GYL32** (kDa) : 6.7
*GYL32: Lc. lactis subsp. lactis GYL32
* *Jelin üstüne üst tabaka olarak Lb. plantarum LMG2003 suşu dökülmüştür
74
5. SONUÇ
1. Araştırma kapsamında Bozadan izole edilen nisin Z üreticisi Lc. lactis subsp.
lactis GYL32 suşu farklı fermente gıdaların üretiminde biyokoruyucu olarak
kullanım potansiyeli taşımaktadır.
2. Nisin Z üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun laktik asit üretimi,
proteolit aktivite ve faj dirençlilik özellikleri bundan sonra yapılacak
çalışmalarda belirlenerek söz konusu suşun starter kültür olarak kullanım
potansiyeli araştırılmalıdır.
3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun pilot üretim tesislerinde denenmesi
suretiyle endüstriyel boyutta üretim sırasında metabolik karakterlerin stabilitesi
test edilmelidir.
75
6. KAYNAKLAR
Akçelik, O., Tükel, Ç., Özcengiz, G., Akçelik, M., 2006. Characterization of
bacteriocins from two Lactococcus lactis subsp. lactis isolates. Molecular
Nutrition & Food Research, 50, 306-313.
Anderson, D.G., McKay, L.L., 1983. A simple and rapid method for isolating large
plasmid DNA from lactic streptococci. Applied and Environmental
Microbiology, 46, 549-552.
Atanassova, M., Choiset, Y., Delgalarrondo, M., Chobert J-M., Dousset X., Ivanova,
I., Haertlé, T., 2003. Isolation and partial biochemical characterization of a
proteinaceous anti-bacterial and anti-yeast compound produced by
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei M3. International Journal of Food
Microbiology, 87, 63-73.
Axelsson, L., 1998. Lactic acid bacteria: classification and physiology. In: Lactic
Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects 2nd Edition. (Salminen,
S. and von Wright, A. -eds) Marcel Dekker Inc., pp. 1-72, New York.
Bardowski, J., Kozak, W., Dobrzanski, W.T., 1979. Further characterization of
lactostrepcins-acid bacteriocin of lactic streptococci. Acta Microbiologica
Polonica, 28, 93-99.
Ben Amor, K., Vaughan, E.E., de Vos, W.M., 2007. Advanced molecular tools for
the identification of lactic acid bacteria. Journal of Nutrition, 741-747.
Boumerdassi, H., Monnet, C., Desmazeaud, M., Corrieu, G., 1997. Isolation and
properties of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis CNRZ 483
mutants producing diacetyl and acetoin from glucose. Applied and
Environmental Microbiology, 63, 2293-2299.
Breukink, E., de Kruijff B., 2006. Lipid II as target for antibiotics. Nature Reviews
Drug Discovery. 1-11.
Breukink, E., van Heusden, H.E., Vollmerhaus, P.J., Swiezewska, E., Brunner, L.,
Walker, S., Heck, A.J., de Kruijff, B., 2003. Lipid II is an intrinsic
component of the pore induced by nisin in bacterial membranes. Journal
Biological Chemistry, 278, 19898-19903.
76
Breukink, E., van Kraaij, C., Demel, R.A., Siezen, R.J., Kuipers, O.P., de Kruijff, B.,
1997. The C-terminal region of nisin responsible for the initial interaction of
nisin with the target membrane. Biochemistry, 36, 6968-6976.
Breukink, E., Wiedemann, I., van Kraaij, C., Kuipers, O.P., Sahl, H., de Kruijff B.,
1999. Use of the cell wall precursor lipid II by a pore-forming peptide
antibiotic. Science 286, 2361–2364.
Brown, E.W., 2001. Molecular differentiation of bacterial strains. In: Molecular
Epidomilogy. (Carrington, M. and Rus Hoelzel, A. -eds.) Oxford University
Pres, pp. 29-66, Oxford UK.
Buchman, G.W., Banerjee, S., Hansen, J.N., 1988. Structure, xpression, and
evolution of a gene encoding the precursor of nisin, a small protein peptide.
Journal of Biological Chemistry, 263, 6260-6266.
Cai, Y., Yang, J., Pang, H., Kitahara, M., 2010. Lactococcus fujiensis sp nov., a
lactic acid bacterium isolated from vegetable. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, (in press).
Campbell, R.C., 1974. Statistics for Biologists. Cambridge University Press, Second
Edition, 385 p.
Cancilla, M.R., Powell, I.B., Hillier, A.J., Davidson, B.E., 1992. Rapid genomic
fingerprinting of Lactococcus lactis strains by arbitrarily primed polymerase
chain reaction with 32P and fluorescent labels. Applied and Environmental
Microbiology, 58, 1772-1775.
Cao, L.T., Wu, J.Q., Xie, F., Hu, S.H., Mo, Y., 2007. Efficacy of nisin in treatment
of clinical mastitis in lactating dairy cows. Journal of Dairy Science, 90,
3980-3985.
Casalta, E., Montel, M.C., 2008. Safety assessment of dairy microorganisms: The
Lactococcus genus. International Journal of Food Microbiology 126, 271–
273.
Cheigh, C.I., Choi, H.J., Park, H., Kim, S.B., Kook, M.C., Kim, T.S., Hwang, J.K.,
Pyun, Y.R., 2002. Influence of growth conditions on the production of a
nisin-like bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. lactis A164 isolated from
kimchi. Journal of Biotechnology, 95, 225-235.
77
Chen, H., Hoover, D.G., 2003. Bacteriocins and food applications. Comprehensive
Reviews in Food Science and Food Safety, 2, 82-100.
