TBC, "the reemergent killer" aumento della tubercolosi nei paesi industrializzati crescente...

TBC, "the reemergent killer"TBC, "the reemergent killer"

aumento della tubercolosi nei paesi industrializzaticrescente diffusione dei ceppi di M. tuberculosis multiresistenti (MRMT)

la diagnostica tradizionalela diagnostica tradizionale

esame microscopicoesame colturaleidentificazioneantibiogramma

esame microscopicoesame microscopico

colorazione di Ziehl-Neelsenfluorescenza

tecnica scarsamente sensibile e non specie-specifica

Ziehl-NeelsenZiehl-Neelsen

1000x

fluorescenzafluorescenza

400x

metodi colturali "alternativi"metodi colturali "alternativi"

metodo radiometricoterreno bifasicoterreno con indicatore fluorescenteterreno Redox

il metodo radiometricoil metodo radiometrico

flaconcini sigillati di terreno liquido contenente un substrato (ac. palmitico) marcato con 14Cmiscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioniliberazione di CO2 radiomarcata ad opera del metabolismo battericorilevamento di radioattività nella fase gassosa come spia di batteri metabolicamente attivi

notevole accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

il terreno bifasicoil terreno bifasico

flacone di terreno liquido per micobatterimiscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazionislide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo, agarizzato, agar cioccolato)arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie isolate sul terreno solido

moderato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

medium con indicatore fluorescentemedium con indicatore fluorescente

provetta di terreno liquido per micobatterimiscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazionifluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigenocomparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo battericorilevamento della fluorescenza

visivo, sotto una lampada UV automatizzato

accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

il terreno Redoxil terreno Redox

i micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniformei sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazzano dai micobatteri in crescitail formazzano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche permettendone il riconoscimento

automazione nella coltura dei micobatteriautomazione nella coltura dei micobatteri

metodo radiometrico la produzione di CO2 radiomarcata viene rilevata da

un -counter

metodo pressometrico l’aumento di pressione, dovuto a produzione di CO2,

viene rilevato da un manometro

metodo fluorimetrico la fluorescenza di un indicatore, inibita dalla

presenza di ossigeno nel terreno, viene ripristinata per effetto del consumo di ossigeno

metodo refrattometrico la produzione di CO2 fa virare un sensore che a sua

volta modifica l’intensità di un raggio di luce riflessa

l’emocoltura per micobatteri 1l’emocoltura per micobatteri 1

la ricerca dei micobatteri nel sangue è giustificata per i pazienti immunodepressi nei quali può essere richiesta anche la mielocolturala bassa sensibilità rende inutile l’esecuzione dell’esame microscopico un tipo particolare di emocoltura è quello che si esegue sul sangue mestruale quando si sospettano forme tubercolari a carico dell’apparato genitale


semina diretta del sangue nei flaconi Bactec 13A nei flaconi BacT ALERT MB blood nelle bottiglie Bactec MYCO/F Lytic

semina dopo lisi-centrifugazione (sistema Isolator) su tutti i terreni solidi (a base di uovo o

sintetici) in tutti i terreni liquidi compresi quelli,

non dedicati alle emocolture, impiegati dai sistemi automatizzati

nel terreno bifasico


la sensibilità dei terreni solidi è notevolmente inferiore a quella dei terreni liquiditempi di incubazione inferiori alle otto settimane sono sconsigliati anche per i terreni liquidile specie appartenenti al MAC sono di gran lunga quelle di più frequente reperimentolo sviluppo di micobatteri in terreno liquido che non crescono nelle subcolture su terreno solido deve far pensare alla presenza della specie M. genavense

accumulo di niacinariduzione dei nitraticatalasi quantitativa termoresistente

idrolisi del Tween 80ureasiarilsolfatasiriduzione del tellurito

identificazione tradizionale, test biochimici

identificazione tradizionale, test biochimici

velocità di crescitaaspetto delle colonie rugose lisce fotocromogene scotocromogene non pigmentate

crescita a varie temperaturetest di inibizione selettiva

identificazione tradizionale, test colturali

identificazione tradizionale, test colturali

NAP testNAP test

il p-nitro-acetil-amino-idrossi-propriofenone (NAP), aggiunto al terreno di coltura, inibisce lo sviluppo dei micobatteri appartenenti al M. tuberculosis complex ma non quello dei micobatteri non tubercolari risultati accettabili solo in terreno liquido

test di screening rapido (4-7 gg)

metodi di identificazione “alternativi”metodi di identificazione “alternativi”

