TBT4170 BioteknologiEksamensnotater

Audun F. Bueneaudunfor@stud.ntnu.no

9. mai 2012

Chapter 1: Basics of biotechology

DNA står for deoxyribonucleic acid og er bygget opp av lange kjeder med nuk-leotider. DNA er en dobbel-stranded helix som vrir seg med klokken, nedover.Trådene er antiparallelle, dvs at de løper i 5’ til 3’ retning, motsatt veg. De firenukleotidene i DNA heter Adenine, Cytosine, Guanine og Thymine. Disse er allebundet sammen med et phosphodiester bond, og bindingene på tvers av trådene erhydrogenbindinger mellom hhv. C - G og A - T.

En DNA-tråd har en 5’-ende, som består av en terminal fosfatgruppe (PO32−).Den andre enden, 3’ er en terminal hydroksylgruppe (OH).

RNA står for ribonucleic acid. I RNA er Thymine byttet ut med Uracil. I mot-setning til DNA som er dobbeltrådig er RNA enkelttrådig.

Nukleotidene kan deles inn i to grupper, puriner og pyrimidiner . Purinene be-står av guanine og adenine mens pyrimidinene er cytosine og thymine/uracil. Nårhydrogenbindingene i DNA dannes, er disse mellom en purin og pyrimidin. A-Tog A-U har kun to hydrogenbindinger, mens G-C har tre.

Pakking av DNA er nødvending, fordi det er utrolig mye av det i hver celle. IProkaryoter supercoiles DNA’et i cellene. I eukaryoter er det litt vanskeligere, fordidet finnes egne proteiner (histoner) som DNA pakkes rundt. Kulene som danneskalles nukleosomer og sammen danner de et chromatin, som igjen coiles sammenog pakkes inn i proteiner til 30 nm fiber. Da er DNA’et komprimert nok til å fåplass i cellekjernen.

Escherichia Coli (E.coli) er modellorganismen for bakterier. Den er normaltomtalt som en farlig bakterie om den forekommer i matvarer, fordi den finnes na-turlig som tarmbakterie i pattedyr. E.coli er en gram-negativ bakterie, som betyrat den har en cytoplasmic membram, så en tynn cellevegg før den helt ytterst haren ytre cellemembran. Bakterier har ingen cellekjerne, så kromosomene flyter frittrundt i cytoplasmaen.

1

På utsiden av E.coli finnes det ca. 10 flagella, som er med på å gi bakterien beve-gelse, og det er tusenvis av pili, som lar den feste seg til overflater.

Plasmider er DNA som ikke er en del av kromosomet i bakterier. De er runderinger, og det finnes som regel flere av dem i hver celle (avhenger av kopitallet).Disse inneholder gener som er med på å gi bakterier egenskaper i konkurranse medandre, som f.eks. toksiner. Plasmider finnes hovedsaklig i prokaryoter, men er ogsåfunnet i gjær, som er en eukaryot.

Plasmider er skikkelig viktige for bioteknologien. De er små nok til å dytte inn iandre celler, og greit stabile, så de er enkle å jobbe med.

Diploide organismer har to like kopier av sine kromosomer. Dette gjelder for defleste pattedyr og de fleste eukaryoter generelt. Polyploide organismer har flere ennto kopier av deres kromosomer. Mange planter er polyploide, men polyploide dyrer ytterst sjeldent.

Germline cells (kjønnsceller) er i dyr de eneste cellene som deler seg i to utenå duplisere kromosomene. En kjønnscelle kan celledele seg til to haploide celler.Ved befruktning vil to haploide celler danne en diploid celle, som kalles zygot. Fraden utvikler forsteret seg.

Somatiske celler er resten av cellene i kroppen, unntatt kjønnscellene. Somatiskeceller er diploide, og under mitose dannes to nye diploide celler.

Stamceller er viktige for medisinsk forskning, fordi de kan utvikle seg til hvilkensom helst celle i kroppen. De er totipotente i motsetning til andre celler i kroppensom har sin "jobb", og ikke kan utføre en annen celles jobb.

2

Chapter 2: DNA, RNA and Protein

Sentraldogmet sier at DNA transkriberes til mRNA, som igjen transleres til pro-tein.

Transkripsjon er prosessen hvor DNA blir skrevet av til mRNA. Skjer ved hjelpav enzymet RNA transkriptase.

mRNA står for messenger RNA. Inneholder koden for proteiner, og består avbasene G, C, A og U.

Translasjon er prosessen hvor mRNA blir avskrevet, og protein dannet. Dettegjøres av enzymet RNA polymerase. (RNApol-II i eukaryoter).

RNA-polymerase er en samling av protein utgjør et enzym som omgjør mRNAtil protein ved å lese av, og koble sammen aminosyrer i riktig rekkefølge. Proteinerkalles også for polypeptider, fra de mange peptidbindingene som dannes mellomaminosyrene.

Cistron kalles den kodende region for et gen på DNA.

