TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21

15

TẠO CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN NHƯỢC ĐỘC

BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCK-OUT GEN aroA

Trương Ngọc Thùy Liên*, Vũ Thị Thanh Hương, Trần Thanh Tiếng, Nguyễn Quốc Bình

Trung tâm Công nghệ sinh học tp Hồ Chí Minh, *truongngocthuylien@gmail.com

TÓM TẮT: Với mục tiêu phát triển vaccine kháng lại sự xâm nhiễm của Aeromonas hydrophila trên cá, chủng A. hydrophila đột biến được tạo ra bằng phương pháp knock-out gen aroA, gen mã hóa 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase. Đoạn giữa dài 683 bp của gen này được thay thế bằng gen kháng Kanamycin KmR tạo tổ hợp gen (cassette) aroA:KmR. Chủng E. coli Sm10λpir chứa vector pGP704 có mang cassette aroA:KmR được sử dụng để tiếp hợp với A. hydrophila hoang dã tạo chủng đột biến. Độc lực của chủng A. hydrophila đột biến được kiểm tra bằng phương pháp tiêm vào cá tra giống. Kết quả cho thấy LD50 của chủng đột biến lớn hơn 107 CFU/ml, trong khi chủng hoang dã có LD50 thấp hơn 103 CFU/ml. Như vậy, chủng M25 A. hydrophila đột biến bất hoạt gen aroA có độc lực thấp hơn nhiều (>1.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu. Từ khóa: Aeromonas hydrophila, đột biến, knock-out gen, nhược độc, vaccine.

MỞ ĐẦU

Trong các bệnh thường gặp ở cá tra, bệnh nhiễm trùng huyết do Aeromonas hydrophila gây thiệt hại thứ hai, chỉ sau bệnh gan thận mủ, tỷ lệ gây chết có thể lên đến 80%. Hiện nay, người nuôi cá tra chủ yếu sử dụng kháng sinh để chữa bệnh cho cá, để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh việc nghiên cứu tạo vaccine rất cần thiết.

Trong các phương pháp tạo vaccine, phương pháp knock-out gen tạo vaccine sống nhược độc là phương pháp phổ biến và rất hữu hiệu. Với chiến lược lựa chọn gen mục tiêu cho phương pháp knock-out gen, có 2 hướng là loại bỏ yếu tố gây độc hoặc gây đột biến khuyết dưỡng. Trong đó, đột biến gen aroA là một đột biến khuyết dưỡng được nhiều nghiên cứu lựa chọn. Gen aroA mã hóa cho enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase, là enzyme cần thiết cho sinh tổng hợp folate; các dòng đột biến gen aroA bị mất độc tính do không thể phát triển được trong mô vì không thể tự tổng hợp folate đồng thời không thể thu nhận được folate từ bên ngoài [1]. Thune et al. (1999) [3] đã sử dụng phương pháp knock-out để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen aroA. Vaughan (1993) [4] đã nghiên cứu về độc tính của Aeromonas salmonicida đột biến aroA trên cá hồi Atlantic (10 đến 15 g) kết quả ở nồng độ 106CFU dòng đột biến không gây chết cá trong khi dòng hoang dại gây chết 100% cá ở cùng

nồng độ. Priebe et al. (2001) [2] tạo đột biến loại bỏ gen aroA trên đối tượng Pseudomonas aeruginosa. Dòng đột biến được chứng minh nhược độc khi chủng qua cả đường mũi và màng bụng chuột với liều lên đến 5.109 CFU đều không gây bệnh. Moral et al. (1998) [1] đã nghiên cứu gây đột biến khuyết dưỡng loại bỏ gen aroA làm mất độc tính của vi khuẩn A. hydrophila và dùng như vaccine cho cá hồi. Kết quả khi tiêm với nồng độ 108 CFU/ml vào cá hồi, chủng đột biến không gây bệnh, trong khi đó, 50% LD của dòng hoang dã là 106CFU/ml.