Chen, H-C., Wang, S-Y., Chen, M-J., 2008. Microbiological study of lactic acid
bacteria in kefir grains by culture-dependent and culture-independent
methods. Food Microbiology, 25, 492–501
Cho, S-L., Nam, S-W., Yoon, J-H., Lee, J-S., Sukhoom, A., Kim, W., 2008.
Lactococcus chungangensis sp. nov., a lactic acid bacterium isolated from
activated sludge foam. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 58, 1844-1849.
Chung, W., Hancok. 2000. REW. Action of lysozyme and nisin mixtures against
lactic acid bacteria. Inernational Jorunal of Food Micribiyology. 60,25-32.
Cintas, L.M., Casaus M.P., Hérranz C., Nes I.F., Hernández P.E., 2001. Bacteriocins
of lactic acid bacteria. Food Science and Technology International, 7, 281-
305.
Condo, S., 1987. Responses of lactic acid bacteria to oxygen. FEMS Microbiology
Reviews, 46, 269-280.
Cotter, P.D., Colin, H., Ross, R.P., 2005. Bacterial lantibiotics: strategies to improve
therapeutic potential. Current Protein and Peptide Science, 6, 61-75.
Dağdemir, E., Özdemir S., 2008. Technological characterization of the natural lactic
acid bacteria of artisanal Turkish White Picled cheese. International Journal
of Dairy Technology, 61, 133-140.
Dağlıoğlu, O., Arıcı M., Konyalı, M., Gümüş, T., 2002. Effects of tarhana
fermentation and drying methods on the fate of Escherichia coli O157:H7
and Staphylococcus aureus. European Food Research & Technology, 215,
515-519.
Davey, G.P., 1984. Plasmid associated with diplococcin production in Streptococcus
cremoris. Applied and Environmental Microbiology, 48, 895-896.
Davey, G. P. and Richardson, B. C. 1981. Prufication and some properties of
diplococsin from Streptococcus cremoris 346. Applied and Environmental
Microbiology, 41,84-89.
Davies, F.L., Underwood, H.M., Gasson, M.J., 1981. The value of plasmid profiles
for strain identification between Streptococci and the relationship between
78
Streptococcus and lactic acid bacteria. Journal of Applied Bacteriology, 51,
325-338.
De Arauz, L., Jozola, A., Mazzola, P., Pena, T., 2009. Nisin biotechnological
production and application. Trends in Food Science & Technology, 20, 146-
154.
De Kwaadsteniet, M., ten Doeschate, K., Dicks, L.M.T., 2008. Characterization of
the structural gene encoding nisin F, a new lantibiotic produced by a
Lactococcus lactis subsp. lactis isolate from freshwater catfish (Clarias
gariepinus). Applied and Environmental Microbiology, 74, 547–549.
De Lima Girisi, T.C.S., Lira, K.G., 2005. Action of nisin and high pH on growth of
Staphylococcus aureus and Salmonella sp. in pure culture and in the meat of
land crab (Ucıdes Cordatus). Brazilian Journal of Microbiology, 36, 151-156.
De Ruyter, P.G., Kuipers, O.P., de Vos, W.M., 1996. Controlled gene expression
systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Applied and
Environmental Microbiology, 62, 3662-3667.
De Vuyst, L., Leroy, F., 2007. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production,
purification, and food applications. Journal of Molecular Microbiology and
Biotechnology, 13, 194–199.
De Vuyst, L., Vandamme, E.J., 1992. Influence of the carbon source on nisin
production in Lactococcus lactis subsp. lactis batch fermentations. Journal of
General Microbiology 138, 571-578.
De Vuyst, L., Vandamme, E.J., 1994. Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria.
Microbiology, Genetics and Applications. Chapman and Hall, New York, 539
p.
Deegan, L.H., Cotter, P.D., Hill, C., Ross, P., 2006. Bacteriocins: biological tools for
bio-preservation and shelf-life extension. International Dairy Journal, 16,
1058-1071.
Delves-Broughton, J., 1990. Nisin and its application as a food preservative. Journal
of the Society of Dairy Technology, 43, 73-76.
Delves-Broughton, J., 2005. Nisin as a food preservative. Food Australia, 57, 525-
527.
79
Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R.J., Hugenholtz, J., 1996. Applications
of the bacteriocin, nisin. Antonie van Leeuwenhoek, 69, 193-202.
Demel, R.A., Peelen, T., Siezen, R.J., de Kruijff, B., Kuipers, O.P., 1996. Nisin Z,
mutant nisin Z and lacticin 481 interactions with anionic lipids correlate with
antimicrobial activity. A monolayer study. European Journal of Biochemistry,
235, 267-274.
Devlieghere, F., Vermeiren, L., Debevere, J., 2004. New preservation technologies:
possibilities and limitations. International Dairy Journal, 14, 273-285.
Diep, D.B., Nes, I.F., 2002. Ribosomally synthesized antibacterial peptides in Gram
positive bacteria. Current Drug Targets, 3, 107-122.
Diep, D.B., Skaugen, M., Salehian, Z., Holo, H., Nes, I.F., 2007. Common
mechanisms of target cell recognition and immunity for class II bacteriocins.
Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), 104, 2384-2389.
Dieye, Y., Usai, S., Clier, F., Gruss, A., Piard, J.C., 2001. Design of a protein
targeting system for lactic acid bacteria. Journal of Bacteriology, 183, 4157-
4166.
Dodd, H.M., Horn, N., Gasson, M.J., 1990. Analysis of the genetic determinant for
production of the peptide antibiotic nisin. Journal of General Microbiology,
136, 555-566.
Dougherty, B.A., Hill, C., Weldman, J.F., Richardson D.R., Venter, J.C., Ross, R.P.,
1998. Sequence and analysis of the 60 kb conjugative bacteriocin producing
plasmid pMRC01 from Lactococcus lactis DPC3147. Molecular
Microbiology, 29, 1029-1038.