Open reading frame (ORF) er DNA-sekvensen som inneholder koden for detsom kommer til å bli det ferdige proteinet. ORF inneholder ingen stoppkodoner.

Promotor er en region på DNA-tråden som RNA-polymerase gjenkjenner, ogbinder seg til for å starte transkripsjon.

5’-TATAAA-3’ (/TTGACA) kalles TATA-boksen, og er et recognition site fortranskripsjonsfaktorer. Ligger typisk -10 eller -35 bp oppstrøms for promotoren.TATA-boksen antas å være uendret gjennom evolusjonen. Siden den består av Aog T, skal det lite til for å åpne DNA ved denne sekvensken. Det vil gjøre tran-skripsjon enklere.

3

5’/3’-UTR er deler av DNA såvel som plasmider, og heter 5’/3’-ende UTranslertRegion. Koder ikke for gener men inneholder regulatoriske seter.

Kodende tråd (Coding strand) er tråden i DNA som er identisk med mRNA(utenom at U erstatter T).

Template strand er tråden hvor RNA polymerase kjører. Motsatt av codingstrand. På bakgrunn av denne tråden blir RNA bygget til å være tilnærmet liktden kodene tråden.

CAT er et typisk startkodon for RNA polymerase på DNA. Tilsvarer GTA på denkodende tråden, som igjen tilsvarer AUG på mRNA.

Operon er en samling av gener som deler samme promotor, og er transkribertsom ett mRNA. Under translasjonen vil de deles opp i separate proteiner.

Regulatorer kan regulere transkripsjonen av spesifikke gener. Det finnes aktivato-rer som aktiverer et ellers inaktivt gen, og repressorer, som stopper transkripsjonenav et ellers aktivt gen. Regulatorene er molekyler som binder seg til eller fjernesfra et område på DNA-tråden som er essensielt for at transkripsjon skal kunne skje.

Signal molecules/inducers er molekyler som endrer formen på repressorer/aktivatorerslik at disse kan være avhengig av ytre påvirkninger.

Operator (LacO) er setet hvor repressoren LacI kan binde seg.

CRP (cyclic AMP reseptor protein) aka CAP, er en global aktivator for tran-skribering av operoner. Aktiveres av cAMP (cyclic AMP).

Enhancere er sekvenser på DNA som kan være tusenvis av basepar fra promo-toren. DNA bøyes slik at denne kommer i nærheten av promotoren, og øker tran-skripsjonen av det gitte genet. Trenger ikke engang være på samme kromosom!

4

Insulators er sekvenser som blokkerer enhancere, slik at enhancerene ikke aktivererfeil gen.

Intron er kjipe, ubrukelige kodesekvenser som ofte er på feil sted. Kan spleisesvekk. De koder stort sett for ingen verdens ting. Exons derimot er alle sekvensenevi er glade i, som koder for noe nyttig.

Spleising er sammenføying av kuttet DNA. Brukes for å fjerne introns.

Triplet/kodon er et sett av tre basepar som koder for en aminosyre i et polypep-tid. I et kodon er den siste posisjonen kalt wobble-posisjonen. Det siste baseparethar ofte liten betydning for hvilken aminosyre det kodes for, men er nyttig for åkunne variere kodonbruken mellom forskjellige organismer.

tRNA er kort for transfer RNA. Er proteiner som er ansvarlige for at riktig amino-syre fester seg til riktig mRNA-sekvens under translasjonen. tRNA består av etAnti-codon, som tilsvarer sekvensen tRNA må ha for å kunne binde seg til mRNA.tRNA inneholder også en acceptor stem, som er stedet på tRNA hvor amonisyrener festet.

Ribosomet er "maskinensom henter inn riktig tRNA og linker sammen de riktigeaminosyrene til et protein.

Shine-Dalgarno-sekvensen i E.coli er AGGAGGU, som også er en ganske godtilnærming til SD-sekvenser i andre organismer. Som regel plassert 9-15 bp (Wikisier 8 bp) oppstrøms (mot 5’-enden) fra startkodonet AUG. Er en RBS på mRNA.

Elongering er prosessen hvor aminosyrene adderes en etter en for å danne pro-teiner. Skjer nødvendigvis i ribosomet.

Polysom (polyribosom) er et cluster av ribosomer som kan binde seg til mRNAi prokaryoter. Transkripsjon og translasjon kan ofte skje samtidig i prokaryoter,fordi de ikke har noen cellekjerne.

5

Symbiotic theory kalles historien om hvordan mitokondriene og kloroplastenehoppet inn i cellene våre. De var visst en gang selvstandige bakterier eller algersom dannet et symbiotisk forhold til våre forfedres celler.

Chapter 3: Recombinant DNA Technology

Isolasjon av DNA skjer ved først å fjerne cellevegger, som kan gjøres mekaniskeller kjemisk. Proteiner kan fjernes med fenol, mens RNA som finnes i cellen fjernesmed ribonuklease (RNase). Gjøres forskjellig i alle organismer.