Ngoài đặc tính nhược độc, dòng đột biến gen aroA còn thể hiện tính an toàn khi đưa ra môi trường tự nhiên, điều này được chứng minh trong nghiên cứu của Vivas et al. (2004) [5], dòng đột biến có khả năng sống sót trong nước thấp hơn so với dòng hoang dã và không tồn tại lâu trong môi trường nuôi cá.

Từ những vấn đề trên, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu tạo ra chủng Aeromonas hydrophila đột biến gen aroA (GeneID: 4489425) nhược độc có thể ứng dụng làm vaccine cho cá tra và an toàn khi đưa ra môi trường tự nhiên.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chủng Aeromonas hydrophila hoang dã được phân lập từ cá bệnh ở An Giang. Vi khuẩn được cấy trên môi trường RS (Rimler Shott)

Truong Ngoc Thuy Lien et al.

16

(HiMedia) là môi trường đặc hiệu để phân lập A. hydrophila. Các dòng vi khuẩn thu nhận được sẽ được định danh bằng cách giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal.

Cá tra được ương nuôi từ giai đoạn noãn hoàng đến 7-10 g trong bể composite. Trước khi tiến hành thử nghiệm, cá (n=10) được kiểm tra sự hiện diện của A. hydrophila bằng cách cấy mẫu máu trên môi trường RS. Tạo chủng A. hydrophila nhược độc Tạo plasmid mang cassette aroA::KmR

Đoạn đầu HaroA và đoạn cuối TaroA của gen aroA được khuếch đại từ bộ gen A. hydrophila, gen kháng kháng sinh Kanamycin KmR được khuếch đại từ pCAMBIA (Canada) bằng các cặp mồi (bảng 1), chuyển vào pJET1.2 Blunt (Fermentas) và nhân dòng E. coli DH5α (Invitrogen). Ba đoạn gen này sau đó được cắt và nối với nhau bằng các enzyme cắt hạn chế

SacI, BamHI, XbaI (New England Biolabs) để tạo thành cassette aroA::KmR có thứ tự nối như sau: HaroA-KmR-TaroA. Cassette có 2 vùng đầu và cuối tương đồng với gen aroA, đoạn giữa là marker chọn lọc KmR. Casstte được chuyển vào plasmid pGP704 (Đại học Harvard) và được biến nạp E. coli Sm10 λpir (Biomedal). Gen kháng Kanamycin được dùng với mục đích knockout đoạn gen aroA đồng thời là marker chọn lọc các dòng đột biến tạo thành ở các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, do tính an toàn của vi khuẩn biến đổi gen, tránh sự phát tán gen kháng kháng sinh ra môi trường bởi hiện tượng chuyển gen ngang, các chủng đột biến sau khi tạo thành cần được loại bỏ gen kháng Kanamycin trong các nghiên cứu tiếp theo. Đó là lý do cặp mồi khuếch đại gen KmR được chèn thêm đoạn trình tự FRT 5’ GAAGTTCCTATT CtctagaaaGtATAGGAACTTC 3’ là trình tự nhận biết của hệ thống λ Red Recombinase.

Bảng 1. Danh sách các cặp mồi sử dụng trong quá trình tạo cassette

S TT Tên mồi Gen Trình tự Enzyme cắt

hạn chế

1 aroA -F1 aroA -R3 HaroA

5’- AAGAGCTCTTGTGCCACCCGCAGTCTTGC -3’ 5’- AAGGATCCTTCACCGCGAAGCTGCG - 3’

SacI BamHI

2 aroA -F3 aroA -R1 TaroA

5’- AAGGATCCATGCGGCCATGACCATCG -3’ 5’- AATCTAGATCACGCGCGCTGACTGAT -3’

BamHI XbaI

3

FKm

RKm

Kanamycin (KmR)

5’AAGGATCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCCCAGCCAGCCAA-3’ 5-’AAGGATCCAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTC TCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTAAAACAATTCATCCAGT-3’

