TBC, "the reemergent killer" aumento della tubercolosi nei paesi industrializzati...

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  • TBC, "the reemergent killer" aumento della tubercolosi nei paesi industrializzati crescente diffusione dei ceppi di M. tuberculosis multiresistenti (MRMT)
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  • la diagnostica tradizionale esame microscopico esame colturale identificazione antibiogramma
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  • esame microscopico colorazione di Ziehl-Neelsen fluorescenza tecnica scarsamente sensibile e non specie-specifica
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  • Ziehl-Neelsen 1000x
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  • fluorescenza 400x
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  • metodi colturali "alternativi" metodo radiometrico terreno bifasico terreno con indicatore fluorescente terreno Redox
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  • il metodo radiometrico flaconcini sigillati di terreno liquido contenente un substrato (ac. palmitico) marcato con 14 C miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni liberazione di CO 2 radiomarcata ad opera del metabolismo batterico rilevamento di radioattivit nella fase gassosa come spia di batteri metabolicamente attivi notevole accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilit
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  • il terreno bifasico flacone di terreno liquido per micobatteri miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni slide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo, agarizzato, agar cioccolato) arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie isolate sul terreno solido moderato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilit
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  • medium con indicatore fluorescente provetta di terreno liquido per micobatteri miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni fluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigeno comparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo batterico rilevamento della fluorescenza visivo, sotto una lampada UV automatizzato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilit
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  • il terreno Redox i micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniforme i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazzano dai micobatteri in crescita il formazzano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche permettendone il riconoscimento
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  • automazione nella coltura dei micobatteri metodo radiometrico la produzione di CO 2 radiomarcata viene rilevata da un -counter metodo pressometrico laumento di pressione, dovuto a produzione di CO 2, viene rilevato da un manometro metodo fluorimetrico la fluorescenza di un indicatore, inibita dalla presenza di ossigeno nel terreno, viene ripristinata per effetto del consumo di ossigeno metodo refrattometrico la produzione di CO 2 fa virare un sensore che a sua volta modifica lintensit di un raggio di luce riflessa
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  • lemocoltura per micobatteri 1 la ricerca dei micobatteri nel sangue giustificata per i pazienti immunodepressi nei quali pu essere richiesta anche la mielocoltura la bassa sensibilit rende inutile lesecuzione dellesame microscopico un tipo particolare di emocoltura quello che si esegue sul sangue mestruale quando si sospettano forme tubercolari a carico dellapparato genitale
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  • lemocoltura per micobatteri 2 semina diretta del sangue nei flaconi Bactec 13A nei flaconi BacT ALERT MB blood nelle bottiglie Bactec MYCO/F Lytic semina dopo lisi-centrifugazione (sistema Isolator) su tutti i terreni solidi (a base di uovo o sintetici) in tutti i terreni liquidi compresi quelli, non dedicati alle emocolture, impiegati dai sistemi automatizzati nel terreno bifasico
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  • lemocoltura per micobatteri 3 la sensibilit dei terreni solidi notevolmente inferiore a quella dei terreni liquidi tempi di incubazione inferiori alle otto settimane sono sconsigliati anche per i terreni liquidi le specie appartenenti al MAC sono di gran lunga quelle di pi frequente reperimento lo sviluppo di micobatteri in terreno liquido che non crescono nelle subcolture su terreno solido deve far pensare alla presenza della specie M. genavense
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  • accumulo di niacina riduzione dei nitrati catalasi quantitativa termoresistente idrolisi del Tween 80 ureasi arilsolfatasi riduzione del tellurito identificazione tradizionale, test biochimici
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  • velocit di crescita aspetto delle colonie rugose lisce fotocromogene scotocromogene non pigmentate crescita a varie temperature test di inibizione selettiva identificazione tradizionale, test colturali