Elektroforese er en metode for å skille DNAmolekyler basert på deres lengde.Baserer seg på at fosfatgruppen i DNAskjelettet er negativt ladet og vil tiltrekkesen positiv elektrode. DNA ledes gjennom agarose/(polyacrylamide) og korte mo-lekyler beveger seg lengst. DNA/RNA kan farges med ethidium bromid, slik at detblir orange flekker der det er DNA.

Pulsed field gen electrophoresis (PFGE) er en metode for å få veldig lan-ge DNA-molekyler gjennom agarosegel. Pulserende og alternerende elektriske feltmed forskjellige vinkler gjør at DNA beveger seg tredimensjonalt.

Restriksjonsenzymer binder seg til sine egne spesifikke DNA-sekvanser, og kut-ter. De kan enten kutte blunt eller sticky, som resulterer i rette ender eller over-lappende ender. Type II restriksjonsenzymer er nyttigst for bioteknologi, da dissekutter midt i sekvensen.

Okazaki fragment er en sammenhengende DNA-sekvens laget på lagging strandved DNA-replikasjon. Limes sammen med DNA ligase.

Merking av DNA kan generelt skje på to måter. Enten ved hjelp av radioaktiveisotoper substituert inn på DNA-skjelettet, eller ved hjelp av fluorescerende ato-mer. Enten kan fosforatomet i fosfatgruppen byttes ut med isotopen 32P, eller så

6

kan et av oksygenatomene substitueres med 35S.

Southern blot er en metode for å sjekke hvor et enkelt gen er plassert i en langDNA-sekvens. En DNA-probe med radioaktive/forforescerende isotoper blir laget,og denne vil binde seg til splittet DNA (vha. varme eller sterk syre). Kun denDNA-sekvensen som matcher proben vil da dukke opp i screening.

Northern blot er noe likt southern blot bortsett fra at det er mRNA som match-es med en probe vha nucleic acid hybridization. Trenger ikke sterk syre, og manslipper introns, som man har i DNA.

Kloning vectors er plasmider med visse egenskaper som gjør de ideelle for klo-ning av gener. Disse inneholder ofte et gen for antibiotikaresistens, slik at kolonienkan dyrkes. De har et kopitall, som helst skal være stort. Dette fordi da vil det tilenhver tid være mange kopier av plasmidet i en celle. De inneholder også etmultiplecloning site (MCS) sammensatt an mange kuttesekvenser for restriksjonsenzymer.Det er her insertet plasseres.

Construct heter det sammenføyde plasmidet som har det klonede genet på plass.Brukes om alle rekombinante molekyler konstruert med genetisk engineering.

Shuttle vektorer er vektorer som har alt som trengs for å overleve i to typerceller. Dette kan for eksempel være både i gjær og bakterier.

Mitose er celledelingen som hovedsaklig skjer i gjær og bakterier. Diploide cellerhar to sett med kromosomer. Disse splitter seg, og to nye diploide celler dannesmed dobbelt gensett.

Meiose er dannelse av haploide celler (kjønnsceller) fra diploide celler. Man gårfra en celle med to gensett, til fire celler med enkle gensett.

Transformasjon er prosessen hvor en endret vektor skal klones inn i en celle. Forat dette skal være mulig, må cellen åpnes en liten stund. Dette kan gjøres på to

7

måter: Kalsiumioner på is fulgt av termosjokk i 5 min, eller elektroporering. Sist-nevnte er oftest best, da denne er svært allsidig, rask, og ikke så ødeleggende somførstnevnte.

Gen-bibliotek er nor et helt genom kuttes med et restriksjonsenzym, og klonesinn i en mengde vektorer som kan dyrkes i cellekolonier. Slik har man et helt gen-om i mange små cellekolonier på noen agarskåler.

Ekspresjonsbibliotek Det samme som et gen-bibliotek, men alle genene kan ogsåuttrykkes som proteiner. Om det er gener eller ukodende sekvenser som translatereser ikke så viktig. For eukaryoter bør man bruke cDNA for å unngå alt ikke-kodendeDNA. For prokaryoter er det lite ikke-kodende DNA, så da er det ikke så viktig.

Revers transkriptase er et enzym som danner cDNA fra mRNA. Lenge var det-te tenkt umulig, fordi det strider mot sentral dogmet i biologien.

Chapter 4: DNA Synthesis in Vivo and in Vitro

Replikasjon av DNA skjer i eukaryoter med en hastighet på ca 50 kb/s, mens iprokaryoter kopieres ca 1000 kb/s. DNA helicase åpner DNA-helixen, slik at repli-kasjon kan starte. DNA-trådene holdes fra hverandre med proteiner som hindrerannilering.

Origin of replication (ori) er stedet på DNA hvor repliksajonen starter. I eu-karyoter finnes det mange slike ori’er, mens i prokaryoter er det kun ett. Disse ertypisk 245 bp lange, og består hovedsaklig av Adenine og Thymine. Disse er pu-riner med kun to hydrogenbindinger mellom seg, og krever dermer mindre energifor å åpnes.