Durlu-Özkaya, F., Xanthopoulos, V., Tunail, N., Litopoulou-Tzanetaki, E. 2001.
Technologically important properties of lactic acid bacteria isolates from
Beyaz cheese made from raw ewes’ milk. Journal of Applied Microbiology,
91, 861-870.
Edwards, U., Rogall, T., Blocker, H., Emde, M., Bottger, E.C., 1989, Isolation and
direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of
a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Research, 17, 7843-
7853.
80
Elder, J.K., Amos, A., Southern, E.M., Shippey, G.A., 1983. Measurement of DNA
length by gel electrophoresis (I). Analytical Biochemistry, 128, 223-226.
Elder, J.K., Southern, E.M., 1983. Measurement of DNA length by gel
electrophoresis (II): comparison of methods for plating mobility of fragment
length. Analytical Biochemistry, 170, 38-44.
Engelke, G., Gutochowski-Eckel, Z., Hammelman, M., Entian, K.D., 1994.
Regulation of nisin biosynthesis and immunity in Lactococcus lactis 6F3.
Applied and Environmental Microbiology, 60, 814-825.
Ennahar, S., Sashihara, T., Sonomoto, K., Ishizaki, A., 2000. Class IIa bacteriocins:
biosynthesis, structure and activity. FEMS Microbiology Reviews, 24, 85-
106.
FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. 1969. Specifi cations for identity
and purity of some antibiotics. Twelth Report. WHO Technical Report Series,
No. 430.
Ferchichi, M., Frere, J., Mabrouk, K., Manai, M., 2001. Lactococcin MMFII, a novel
class IIa bacteriocin produced by Lactococcus lactis MMFII, isolated from a
Tunisian dairy product. FEMS Microbiology Letters, 205, 49-55.
Franz, C.M.A.P., Du Toit, M., von Holy, A., Schillinger, U., Holzapfel,W.H., 1997.
Production of nisin-like bacteriocins by Lactococcus lactis strains isolated
from vegetables. Journal of Basic Microbiology, 37, 187-196.
Frengova, G.I., Simova, E.D., Beshkova, D.M., Simov, Z.I., 2002.
Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria of kefir grains.
Zeitschrift für Naturforschung, 57, 805-810.
Fujita, K., Ichimasa, S., Zendo, T., Koga, S., Yoneyama, S., Nakayama, J.,
Sonomoto, K., 2007.Structural analysis and characterization of Lacticin Q, a
novel bacteriocin belonging to a new family of unmodified bacteriocins of
Gram positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 73, 2871-
2877.
Gasson, M.J., Davies, F.L., 1984. The genetics of lactic acid bacteria. In: Advances
in Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk. (Davies,
F.L. and Law, B.A. -eds) Elsevier Applied Science Publishers, pp. 99-126.
New York.
81
Geis, A., Singh, J., Teuber, M., 1983. Potential of lactic Streptococci to produce
bacteriocin. Applied and Environmental Microbiology, 45, 205-211.
Ghrairi, T., Frére, J., Berjeaud, J.M., Mania, M., 2005. Lactococcin MMT24, a novel
two-peptide bacteriocin produced by Lactococcus lactis isolated from rigouta
cheese. International Journal of Food Microbiology, 105, 389-398.
Gillor, O., Nigro, L.M., Riley, M.A., 2005. Genetically engineered bacteriocins and
their potential as the next generation of antimicrobials. Current
Pharmaceutical Design, 11, 1-9.
González, B., Glaasker, E., Kunji, E.R.S., Driessen, A.J.M., Suárez, J.E., Konings,
W.N., 1996. Bactericidal mode of action of plantaricin C. Applied and
Environmental Microbiology, 62, 2701-2709.
Gotcheva, V., Pandiella, S. S., Angelov, A., Roshkova, V.G., Webb, C., 2000.
Microflora identification of the Bulgarian cereal-based fermented beverage
Boza. Process Biochemistry, 36, 127-130.
Gratia, A., 1925. Sur un remarquable exemple d’antagonisme entre deux souches de
colibacille. C.R. Seances Society of Biology. 93, 1040–1041.
Gratia, A., 1946. Techniques selectives pour la recherche systematique des germes
antibiotiques. C.R. Seances Society of Biology. 140, 1053-1055.
Gross, E., 1977. T, Q-unsaturated and related amino acids in peptides and proteins.
In: Protein Cross-Linking-B. (Fiedman, M. –eds.) Plenum, pp. 131-153, New
York.
Gross, E., Morell, J.L., 1967. The presence of dehydroalanine in the antibiotic nisin
and its relationship to activity. Jounal of American Chemistry Society, 89,
2791.
Gross, E., Morell, J.L., 1971. The structure of nisin. Jounal of American Chemistry
Society, 93, 4634-4635.
Güzel-Seydim, Z., Ekinci, F.Y., 2007. Bacteriocins of lactic acid bacteria. In:
Metabolism and Applications of Lactic Acid Bacteria. (Özer, B. -eds.)
Research Signpost, pp. 33-65, Krela, India.
Hancıoglu, Ö., Karapınar, M., 1997. Microflora of boza, a traditional fermented
Turkish beverage. International Journal of Food Microbiology, 35, 271-274.
82
Harrigan, F.W., McCance, E.M., 1966. Laboratory Methods in Microbiology.
Academic Pres London, 285 p, New York.
Hasper, H.E., de Kruijff, B., Breukink, E., 2004. Assembly and stability of nisin-lipid
II pores. Biochemistry. 43, 11567-11575.
Hill, C., Ross, R.P., 1998. Starter cultures for the dairy industry. In: Genetic
Modification in the Food Industry. (Roller, S. and Harlander, S. -eds.) pp.
256-274. Blackie Academic and Professonal, London.
