ILEANA STOICA TATIANA VASSU ELENA SĂSĂRMAN

BIOLOGIA ŞI TAXONOMIA MOLECULARĂA MICROORGANISMELOR

COLECŢIA DE CULTURI MICROBIENE

Ilustraţie: Oana Iftime

Ileana Stoica Coperta: Oana Iftime

Redactor: Oana Iftime Ileana Stoica

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a RomânieiSTOICA, ILEANA

Biologia şi taxonomia moleculară a microorganismelor:Colecţia de culturi microbiene / Ileana Stoica, Tatiana Vassu-Dimov,Elena Săsărman – Bucureşti: Arvin Press, 2002

p. ; cm.ISBN 973-96090-3-8

I. Vassu-Dimov, TatianaII. Săsărman, Elena

579.8

CAPITOLUL VII

Taxonomia moleculară a bacteriilor

VII.1. Definiţii. Generalităţi

Taxonomia, cunoscută şi sub denumirtea de (bio)sistematică, reprezintă ştiinţa clasificării şi reuneşte de fapt, trei domenii ştiinţifice:

(1) Clasificarea – gruparea organismelor în grupe distincte (denumite taxoni) pe baza unor caractere de asemănare;

(2) Nomenclatura – atribuirea de nume (nomen) taxonilor definiţi de clasificare;(3) Identificarea – poziţionarea unui organism necunoscut într-una din grupele definite de

clasificare şi denumite de nomenclatură.În taxonomia modernă au fost integrate/asociate două alte domenii ştiinţifice: filogenia

şi genetica populaţiilor. Ca urmare, în ultimii 15 ani, este unanim acceptată ideea conform căreia clasificarea bacteriilor ar trebui să reflecte, cât mai apropiat posibil, relaţiile naturale dintre taxonii bacterieni.

Pentru a stabili şi defini grupe în cadrul clasificării microorganismelor, Vandamme (1996) a propus utilizarea aşa-numitei taxonomii polifazice. În acest scop, taxonii sunt definiţi pe baza informaţiilor obţinute de diverse discipline, reunind astfel atât date fenotipice (cunoscute ca facând parte din taxonomia convenţională), cât şi date de nivel molecular (taxonomia moleculară, chemotaxonomie).

La bacterii, taxonomia convenţională se bazează pe o serie de trăsături morfologice, structurale, fiziologice şi biochimice: forma şi mărimea celulei, morfologia coloniilor, ultrastructura celulei, constituenţii peretelui celular, tinctorialitate, motilitate, incluziuni celulare, surse de carbon, azot şi energie, produse de fermentaţie, range-ul de temperaturi/pH optime, toleranţa osmotică, metabolizarea oxigenului, sensibilitatea la o serie de inhibitori metabolici şi la antibiotice.

Taxonomia moleculară se ocupă cu studiul variaţiilor chimice în organismele vii şi folosirea acestor caractere, atât pentru clasificarea şi identificarea unui organism necunoscut, cât şi pentru evidenţierea relaţiilor filogenetice, evolutive, dintre diverse organisme.

Multe dintre caracterele fiziologice şi biochimice prezintă dezavantaje majore: variază, atât calitativ, cât şi cantitativ, funcţie de condiţiile de cultivare. La rândul lor, acestea variază în mod obiectiv datorită necesităţilor nutriţionale diferite de la o grupă la alta de bacterii. Ca urmare, este dificil de elaborat sisteme standard de analiză a unor asemenea parametri, sisteme care să fie universal valabile pentru toate bacteriile.

Pe de altă parte, cercetările din ultimii 15 ani au demonstrat că, cel puţin parte din caracterele morfologice şi fiziologice, reprezintă adaptări ale populaţiilor bacteriene la diverse nişe ecologice şi nu exprimă decât în mică măsură gradul de înrudire reală dintre diverşi taxoni bacterieni.

Nu în ultimul rând este de subliniat faptul că în ultimul deceniu au fost descrise din ce în ce mai multe specii bacteriene ce nu sunt cultivabile.

În contrast cu aceste dezavantaje ale taxonomiei convenţionale, taxonomia moleculară şi, în mod particular, acizii nucleici, prezintă o serie de avantaje generale:

(1) deşi cantitatea de ADN per celulă poate varia funcţie de diverşi factori (condiţii de cultivare, fază a ciclului celular, numărul de copii ale unui replicon per celulă), totuşi ADN-ul nu variază din punct de vedere “calitativ”, adică nu variază secvenţa de nucleotide;

(2) gradul de înrudire între diverşi taxoni bacterieni este exprimat cel mai bine la nivel de ADN;

(3) în prezent, moleculele ADN pot fi analizate şi la microorganisme necultivabile.

VII.2. Conceptul de specie în lumea bacteriană

Grupul taxonomic de bază în sistematica bacteriană modernă este specia. Definirea conceptului de specie bacteriană a ridicat şi încă ridică probleme deosebite.

Astfel, de-a lungul anilor conceptul de specie bacteriană a suferit o serie de transformări. Astfel, Mayr (1957) oferea o abordare practică uşor de folosit în laboratoarele de microbiologie din perioada respectivă, considerând că speciile bacteriene reprezintă entităţi “statice” (ce nu evoluează) definite prin trăsături fenotipice. Nu se ţinea seama de faptul că speciile bacteriene sunt compuse din populaţii naturale aflate în proces de evoluţie moleculară. Pe de altă parte, conceptul de specie biologică descris de Mayr se baza pe interbreeding şi, ca atare, acest concept este aplicabil la speciile de eucariote la care există fenomenul de sexualitate. Astfel, conform sistematicii eucariotelor, specia reprezintă un grup de organisme a căror divergenţă este contrabalansată de o forţă de coeziune ce se bazează din punct de vedere genetic pe fenomenul de sexualitate (Cohan, 2002). În contrast, conceptul lui Mayr este dificil de aplicat la organisme asexuate cum sunt procariotele (D.M.Ward, 1998).

La sfârşitul anilor 50, specia bacteriană era definită doar pe criterii morfo-fiziologice, rezultatele testelor fiind supuse unor analize multivariate sub forma taxonomiei numerice. Este totuşi de aminit şi faptul că în 1961 Simpson (citat de Ward, 1998) elaborează conceptul de specie evolutivă, concept conform căruia o specie reprezintă o secvenţă (temporală) de populaţii cu ascendent comun şi care evoluează separat de alte populaţii.

Anii 60 sunt cunoscuţi ca fiind debutul analizelor de tip molecular. Punerea la punct a unor tehnici fezabile de izolare şi purificare a moleculelor de ADN cromozomal (Marmur, 1961) şi, mai apoi, şi a celor de ADN plasmidial, au condus şi la primele analize taxonomice pe acizi nucleici.

Primul criteriu de taxonomie moleculară ce a fost utilizat în sistematica bacteriană a fost compoziţia totală în nucleotide, altfel exprimat procentul molar de guanină + citozină (%mol GC) (De Ley J., 1963 şi 1970). Tulpinile bacteriene a căror %mol GC diferea semnificativ erau considerate ca aparţinând la taxoni diferiţi – specii, sau chiar genuri diferite. Cercetările în această direcţie au avansat în ultimii 20 de ani, punându-se la punct tehnici din ce în ce mai acurate, dar şi mai rapide, şi elaborându-se un întreg aparat matematic conex (Franck, 1971; Owen, 1985; Diaz, 1989). În prezent, procentul molar de guanină + citozină este un parametru listat în toate manualele internaţionale şi cerut la orice descriere de specie bacteriană nouă, rămânând însă un criteriu negativ, de excludere taxonomică.

Compoziţia globală în baze azotate (exprimată în %mol GC) era totuşi o informaţie destul de “superficială”, simţindu-se necesitatea diferenţierii mai precise a genomurilor bacteriene. Ca urmare, de la jumătatea anilor 70, în tehnicile de taxonomie moleculară şi-a făcut apariţia metoda hibridizării ADN : ADN (De Ley, 1970), metodă ce exprimă gradul de omologie de secvenţă între doi cromozomi bacterieni ce aparţin la tulpini con-specifice sau din specii diferite. Şi în acest caz au fost dezvoltate tehnici din ce în ce mai precise şi mai rapide.

Esenţial este însă faptul că s-a constatat că acest parametru are valoare taxonomică mult mai mare, permiţând diferenţierea speciilor bacteriene. Astfel, şi în prezent este încă oficial

acceptată de către Comitetul Internaţional de Sistematică Bacteriană, definiţia speciei bacteriene ca “grup de tulpini bacteriene (inclusiv tulpina tip) ce prezintă cel puţin 70% omologie de secvenţă ADN, cu o valoare a Tm de cel mult 5oC” (Wayne, 1987).

Dezvoltarea tehnicilor de biologie moleculară (şi, în mod special, a tehnologiei PCR şi a tehnicilor de secvenţiere ADN) în ultimii 20 de ani a culminat cu studiul secvenţelor ARNr, mai corect spus, a genelor ce codifică aceste molecule. S-a constatat că, din punct de vedere taxonomic, dintre cele 3 tipuri de ARN ribozomal de la bacterii (5S, 16S şi, respectiv, 23S), cele mai utile sunt cele de dimensiune medie (16S). Moleculele de ARNr 16S (ca, de altfel, şi celelalte două tipuri) prezintă o structură “modulară”, conţinând domenii ce prezintă grade diferite de variabilitate de secvenţă.