Leading strand replikeres i 5’ til 3’-retning.

Lagging strand er den andre siden av replikasjonsgaffelen, og her lages mange

8

små Okazaki fragments pga retningen av replikasjonen. RNA-primerene blir fjer-net av RNaseH, deretter vil DNA polymerase I fylle inn de manglende basene. Tilslutt kommer DNA ligase for å tette hullene i stråden som DNA pol I ikke kunnetette.

RNA-primer er et 10-11 bp lang RNA-tråd, som binder seg først på leadingstrand og kontinuerlig i starten av hvert Okazaki fragment. Dette skjer slik atDNApolymeraske skal ha en 3’-OH å starte replikasjonen fra.

Mismatch repair system er en måte å for cellen å finne feil i replikasjonen.Dette gjøres ved å lete etter buler langs DNA-molekylet. Disse vil komme av at enbase med 2 hydrogenbindinger må pares med en som har 3. Det antas at trådenmed minst metyleringer er den originale, korrekte tråden, og denne brukes da sommal når feilen skal fikses.

Theta-replikasjon skjer f.eks. i E.coli fordi replikasjonen starter i oriC og går ibegge retninger, slik at halvveis ser det ut som den greske bokstaven theta.

Mitose er begrepet som brukes for celledeling, hvor cellen replikerer sitt DNA, ogdeler sine andre cellekomponenter i to. Deretter blir to datterceller dannet.

in Vitro DNA syntese kan gjøres på laben, og følger stort sett samme metodesom in Vivo DNA syntese. Man trenger nukleotider, primere, DNA polymerase.Bland godt, og vips!

Oligonukleotider er et samlebegrap på korte, syntetiserte DNA-molekyler somer kortere enn 20 bp.

DNA-syntese av hele gener er ganske vanskelig. Det er slik at om man skallage 100 bp DNA med 98 % nøyaktighet, vil utbyttet være omtrent 10 % tilslutt.Syntetiserte gener er derfor laget med overlappende endre, og limes sammen tilkomplette gener som dette er nødvendig.

9

Sanger-sekvensering er oppkalt etter Frederick Sanger, som sekvenserte Insulinførst. Han gjennomførte vanlig oligonukleotid-syntese, men innførte en viss andeldideoxynukleotider. Disse har ingen 3’-OH-gruppe. Derfor vil det ikke kunne syn-tetiseres videre noe i den DNA-tråden som får et slikt molekyl. Dermed vil en vissmengde dNA-molekyles stoppes ved hver base. Når dideoxynukleotidene i tillegger radioaktive, kan man lese basesekvensen ut fra en elektroforesegel.

Polymerase chain reaction (PCR) er bioteknologiens kopimaskin. Man bru-ker små spesifikke primere som annilerer seg til start og slutt (hhv. 5’ og 3’-ende),etter denaturering av DNA-tråden. Deretter tilsettes DNA polymerase og nukle-otider. PCR kjøres da mellom primerene, og oppamplifiserer kun det området maner interessert i. Etter noen omganger med eksponensiell vekst/kopiering, har manmange millioner like kopier av genet.

PCR-sekvensering eller cycle-sequencing brukes PCR og en viss andel dide-oxynukleotider med forskjellig forforescens for A, T, G og C. Derfor vil PCR lagemange kopier av forskjellige lenger, som kan kjøres i elektroforesegel. En maskinkan lese av de forskjellige fosforescensene, slik at kun en mix er nødvendig. Detteer en veldig rask og ryddig prosess.

Revers transkriptase PCR (RT-PCR) bruker enzymet revers transkriptasefor å lage cDNA fra mRNA. Deretter kjøres PCR på cDNA’et, som oppamplifise-res. Dette er en god metode for å oppamplifisere DNA fra eukaryoter, siden dissehar masse uniteressante introns som er kjipt.

Chapter 8: Genomics and Gene Expression

Chromosome walking er en måte for å sekvensere lengere gener, typisk 1.3 til7 kb. Man trenger en primer, deretter bruker man PCR-sekvensering et lite styk-ke. Fra sekvensen lager man en ny primer og går videre derfra. Fungerer greit formiddels korte stykker, men tar lang tid. De startet The Human Genome Projectpå denne måten, men gikk etter hvert over på Shotgun sekvensering.

10

Shotgun sekvensering er en annen måte å sekvensere STORE gener på. Førstkuttes genet opp med restriksjonsenzymer, før det klones og alle bitene sekvenseresseparat. Til slutt brukes en datamaskin for å sette sammen alle bitene. Dette kanden gjøre fordi det statistisk sett vil finnes overlapper.

Menneskets genom består av omtrent 2.9 · 109 basepar. Det antas at det bestårav 25.000 gener, hvor vi kun vet fuksjonen til halvparten. I motsetsning har Myco-plasma kun 500 gener i sitt genom, mens enkelte planter kan ha over 40.000.