Holo, H., Nilssen, Ø., Nes, I.F., 1991. Lactococcin A, a new bacteriocin from
Lactococccus lactis subsp. cremoris: isolation and characterization of the
protein and its gene. Journal of Bacteriology, 173, 3879-3887.
Holt, G.H., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T., 1994. Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology. Williams and Wilkins Co., Ninth
Edition, 787 p.
Hsu, S.T., Breukink, E., Tischenko, E., Lutters, M.A., de Kruijff, B., Kaptein, R.,
Bonvin, A.M., van Nuland, NA., 2004. The nisin-lipid II complex reveals a
pyrophosphate cage that provides a blueprint for novel antibiotics. Nature
Structural & Molecular Biology, 11, 963-967.
Hsu, S-T., Breukink, E., de Kruijff, B., Kaptein, R., Bonvin, A.M.J.J., van Nuland,
N.A.J., 2002. Mapping the targeted membrane pore formation mechanism by
solution NMR: the nisin Z and lipid II interaction in SDS micelles.
Biochemistry, 41, 7670-7878.
Hugenholtz, J., Starrenburg, M.J.C., 1992. Diacetyl production by different strains of
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis and Leuconostoc ssp.
Applied Microbiolgy and Biotechnology, 38, 17-22.
Immonen, T., Saris, P.E.J., 1998. Characterization of the nisFEG operon of the nisin
Z producing Lactococcus lactis subsp. lactis N8 strain. DNA Sequence, 9,
263-274.
Iwatani, S., Zendo, T., Yoneyama, F., Nakayama, J, Sonomoto, K., 2007.
Chracterizaion and structure analysis of a novel bacteriocin, Lacticin Z,
produced by Lactococcus lactis QU 14. Bioscience Biotechnology and
Biochemistry, 71(8), 1984-1992.
83
Jack, R.W., Tagg, J.R., Ray, B., 1995. Bacteriocins of gram positive bacteria.
Microbiology Reviews, 59, 171-200.
Jay, J.M., 1982. Antimicrobial properties of diacetyl. Applied and Environmental
Microbiology, 44, 525-532.
Jeevaratnam, K., Jamuna, M., Bawa A.S., 2005. Biological preservation of foods-
Bacteriocin of lactic acid bacteria. Indian Journal of Biotechnology, 4, 446-
454.
Kékessy D.A., Piguet, J.D., 1970. New method for detecting bacteriocin production.
Applied and Environmental Microbiology, 20, 282-283.
Kim, W.S., Hall, R.J., Dunn, N.W., 1997. The effect of nisin concentration and
nutrient depletion on nisin production of Lactococcus lactis. Applied
Microbiology and Biotechnology, 48, 449-453.
Klaenhammer, T. R., 1993. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria.
FEMS Microbiology Reviews, 12, 39-86.
Klaenhammer, T.R., McKay, L.L., Baldwin, K.A., 1978. Improved lysis of group N
streptococci for isolation and rapid characterization of plasmid DNA. Applied
and Environmental Microbiology, 35, 592.
Klostermann, K., Crispie, F., Flynn, J., Meaney, W.J., Ross, R.P., Hill, C., 2010.
Efficacy of a teat dip containing the bacteriocin lacticin 3147 to eliminate
Gram-positive pathogens associated with bovine mastitis. Journal of Dairy
Research, 77, 231-238.
Kojić, M., Lozo. J., Begović, J., Jovčić, B., Topisirović. L.J., 2007. Characterization
of Lactococci isolated from homemade kefir. Archives of Biological
Sciences, 59, 13-22.
Kozak, W., Bardowski, J., Dobrzanski, W.T., 1977. Lactostrepcin-a bacteriocin
produced by Streptococcus lactis. Bulletin Academy Polish Science Cl., 25,
217-221.
Kozak, W., Bardowski, J., Dobrzanski, W.T., 1978. Lactostrepcins-acid bacteriocins
produced by lactic streptococci. Journal of Dairy Research, 45, 247-257.
Kuhl, S.A., Larsen, L.D., McKay, L.L., 1979. Plasmid profiles of lactose-negative
and proteinase-deficient mutants of Streptococcus lactis C10, ML3 and M18.
Applied and Environmental Microbiology, 37, 1193-1195.
84
Kuipers, O.P., Beerthuyzen, M.M., De Ruyter, P.G.G.A., Luesink, E.J., De Vos,
W.M., 1995. Autoregulation of nisin biosynthesis in Lactococcus lactis by
signal transduction. Journal Biological Chemistry, 270, 27299-27304.
Li, H., O’Sullivan, D.J., 2006. Identification of a nisI promoter within the
nisABCTIP operon that may enable establishment of nisin immunity prior to
induction of the operon via signal transduction. Journal of Bacteriology, 188,
8496–8503.
Liu, C.Q., Dunn, N.W., Duan, K., 1997. Cloning and sequence analysis of a plasmid
replicon from Lactococcus lactis subsp. cremoris FG2. Journal of General
Microbiology, 43, 75-80.
Liu, C.Q., Su, P., Khunajakr, N., Deng, Y.M., Sumual, S., Kim, W.S., Tandianus,
J.E., Dunn, N.W., 2005. Development of food-grade cloning and expression
vectors for Lactococcus lactis. Journal of Applied Microbiology, 98, 127-
135.
Liu, W., Hansen, J.N., 1990. Some chemical and physical properties of nisin, a small
protein antibioic produced by Lactococcus lactis. Applied and Environmental
Microbiology, 56, 2551-2558.
Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G.N., Kuipers, O.P., 2008. Biosynthesis,
immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic
nisin. Cellular and Molecular Life Sciences, 65, 455-476.