Pe baza analizelor acestor molecule au fost obţinute foarte multe informaţii utile din punct de vedere taxonomic şi filogenetic. Astfel, grupul Archaea (cunoscut anterior ca Archaebacteria) a fost recunoscut ca grup independent, separat de Bacteria (anterior denumit Eubacteria) (Woese, 1990 şi 2000; Wheelis, 1992; Olsen, 1994).

A existat o perioadă când s-a crezut că studiul acestor molecule reprezintă punctul ultim în taxonomia bacteriilor. Mai mult chiar, pe baza analizei moleculelor ARNr de dimensiune medie au fost propuşi noi arbori filogenetici – universali şi, respectiv, de grup (Olsen, 1994).

În ceea ce priveşte însă diferenţierea taxonomică a speciilor bacteriene, s-a constatat că moleculele ARNr 16S nu oferă o rezoluţie suficient de bună, sau chiar pot conduce la interpretări eronate. S-a concluzionat astfel că cea mai completă sursă de informaţii taxonomice de nivel molecular este genomul bacterian ca întreg. Nici una din gene luate separat, nici măcar cele ce codifică pentru ARNr, nu oferă suficiente informaţii pentru diferenţierea speciilor bacteriene (Schloter, 2000).

Pe de altă parte, deşi este încă oficial acceptată definirea speciei bacteriene pe baza omologiei de secvenţă la nivel de genom întreg, totuşi în ultimii 5 ani au fost realizate o serie de studii ce tind să demonstreze faptul că gradul total de omologie ADN este totuşi un parametru mult prea “grosier”. Coeziunea genetică în interiorul speciilor bacteriene s-ar baza pe existenţa unor clusteri genetici (filogenetici) cu structură suficient de conservată în interiorul speciilor bacteriene, şi diferită între specii (Embley, 1997; Gest, 1999; Liu, 1999). Cu totate acestea, până în prezent, majoritatea celor ce lucrează taxonomie bacteriană consideră că analiza moleculelor ARNr 16S oferă un cadru satisfăcător pentru clasificarea procariotelor.

Pe plan internaţional, sunt recomandate studiile de taxonomie polifazică, în mod special pentru taxonii bacterieni inferiori, cum este de altfel şi specia (Vandamme, 1996). Cu ajutorul taxonomiei polifazice sunt reunite criterii dintre cele mai diverse, fenotipice şi genotipice. În prezent, descrierea unei noi specii procariote este acceptată numai dacă este descrisă atât din punct de vedere genetic (şi, în mod obligatoriu, %mol GC şi grad de omologie ADN faţă de speciile apropiate), cât şi din punct de vedere fenotipic (atât trăsături fenotipice ce o încadrează într-un gen bacterian alături de alte specii, cât şi trăsături ce o diferenţiază de acestea).

O problemă de loc neglijabilă în taxonomia bacteriană o reprezintă aşa-numita “izolare sexuală”. Nu ne referim la proto (para) sexualitatea bacteriilor, aşa cum era denumit fenomenul de conjugare bacteriană în anii 50 (bacteriile F+ erau numite bacterii mascule, iar cele F - bacterii femele). Dacă la organismele eucariote se poate vorbi de sexualitate propriu-zisă, la procariote conceptul de sex îşi lărgeşte accepţiunea, putând fi comparat cu schimbul de material genetic pe orizontală (între indivizi aparţinând aceloraşi generaţii) (Majewski, 2001).

În lumea bacteriană acest fenomen de transfer se realizează practic prin 3 tipuri principale de mecanisme: transformare genetică, conjugare şi transducţie (de la Cruz, 2000). În cazul transformării genetice, bacteriile includ molecule ADN ce provin de la alţi indivizi biologici, fără intervenţia unor elemente genetice specializate (Dreiseikelmann, 1994; Lorenz,

1994). În conjugarea bacteriană, transferul de gene cromozomale de la o bacterie la alta este realizat de plasmide conjugative sau de transpozoni conjugativi (Amabile-Cuevas, 1992; Cohen, 1993). În transducţie, genele cromozomale sunt transferatede la o bacterie la alta de către bacteriofagi (Campbell, 1992).

S-a constatat că unele specii bacteriene favorizează anumite tipuri de transfer. De exemplu, Bacillus subtilis este în mod natural uşor transformabil cu ADN exogen, prezentând în cursul ciclului celular o etapă de competenţă genetică naturală. În contrast, bacteriile din specia Escherichia coli nu desfăşoară în mod natural transformare genetică, în schimb favorizează evenimentele de transducţie. La o extremă se află genul Pseudomonas, la care toate cele 3 tipuri de fenomene de transfer genetic orizontal par să fie extrem de frecvente, determinând o versatilitate catabolică şi o capacitate adaptativă foarte mare a acestui grup de bacterii.

Indiferent de varianta de transfer, se pune problema izolării speciilor bacteriene : dacă aceste evenimente de transfer au loc doar în interiorul speciilor bacteriene, sau şi între bacterii aparţinând la specii diferite. Cercetările efectuate până în prezent au evidenţiat încă o dată extrema variabilitate în lumea bacteriană. Astfel, din punct de vedere al transformării genetice, anumite specii bacteriene (de exemplu, cele aparţinând genurilor Neisseria, Haemophilus) acceptă doar ADN înrudit, deci aparţinând la aceeaşi specie; există însă şi specii bacteriene (din genurile Streptoccus, Pseudomonas) care pot accepta şi molecule ADN de la specii îndepărtate filogenetic.

Un alt exemplu îl reprezintă plasmidele conjugative de antibiorezistenţă care traversează barierele de specie, răspândindu-se global între bacteriile patogene. În mod similar acţionează şi plasmidele conjugative ce poartă gene catabolice, plasmide ce se pot răspândi rapid între diverse specii bacteriene cu capacităţi xenodegradative.

Nu în ultimul rând, este de amintit faptul că au fost evidenţiate fenomene de transfer de material genetic chiar şi între bacterii şi plante, bacterii şi drojdii, bacterii şi alte tipuri de organisme eucariote (Young, 2001).

În concluzie, conceptul de specie în lumea bacteriană reprezintă o problemă extrem de dezbătută în ultimul deceniu. Este însă necesară acumularea de mult mai multe informaţii pentru a putea defini aceste “noduri” cu existenţă temporară într-un continuum de schimbare şi evoluţie.

VII.3. Analiza proteinelor citoplasmatice

Analizele taxonomice ale proteinelor citoplasmatice pot fi realizate prin două categorii mari de tehnici:

a) comparaţii între molecule individuale; acest tip de analize se realizează, fie prin secvenţierea comparativă a aminoacizilor din componenţa proteinelor, fie prin reacţii de tip serologic;

b) evaluarea globală a proteinelor totale: se realizează prin compararea mobilităţilor electroforetice ale unor seturi de proteine.

1. Serologia comparativă a proteinelor

Reacţiile de tip serologic pot detecta asemănări structurale între enzime din diverse tulpini bacteriene. De regulă, se alege o enzimă purificată din câteva tulpini de referinţă, pentru a obţine astfel antiserurile. În continuare, antiserurile sunt folosite în imunodifuzie

bidimensională pentru a compara antiserurile cu enzimelor izologe din diverse tulpini bacteriene.

Această tehnică se bazează pe faptul că orice variaţie în secvenţa de aminoacizi a unei proteine se va reflecta în structura sa secundară şi, deci, şi în antigenicitate. Serologia cantitativă reprezintă o tehnică rapidă, ce oferă date preliminare pentru identificarea taxonomică a tulpinilor bacteriene.

Majoritatea studiilor de serologie comparativă s-au centrat pe bacterii lactice (Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus), iar ca enzime: fructozo- aldolaza, glucozo-6-fosfatdehidrogenaza, lactat-dehidrogenaza.

2. Electroforeza comparativa a proteinelor

În general, un genom bacterian codifică în medie aproximativ 2000 de proteine, parte cu funcţii structurale, parte cu funcţii enzimatice. S-a constatat că în condiţii standard de cultivare complementul proteic este relativ constant. Prin electroforeza proteinelor totale în gel de poliacrilamidă se obţine o separare parţială a proteinelor, în sensul că fiecare bandă din gel reprezintă, de fapt, mai multe clase de proteine; pattern-ul total reprezintă însă o “amprentă” (fingerprint) a tulpinii bacteriene respective.

Electroforeza comparativă a proteinelor totale constituie o analiză echivalentă, din punct de vedere al informaţiilor taxonomice, cu analizele de reasociere ADN:ADN (grad de omologie de secvenţă de nucleotide), ambele oferind rezultate congruente. Diferenţa constă în faptul că electroforeza proteinelor este o tehnică mult mai rapidă decât reasocierea ADN:ADN.

În ansamblu, deşi electroforeza proteinelor totale prezintă reproductibilitate înaltă în acelaşi laborator, s-au înregistrat totuşi diferenţe între rezultate obţinute în laboratoare diferite.