BamHI BamHI

4 aroA_F4 aroA 5’- GGAGCCGGTCAATCTGTTCC- 3’ 5 aroA_R4 aroA 5’- CGGGGATGTGGTTCATGTCC- 3’ 6 aroA_F5 aroA 5’- GCTGGTCAGCTTTATGGATGGC- 3’ 7 aroA_R5 aroA 5’- ATCTAGCCCGCACGGGCAG- 3’ 8 FpJET1.2 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' 9 RpJET1.2 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'

Tiếp hợp

E. coli Sm10 λpir mang cassette (chủng cho) và chủng A. hydrophila hoang dã (chủng nhận) được tăng sinh trong môi trường LB đến giữa pha tăng trưởng (OD600=1), sau đó dịch tăng sinh được bổ sung BSA 2 mg/ml và 10 mM MgSO4. Chủng cho và chủng nhận được trộn chung theo tỷ lệ 1: 9, đưa hỗn hợp lên màng nitrocellulose (Whatman) có đường kính

lỗ màng 0,45 µm. Màng được chuyển lên môi trường LB agar bổ sung BSA 2 mg/ml và 10 mM MgSO4 và phủ lên bằng LB agar cùng loại, ủ ở 28oC, 4 giờ. Vi khuẩn sau đó được thu nhận, trộn đều dịch vi khuẩn (resuspension) và cấy trải trên môi trường LB agar bổ sung kanamycin và colistin, chọn lọc các dòng A. hydrophila mang cassette. Các khuẩn lạc thu nhận được sẽ được kiểm tra kiểu gen bằng PCR.

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21

17

Thử nghiệm độc lực Chủng đột biến và hoang dã được tăng sinh

trong môi trường LB lỏng đến khi OD600 đạt 1,45 (khoảng 109 CFU/ml). Sinh khối vi khuẩn được ly tâm ở 2.200 g trong 15 phút ở 4oC, sau đó trộn đều dịch vi khuẩn và pha loãng trong NaCl 0,65% [3].

Cá được bố trí thí nghiệm trong bể plastic 100 lít, mỗi bể 10 cá. Nồng độ vi khuẩn tiêm vào cá, đối với chủng A. hydrophila hoang dã là 103, 104, 105, 106 CFU/ml, đối với chủng đột biến là 104, 105, 106, 107 CFU/ml, đối chứng âm tiêm nước muối 0,65%. Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Theo dõi và ghi nhận số lượng cá chết trong 2 tuần.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tạo cassette mang gen aroA đột biến Kết quả nhân dòng các đoạn HaroA (kích

thước 354 bp), TaroA (kích thước 363 bp) được kiểm tra bằng cặp mồi FpJET1.2/RpJET1.2 cho sản phẩm kích thước lần lượt là 473 bp và 482 bp; cũng như kết quả nhân dòng gen KmR (kích thước 1327 bp) được trình bày lần lượt ở hình 2A, 2B, 2C. Các đoạn gen được giải trình tự và đối chiếu cho thấy có sự trùng khớp 99-100%

với trình tự của gen aroA và gen kháng kanamycin (AAF65337.1) được công bố trên Genbank (không trình bày) chứng tỏ các đoạn gen đã được nhân dòng thành công.

Các đoạn gen này được nối với nhau theo thứ tự ở hình 1. Cassette tạo thành được chuyển vào vector pGP704 và nhân dòng trong E. coli Sm10λpir. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid nhân dòng với enzyme BglII (hình 2d) cho thấy đã tạo được cassette và nhân dòng thành công plasmid pGP704 trong E. coli Sm10λpir.

Hình 1. Sơ đồ cassette và các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra chủng A. hydrophila đột biến

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

500 bp

B

1500 bp 1000 bp

1 2 3 1 2 3

4 kb 2 kb

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%

A: 2-6. Các dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET::HaroA, 1. thang DNA, 7. đối chứng(-); B: 1-5. Các dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET::TaroA. 7. Thang DNA, 6. Đối chứng(-); C: 2. Khuẩn lạc E. coli DH5α chứa pJET::KmR, 3. thang DNA, 1. đối chứng (-); D: 2. Kết quả cắt plasmid pGP704 chứa cassette với BglII, 1. Thang DNA, 3. pGP704 chứa cassette.