Lucey, M., Daly, C., Fitzgerald, G.F.,1993. Relationship between Lactococcus lactis
subsp. lactis 952, and industrial lactococcal starter culture and strains 712,
ML3 and C2. Journal of Applied Bacteriology, 75, 326-335.
Mackay, V.C., Arendse, G., Hastings, J.W., 1996. Purification of bacteriocins of
lactic acid bacteria: problems and pointers. International Journal of Food
Microbiology, 34, 1-16.
Macrina, F.L., Kopecko, D.J., Jones, K.R., Ayers, D.S., McCoven, S.M., 1978. A
multiple plasmid containing Escherichia coli strain: convenient source of size
reference plasmid molecules. Plasmid, 1, 417-420.
Macrina, F.L., Tobian, J.A., Jones, K.R., Evans, R.P., Clewell, D.B., 1982. A cloning
vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sangius. Gene,
19, 345-353.
85
Mao, Y., Muriana, P.M., Cousin, M.A., 2001. Purification and transpositional
inactivation of Lacticin FS92, a broad-spectrum bacteriocin produced by
Lactococcus lactis FS92. Food Microbiology, 18, 165-175.
Martín, M.G., Sender, P.D., Peirú, S., de Mendoza, D., Magni, C., 2004. Acid-
inducible transcription of the operon encoding the citrate lyase complex of
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis CRL264. Journal of
Bacteriology, 186, 5649-5660.
Martinez, B., Fernandez, M., Rodriguez, A., Suárez, J.E., 1999. Synthesis of
lactococcin 972, a bacteriocin produced by Lactococcus lactis IPLA 972,
depends on the expression of a plasmid-encoded bicistronic operon.
Microbiology, 145, 3155-3161.
Martinez, B., Suárez, J.E., Rodriguez, A., 1996. Lactococcin 972, a homodimeric
lactococcal bacteriocin whose primary target is not the plasma membrane.
Microbiology, 142, 2393-2398.
Mattick, A.T.R., Hirsch, A., 1947. Further observation on an inhibitor (nisin) from
lactic streptococci. Lancet, 2, 5-7.
McAuliffe, O., Hill, C., Ross, R.P., 1999 . Inhibition of Listeria monocytogenes in
cottage cheese manufactured with a lacticin 3147-producing starter culture.
Journal of Applied Microbiology, 86, 251-256.
McAuliffe, O., Hill, C., Ross, R.P., 2000. Each peptide of the two-component
lantibiotic lacticin 3147 requires a separate modification enzyme for activity.
Microbiology, 146, 2147-2154.
McAuliffe, O., Ross, R.P., Hill, C., 2001. Lantibiotics: structure, biosynthesis and
mode of action. FEMS Microbiology Reviews, 25, 285-308.
McAuliffe, O., Ryan, M.P., Ross, R.P., Hill, C., Breeuwer, P., Abee, T., 1998.
Lacticin 3147, a broad-spectrum bacteriocin which selectively dissipates the
membrane potential. Applied and Environmental Microbiology, 64, 439-445.
McKay, L.L., 1983. Functional properties of plasmids in lactic streptococci. Antonie
van Leeuwenhoek, 49, 259-274.
Millette, M., Smoragiewicz, W., Lacroix, M., 2004. Antimicrobial potential of
immobilized Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 against selected
bacteria. Journal of Food Protection, 67, 1184-1189.
86
Moll, G., Ubbink-Kok, T., Hildeng-Hauge, H., Nissen-Meyer, J. Nes, I. F., Konings,
W.N., Driessen, A.J.M., 1996. Lactococcin G is a potassium ion-conducting,
two-component bacteriocin. Journal of Bacteriology, 178, 600-605.
Moreno, M.R. Foulquie., Callewaert, R., Devreese, B., Van Beeumen, J., De Vuyst,
L., 2003. Isolation and biochemical characterisation of enterocins produced
by enterococci from different sources. Journal of Applied Microbiology, 94,
214–229.
Morgan, S.M., O’Connor, P.M., Cotter, P.D., Ross, R.P., Hill C., 2005. Sequential
Actions of the Two Component Peptides of the Lantibiotic Lacticin 3147
Explain Its Antimicrobial Activity at Nanomolar Concentrations.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49, 2606–2611.
Morita, H., Kamizono, K., Nakamura, S., Fujita, Y., Sakata, R., Nagata, Y., McKay,
L.L., 1997. Cloning of citrate permease gene of Lactococcus lactis subsp.
lactis biovar. diacetylactis NIAI N-7 and expression in citrate-negative
lactococci. Milchwissenschaft, 52, 138-141.
Morris, S., Walsh, R.C., Hansen, J.N., 1984. Identification and characterization of
some bacterial membrane sulfhydryl groups which are targets of
bacteriostatic and antibiotic action. Journal of Biological Chemistry, 259,
13590-13594.
Mulders, J.W.M., Boerrigter, I.J., Rollema, H.S., Siezen, R.J., De Vos, W.M., 1991.
Identification and characterization of the lantibiotic nisin Z, a natural nisin
variant. European Journal of Biochemistry, 201, 581-584.
Nes, I.F., Holo, H., 2000. Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria.
Biopolymers, 55, 50-61.
Nettles, C.G., Barefoot, S.F., 1993. Biochemical and genetic characterization of
bacteriocins of food-associated lactic acid bacteria. Journal of Food
Protection, 56, 338-356.
Nieto-Lozano, J.C., Reguera-Useros J.I., Pelaez-Martinez M.C., de la Torre, A.H.,
2002. Bacteriocinogenic Activity From Starter Culture Used In Spanish Meat
Industry. Meat Science, 62, 237-243.
87
Nissen-Meyer, J., Holo, H., Havarstein, L.S., Sletten, K., Nes, I.F.,1992. A novel
lactococcal bacteriocin whose activity depends on the complementary action
of two peptides. Journal of Bacteriology, 174, 5686-5692.