Pseudogener er gener som opptrer flere steder i genomet, men som ikke uttryk-kes. For å kunne kalle noe et gen, må det ofte finnes en tilsvarende sekvens i etmRNA. Det finnes også DNA som transkriberes, men som ikke translateres tilprotein. Dette kan bli til rRNA eller tRNA.

Familier av gener er vanlige grupperinger. Disse kommer av mutasjoner, slik atgener som gjør helt forskjellige ting kan ha vært samme gen i en organisme forlenge siden. Superfamilier er et navn på slike grupper som er utviklet fra ett gen,som f.eks. globin-superfamilien som inneholder hemoglobin (transporterer oksygeni blodet) og myoglobin (gjør det samme, men i musklene).

Mutasjoner foregår hele tiden, men med forskjellige rater for forskjellige gener.Dette avhenger av mange faktorer, som f.eks. metylering. Mutasjoner kan værehelt ufarlige, om de f.eks. skjer på wobble-posisjonen (siste av 3 baser i et kodon)da dette ikke har noen effekt på proteinet som lages. Essensielle gener har historisksett hatt en lavere mutasjonsfrekvens enn ikke-essensielle.

Gen-ekspresjon er hvorvidt et gen uttrykkes som protein. Å sjekke dette er littvanskelig, men gjøres ofte ved at genet fjernes og erstattes med et reporter-gen.Dette vil innføre en synlig forandring for cellene genet er i, og genet er aktivt underde gitte forholdene. Reporter-genet kan splitte disaccharider, eller gjøre cellene fos-forescerende/fluorescerende. Et positivt utslag med reporter-gen vil si at plassengenet sitter på er aktiv.

11

Chapter 9: Proteomics

Betyr analyse av proteiner. Proteomet er den totale samlingen av alle proteinerhos en organisme.

Translatomet er den totale samlingen av proteiner som til enhver tid translateresfra mRNA. Translatomet avhenger av hvilke forholde det er i cellen.

Polyakrylamid-gel-elektroforese (PAGE) er en måte å skille proteinger på,etter størrelse. For at proteinene skal kunne bevege seg i det elektriske feltet, måde få en netto ladning. Dette gjøres med kokende SDS (sodium dodecyl sulfate).SDS pakker inn proteinene, og gir de en negativ ladning. Siden SDS fordeler seghomogent på proteinene, vil de største proteinene få størst negativ ladning. Denneprosessen kalles ofte SDS-PAGE.

2D-PAGE er det samme som SDS-PAGE, men i "2 dimensjoner". Først blir pro-teinene separert mhp sin egen native charge. Dette kommer av at alle proteiner haren viss mengde aminosyrer med hhv. positive og negative sidegrupper. I et elek-trisk felt vil proteinene fordele seg mhp sin ladning i en polyakrylamid-gel med enpH-gradient.

Deretter behandles gelen med de fordelte proteinene med SDS, og legger inntillen polyakrylamidgel, og elektroforese gjøres. På denne måten kan men få fordelproteinene mhp både egenladning og molvekt.

Western blotting er en måte å finne akkurat det proteinet man vil finne i enblanding av mange. Det antas at aminosyresekvensen av proteinet er kjent. Førstgjennomføres SDS-PAGE eller 2D-PAGE, slik at proteinene er fordelt i en poly-akrylamidgel. Proteinene overføres deretter til en membran av papir (nitrocellulo-se) eller nylon. Dette gjøres ved at membranen gis en positiv ladning, slik at denegativt ladede proteinene fester seg.

12

Deretter behandles gelen med et antistoff, som binder seg til akkurat det proteinetvi er interessert i. Fortsatt synes ingenting på membranen, inntil vi tilsetter etandre antistoff, som er merket. Dette er et antistoff som gjenkjenner alle andreantistoff, og som vi enten kan se med det blotte øyet, eller som har fosforescenseller radioaktivt.

Western blotting brukes til å bevise at et protein er uttrykket, men også til å an-slåp mengden av protein. Dette kan gjøres fordi styrken på signalet fra antistoffeter proporsjonalt med mengde protein.

High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) er en metode for å separe-re såvel som detektere proteiner i løsning. Dette gjøres ved eluering, som er å laen mobil fase bevege seg gjennom en stasjonær fase (kolonne full av drit). Lettemolekyler vil komme først ut, og om vårt protein er merket kan vi detektere nårdette kommer ut på andre siden. Om man tar ut mange prøver kontinuerlig, vilman få en fordeling av proteiner.

Bestemmelse av proteiner kan være vanskelig, men man kan f.eks. brukemasse-spektrometri. Problemet her er at proteiner ofter er skikkelig store, og dermed vans-kelige å ionisere. Det finnes avanserte metoder for å få dette til, som electrosprayionization (ESI) og Matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI).

Protein-tagging er en metode å separere de ellers ganske inaktive proteinene.Dette skjer ofte helt ned på DNA-nivå, ved at man legger til en tag i direktetilknytning til genet, som transkriberes sammen med genet. En tag kan være poly-histidine, også kalt His6 tag. Det blir kodet 6 histidiner før genet, som binder segtil Ni+2 , f.eks. i en kolonne. Når en blanding av proteiner heller gjennom kolonnen,vil de med His6 tag bli hengende igjen i nikkelcoatingen. Disse kan vaskes ut seneremed histidine eller imidazole. Til slutt må taggen fjernes fra resten av proteinet.