3. MultiLocus Enzyme Electrophoresis (MLEE)

În ultimii ani, MLEE reprezintă cel mai folosit tip de analize de taxonomie moleculară pe proteine. Cu ajutorul acestei metode, diverse tulpini bacteriene pot fi clasificate în grupe, pe baza prezenţei sau absenţei anumitor enzime, şi prin compararea mobilităţilor lor electroforetice.

Ca principiu, tehnica se bazează pe faptul că diferenţele în secvenţele de aminoacizi din diverse proteine determină diferenţe în sarcina electrostatică a moleculelor respective şi, ca atare, diferenţe de mobilitate în câmp electric. Variantele moleculare de mobilitate electroforetică au fost denumite electromorfe (sinonim cu electrotipuri, ET) sau alozime şi sunt echivalente cu alelele de la eucariotele superioare (în contrast cu izozimele ce reprezintă un acelaşi tip de enzimă codificat însă de loci diferiţi).

S-a demonstrat că distanţele genetice estimate prin MLEE se corelează strâns cu cele estimate prin studii de reasociere ADN:ADN. Pe de altă parte, s-a constatat că tehnica MLEE este utilă în mod special în decelarea variabilităţii genetice intra-specifice, şi mai puţin pentru a compara tulpini ce aparţin la specii diferite.

Tehnica MLEE presupune ca principale etape: obţinerea extractului proteic celular, electoforeză în gel de poliacrilamidă; se aplică apoi o coloraţie pentru o anumită enzimă (sau clasă de enzime). Mobilităţile electroforetice ale enzimelor din diverse tulpini bacteriene se compară cu mobilităţile electroforetice a enzimei dintr-o tulpină bacteriană standard. Se consideră că enzimele ce prezintă aceeaşi mobilitate electroforetică fac parte din aceeaşi electromorfă (în contrast cu enzimele ce au mobilităţi diferite şi care se consideră că fac parte

din electromorfe diferite). În acest mod, fiecare tulpină bacteriană este caracterizată prin combinaţia sa de electromorfe.

Studii extinse realizate pe foarte multe tulpini bacteriene Gram-negative au condus la 3 concluzii generale:

(1) Majoritatea speciilor bacteriene au structură clonalăConform acestei afirmaţii, speciile bacteriene sunt compuse din grupuri de tulpini

identice, sau cvasi-identice, denumite clone. Membrii unei clone se caracterizează prin:- au pattern MLEE identic- sunt stabile pe perioade lungi de timp- din punct de vedere geografic, au răspândire globală

Se consideră totodată, că este foarte puţin probabil ca două tulpini bacteriene din două stocuri genetice diferite, să conveargă spre un pattern MLEE identic, ci probabil că au derivat din acelaşi parental.

Studiile au mai constatat faptul că din punct de vedere al structurii clonale, există 2 tipuri principale de specii bacteriene:

a) specii bacteriene cu structură clonală “stringentă ”La asemenea specii, clonele sunt extrem de diferite între ele şi este de presupus

evenimentele de transfer de gene între clone sunt foarte sporadice. Cele mai cunoscute exemple de asemenea specii bacteriene sunt Escherichia coli, Haemophilus, Legionella - specii cunoscute ca fiind greu transformabile cu ADN exogen.

b) specii bacteriene cu structură clonală relaxată La asemenea specii (de ex. Neisseria gonorhoeae, Bacillus subtilis), evenimentele de

transfer de gene pe orizontală, între clone, sunt foarte frecvente, astfel încât are loc un fenomen de randomizare a alelelor. Era de aşteptat ca cele două specii menţionate să aibă structură clonală slabă, pentru că amândouă sunt, în mod natural, fiziologic, uşor transformabile cu ADN exogen.

(2) În interiorul speciilor cu structură clonală, numărul clonelor este redusAnalize moleculare pe un număr mare de specii şi tulpini bacteriene au condus la

concluzia că numărul de clone din interiorul unei specii este destul de mic. De exemplu, un studiu pe proteine corespunzătoare la 12 loci la 2000 de tulpini de Escherichia coli a evidenţiat existenţa a doar 300 de electromorfe, toate având răspândire geografică globală.

(3) La microorganismele patogene, foarte puţine clone sunt asociate cu îmbolnăviri grave.

În general, s-a constatat că patogenitatea variază mult în interiorul unei specii bacteriene, şi numai puţine clone au evoluat prin creşterea virulenţei. Pe de altă parte, s-a demonstrat şi faptul că la speciile ce pot infecta gazde diferite, există o corelaţie între organismul gazdă şi tipul clonal. Astfel, la Bordetella bronchiseptica, clona ET-1 este izolată numai de la porc, în timp ce clona ET-6 este izolată numai de la câine.

În concluzie, cu ajutorul analizelor MLEE, s-a constatat că diversitatea intraspecifică găsită la majoritatea speciilor bacteriene este mult mai mică decât cea aşteptată (dacă alelele s-ar fi combinat randomizat şi independent una de cealaltă), existând o tendinţă pronunţată de a se asocia anumite combinaţii de alele. Se poate spune, deci, că la foarte multe specii bacteriene există tendinţa menţinerii unui linkage la nivelul întregului cromozom (chromosome-wide).

VII.4. Analiza învelişului celular

Învelişul celular al bacteriilor prezintă o compoziţie şi o structură suficient de variabilă pentru a putea oferi informaţii cu valoare taxonomică.

1. Peptidoglicanul

Peptidoglicanul intră în compoziţia peretelui celular la marea majoritate a bacteriilor, existând diferenţe în structura sa, mai ales în diaminoacidul lanţurilor tetrapeptidice şi în structura unor peptide.

La bacteriile Gram-negative, peptidoglicanul are o structură relativ uniformă şi, ca atare, nu prezintă interes pentru studiile de taxonomie. În contrast, el este extrem de util la bacteriile Gram-pozitive, în mod special la actinomicete (şi la bacteriile înrudite cu acestea), care au fost clasificate în 8 chemotipuri de perete celular.

2. Lipidele

În celulele bacteriene există 4 clase importante de lipide: acizi graşi cu lanţ lung, acizi micolici, lipide polare şi, respectiv, quinone izoprenoide.

Acizii graşi cu lanţ lung

La acest tip de molecule pot să varieze mai mulţi parametri: lungimea lanţului de carbon (între 8 şi 26 atomi de carbon), prezenţa/absenţa ramificaţiilor (ramificaţiile sunt predominante la bacteriile Gram-pozitive). Este de menţionat faptul că aceşti doi parametri determină gradul de fluiditate a membranei celulare.

Alţi parametri ce variază sunt gradul de saturare a legăturilor chimice dintre atomii de carbon şi prezenţa/absenţa structurilor chimice inelare.

Acizii micolici

Acizii micolicii reprezintă forme moleculare de acizi graşi şi au fost identificaţi doar la foarte puţine genuri bacteriene: Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia. În acizii micolici numărul total de atomi de carbon este foarte mare (între 24 şi 90), fapt pentru care ei creează un înveliş ceros, impermeabil.

Lipide polare

Lipidele polare intră în structura membranei celulare. Unele din ele sunt mult prea comune şi, ca atare, nu prezintă valoare taxonomică. Altele sunt însă mai specifice: fosfatidil-inozitol-manozidele sunt specifice actinomicetelor; pe de altă parte, Archaea au lipidele eterificate, şi nu esterificate.

Quinone izoprenoide

Acest tip de molecule există în membrana tuturor bacteriilor aerobe; există însă variaţii de gen şi chiar de specie bacteriană.

3. Produse metabolice

Analizele moleculare a produselor metabolice sunt valoroase din punct de vedere taxonomic mai ales pentru bacteriile anaerobe, care au un pattern complex de produse metabolice.

4. Celule întregi

În acest tip de analiză, celulele sunt cultivate în condiţii standard, apoi sunt degradate termic la 3 - 400oC. Produsul este analizat prin gaz-cromatografie sau prin spectrometrie de masa şi reprezintă o amprentă a tulpinii respective.

VII.5. Analize taxonomice pe ADN cromozomal

In analizele de chemosistematică s-a constatat că compoziţia chimică a majorităţii microorganismelor depinde substanţial de condiţiile de mediu, fiind astfel necesară stabilirea unor condiţii standard de testare.

In contrast, s-a mai constatat că moleculele acizilor nucleici, şi în mod special ADN cromozomal, nu sunt afectate calitativ de condiţiile de creştere. S-a concluzionat deci, că acizii nucleici reprezintă singurele molecule standard prin care pot fi comparate şi clasificate o gamă largă de microorganisme.

In prezent, s-au dezvoltat o serie întreagă de analize de nivel molecular pe ADN cromozomal, ce pot oferi informaţii cu valoare taxonomică despre microorganisme.

1. Procentul molar de guanină + citozină

Una dintre cele mai folosite tipuri de analize este reprezentată de determinarea compoziţiei ADN cromozomal, în ceea ce priveşte conţinutul în cele 4 baze azotate – adenină (A), timină (T), guanină (G) şi citozină (C). Complementaritatea bazelor azotate (A = T şi G = C), precum şi structura în duplex (dublucatenară) a moleculei ADN, asigură cantităţi echivalente de guanină faţă de citozină şi, respectiv, adenină faţă de timină. In acest sens, în prezent, conţinutul în baze azotate a unei molecule ADN este exprimat ca procent molar de guanină + citozină (mol% GC) (Marmur, 1962 ; DeLey, 1963, 1970a şi b ; Siedler, 1971 ; Johnson, 1985).