Noonpakdee, W., Santivarangkna, C., Jumriangrit, P., Sonomoto, K., Panyim, S.,
2003. Isolation of nisin-producing Lactococcus lactis WNC 20 strain from
nham, traditional Thai fermented sausage. International Journal of Food
Microbiology, 81, 137-145.
O’Sullivan, L., Morgan, S.M., Ross, R.P., Hill, C., 2002. Elevated enzyme release
from lactococcal starter cultures on exposure to the lantibiotic lacticin 481,
produced by L. lactis DPC5552. Journal of Dairy Science, 85, 2130-2140.
O’Sullivan, L., Ross, R.P., Hill, C., 2003b. A lacticin 481-producing adjunt culture
increases starter lysis while inhibiting nonstarter lactic acid bacteria
proliferation during Cheddar cheese ripening. Journal of Applied
Microbiology, 95, 1235-1241.
O’Sullivan, L., Ryan, M.P., Ross, R.P., Hill, C., 2003a. Generation of food-grade
lactococcal starters which produce the lantibiotics lacticin 3147 and lacticin
481. Applied and Environmental Microbiology, 69, 3681-3685.
Ogden, K., Waites, M.J., 1986. The action of nisin on beer spoilage lactic acid
bacteria. Journal of Institute Brewing, 92, 463-467.
Olasupo, N.A., Schillinger, U., Narbad, A., Dodd, H., Holzapfel, W.H., 1999.
Occurrence of nisin Z production in Lactococcus lactis BFE 1500 isolated
from wara, a traditinol Nigerian cheese product. International Journal of Food
Microbiology, 53, 141-152.
Özden, B., Akçelik, M., 2008. Genetic analysis of bacteriocin production ability and
phage adsorption type resistance system in six Lactococcus lactis strains.
Acta Alimentaria, 37, 169-179.
Özer, B., 2007. Metabolism and Applications of Lactic Acid Bacteria. Research
Signpost, Kerala, India, 197 p.
Özkalp, B., Özden, B., Tuncer, Y., Şanlıbaba, P., Akçelik, M. 2007. Technological
characterization of wild-type Lactococcus lactis strains isolated from raw
milk and traditional fermented milk products in Turkey. Lait, 87, 521-534.
88
Pathanibul, P., Taylor, T.M., Davidson, P.M., Harte, F., 2009. Inactivation of
Escherichia coli and Listeria innocua in apple and carrot juices using high
pressure homogenization and nisin. International Journal of Food
Microbiology, 129, 316-320.
Patton, G.C., van der Donk, W.A., 2005. New developments in lantibiotic
biosynthesis and mode of action. Current Opinion in Microbiology, 8, 543-
551.
Piard, J.C., Delorme, F., Giraffa, G., Commissaire, J., Desmazeaud, M., 1990.
Evidence for a bacteriocin produced by Lactococcus lactis CNRZ 481.
Netherlands Milk and Dairy Journal, 44, 143-158.
Piper, C., Draper, L.A., Cotter, P.D., Ross, R.P., Hill, C., 2009. A comparison of the
activities of lacticin 3147 and nisin against drug-resistant Staphylococcus
aureus and Enterococcus species. Journal of Antimicrobial Chemotherapy,
64, 546–551
Pu, Z.Y., Dobos, M., Limsowtin, G.K.Y., Powell, I.B., 2002. Integrated polymerase
chain reaction-based procedures fort he detection and identification of species
and subspecies of the Gram-positive bacterial genus Lasctococcus. Journal of
Applied Microbiology, 93, 353-361.
Qiao, M., Ye, S., Koponen, O., Ra, R., Usabiaga, M., Immonen, T., Saris, P.E., 1996.
Regulation of the nisin operons in Lactococcus lactis N8. Journal of Applied
Bacteriology, 80, 626-634.
Ra, S.R., Qiao, M., Immonen, T., Pujana, I., Saris, E.J., 1996. Genes responsible for
nisin synthesis, regulation and immunity form a regulon of two operons and
are induced by nisin in Lactococcus lactis N8. Microbiology, 142, 1281-
1288.
Rauch, P.J.G., De Vos, W.M., 1992. Characterization of the novel nisin-sucrose
conjugative transposon Tn5276 and its integration in Lactococcus lactis.
Journal of Bacteriology, 174, 1280-1287.
Reunanen, J., 2007. Lantibiotic nisin and its detection methods. Department of
Applied Chemistry and Microbiology Division of Microbiology Faculty of
Agriculture and Forestry and Viikki Graduate School in Biosciences
University of Helsinki. 42s. Helsinki.
89
Rodrígues, J.M., Cintas, L.M., Casaus, P., Horn, N., Dodd, H.M., Hernández, P.E.,
Gasson, M.J., 1995. Isolation of nisin-producing Lactococcus lactis strains
from dry fermented sausages. Journal of Applied Bacteriology, 78, 109-115.
Rogers, L.A., Whittier., E.O., 1928. Limiting factors in lactic fermentation. Journal
of Bacteriology, 16, 211–14.
Ross, R.P., Galvin, M., McAuliffe, O., Morgan, S.M., Ryan, M.P., Twomey, D.P.,
Meaney, W.J., Hill, C., 1999. Developing applications for lactococcal
bacteriocins. Antonie van Leeuwenhoek, 76, 337-346.
Ryan, M.P., Flynn, J., Hill, C., Ross, R.P., Meaney, W.J., 1999. The natural food
grade inhibitor, Lacticin 3147, reduced the incidence of mastitis after
experimental challenge with Streptococcus dysgalactiae in nonlactating dairy
cows. Journal of Dairy Science, 82, 2108–2114.