DNA probeHPLC degli acidi micolicisequenziamento genico16S rDNASODHSP65

il sistema AccuProbeil sistema AccuProbe

lisi delle cellule batteriche e liberazione del rRNAprobe marcato costituito da un frammento di DNA a filamento singolo contenente una sequenza specie-specifica presente in una regione ipervariabile del rRNAibridizzazione in presenza di complementarità fra rRNA e proberimozione della marcatura dal DNA non ibridizzatoeccitazione della molecola marcatrice chemioluminescenterilevamento della luce prodotta in presenza di molecole ibride di acidi nucleici

metodo rapido (2 h) altamente specifico

HPA (hybridization protection assay)HPA (hybridization protection assay)

gli esteri di acridinio utilizzati come marcatori emettono luce se eccitati chimicamentenel DNA a catena singola la molecola marcatrice è esposta all'azione di eventuali agenti inattivantila struttura assunta dall'acido nucleico a catena doppia protegge la molecola marcatrice dall'azione di eventuali agenti inattivantil'aggiunta di agenti inattivanti elimina ogni possibilità di emissione di segnale da parte di molecole non ibridizzate, l'emissione di luce è pertanto indice di avvenuta ibridizzazione

Line Probe Assay (LiPA) Line Probe Assay (LiPA)

LiPA, interpretazione LiPA, interpretazione

acidi grassi, ramificati in posizione presenti nella parete batterica dei generi:

Corynebacterium: 22-38 atomi di C Rhodococcus: 34-52 atomi di C Nocardia: 44-60 atomi di C Gordona: 48-66 atomi di C Tsukamurella: 64-78 atomi di C Mycobacterium: 60-90 atomi di C

presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici

alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega' metossi-

gli acidi micolici gli acidi micolici

HPLC degli acidi micoliciHPLC degli acidi micolici

saponificazione, estrazione e derivatizzazione degli acidi micolici presenti nella parete dei micobatterifrazionamento mediante HPLCindividuazione dei picchi presenti nel tracciato cromatografico e identificazione per confronto con profili di riferimento

profilo HPLC del M. tuberculosis complexprofilo HPLC del M. tuberculosis complex

ad eccezione del ad eccezione del M. bovisM. bovis BCG BCG

SI

esempi di profili HPLCesempi di profili HPLC

SI

SI

TLC degli acidi micoliciTLC degli acidi micolici

gas-cromatografiagas-cromatografia

RNA ribosomiale 16S RNA ribosomiale 16S

i farmaci antitubercolari maggioriil principio del metodo delle proporzionil’antibiogramma manualel’antibiogramma automatizzatol’antibiogramma sui micobatteri non tubercolari

antibiogrammaantibiogramma

antibiogramma radiometricoantibiogramma radiometrico

inoculo di una serie di flaconcini radiometrici, addizionati con antibiotici, con una sospensione micobatterica standardizzatainoculo di un flaconcino di controllo con una diluizione 1/100 della sospensione precedentelettura radiometrica giornaliera fino al raggiungimento, da parte del controllo, di una soglia prefissatasensibilitàflaconcini con incremento giornaliero inferiore a

quello del controlloresistenzaflaconcini con incremento giornaliero superiore a

quello del controllometodica di riferimento, durata 5-10 gg

le fasi dellaPolymerase Chain Reactionle fasi dellaPolymerase Chain Reaction

pretrattamento del materiale e liberazione dell'acido nucleico– fluidificazione ed eventuale

decontaminazione– lavaggio– lisi delle cellule

amplificazione dell'acido nucleicorilevamento dell'amplificato

componenti principali dellamiscela di amplificazionecomponenti principali dellamiscela di amplificazione

NUCLEOTIDI

PRIMER: oligonucleotidi complementari di sequenze presenti alle due estremità della regione da amplificare

POLIMERASI: enzima che determina l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi presenti nella miscela di reazione

i componenti della Mastermix del sistema Amplicor M. tuberculosis

i componenti della Mastermix del sistema Amplicor M. tuberculosis

NUCLEOTIDIassenza di nucleotidi contenenti timina (sostituiti da quelli contenenti uracile)

PRIMERcomplementari di sequenze che delimitano una regione del genoma specifica del genere Mycobacterium marcati con biotina