Studiile realizate pe foarte mulţi taxoni bacterieni au condus la concluzia că acest parametru variază între limite foarte largi: între 25 %mol GC la unele micoplasme, şi 75 %mol GC la unele streptomicete (Vandamme, 1996). Pe de altă parte, s-a mai constatat că deşi bacteriile diferă între ele foarte mult în ceea ce priveşte compoziţia în baze azotate, valoarea procentului molar de guanină + citozină este constantă pentru fiecare tip de microorganism în parte.

Este important de subliniat faptul că similaritatea în compoziţia în baze azotate nu înseamnă în mod necesar că două microorganisme sunt înrudite, pentru că pot avea aceeaşi valoare a procentului molar de guanină + citozină, dar secvenţe diferite de nucleotide. Un exemplu (dintre foarte multe) îl oferă speciile Spirochaeta halophila şi Pseudomonas

testosteroni, care au amândouă 62 %mol GC, deşi cele două microorganisme nu sunt apropiate din punct de vedere filogenetic.

Reciproca însă nu este valabilă. Astfel, două microorganisme cu valori foarte diferite ale procentului molar G+C, în mod necesar au şi secvenţă diferita de nucleotide. Deci, compoziţia în baze azotate – exprimată ca %mol GC – reprezintă un criteriu taxonomic de excludere şi nu de includere.

In ansamblu, se poate aprecia că procentul molar de G + C reprezintă o măsură a gradului de heterogenitate genetică. S-a constatat astfel, că la majoritatea genurilor bacteriene, acest parametru variază între limite destul de înguste (10-12 procente). Există însă şi genuri bacteriene în interiorul cărora heterogenitatea genetică este foarte mare (Tabelul 7.1), o extremă fiind reprezentată de genul Flavobacterium, în interiorul căruia %mol GC variază între 31 şi 68%. Alte astfel de genuri bacteriene sunt Lactobacillus (32 – 52 %mol GC), Bacillus (33 – 64 %mol GC), Haemophilus (37 – 55 %mol GC). Ca urmare, s-a sugerat necesitatea diferenţierii unor asemenea taxoni în mai multe genuri bacteriene.

In concluzie, acumularea informaţiilor privind procentul molar de guanină + citozină a condus la propunerea (Priest, 1994) ca încadrarea taxonomică a microorganismelor să fie realizată astfel încât variaţia genetică maximă permisă în interiorul unui gen bacterian să fie de 10-12 procente, iar cea din interiorul unei specii bacteriene să fie de 5%.

Nu în ultimul rând, subliniem faptul că manualele Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Krieg, 1984), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt, 1994), The Prokaryotes (Starr, 1981), includ valorile %mol GC la un număr foarte mare din taxonii descrişi.

Tabelul 7.1 Compoziţia în baze azotate la câteva genuri bacteriene (după Priest, 1994)

GEN BACTERIAN

(GRAM-NEGATIVE)%MOL GC GEN BACTERIAN

(GRAM-POZITIVE)%MOL GC

Acetobacter 51-65 Bacillus 33-64Aeromonas 57-63 Clostridium 22-55Cytophaga 29-45 Corynebacterium 51-63Enterobacter 52-60 Lactobacillus 32-52Escherichia 48-52 Micrococcus 66-75Haemophilus 37-44 Mycobacterium 62-70Klebsiella 53-58 Staphylococcus 30-37Pseudomonas 58-70 Streptococcus 34-46Rhodospirillum 60-67 Streptomyces 69-77

Variante tehnice de determinare a %mol GC

In ceea ce priveşte variantele tehnice de determinare a compoziţiei în baze azotate, există în prezent 3 metode principale:

hidroliza moleculelor ADN până la nivel de baze azotate şi cuantificarea acestora prin cromatografie în fază lichidă, de înaltă performanţă (HPLC – High Performance-

Pressure Liquid Chromatography); această metodă este extrem de acurată, dar laborioasă şi foarte costisitoare;

ultracentrifugarea probei de ADN cromozomal în gradient de densitate de CsCl; se calculează apoi densitatea de plutire a moleculelor de ADN din probă cu ajutorul densităţii de plutire a unei probe standard de ADN; procentul molar G + C se calculează pe baza relaţiei:

densitatea de plutire = 1.66 + 0.098 x %mol GC

Şi această metodă este laborioasă şi costisitoare, deşi nu la fel de acurată ca HPLC.

denaturarea termică - în prezent cea mai folosită variantă tehnică pentru estimarea procentului molar de guanină + citozină dintr-o probă de ADN.In această tehnică, moleculele de ADN sunt încălzite între 20 şi 100oC, timp în care

este măsurată spectrofotometric variaţia absorbanţei la lungimea de undă = 260 nm (A260). Datorită creşterii temperaturii, are loc denaturarea termică a moleculelor ADN. Procesul constă în ruperea legăturilor de hidrogen dintre cele două catene şi, deci, ADN trece din formă dublucatenară în formă monocatenară.

In timpul denaturării termice, valoarea A260 creşte cu până la 40%, proces denumit shift hipercromic. Temperatura la care jumătate din cantitatea de ADN se află deja sub formă monocatenară este denumită temperatură de topire Tm şi este corelată linear cu procentul molar de guanină + citozină din probă.

De-a lungul anilor, au fost elaborate mai multe ecuaţii de corelaţie între aceşti doi parametri - %mol GC şi Tm – funcţie de încărcătura ionică a tamponului în care a fost dizolvat ADN (în mod special, funcţie de concentraţia ionilor Na+), precum şi funcţie de tipul de microorganism. Astfel, pentru bacterii au fost elaborate două ecuaţii de corelaţie:

(1) %mol GC = 2.44 x Tm – 169 (Franck, 1971)utilă când ADN este dizolvat în 0.1X SSC (NaCl 15 mM, citrat trisodic 1.5 mM), deci

la o concentraţie mai mare a ionilor Na+.

(2) %mol GC = 2.44 x Tm – 131.5 (Diaz, 1989)utilă când ADN este dizolvat în tampon TE pH 8.0 (Tris 10 mM EDTA 1mM), deci la

concentraţie mică a ionilor Na+

Owen (1985) a elaborat o altă ecuaţie de corelaţie:

(3) %mol GC = 2.08 x Tm – 106.4utilă în mod special pentru ADN din drojdii.

Din curbele de shift hipercromic se calculează valorile temperaturii de topire Tm, folosindu-se acelaşi program SWIFT-Tm v1.05. Indiferent de formula aplicată, este necesară folosirea unui ADN de referinţă, de cele mai multe ori ADN cromozomal de Escherichia coli, care are mol% GC = 51 (Figurile 7.1, 7.2).

Literatura de specialitate (Starr, 1981; Krieg, 1984; Holt, 1994) listează în tabelele de identificare, alături de criteriile morfo-fiziologice şi biochimice, şi compoziţia în baze azotate, exprimată ca procent molar de G + C. Deşi valoarea taxonomică a acestui parametru molecular este indiscutabil inferioară secvenţei de nucleotide a genelor pentru ARNr (şi, la

bacterii, în mod special 16S ARNr), %mol GC este în prezent acceptat ca parametru cvasi-universal de taxonomie moleculară.

Subliniem valoarea taxonomică a acestui parametru de nivel molecular, în contextul unor abordări de tip polifazic în taxonomia bacteriană.

Mai mult decât atât, determinările de procent molar G+C au contribuit substanţial şi la studiile de filogenetică. Astfel, s-a confirmat şi pe această cale că bacteriile Gram-negative sunt distincte filogenetic de cele Gram-pozitive. Totodată, s-a demonstrat că bacteriile Gram-pozitive formează o linie filetică care se divide în două ramuri ce pot fi distinse una de cealaltă pe baza compoziţiei în G+C :

(a) linia actinomicete – bacterii corineforme, ce se caracterizează printr-un %mol GC de mai mare de 55% ;

(b) linia Bacillus – Clostridium – Streptococcus, cu un %mol GC mai mic de 55%.Totodată, s-a constatat că o serie de taxoni asociaţi anterior cu actinomicetele, de fapt,

fac parte din cea de-a doua linie filetică : Eubacterium este înrudit cu Clostridium, Kurthia este înrudită cu bacteriile lactice, iar Thermoactinomyces cu familia Bacillaceae.

Figura 7.1. Curba de denaturare termică a ADN cromozomal din E. coli B. (Tm = 74.9 %molGC = 51.27)

2. Omologia de secvenţă ADN

Una din proprietăţile fizice deosebite ale acizilor nucleici este capacitatea monocatenelor de a reasocia prin reformarea legăturilor de hidrogen, pe bază de complementaritate între bazele azotate. Hibridizarea acizilor nucleici reprezintă, deci, procesul prin care două monocatene ADN sau ARN din surse biologice diferite, reformează configuraţia dublu-catenară. Din punct de vedere chimic, procesul se bazează pe:

- principiul complementarităţii dintre cele două catene ale unui duplex ADN sau ARN;- eventuala omologie de secvenţă dintre cele două surse ADN.