Ryan, M.P., Rea, M.C., Hill, C., Ross, R.P., 1996. An application in cheddar cheese
manufacture for a strain of Lactococcus lactis producing a novel broad
spectrum bacteriocin lacticin 3147. Applied and Environmental
Microbiology, 62, 612-619.
Sahl, H-G., Jack, R.W., Bierbaum, G., 1995. Biosynthesis and biological activities of
lantibiotics with unique post-translational modifications. European Journal of
Biochemistry, 230, 827-853.
Samaržija, D., Antunac, N., Havranek, J.L., 2001. Taxonomy, physiology and
growth of Lactococcus lactis: a review. Mljekarstvo, 51, 35-48.
Sawa, N., Zendo, T., Kiyofuji, J., Fujita, K., Himeno, K., Nakayama, J., Sonomoto,
K., 2009. Identification and characterization of lactocyclicin Q, a novel cyclic
bacteriocin produced by Lactococcus sp. strain QU 12. Applied and
Environmental Microbiology, 5, 1552-1558.
Schaffer, H.E., Sederoff, R.R., 1981. Improvement estimation of DNA fragment
lengths from agarose gels. Analytical Biochemistry, 115, 122-133.
Schägger, H., von Jagow, G., 1987. Tricine-SDS-PAGE for the separation of
proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry, 166, 368-
379.
90
Schillinger, U., Geisen, R., Holzapfel, W.H., 1996. Potential of antagonistic
microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods.
Trends in Food Science & Technology, 7, 158-164.
Schleifer, K.H., 1987. Recent changes in taxonomy of lactic acid bacteria. FEMS
Microbiology Reviews, 46, 201-203.
Schleifer, K.H., Kraus, J., Dvorak, C., Kilpper-Bälz, R., Collins, M.D., Fischer, W.,
1985. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus
Lactococcus gen. nov. Systematic and Applied Microbiology, 6, 183-195.
Sears, P.M., Peele, J., Lassauzet, M., Blackburn, P., 1995. Use of antimicrobiol
proteins in the treatment of bovine mastitis. In: Proceeding of the 3rd
International Mastitis Seminar. pp. 17-18.
Southern, E.M., 1979. Measurement of DNA lengths by gel electrophoresis.
Analytical Biochemistry, 100, 319-323.
Stiles, M.E., Holzapfel, W.H., 1997. Lactic acid bacteria of foods and their current
taxonomy. International Journal of Food Microbiology, 36, 1-29.
Şahingil, D., İşleroğlu, H., Yıldırım, Z., Akçelik, M., Yıldırım, M., 2010.
Characterization of lactococcin BZ produced by Lactococcus lactis subsp.
lactis BZ isolated from boza. Turkish Journal of Biology, 34, 1-13.
Tagg, J.R., Dajani, A.S., Wannamaker, L.W., 1976. Bacteriocins of Gram-positive
bacteria. Bacteriological Reviews, 40, 722-756.
Tagg, J.R., McGiven, A.R., 1971. Assay system for bacteriocins. Applied
Microbiology, 21, 943.
Taylor, T.M., Davidson, P.M., Zhong, Q., 2007. Extraction of nisin from a 2.5%
commercial nisin product using methanol and ethanol solutions. Journal of
Food Protection, 70, 1272-1276.
Todorov, S.D. Dicks, L.M.T., 2006. Screening for bacteriocin-producing lactic acid
bacteria from boza, a traditional cereal beverage from Bulgaria comparison of
the bacteriocins. Process Biochemistry, 41, 11-19.
Todorov, S.D., 2009. Bacteriocins from Lactobacıllus plantarum production, genetic
organization and mode of action. Brazilian Journal of Microbiology, 40, 209-
221.
91
Todorov, S.D., Dicks, L.M.T., 2005. Pediocin ST18, An anti-listerial bacteriocin
produced by Pediococcus pentosaceus ST18 isolated from boza, a traditional
ceral beverage from Bulgaria. Process Biochemistry, 40, 365-370.
Tramer, J.,1966. Nisin in food preservation. Chemistry & Industry, 11, 446-450.
Tuncer, Y., 2009. Phenotypic and genotypic characterization of nisin-producing
Lactococcus lactis subsp. lactis YB23 isolated from raw milk in Turkey.
Biotechnology & Biotechnological Equipment, 23, 1504-1508.
Tuncer, Y., Akcelik M., 2007. Technological characterization of wild-type
Lactococcus lactis strains isolated from raw milk and traditional fermented
milk products in Turkey. Australian Journal of Dairy Technology, 62, 19-25.
Tuncer, Y., Özden, B., 2010. Partial biochemical characterization of nisin-like
bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. lactis YBD11 isolated
from Boza, A traditional fermented Turkish beverage. Romanian
Biotechnological Letters, 15, 4940-4948.
Tuncer, Y., Özden, B., Avşaroğlu, M.D., 2008. Bozanın bazı mikrobiyolojik
özelliklerinin ve laktik asit bakterisi izolatlarının antibakteriyel aktivitelerinin
belirlenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü
Dergisi, 12, 19-25.
Tükel, Ç., Akçelik, M, 2004. Plasmid encoded lacticin 481 production in
Lactococcus lactis subsp. lactis CM41. Milchwissenschaft, 59, 601-604.
Tükel, Ç., Akçelik, M., 2000. Lactococcus lactis subsp. lactis suşlarında laktoz
plazmidlerinin tanımlanması. Turkish Journal of Biology, 24, 405-424.
Tükel, Ç., Avşaroğlu, M.D., Şimşek, Ö., Akçelik, M., 2007. Isolation and partial
characterization of a novel bacteriocin produced by Lactococcus lactis ssp.
lactis MC38. Journal of Food Safety. 27, 17-29.