POLIMERASITaq polimerasi

il sistema AmpErase per la prevenzione delle contaminazioni

il sistema AmpErase per la prevenzione delle contaminazioni

il DNA-target non contiene uracileil DNA-amplificato contiene uracile al posto della timinal'aggiunta di uracil-N-glicosilasi al materiale da amplificare determina la distruzione di qualsiasi traccia di DNA contaminante (frutto di precedenti amplificazioni); l'enzima è invece del tutto inattivo sul DNA-target

i cicli termici della reazione di amplificazionei cicli termici della reazione di amplificazione

20 sec a 94°C: la doppia elica del DNA si separa ed i filamenti singoli costituiscono lo stampo per successive amplificazioni20 sec a 62°C: i primer si legano alle sequenze complementari presenti sul DNA-target (annealing)45 sec a 72°C: la polimerasi determina l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi presenti nella miscela di reazione

30 cicli (ne sono previsti 35) determinano la formazionedi un miliardo di copie del DNA originale

il rilevamento dell'amplificatoil rilevamento dell'amplificato

trasferimento dell'amplificato in un pozzetto di una piastra microtiter, coated con probe complementari di una sequenza dell'amplicone specifica per il M. tuberculosisincubazione (ibridizzazione)lavaggi (eliminazione dell'amplificato non ibridizzato)aggiunta del coniugato avidina-enzimaincubazione (legame avidina-amplicone biotinilato)lavaggi (eliminazione del coniugato non legato)aggiunta del substratoincubazione (reazione enzimatica)bloccaggio della reazione enzimaticalettura fotometrica a 450 nm

fluidificazione e decontaminazione del campionelisi (ultrasuoni) delle celluletrasferimento del lisato in provette contenenti la miscela di amplificazione e breve incubazione a 95°Caggiunta della miscela enzimatica e amplificazione isotermica (2 h a 42°C) di una regione del rRNA specifica del genere Mycobacteriumblocco dell'amplificazione ed ibridizzazione dell'eventuale amplificato con un DNA-probe specifico per il M. tuberculosis complexrilevamento HPA dell'eventuale ibridizzazione

le fasi della Transcriptase Mediated Amplification

le fasi della Transcriptase Mediated Amplification

il principio della TMAil principio della TMA

annealing dei primer, presenti nella miscela di reazione, con il rRNA liberato mediante lisi cellularesintesi di DNA a partire da RNA grazie alla transcriptasi inversaseparazione dell'ibrido DNA-RNA ad opera della RNasiutilizzo del DNA come stampo per la sintesi di molte copie di RNA ad opera della polimerasiulteriore annealing del RNA sintetizzato con nuovi primer

non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazioneformazione di 10 miliardi di copie in 2 ore

bamper primer

sito di restrizione

5’ 3’target

la Strand Displacement Amplificationla Strand Displacement Amplification

TARGET: IS6110PRINCIPALI COMPONENTI DELLA MISCELA DI AMPLIFICAZIONE:

bamper primer polimerasi enzima di restrizione

non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazione

SDA: amplificazione esponenzialeSDA: amplificazione esponenziale

il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA

ricerca del M. tuberculosis mediante amplificazione, pro e contro

ricerca del M. tuberculosis mediante amplificazione, pro e contro

rapiditàmetodiche in-house elevata sensibilità manualità complessa alto rischio di contaminazioni

metodiche commerciali sensibilità non superiore a quella della

coltura parzialmente automatizzabili minimo rischio di contaminazioni standardizzate solo per i materiali respiratori

indicazioni delle tecniche di amplificazioneindicazioni delle tecniche di amplificazione

utilizzabili per la ricerca di nuovi casinon utilizzabili per il monitoraggio della terapia

interpretazione del risultato dell’amplificazione 1interpretazione del risultato dell’amplificazione 1

Microscopia POS Amplificazione POS M. tuberculosis

Microscopia NEG Amplificazione NEG probabile NEG

Microscopia NEG Amplificazione POS probabile M. tuberculosis

Microscopia POS Amplificazione NEG probabile MOTT

interpretazione del risultato dell’amplificazione 2

interpretazione del risultato dell’amplificazione 2

Coltura POS Amplificazione POS M. tuberculosis

Coltura NEG Amplificazione NEG NEG

Coltura NEG Amplificazione POS ???

Coltura POS Amplificazione NEG M. tuberculosis o MOTT

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