În principal, există două modalităţi de determinare a omologiei de secvenţă ADN:(a)determinări în soluţie, cu ADN liber;(b)determinări pe suport solid pe care sunt imoblizate moleculele de ADN.

Figura 7.2. Curba de denaturare termică a ADN cromozomal din P.aeruginosa ATCC 27853 (Tm = 81.6 %molGC = 67.6).

Determinări în soluţie, cu ADN liber

Asemenea determinări se pot realiza în mai multe variante tehnice: 1. determinări în soluţie, cu ADN de referinţă marcat

- se folosesc molecule de ADN dintr-o tulpină de referinţă (ADN de referinţă), digerate în fragmente de dimensiuni mici (oligonucleotide), monocatenare şi marcate cu 14C (Figura 7.3) şi, respectiv, molecule ADN din tulpina de analizat

(ADN probă), tot sub formă monocatenară, dar nemarcate (ADN-ul probă se introduce într-o concentraţie mult mai mare faţă de cel de referinţă) ;

- după amestecarea celor două tipuri de monocatene, hibrizii dublucatenari pot fi separaţi de cele două tipuri de monocatene, fie prin cromatografie pe hidroxiapatită (doar moleculele de ADN d.c. se vor lega de hidroxiapatită), fie prin digestie cu nuclează SI (acest tip de enzimă digeră doar monocatenele) ;

- în final, se efectuează o determinare a concentraţiei de 14C cu ajutorul unui contor de tip Geiger-Muller.

2. determinări în soluţie, cu ADN nemarcatDeterminările de reasociere ADN :ADN, în soluţie, nu necesită în mod obligatoriu,

molecule de ADN marcat. În general, procesul de reasociere a unor molecule monocatenare de ADN este însoţită de o reducere a absorbanţei la = 260 nm (A260). Ratele iniţiale de reasociere a unui amestec echimolar de molecule ADN din două surse biologice diferite (dintre care una este lcunoscută din punct de vedere taxonomic) se compară cu ratele iniţiale ale reacţiilor omoloage. Este evident faptul că moleculele din amestec vor reasocia mai încet decât în cazul reacţiilor omoloage. Există deja formule de corelare pentru estimarea omologiei de secvenţă ADN.

Acest tip de tehnică prezintă o serie de avantaje : este foarte rapidă, nu necesită ADN marcat, poate realiza comparaţii între diverse perechi de microorganisme (nu neapărat între o tulpină necunoscută şi una de referinţă) şi este suficient de acurată.

Figura 7.3. Reprezentarea schematizata a hibridizarii ADN: ADN in solutie

Determinări pe suport solid

Şi în acest caz există două variante tehnice :

1. reasociere directă (« direct binding »)2. reasociere competitiva

În cazul reasocierii directe, pe suportul solid se fixează ADN probă monocatenar (denaturat) nemarcat (Figura 7.4). Peste acesta se adaugă o soluţie ce conţine ADN de referinţă monocatenar marcat cu 14C. După realizarea etapei de hibridizare (urmată apoi de cea de spălare), gradul de radioactivitate al filtrelor se citeşte într-un contor de tip Geiger-Muller, un număr ridicat de impulsuri semnificând un grad ridicat de omologie de secvenţă între ADN probă şi ADN de referinţă utilizat.

Figura 7.4. Reprezentarea schematizata a hibridizarii ADN : ADN prin legare directa (pe suport solid)

În reasocierea competitivă (Figura 7.5) se folosesc 3 tipuri de molecule de ADN :- ADN de referinţă m.c. marcat, de lungime mică ;- ADN de referinţă m.c. nemarcat, de lungime mare ;- ADN probă m.c., nemarcat, de lungime mare.Pe filtru se fixează ADN de referinţă mare ; peste acesta se adaugă celelalte două tipuri

de ADN, care vor intra în competiţie unul cu celălalt pentru a hibridiza cu ADN-ul fixat. După hibridizare şi spălare, filtrele se citesc în contor Geiger-Muller. De data aceasta, corelaţia este invers proporţională : un număr mare de impulsuri semnifică un grad scăzut de omologie, în timp ce un număr mic de impulsuri semnifică un grad ridicat de omologie între ADN probă şi ADN de referinţă.

Figura 7.5. Reprezentare schematizata a hibridizarii ADN : ADN de tip competitiv

Pentru a obţine rezulate repreductibile, este necesar ca toate determinările experimentale de reasociere ADN:ADN să fie standardizate. În principal, există 5 factori ce afectează aceste determinări:

(1)lungimea fragmentelor de ADN probă

Cu cât aceste fragmente sunt mai mari, cu atât rata de reasociere este mai mare (fragmentele foarte mici – de aproximativ 15 nucleotide lungime - nu pot participa eficient în procesele de renaturare); totuşi, cu cât creşte vâscozitatea soluţiei, cu atât scade rata renaturării; în final se ajunge la un compromis tehnic: fragmentele sunt micşorate (fie prin sonicare, fie cu ajutorul unei prese franceze) pentru a avea o greutate moleculară uniformă, de aproximativ 1 – 5 x 105 dal.

(2) rata renaturării creşte proporţional cu tăria ionică a tamponului de incubare

Prezenţa sărurilor este esenţială în procesele de renaturare a moleculelor de ADN. Astfel, în absenţa sărurilor ADN-ul nu va renatura datorită repulsiei dintre sarcinile negative ale grupărilor fosfat. Pe de altă parte, duplexurile de acizi nucleici formate la tării ionice înalte au specificitate mai redusă. Ca urmare, se folosesc tampoane de ractţie standard, bazate de regulă pe SSC (NaCl 0.15M citrat trisodic 0.015M pH 7.0). Ionii de Na+ acoperă grupările fosfat, iar citratul reprezintă un agent chelator pentru cationii bivalenţi, inhibând astfel activitatea nucleazelor.

(3)puritatea preparatelor ADN

În procesele de renaturare ADN este extrem de importantă puritatea probei. Astfel, prezenţa moleculelor de ARN, de carbohidraţi, interferă cu reasocierea ADN:ADN. Pe de altă parte, moleculele de ADN trebuie să fie complet denaturate (monocatenare), ceea ce este realizată de obicei prin fierbere şi răcire rapidă pe gheaţă.

(4)concentraţia ADN şi timpul de incubare

Formarea duplexului este o funcţie doi parametri (Cot): concentraţia iniţială a moleculelor de ADN (Co) şi timpul de incubare (t). Schimbarea concentraţiei substratului în timp este proporţională cu pătratul concentraţiei: dc/dt = k x c2.

Forma integrală a ecuaţiei este:

C / Co = 1 / (1 + k x Cot)

C / Co = raportul între concentraţia ADN m.c. la timpul t şi concentraţia iniţială (Co) a ADN m.c. la timpul to. Ca urmare, C / Co este o funcţie ce exprimă procentul de reasociere a ADN m.c.

Valoarea Cot1/2 reflectă mărimea sau complexitatea genomului şi este atinsă mai rapid în cazul genomurilor mai mici.

(5) temperatura de incubare a amestecului

În general, rata optimă de renaturare este la 25oC sub Tm (“melting temperature” = temperatura de topire) a amestecului. La temperaturi mai mici de [Tm – 25oC]  prin reasociere între secvenţe neomoloage se formează hibrzi nespecifici. La temperaturi mai mari de [Tm – 25oC] procesul de renaturare este stringent, iar rata reacţiei scade foarte mult. În general, dacă se examinează bacterii înrudite, este recomandabil să se lucreze la temperaturi de aproximativ [Tm – 10-15oC].

Valoarea taxonomică a studiilor de reasociere ADN:ADN

Studiile de reasociere ADN:ADN sunt recomandate pentru evaluarea relaţiilor fenetice, din mai multe motive:(1) Compoziţia ADN a unei celule este constantă indiferent de condiţiile de creştere (şi deci,

de stadiul fiziologic). Din acest motiv clasificările bazate pe reasociere ADN sunt mai stabile.

(2) Estimarea înrudirii dintre organisme se bazează pe genotipul întreg.De regulă, comparaţiile fenetice se fac analizând o mică partea genotipului (5 – 20%). În cazul reasocierii ADN, se utilizează întreg genomul şi, ca atare, informaţiile au o mai mare valoare. Pe de altă parte, reasocierea ADN şi fenetica numerică dau rezultate (clasificări) similare.

(3) Analizele de reasociere ADN pot fi realzate cu o fineţe mai mare, estimând stabilităţile termice ale duplexelor reasociate. Datorită secvenţelor împerecheate greşit sau neîmperecheate, moleculele ADN hibride rezultate în urma unui proces de reasociere au, în general, o valoare Tm mai mică decât valoarea Tm a duplexurilor parentale. Experimentele realizate au dus la concluzia că fiecare scădere a Tm cu câte 0.7oC reprezintă 1% baze împerecheate greşit.