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  • NAP test il p-nitro-acetil-amino-idrossi-propriofenone (NAP), aggiunto al terreno di coltura, inibisce lo sviluppo dei micobatteri appartenenti al M. tuberculosis complex ma non quello dei micobatteri non tubercolari risultati accettabili solo in terreno liquido test di screening rapido (4-7 gg)
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  • metodi di identificazione alternativi DNA probe HPLC degli acidi micolici sequenziamento genico 16S rDNA SOD HSP65
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  • il sistema AccuProbe lisi delle cellule batteriche e liberazione del rRNA probe marcato costituito da un frammento di DNA a filamento singolo contenente una sequenza specie- specifica presente in una regione ipervariabile del rRNA ibridizzazione in presenza di complementarit fra rRNA e probe rimozione della marcatura dal DNA non ibridizzato eccitazione della molecola marcatrice chemioluminescente rilevamento della luce prodotta in presenza di molecole ibride di acidi nucleici metodo rapido (2 h) altamente specifico
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  • HPA (hybridization protection assay) gli esteri di acridinio utilizzati come marcatori emettono luce se eccitati chimicamente nel DNA a catena singola la molecola marcatrice esposta all'azione di eventuali agenti inattivanti la struttura assunta dall'acido nucleico a catena doppia protegge la molecola marcatrice dall'azione di eventuali agenti inattivanti l'aggiunta di agenti inattivanti elimina ogni possibilit di emissione di segnale da parte di molecole non ibridizzate, l'emissione di luce pertanto indice di avvenuta ibridizzazione
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  • Line Probe Assay (LiPA)
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  • LiPA, interpretazione
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  • acidi grassi, ramificati in posizione presenti nella parete batterica dei generi: Corynebacterium: 22-38 atomi di C Rhodococcus: 34-52 atomi di C Nocardia: 44-60 atomi di C Gordona: 48-66 atomi di C Tsukamurella: 64-78 atomi di C Mycobacterium: 60-90 atomi di C presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega' metossi- gli acidi micolici
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  • HPLC degli acidi micolici saponificazione, estrazione e derivatizzazione degli acidi micolici presenti nella parete dei micobatteri frazionamento mediante HPLC individuazione dei picchi presenti nel tracciato cromatografico e identificazione per confronto con profili di riferimento
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  • profilo HPLC del M. tuberculosis complex ad eccezione del M. bovis BCG SI
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  • esempi di profili HPLC SI
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  • TLC degli acidi micolici
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  • gas-cromatografia
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  • RNA ribosomiale 16S
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  • i farmaci antitubercolari maggiori il principio del metodo delle proporzioni lantibiogramma manuale lantibiogramma automatizzato lantibiogramma sui micobatteri non tubercolari antibiogramma
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  • antibiogramma radiometrico inoculo di una serie di flaconcini radiometrici, addizionati con antibiotici, con una sospensione micobatterica standardizzata inoculo di un flaconcino di controllo con una diluizione 1/100 della sospensione precedente lettura radiometrica giornaliera fino al raggiungimento, da parte del controllo, di una soglia prefissata sensibilit flaconcini con incremento giornaliero inferiore a quello del controllo resistenza flaconcini con incremento giornaliero superiore a quello del controllo metodica di riferimento, durata 5-10 gg
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  • le fasi della Polymerase Chain Reaction pretrattamento del materiale e liberazione dell'acido nucleico fluidificazione ed eventuale decontaminazione lavaggio lisi delle cellule amplificazione dell'acido nucleico rilevamento dell'amplificato
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  • componenti principali della miscela di amplificazione NUCLEOTIDI PRIMER: oligonucleotidi complementari di sequenze presenti alle due estremit della regione da amplificare POLIMERASI: enzima che determina l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi presenti nella miscela di reazione
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  • i componenti della Mastermix del sistema Amplicor M. tuberculosis NUCLEOTIDI assenza di nucleotidi contenenti timina (sostituiti da quelli contenenti uracile) PRIMER complementari di sequenze che delimitano una regione del genoma specifica del genere Mycobacterium marcati con biotina POLIMERASI Taq polimerasi
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  • il sistema AmpErase per la prevenzione delle contaminazioni il DNA-target non contiene uracile il DNA-amplificato contiene uracile al posto della timina l'aggiunta di urac