En annen metode for å gjøre dette er med en FLAG-tag (AspTyrLysAspAspAspAs-pLys), som fester seg til FLAG-antistoff som kan være i en kolonne.

13

Metabolomics er analysen av alle små molekyler som finnes inne i en celle elleren organisme. Dette kan f.eks. være lukt- og fargemolekyler. Mange metabolitterer funnet ved hjelp av NMR og thin layer chromatography (TLC). Massespektro-metri er den ideelle metoden for å analysere et helt metabolom.

Chapter 10: Recombinant proteins

Rekombinante proteiner er proteiner fra klonede gener, som kan produseres i stortantall.

Ekspresjonsvektorer er plasmider med en sterk promotor, og antibiotikaresis-tens. Disse plasmidene har også et MCS/polylinker for å plassere inn inserts. Eks-presjonsvektorer brukes til å lage eukaryotproteiner i bakterier.

Translasjons ekspresjonsvektorer er vektorer spesialisert for å bedre transla-sjonen. Dette gjør de ved å ha et RBS (ribosome binding site) med tilhørendestartkodon ATG, i vektoren. Restriksjonsenzymet NcoI brukes til å kutte, fordidette kutter i sekvensen C/CATGG, som inneholder startkodonet. Om genet ikkehar et slikt kuttesete, kan dette lages med site-directed mutagenase.

Kodonbruken varierer fra organisme til organisme. For å ha riktig, og nok meng-de tRNA i en celle, finnes det plasmider som har genene for å lage de tRNAvertscellen selv ikke har.

Protein fusion er en måte for å få cellen til å eksportere de fremmede protei-nene den har laget. Dette gjøres ved å klone to proteiner ved siden av hverandrei ekspresjonsvektoren, ett cellen vanligvis eksporterer og ett som vi vil lage selv.Delen av proteinet som vanligvis eksporteres vil gjenkjennes og passere gjennomcellemembranen, mens det tar med seg genet vi vil ha. Mellom de to genene kodesdet for et protease-kløyve-sete, slik at de to proteinene kan separeres etter de erutenfor cellen.

14

Produksjon av proteiner i pattedyr er ofte svært vanskelig og langsomt, menkan gjennomføres med mammalian shuttle vectors. Man trenger nye origoer forreplikasjon, og disse kan hentes fra virus som infiserer pattedyr, eller fra gener somuttrykkes hyppig i deler av et pattedyr.

Chapter 11: Protein Engineering

Protein engineering er å endre egenskapene til eksisterende proteiner. Dette gjø-res ved å endre sekvensen i genet, og kan gi fordelaktige egenskaper. Stort setthandler protein engineering om å lage mer stabile proteiner for bruk i industrielleprosesser, ofte ved høye temperaturer.

Disulfidbindinger bidrar til å øke stabiliteten i en polypeptidkjede (protein).Disse bindingene dannes mellom to og to Cystein-aminosyrer i proteinet (Cys-S-S-Cys). Det er nødvendig at proteinet bøyer seg for at Cysteinene skal møtes.Aminosyrer kan endres, slik at det Cysteiner kommer på riktig plass, og dannerdisulfidbindinger. Dette fører igjen til økt stabilitet for proteinet.

Stabilitet kan oppnås på andre måter også:

Man kan bytte ut små aminosyrer, som har stor bevegelsesfrihet, med større, merforgreinete amonisyrer. Dette fører til at proteinet blir med rigid, og vil øke stabi-liteten.

Proteiner har en sekundærstruktur som heter en alpha helix. Det er en høyrehånds-vridd enkelt coil, med fire aminosyrer for hver runde oppover. Denne konformasjo-nen gjør proteiner til dipoler. Ved å innføre aminosyrer på C- og N-terminalen medhhv. motsatt ladning av dipolen til proteinet, vil dette stabilisere proteinet i helhet.

Directed evolution er en metode brukt i protein engineering for å dra nytte avnaturens egen seleksjon i utviklingen av proteiner og RNA. Direkte evolusjon gjen-

15

nomføres enten ved error-prone PCR eller med DNA shuffling. Error-prone PCR(epPCR) er vanlig PCR, men gjennomført i omgivelser rike på MnCl2. Dette førertil at feil gjort av polymerasen blir stabilisert, og ført videre til neste generasjon avgener. Slik innføres randomiserte feil i DNA. DNA shufflling er PCR gjennomførti uten primere på oppkuttede biter 100 - 300 bp lange, hvor DNA blir stokket omog satt sammen igjne. Til slutt blir det oppamplifiert med vanlig PCR.

Etter at mutasjonene er gjennomført må resultatet screenes for å sjekke om noenav klonene har de ønskede egenskapene. Når disse er funnet kan de igjen oppamp-lifiseres videre.