Măsurând reducerea Tm (Tm) putem estima gradul de divergenţă a celor două secvenţe. De exemplu, hibridul Escherichia coli : Serratia marcescens are Tm = 13 – 14oC (faţă de parentali), valoare ce corespunde la aproximativ 20% divergenţe de secvenţă în

moleculele hibridului. Hibridul E.coli : Shigella dysentariae are Tm = 1 – 6oC (faţă de parentali), valoare ce corespunde la aproximativ 4% divergenţe de secvenţă în moleculele hibridului. Dacă Escherichia coli reprezintă ancestorul comun, atunci probabil că Serratia marcescens s-a desprins mai devreme decât Shigella dysentariae.(4) Omologia ADN oferă un concept unificator al speciei bacteriene. De regulă, o specie bacteriană reprezintă un grup de tulpini ce au foarte multe trăsături comune, tulpini care, la rândul lor, diferă de alte grupuri de tulpini. Această definiţie este extrem de subiectivă, datorită faptului că multe specii bacteriene sunt foarte heterogene. Aparent, organismele din cadrul speciilor bacteriene deja definite ar trebui să prezinte o înaltă omologie a moleculelor de ADN; şi invers, organismele din specii diferite ar trebui să aibă omologie slabă.

În urma experimentelor şi a dezbaterilor, s-a stabilit ca limita inferioară a omologiei ADN din cadrul speciei bacteriene să fie de 70%, în condiţii optime de hibridizare ADN. Ca urmare, organismele din cadrul unei specii ar trebui să aibă cel puţin 70% înrudire ADN şi cel mult 5% divergenţă de secvenţe ADN, ambele măsurate prin Tm. Aceasta reprezintă, în final, o definiţie universală a speciei “genomice” procariote.(5) Aplicarea unor tehnici cu sonde ADN reprezintă o extensie a experimentelor de reasociere ADN; în acest caz, detectarea şi identificarea bacteriilor se realizează mult mai rapid şi specific.

Există foarte multe exemple în care studiile de reasociere ADN au modificat sistematica bacteriană. Cea mai cunoscută situaţie o reprezintă specia Bacillus sphaericus. În cadrul acestei specii, unele tulpini sunt patogene pentru larvele de ţânţari, ceea ce a permis elaborarea unor strategii de control biologic al numărului de ţânţari. Această specie bacteriană este diferită de alţi bacili prin faptul că poate diferenţia endospori sferici (în timp ce la ceilalţi bacili, endosporii sunt ovali). Au un metabolism strict oxidativ, preferând ca sursă de carbon şi energie, acetatul şi alţi acizi organici. În mod tradiţional, toate bacteriile ce formează endospori sferici erau încadrate în Bacillus sphaericus. Studiile de reasociere ADN au demonstrat existenţa a cel puţin 5 grupe de omologie, deci 5 “specii genomice”, dintre care cele mai importante sunt:

Grupa I – Bacillus sphaericus sensu strictoGrupa II - include toate tulpinile patogene pe ţânţariPe de altă parte, tehnicile de reasociere ADN au şi limitări. Astfel, se recomandă

comparaţii cu tulpini test din taxonul studiat, în caz contrar putând apărea erori de interpretare. Totodată, se mai recomandă folosirea metodelor de reasociere ADN în combinaţie cu o altă tehnică, de exemplu cu taxonomia numerică tradiţională.

VII.6. Analiza unor gene cromozomale

Cronometre moleculare

În 1965, Zuckerkandl şi Pauling (Zuckerkandl, 1965) au publicat articolul devenit clasic în care lansau conceptul de cronometru molecular. Ipoteza existenţei unor cronometre moleculare ale evoluţiei s-a bazat pe opbservaţia că numărul de aminoacizi schimbaţi într-o anumită proteină pare să fie proporţional cu timpul scurs de la separarea celor două organisme comparate. Astfel, o moleculă a cărei secvenţă se schimbă randomizat în timp poate fi considerată un cronometru molecular al evoluţiei. Cantitatea de secvenţă schimbată pe care o acumulează o asemenea moleculă (această cantitate fiind formal denumită “distanţă”) este egală cu produsul dintre rata de fixare a mutaţiilor şi timpul în care a avut loc schimbarea (Ayala, 1997). Este însă de menţionat faptul că nu avem la dispoziţie ancestorii şi, ca atare, această distanţă o măsurăm între reprezentanţii biologici actuali.

În urma analizelor realizate s-a constatat că nu toate moleculele au valoare egală în determinarea relaţiilor filogenetice între specii biologice. Pentru a fi un cronometru folositor, o moleculă trebuie să îndeplinească următoarele caractere:

(a) să aibă comportament de ceas molecular, adică schimbarea în secvenţa sa să aibă loc cât mai randomizat posibil;

(b) să aibă un range cât mai mare: ratele schimbării să acopere distanţe evoluţionare suficient de mari;

(c) să aibă o dimensiune suficient de mare.

Comportamentul de ceas molecular

S-ar putea crede că cel mai bun cronometru ar fi un segment genetic asupra căruia nu acţionează presiunea selecţiei naturale. Ca atare, schimbările într-o asemenea moleculă ar avea loc complet randomizat de-a lungul segmentului şi toate mutaţiile ar fi fixate în moleculă, transmiţându-se la descendenţi.

Totuşi, asemenea molecule nu prezintă nici o valoare pentru măsurătorile filogenetice, pentru că ele se schimbă atât de rapid, încât acoperă doar range-uri filogenetice foarte restrânse şi pot măsura doar evenimente evolutive pe termen scurt. Cel mai cunoscut exemplu este reprezentat de nucleotidele din poziţia a treia a codonilor în diverse gene structurale (datorită degenerării codului genetic aceste nucleotide se pot schimba fără să afecteze secvenţa de nucleotide a proteinei codificate).

Moleculele cu un bun comportament de ceas molecular sunt cele cu funcţii foarte conservate, deci supuse unei puternice presiuni selective. Asemenea molecule au o rată de schimbare atât de scăzută încât pot acoperi un spectru evolutiv foarte mare. Această caracteriastică prezintă însă şi dezavantajul că poate mări în mod artificial distanţele filogenetice dintre două specii. Cel mai cunoscut exemplu este gena ce codifică citocromul c.

Range-ul filogenetic

Trebuie luat în considerare faptul că timpul în care bacteriile au existat şi, respectiv, evoluat, este mult mai mare decât timpul în care au evoluat organismele eucariote. Acest lucru este amplificat şi de faptul că, în general, timpul în care are loc evoluţia biologică se numără în număr de generaţii şi nu în număr de ani; ori, se ştie că procariotele au un timp de generaţie foarte mic şi, ca atare, au avut la dispoziţie un număr imens de generaţii.

Ca urmare, range-ul cronometrelor folositoare pentru măsurarea relaţiilor filogenetice dintre bacterii trebuie să fie mult mai mare decât cel al cronometrelor utilizate la organisme metazoare. Astfel, citocromul c poate oferi o rezoluţie filogenetică suficient de bună pentru o serie de eucariote. Pentru bacterii însă, această moleculă are un range restrâns la nivel de subdiviziune: poate ordona filogenetic bacteriile din subdiviziunea -proteobacterii, dar nu le poate lega pe acestea de altă subdiviziune a proteobacteriilor.

Dimensiunea

În afară de necesitatea unei dimensiuni destul de mari, mai important este ca moecula să fie alcătuită dintr-un mare număr de domenii sau unităţi funcţionale; acestea ar putea fi reprezentate de regiuni relativ independente una de cealaltă din punct de vedere evolutiv, astfel încât eventuale schimbări ne-randomizate într-una din unităţi să nu afecteze celalalte unităţi.

Analize pe ARNr

In ultimii zece ani, dezvoltarea progresivă a tehnicilor de analiză moleculară şi, în mod special, a tehnicilor de amplificare in vitro a unor secvenţe de acizi nucleici (PCR = Polymerase Chain Reaction), precum şi a tehnicilor de determinare a secvenţelor de nucleotide, a condus la acumularea unor informaţii importante privind caracteristicile moleculare ale genomurilor unor extrem de diverse organisme. S-a ajuns astfel la concluzia că, dintre toate moleculele existente în sistemele vii, speciile de ARN ribozomal constituie cele mai bune cronometre moleculare. Ele sunt prezente la toate organismele şi, ca urmare, pe baza analizelor acestor molecule, pot fi realizate comparaţii între foarte diverse organisme. Pe de altă parte, moleculele de ARN ribozomal prezintă, în scară evolutivă, un grad foarte ridicat de constanţă funcţională, fapt ce le asigură un bun comportament de ceas molecular.

Mai mult decât atât, analizele moleculare au relevat faptul că moleculele de ARN ribozomal sunt alcătuite din domenii, grupate în 3 clase de variabilitate genetică:

domenii relativ constante – secvenţa lor de nucleotide variază foarte puţin, acoperind un range filogenetic foarte mare ;

domenii cu variabilitate moderată - acoperă distanţe filogenetice mai restrânse, putând distinge între genuri biologice;

domenii hipervariabile – secvenţa lor variază suficient de mult pentru a putea diferenţia chiar specii ale aceluiaşi gen sau tulpini bacteriene conspecifice.Analiza extensivă a moleculelor de ARN ribozomal de la foarte multe specii biologice

a determinat acumularea unei impresionante cantităţi de informaţii, fapt ce a condus la elaborarea unui alt model de evoluţie filogenetică a vieţii pe Terra. Conform acestui model (Woese, 1990), organismele au fost clasificate în 3 mari domenii: Bacteria, Archaea şi Eukarya (Figura 7.6).