A

C D

Truong Ngoc Thuy Lien et al.

18

Tiếp hợp tạo chủng đột biến Do plasmid pGP704 có yếu tố di động

mobRP4 cần thiết cho quá trình tiếp hợp, tuy nhiên, do mang vùng khởi đầu sao chép R6K nên để tự nhân lên trong tế bào, pGP704 cần có sự hiện diện của protein pi, mã hóa bởi gen pir. Do đó, pGP704 mang cassette aroA::KmR được biến nạp vào E. coli Sm10λpir, điều này giúp kiểm soát việc tái tổ hợp cassette từ pGP704 vào bộ gen của A. hydrophila.

Chủng E. coli Sm10λpir mang cassette được tiếp hợp với A. hydrophila hoang dã để tạo

chủng đột biến. Trong quá trình tiếp hợp, nhờ vào mobRP4, plasmid pGP704 mang cassette đột biến từ tế bào E. coli sẽ di chuyển vào tế bào A. hydrophila. Do có sự tương đồng giữa HaroA và TaroA với gen aroA, sẽ có sự trao đổi chéo tương đồng diễn ra giữa cassette trên plasmid pGP704 và gen aroA trên genome của A. hydrophila, kết quả là gen aroA bị knock-out và thay thế bằng cassette. Bên cạnh đó, do A. hydrophila không có gen pir nên pGP704 không thể tự sao chép và nhân lên trong các thế hệ tế bào.

Hình 3. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR các khuẩn lạc thu nhận được sau tiếp hợp bằng cặp mồi aroA-F1/R1. Giếng 2-12 hình A, B, C. Các khuẩn lạc sau tiếp hợp; giếng 13 hình

A, B, C. Thang DNA; giếng 1 hình A, B, C. Đối chứng (-) Sau khi tiếp hợp, vi khuẩn được cấy trải trên

LB-kanamycin-colistin, kết quả thu được 33 khuẩn lạc. 33 khuẩn lạc này được PCR kiểm tra với cặp mồi aroA-F1/aroA-R1 khuếch đại gen aroA, với dòng hoang dã sẽ cho băng kích thước 1,4 kb, dòng đột biến sẽ cho băng kích thước khoảng 2,1 kb. Kết quả điện di ở hình 3 cho thấy,

có 2 khuẩn lạc ở giếng 11 hình 3A và giếng 4 hình 3C đều cho một băng duy nhất và có kích thước tương đồng với dòng đột biến dự kiến.

Hai dòng vi khuẩn, kí hiệu lần lượt là M10 và M25, được tiếp tục kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi 16S-F/16S-R, aroA-F4/aroA-R4, aroA-F5/aroA-R5, FKm/RKm, F-pGP704/R-

BB

A

C

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21

19

pGP704 như ở hình 1 và kết quả được trình bày ở hình 4.

Kết quả PCR 2 dòng M10 và M25 với cặp mồi 16S-F/16S-R, đều cho băng DNA kích thước 686 bp đặc hiệu cho A. hydrophila (giếng 2, 3, hình 4A).

Tương tự khi sử dụng cặp mồi aroA-F1/aroA-R1 khuếch đại gen mục tiêu aroA,

M10 và M25 (giếng 3, 4, hình 4B) đều cho băng có kích thước khoảng 2,1 kb tương đương với kích thước cassette trong khi chủng hoang dã (giếng 2, hình 4B) chỉ cho băng kích thước khoảng 1,4 kb. Hơn nữa, khi sử dụng cặp mồi FKm/RKm kiểm tra sự hiện diện của gen KmR, dòng M10 và M25 đều cho kết quả dương tính (giếng 3,4, hình 4E). Điều này cho thấy có sự hiện diện của cassette trong M10 và M25.

Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%.