Twomey, D., Ross, R.P., Ryan, M., Meaney, B., Hill, C., 2002. Lantibiotics
produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications. In:
Lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications (Sizezen, R.J.,
Kok, J., Abee, T. and Schaafsma, G. Eds.) pp. 165-185. Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht.
92
van Belkum, M.J., Hayema, B.J., Geis, A., Kok, J., Venema, G., 1989. Cloning of
two bacteriocin genes from a lactococcal bacteriocin plasmid. Applied and
Environmental Microbiology, 55, 1187-1191.
van Belkum, M.J., Kok, J., Venema, G., Holo, H., Nes, I.F., Konings, W.N., Abee,
T., 1991. The bacteriocin lactococcin a specifically increases permeability of
lactococcal cytoplasmic membranes in a voltage independent, protein-
mediated manner. Journal of Bacteriology, 173, 7934-7941.
van der Meer, J.R., Rollema, H.S., Siezen, R.J., Beerthuyzen, M.M., Kuipers, O.P.,
De Vos, W.M., 1993. Characterization of the nisin a operon genes nisP,
encoding a subtilisin-like serine protease involved in precursor processing,
and nisR, encoding a regulatory protein involved in nisin biosynthesis.
Journal of Bacteriology, 175, 2578-2588.
van Kraaij, C., Breukink, E., Noordermeer, M.A., Demel, R.A., Siezen, R.J.,
Kuipers, O.P., de Kruijff, B., 1998. Pore formation by nisin involves
translocation of its C-terminal part across the membrane. Biochemistry, 37,
16033-16040.
Venema, K., Abee, T., Haandrikman, A.J., Leenhouts, K.J., Kok, J., Konings W.N.,
Venema, G., 1993. Mode of actions of lactococcin B, a thiol-activated
bacteriocin from Lactococcus lactis. Applied and Environmental
Microbiology, 59, 1041-1048.
Vessoni Penna, T.C., Jozala, A.F., Novaes, L.C.L., Pessoa Jr., A., Cholewa, O.,
2005. Production of nisin by Lactococcus lactis in media with skimmed milk.
Applied Biochemistry and Biotechnology, 121, 619-637.
von Wright, A., Sibakov, M., 1993. Genetic modification of lactic acid bacteria. In:
Lactic Acid Bacteria (von Wright, A. and Salminen, S. Eds.) pp 161-198.
Dekker, New York.
von Wright, A., Suominen, M., Sivelä, S., 1986. Identification of lactose
fermentation plasmids of streptococcal dairy starter strains by Southern
hybridization. Letters of Applied Microbiology, 2, 73-78.
Whitehead, H.R., 1933. A substance inhibiting bacterial growth, produced by certain
strains of lactic streptococci. Biochemical Journal, 27, 1793-1800.
93
Williams, A.M., Fryer, J.L., Collins, M.D., 1990. Lactococcus piscium sp. Nov. a
new Lactococcus species from salmonid fish. FEMS Microbiology Letters,
68, 109-114.
Wirawan, R.E., Klesse, N.A., Jack, R.W., Tagg, J.R., 2006. Molecular and genetic
characterisation of a novel nisin variant produced by Streptococcus uberis.
Applied and Environmental Microbiology, 72, 1148-1156.
Wu, J., Hu, S., Cao, L., 2007. Therapeutic Effect of nisin Z on subclinical mastitis in
lactating cows. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51, 3131-3135.
Yoneyama, F., Imura, Y., Ichimasa, S., Fujita, K., Zendo, T., Nakayama, J.,
Matsuzaki, K., Sonomoto, K., 2009a. Lacticin Q, a lactococcal bacteriocin,
causes high-level membrane permeability in the absence of specific receptors.
Applied and Environmental Microbiology, 75, 538-541.
Yoneyama, F., Imura, Y., Ohno, K., Zendo, T., Nakayama, J., Matsuzaki, K.,
Sonomoto, K., 2009b. Peptide-lipid huge toroidal pore, a new antimicrobial
mechanism mediated by a lactococcal bacteriocin, lacticin Q. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, 53, 3211-3217.
Yoneyama, F., Shioya, K., Zendo, T., Nakayama, J., Sonomoto, K., 2010. Effect of a
negatively charged lipid on membrane-lacticin Q interaction and resulting
pore formation. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 74, 218-221.
Zajdel, J.K., Ceglowski, P., Dobrzanski, W.T., 1985. Mechanism of action of
lactostrepcin 5, a bacteriocin produced by Streptococcus cremoris 202.
Applied and Environmental Microbiology, 49, 969-974.
Zendo, T., Fukao, M., Ueda, K., Higuchi, T., Nakayama, J., Sonomoto, K., 2003.
Identification of the lantibiotic nisin Q, a new natural variant produced by
Lactococcus lactis 61-14 isolated from a river in Japan. Bioscience
Biotechnology and Biochemistry, 67, 1616-1619.
Zendo, T., Koga, S., Shigeri, Y., Nakayama, J., Sonomoto, K., 2006. Lactococcin Q,
a novel two-peptide bacteriocin produced by Lactococcus lactis QU 4.
Applied and Environmental Microbiology, 72, 3383-3389.
Zendo, T., Yoneyama, F., Sonomoto, K., 2010. Lactococcal membrane-
permeabilizing antimicrobial peptides, Applied Biotechnology and
Microbiology, 88, 1-9.
94
ÖZGEÇM İŞ
Adı Soyadı : Gözde KORAL
Doğum Yeri ve Yılı : Tekirdağ, 1986
Medeni Hali : Bekar
Yabancı Dili : İngilizce
Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)
Lise : Tekirdağ Anadolu Lisesi, 2000 - 2004
Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi, 2004 - 2008
Çalıştığı Kurum ve Yıl: Sueno Hotels Beach Side, 2010 -