Figura 7.6. Arbore filogenetic universal construit prin analize comparative de secvenţe ARNr (după Woese, 2000)

Deşi analiza ARN-urilor ribozomale este utilă şi în studii pe organisme de nivel eucariot superior, aceste molecule devin aproape indispensabile în cercetările pe microorganisme. La Bacteria există 3 categorii principale de molecule de ARN ribozomal:

5S ARNr – are 115 – 120 nucleotide şi este considerat o moleculă prea mică (incorporează prea puţină informaţie) pentru a putea fi un bun indicator de înrudire filogenetică;

16S ARNr (Figura 7.7)– în medie are 1500 nucleotide şi este alcătuit din 3 domenii majore şi din 50 de helixuri. Această moleculă este considerată cea mai bună pentru estimarea gradului de înrudire filogenetică dintre două tulpini bacteriene;

23S ARNr – are o dimensiune mai mare (aproximativ 2500-3000 nucleotide), fiind mai dificil de manipulat.

In concluzie, se poate aprecia că, dintre cele 3 categorii de ARNr de la Bacteria, molecula de 16S ARNr este suficient de mare pentru a oferi informaţii utile şi, în acelaşi timp, suficient de mică pentru a putea fi manipulată relativ uşor (Giovannoni, 1991 ; Lane, 1991 ; Stackebrandt, 1994 ; Palleroni, 1997).

O lungă perioadă de timp, analiza moleculei 16S ARNr reprezenta chiar o provocare din punct de vedere tehnic, necesitând purificarea şi concentrarea moleculelor ARN. Dezvoltarea tehnicilor de tip PCR a simplificat foarte mult aceste studii, permiţând în prezent, obţinerea relativ rapidă, a unor cantităţi suficient de mari din gena pentru 16S ARNr (16S ADNr) (Tabelul 7.2). Mai mult decât atât, folosind diverse perechi de primeri se pot obţine, fie gena în totalitatea ei, fie anumite fragmente (în acest caz, se analizează de obicei, regiunile cu structură hipervariabilă) (Embley, 1994; Hugenholtz, 1996).

Figura 7.7. Structura moleculei de 16S ARNr de la Escherichia coli (după Lane, 1991).

Tabelul 7.2 Secvenţe de nucleotide din gena pentru 16S ARNr ce pot fi utilizate ca primeri în tehnici PCR sau de secvenţiere (după Lane, 1991)

SECVENŢA COMENTARII

27f* 5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG PCR şi secvenţiere, majoritatea eubacteriilor342r** 5- CTGCTGCGCCCCGTAG majoritatea eubacteriilor357r 5- CTCCTACGGGAGGCAGCAG majoritatea eubacteriilor519r 5- GAATTACCGCGGCGGCTG majoritatea eubacteriilor, eucariotelor,

arhebacteriilor530f 5- GTGCCAGCCGCCGCGG majoritatea eubacteriilor, eucariotelor,

arhebacteriilor907r 5- CCGTCAATTCCTTTAAGTTT majoritatea eubacteriilor, eucariotelor,

arhebacteriilor926f 5- AAACTCAAAGGAATTGACGG majoritatea eubacteriilor, eucariotelor,

arhebacteriilor1100r 5- GGGTTGCGCTCGTTG majoritatea eubacteriilor1114f 5- GCAACGAGCGCAACCC majoritatea eubacteriilor1392r 5- ACGGGCGGTGTGTAC majoritatea eubacteriilor, eucariotelor,

arhebacteriilor1406f 5- TGCACACACCTCCCGT majoritatea eubacteriilor, eucariotelor,

arhebacteriilor1492r 5- TACGGCTACCTTGTTACGACTT PCR şi secvenţiere, majoritatea

eubacteriilor, arhebacteriilor1525r 5- AAGGAGGTGATCCAACC PCR şi secvenţiere, majoritatea

eubacteriilor, arhebacteriilor

* f = forward (direcţia de sinteză a catenei noi)** r = reverse

Odată amplificată gena de 16S ARNr, ea poate fi investigată în diverse moduri: fie prin secvenţiere (direct, sau clonată în prealabil într-un vector adecvat), fie prin digestie cu endonucleaze de restricţie (Figura 7.11), tehnică denumită ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) (Vanneechoutte, 1995).

În ultimii ani, secvenţierea moleculelor de ARNr 16S este abordată în din ce în ce mai multe laboratoare. Pe de altă parte, dezvolaterea de programe de calculator a permis construcţia unor baze de date (GenBank, EMBL-Bank) ce conţin în prezent secvenţa de nucleotide a peste 20.000 de molecule ARNr 16S (Wuyts, 2002) (Figurile 7.8, 7.9, 7.10).

Figura 7.8. Secventa de nucleotide si structura secundara a moleculei ARNr 16S de la Escherichia

coli, ca reprezentant al Domeniului Bacteria

Figura 7.9. Secventa de nucleotide si structura secundara a moleculei ARNr 16S de la Haloarcula marismortui, ca reprezentant al Domeniului Archaea

Figura 7.10. Secventa de nucleotide si structura secundara a moleculei ARNr 16S de la Saccharomyces cerevisiae, ca reprezentant al Domeniului Eukarya

Analizele de tip ARDRA realizate în ultimii ani la diverse microorganisme, au relevat faptul că informaţiile obţinute cu ajutorul acestei tehnici au valoare taxonomică, de multe ori cu o rezoluţie taxonomică egală cu cea a tehnicilor de secvenţiere (de Baere, 2002; Amann, 1995;; Vaneechoutte, 1995 şi 1999; Snaidr, 1997; Widmer, 1998; Dunbar, 1999; Mahenthiralingam, 2000; Ross, 2000). Mai mult decât atât, Moyer (1996), într-un studiu extensiv de restricţie enzimatică (cu 10 endonucleaze de restricţie) simulată pe calculator, pe secvenţe 16S ADNr aparţinând la 106 taxoni din întregul domeniu Bacteria, avansează următoarele recomandări pentru analizele ARDRA:

folosirea – pentru stabilirea pattern-urilor ARDRA – pe cât posibil, a cât mai multor endonucleaze de restricţie;

utilizarea a cel puţin 3 endonucleaze de restricţie diferite, în reacţii de digestie separată a ampliconilor 16S ADNr, astfel:

- utilizarea Rsa I (5-GTAC-3), pentru diferenţierea genurilor şi speciilor bacteriene;

- utilizarea Hae III (5-GGCC-3), şi Hinf I (5-GANTC-3) pentru diferenţierea tulpinilor conspecifice

In final, Moyer (1996) introduce conceptul de OTU (Operational Taxonomic Units = Unităţi Taxonomice Operaţionale) ca grup de microorganisme cu pattern ARDRA identic, recomandând stabilirea unui OTU cu cel puţin 3 enzime de restricţie.

Figura 7.11. Posibilităţi de investigare a genei pentru 16S ARNr

Pentru amplificarea întregii genei de ARNr 16S de la majoritatea tulpinilor din Bacteria se foloseşte perechea de primeri :

8f 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492r 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3

Aceste secvenţe sunt complementare cu două regiuni cvasi-universale ale moleculei de 16S ADNr, plasate aproape de marginile genei (Heyndrickx, 1995; Snaidr, 1997; Moesender, 1999). Astfel, prin utilizarea acestor doi primeri se poate amplifica aproape întreaga genă 16S ADNr (aproximativ 1484 bp) din orice reprezentant al domeniului Bacteria. In următoarea etapă a tehnicii ARDRA, ampliconii sunt digeraţi (în reacţii separate) cu endonucleaze de restricţie, iar fragmentele se separă prin electroforeză în gel de agaroză 2% (Figurile 7.11, 7.12, 7.13).

Figura 7.11. ARDRA cu CfoI la micobacterii (de Baere, 2002)

Figura 7.12. ARDRA cu MboI la micobacterii (de Baere, 2002)

Figura 7.13. ARDRA cu RsaI la micobacterii (de Baere, 2002)

In ultimii ani, tehnicile bazate pe PCR fingerprinting (în mod special ARDRA) s-au dovedit din ce în ce mai utile, mai ales în caracterizarea structurii comunităţilor bacteriene (Vaneechoutte, 1995; Snaidr, 1997; Dunbar, 1999; Fernandez, 1999; Mahenthiralingam, 2000; Ross, 2000). In esenţă, tehnica ARDRA prezintă următoarele avantaje:

permite analize moleculare şi pe microorganisme greu cultivabile; abordează variaţii ale secvenţei de nucleotide din gena pentru 16S ARNr – în prezent

considerată gena ce poate oferi informaţii de taxonomie şi filogenie moleculară de înaltă acurateţe; subliniem faptul că studiile pe întreaga genă 16S ADNr (amplificată cu perechi de primeri universali) diminuează semnificativ riscul de a nu evidenţia o serie de microorganisme greu cultivabile (Snaidr, 1997) ;

nu necesită secvenţierea ampliconilor 16S ADNr, ci utilizează variante tehnice mai puţin laborioase : digestie cu endonucleaze de restricţie ;

funcţie de combinaţia de endonucleaze de restricţie utilizate, tehnica ARDRA poate distinge între genuri bacteriene, specii congenerice, sau chiar tulpini conspecifice ; mai mult decât atât, în cercetări comparative (Moyer, 1996 ; Vaneechoutte, 1999), s-a constatat că ARDRA se înscrie între tehnicile cu putere discriminatorie (de tipare a tulpinilor bacteriene) dintre cele mai ridicate (95.8), alături de tehnica RFLP pe ADN genomic.