Chapter 12: Environmental Biotechnology

Viktig kapittel for verden, kanskje ikke så viktig for eksamen..

Metagenomics er studien av genomene til store samlinger av organismer sam-tidig. F.eks. fra jordsmonn eller sjøvann. Metagenomics kan bidra til å finne nyeantibiotikum og andre proteiner/stoffer av interesse. Ved å studere organismer fraekstreme områder kan man finne nye biologiske veger for syntese eller nedbrytingav stoffer. Dette kan f.eks. være organismer som lever ved vulkaner på sjøbunnen,ved oljebrønner eller organismer som lever i områder med høy radioaktivitet.

Analyse av metagenomer kan foregå enkelt med PCR, om man har riktige pri-mere. Det spiller ingen rolle om blandingen er fra 1000 organismer, siden PCR kanvære gen-spesifikt.

16

Chapter 13: Pathway Engineering

Dette handler om hvordan man kan få organismer til å lage et stoff vi vil ha. Damå man ofte lage nye biokjemiske veger, via gener fra en eller flere organismer.

Bioremidering er et viktig begrep i bioteknologien. Det handler om å bryte nedforurensninger i miljøet ved å bruke mikroorganismer. De kan f.eks. bryte nedugressmiddel, forurensninger og jordbruksavfall.

Fermentering er produksjon av alkohol fra biologisk materiale. Etanol produ-seres biologisk ved hjelp av gjær, som i øl, vin eller vodka. I Tequila produseresalkoholen av en bakterie som heter Zymomonas ved fermentering av Agaveplanten.Mange andre bakterier og mikroorganismer produserer alkoholer så vel som andreorgansike kjemikalier, ofte en blanding.

Stivelse og cellulose kan nedbrytes til kortere polysaccharider, som igjen kanbrytes ned til glukose. Av glukosen kan man fremstille alkohol. Måten å bryte oppstivelsen på skjer med to enzymer α-amylase (kutter rette stykker) og glucoamy-lase (kutter forgreininger). Cellulose består av lange kjeder med polysaccharider,som har rette stykker og mer krøllete stykker. Cellulose er ganske greit å bryte nedmed 3 forskjellige enzymer: Endoglucanase, Cellobiohydrolase og Exoglucanase.Til slutt kan Cellobiase brukes for å bryte små biter ned til glukosemolekyler.

Alle disse enzymene kan klones inn i f.eks. Zymomonas, slik at bakterien kan lagedem selv. Da har man til slutt en bakterie som kan spise papir, og lage alkoholdirekte. Dette gjøres med pathway engineering.

Polyketider er lineære kjeder av carbon, med keton- og alkylgrupper. Disse ervisst en måte å lage nye antibiotikum på, slik at man kan sloss mot resistentebakterier som følge av overdreven antibiotikabruk. Det er sikkert enkelt å endre påden kjemiske formelen i disse polymerene, slik at man kan få andre antibiotikumsom knekker de resistente bakteriene.

17

Biopolymere, også kalt bioplastikk, kan man få bakterier til å lage. Forskere fanten bakterie som lagret en biopolymer inne i cellen når det var gode forhold, ogtæret på dette lageret i dårlige tider. Litt som vårt kroppsfett. Genet for dette kanoverføres til f.eks. planter, og man kan fikse det slik at det produseres hele tiden.Dette kan bety at en soyaavling kan produsere biologisk nedbrytbar plastikk. Po-lymeren som lages heter Polyhydroxybutyrate (PHB), og går under produktnavnetBiopol.

Chapter 14: Transgenic Plants and Plant

Biotechnology

Gregor Mendel er genetikkens far. Han eksperimenterte med erteplanter på 1860-tallet, og fant ut at gener kan være dominante overfor andre gener. Han gjennom-førte sine eksperimenter ved kryss-pollinering.

Mutation breeding er et begrep brukt på forskningen som ble gjort på tidlig1900-tallet. Man bestrålte plantefrø med røntgenstråler, og så om det hadde noeneffekter på plantene. Slik ble nye farger og størrelser på blomster oppdaget.

Transgene planter er planter som har et transgen. Det er et fremmed gen fra enannen organisme som er ment å endre egenskapene til planten. Slike egenskaperkan være f.eks. plantemiddelresistens eller mer tørketolerante planter.

Planteceller er totipotente, som betyr at enhver celle i en plante har mulighettil å bli til en helt ny plante. Det betyr at få planteceller kan dyrkes opp til mangenye like planter. Dette kan gjøres på en petri dish, også kalt en calluskultur, eller ivæske kalt suspension culture.

Suspansion culture er måten man dyrker planteceller i en væske. I væsken harman planteceller ofte kalt protoplasts, som er planteceller med fjernet cellevegg,sammen med næringsstoffer og plantehormoner. Man kan også bruke microsporer

18

(pollen) eller makrosporer (eggceller).