Hae III M1 Hinf I M2 Rsa I __

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 7.14. Pattern-uri ARDRA evidenţiate prin electroforeză în gel de agaroză 2%

Godeuri: 1, 4, 7 – P.aeruginosa ATCC 27853 digerat cu Hae III, Hinf I şi, respectiv, Rsa I;2, 5, 8 – P.aeruginosa GMQ-1 digerat cu Hae III, Hinf I şi, respectiv, Rsa I;3 – -ADN/Eco RI, Hind III (M1); 6 – -ADN/Bst EII (M2).

Indiferent de modalităţile prin care este studiată, gena pentru ARNr 16S a oferit foarte multe informaţii :

(1) o imagine logică a clasificării procariotelor, indicând şi relaţiile ce n-au putut fi stabilite pe baze fenotipice ;

(2) concepte unificatoare asupra taxonilor de gen şi superiori ;(3) estimarea posibilelor căi de evoluţie pentru toate organismele.

VII.7. Variabilitatea genetică intraspecifică la bacterii

Variabilitatea genetică reprezintă o cerinţă a evoluţiei biologice. Sursele generale ale variabilităţii genetice sunt reprezentate de mutaţie genetică, recombinare genetică, achiziţie genetică şi selecţie.

Mutaţia genică este definită în prezent ca fiind orice schimbare în secvenţa de nucleotide. Astfel, mutaţie poate fi schimbarea unei singure perechi de nucleotide (mutaţie punctiformă), rearanjarea unor secvenţe în cadrul unui acelaşi cromozom (rearanjamente cromozomale), conversii genice, duplicaţii.

Unii cercetători consideră că recombinarea şi achiziţia genetică (achiziţii de secvenţe ADN prin procese de transfer de gene pe orizontală) reprezintă evenimente ce au ca efect tot o schimbare în secvenţa de nucleotide, deci mutaţie. Indiferent de definire, este cert faptul că toate aceste procese generează variabilitate genetică. Asemenea evenimente de transfer de material genetic sunt suficient de dese în interiorul anumitor genuri bacteriene, astfel încât se poate vorbi de un adevărat flux de material genetic pe orizontală, ce favorizează

microdiversitatea până la nivel de speciaţie. De exemplu, tulpinile ne-toxigene de Bacteroides fragilis par să fi evoluat prin transfer genetic orizontal din organisme foarte diferite.

Rate variabile de mutaţie

Experimentele “clasice” de genetică bacteriană au concluzionat că mutaţiile bacteriene sunt neutre, şi nu direcţionate de presiunea selectivă. Ele au o distribuţie randomizată pe loci genetici, deci toate genele sunt egale ca probabilitate de mutaţie.

Ulterior, o serie de experimente (Cairns, 1988) au evidenţiat faptul că în condiţii de stress fiziologic, genele ce sunt utile celulelor pentru a ieşi din starea de stress, suferă mutaţii cu rate neobişnuit de mari. S-a constatat astfel că la E.coli există două tipuri de mutaţii :

(a) mutaţii spontane – au distribuţie randomizată pe loci genetici şi nu apar ca răspuns la o serie de condiţii de mediu;

(b) mutaţii direcţionate (mutaţii de tip Cairns) – au loc cu o rată mai mare când oferă un avantaj celulei în anumite condiţii de mediu.

Pentru a explica frecvenţa mai mare a mutaţiilor cairnsiene au fost propuse maii multe mecanisme posibile :(1) În celulele înfometate s-ar acumula diverse specii moleculare de ARNm, iar unele (şi

anume, cele care ar restaura capacitatea celulei de a supravieţui) din acestea ar putea servi ca matriţă într-un proces de revers-transcriere;

(2) Oprirea transcrierii (transcriere incompletă) Anumite condiţii de mediu induc exprimarea anumitor gene; în unele situaţii,

transcrierea nu se poate realiza complet, tot din cauza aceloraşi condiţii de mediu. Oprirea transcrierii poate determina ca ADN-ul din genele resoective să rămână într-o stare parţial desfăcută (despiralat), fiind astfel mai vulnerabil la evenimente mutaţionale;(3) Fixarea unor mutaţii temporare, tranzitorii

Printr-un asemenea mecanism, mutaţiile s-ar petrece cu aceeaşi frecvenţă în toţi locii genetici ai unor celule bacteriene supuse unui stress fiziologic; aceste mutaţii sunt însă temporare. Pentru persistenţa lor în descendenţă (şi înregistrarea lor ca atare de către experimentator) este necesară fixarea lor în cromozomul bacterian, proces ce are la bază replicarea ADN. Ori, replicarea ADN, ca şi diviziunea celulară, este terminată numai în celulele care au fixat mutaţiile temporare avantajoase.

Hall (1994) a emis ipoteza unui alt model care să explice apariţia cu o frecvenţă mărită a mutaţiilor avantajoase. Hall a examinat apariţia de mutaţii punctiforme de reversie de tip trp+ din auxotrofi trp, în condiţii de deprivare de triptofan. Modelul lui Hall presupune că, într-o asemenea populaţie bacteriană trp, un mic procent din populaţie intră într-o stare hipervariabilă, prezentând o frecvenţă mare a mutaţiilor. Într-o asemenea stare, unele din aceste celule vor acumula mutaţii neutre sau letale şi, ca atare, nu vor supravieţui. Alte celule vor acumula mutaţii utile şi vor supravieţui. Acestea din urmă sunt, de fapt, celulele care vor fi identificate ca prezente. În modelul lui Hall, starea hipervariabilă ar determina creşterea frecvenţei mutaţiilor în toate genele. Ca urmare, supravieţuitorii trp+ ar prezenta mutaţii multiple şi în alte gene în afară de operonul TRP.

(4) Existenţa unor gene “mutator”

În prezent se consideră că genele cu efect mutator sunt reprezentate de un set de gene implicate în procesele de reparare ADN. Cele mai cunoscute sunt două gene de la E.coli, mutT şi mutY, care afecteată frecvenţa transversiilor. Astfel, mutantele mutT au frecvenţă crescută a transversiilor AT CG, iar mutantele mutY au frecvenţă crescută a transversiilor GC TA. Echilibrul dintre aceste două forme va afecta compoziţia finală a ADN.

Variabilitatea genetică intraspecifică diferă de la o specie bacteriană la alta :

(a) Specii bacteriene cu variabilitate genetică intraspecifică (VGI) mică

- genul Mycobacterium; s-a constatat că tulpini de Mycobacterium leprae izolate din zone geografice foarte îndepărtate (India, Africa, America de Nord) prezintă genomuri aporape identice; luând în consideraţie procentul de situsuri de restricţie conservate, a fost estimat gradul de divergenţă de secvenţă nucleotidică dintre aceste tulpini la 0.02 – 0.026%.Acelaşi tip de experimente a fost realizat şi pe tulpini de E.coli, constatându-se că divergenţa de secvenţe nucleotifâdice variază în limite mai largi: între 0.8% şi 6.6%.

- genul Rickettsia; tulpinile izolate de Rickettsia belli au un grad de divergenţă nucleotidică de zece ori mai mic decât cel întâlnit la tulpinile de E.coli.

(b) Specii bacteriene cu variabilitatea genetică intraspecifică mareCele mai cunoscute asemenea specii aparţin genurilor Streptomyces şi Rhizobium.

Aceste bacterii prezintă multe plasmide cu structură variabilă, secvenţe de inserţie, precum şi secvenţe repetitive. Toate aceste elemente genetice pot reprezenta vectori naturali pentru transferul de ADN la nivel intraspecific, crescând astfel variabilitatea genetică. Pe de altă parte, bacteriile din genul Streptomyces prezintă frecevnt în cromozom şi fenomene de amplificare genică: secvenţe cuprinse între 5 şi 24 kb se găsesc amplificate într-un număr de copii şi pot ajunge să reprezinte între o treime şi două treimi din cromozom, şi pot fi însoţite şi de deleţii de sute de kb.(c) Majoritatea eubacteriilor se situează între cele două extreme, adică au o variabilitate

genetică intraspecifică medieÎn concluzie, se constată că cromozomul bacterian prezintă o stabilitate de bază, pe

care se grefează o serie de evenimente dinamice, recombinatorii şi mutaţionale. Se poate considera că cromozomul ca întreg, ar fi un “cadru” în interiorul căruia segmente individuale ar putea avea asendenţă filogenetică diferită.