Calluskulturer er planteceller som dyrkes på fast medium. Her brukes plantecel-ler fra røtter eller skudd, og dyrkes sammen med næringsstoffer på petri-plater.Cellene overføres til plater med gradvis lavere hormonkonsentrasjoner, til de tilslutt slår rot.

Genetisk modifisering av planter kan gjøres for mange formål, som f.eks. åøke vitamininnholdet i ris (Golden Rice), gjøre planter (soyabønner) immune forRound-up eller gjøre planter giftige for skadedyr.

Ti-plasmidet er en kjekk sak for å transformere gener inn i planter via bakterier.Skadede planter avgir noen fenol-lignende stoffer, som trigger bakterien Agrobac-terium. Bakterien starter transkripsjonen av genene for Ti-plasmidet. Plasmidetkopierer av en bit som heter T-DNA, som innkapsuleres i proteiner og fraktesinn i plantecellen, og integreres i plantegenomet. Biten av T-DNA som nå sitter iplantens DNA vil være ansvarlig for produksjonen av to enzymer, nemlig auxin ogcytokinin. Disse sørger for å hhv. gjøre plantecellene større, og å fremme celledeling.Akkurat som en kreftsvulst. For å få inn det genet vi vil planten skal produsere,trenger vi kun erstatte genet som koder for T-DNA.

Round-Up er et populært ugressmiddel, som egentlig er glyphosate. Det stopperenzymet EPSPS i å gjøre jobben sin i omforming av energi for planten, slik atdet sulter i hjel. EPSPS finnes ikke i pattedyr, så vi kan spse Round-Up på fro-kostblandingen. Forskerene sjekket bakterier som også har EPSPS, men som tålerglyphosate, og fant det ansvarlige genet. Dette genet kan få plantepromotor og-terminator, og kan klones inn i planter. Det kan gjøres enten med Ti-plasmid,eller med en gene gun.

Gene gun er en metode for å få DNA inn i vertsceller. Dette gjøres ved å ’coate’tungmetallpartikler med klonede plasmider som inneholder riktig insert. Disse par-tiklene skytes på planten, og noen av partiklene treffer blink.

19

Insektsresistens går ofte ut på at planter har muligheten til å produsere toksinersom tar livet av skadedyr som spiser på planten. Bt toxin brukes for å bekjempeskadedyr, og kommer fra Cry proteine som brytes ned. Genet som produserer dettegenet ble funnet i en bakterie, og plassert i genomet til planter. Dette førte til atplantene produserte ganske små mengder av toksinet. Ved å endre kodonbruken,samt kutte ned på antall aminosyrer, ble produksjonen av Cry proteinene større.

Chapter 15: Transgenic Animals

Også dyr kan få endret sitt arvemateriale, og om de har fått ett eller flere frem-mede gener, kalles de transgene dyr.

Fremgangsmåten for transgene dyr er ganske grei. Først må en eggcelle og enspermcelle fusjonere. Rett etter dette vil den nye cellen ha to kjerner. Transgenetinjiseres i spermcellekjernen, da den er størst og enklest å treffe med en veldig litennål. Den befruktede cellen med transgenet plasseres deretter i en fostermor, somføder unger. De av ungene som har transgenet kalles founder animals, vil kun hadet i halvparten av sine kromosomer. Når to founder-dyr pares, vil statistisk sett25 % av avkommet ha transgenet i begge kromosomene. Når slike dyr krysses vilalle etterkommere ha transgenet.

Chimeric animals er delvis transgene dyr. Dette skjer fordi det injiserte DNA’ethar integrert seg for sent i celledelingen. Da har visse celler allerede fått noenfunksjoner, og transgenet vil kun finnes i visse kropsdeler. Eksempel på dette kanvære en mus med selvlysende flekker eller halvveis selvlysende mark osv.

Knockout mice er et viktig steg innen genforskningen. Det handler om å ødeleggeenkelte gener, for deretter å se hva resultatet blir i avkommet. I praksis ødeleggesgenet ved at det settes inn en ubrukelig kodebit (kasett) midt i genet. Dette førertil at genet mister sin funksjon. Knockout mus har hatt stor betydning for å finneut hvilke gener som har hvilken funksjon i kroppen, og de første som gjennomførtedet fikk Nobelprisen i medisin.

20

Sauen Dolly var det første klonede dyret, og ble født i 1996 i Scotland. Senere erdet blit klonet en rekke dyr, og det er ikke noe i veien for å kunne klone mennesker,bortsett fra at det er helt ulovlig, overalt!

Kloning kan ha mange fordeler. Man kan redde en utdøende rase, ved å klone ettav de siste dyrene. En utdødd rase kan gjenopplives, om man har uskadet DNA. Iforbindelse med kloning kan man også tilføre transgener, slik at det klonede dyretkan produsere enzymer nyttige for andre formål. Det vil også være ulemper vedkloning, som at en bestand basert på et klonet dyr vil være mer mottakelige forarvelige sykdommer, såvel som epidemier osv. De fleste forsøk på kloning går galt,så å utføre kloning av mennesker er svært uetisk.

21