A: 3. M10; 4. M25; 1.Thang DNA; 2. A. hydrophila hoang dã (+); 5. Chứng (-); B: 3. M10; 4. M25; 5.Thang DNA; 2. A. hydrophila hoang dã (+); 1. Chứng (-); C: 2. M10; 3. M25; 1.Thang DNA; 4. A. hydrophila hoang dã (+); 5. Chứng (-); E: 3. M10; 4. M25; 5.Thang DNA; 2. pGP704::cassette (+); 1. Chứng (-); D: 3. M10; 4. M25; 5.Thang DNA; 2. A. hydrophila hoang dã (+); 1. Chứng (-); F: 3. M10; 4. M25; 5. Thang DNA; 2. pGP704::cassette (+); 1. Chứng (-).

Đồng thời, khi sử dụng cặp mồi aroA-F4/aroA-R4 khuếch đại đoạn giữa của gen aroA kích thước 683 bp, cả 2 dòng dòng M10 và M25 (giếng 2, 3, hình 4C) đều cho kết quả âm tính, trong khi dòng hoang dã (giếng 4, hình 4C) cho kết quả dương tính chứng tỏ ở 2 dòng M10 và M25, đoạn gen này đã bị loại bỏ. Bên cạnh đó, khi kiểm tra với cặp mồi aroA-F5/aroA-R5 phía ngoài gen aroA, dòng M10 và M25 (giếng 3, 4, hình 4D) cho băng DNA kích

thước khoảng 2, 3 kb lớn hơn so với dòng hoang dã (giếng 2, hình 4D) có kích thước khoảng 1,7 kb. Điều này chứng tỏ ở vị trí của gen aroA trong genome M10 và M25, đã có đột biến knock-out đoạn DNA kích thước 683 bp và thay thế bằng gen KmR kích thước khoảng 1,3 kb.

Cuối cùng, cặp mồi F-pGP704/R-pGP704 đặc hiệu được sử dụng để kiểm tra sự tồn tại của plasmid pGP704, cả 2 dòng M10 và M25 (giếng

A C

D E F

B

Truong Ngoc Thuy Lien et al.

20

3, 4, hình 4F) đều cho kết quả âm tính, điều này chứng tỏ plasmid pGP704 không tồn tại trong 2 dòng vi khuẩn này.

Những kết quả PCR kiểm tra trên cho thấy M10 và M25 là 2 dòng A. hydrophila đột biến bất hoạt gen (knock-out gen) aroA. Đánh giá độc lực chủng đột biến gen aroA bằng phương pháp tiêm

Kết quả thử nghiệm độc lực của chủng A. hydrophila hoang dã và đột biến M25 được trình bày ở bảng 2. Chủng hoang dã được tiêm

vào cá với các nồng độ 102, 103, 104, 105CFU/cá còn chủng đột biến được tiêm với các nồng độ 103, 104, 105 và 106 CFU/cá. Kết quả ở với nồng độ 102 CFU/cá, chủng hoang dã gây chết 77% cá, trong khi đó chủng đột biến với nồng độ 104

CFU/cá vẫn không gây chết cá. Chủng đột biến chỉ bắt đầu gây chết 30% cá ở nồng độ tiêm 105

CFU/cá và 40% cá ở nồng độ tiêm 106 CFU/cá. Cá chết đều có biểu hiện bệnh và có sự hiện diện của A. hydrophila trong máu. Rõ ràng kết quả trên cho thấy, chủng đột biến có độc lực thấp hơn hơn 1.000 lần so với chủng hoang dã.

Bảng 2. Kết quả thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila hoang dã và đột biến A. hydrophila hoang dã A. hydrophila đột biến Đối chứng (-)

Nồng độ tiêm (CFU/cá) 102 103 104 105 103 104 105 106 NaCl 0,65%

Cá chết (%) 77 83 85 95 0 0 30 40 0 Khi so sánh với kết quả của Moral (1998)

[1], LD50 của dòng hoang dã là 106 CFU/ml còn với dòng đột biến gen aroA, 108 CFU/ml vẫn chưa gây chết cá, ở đây có sự chênh lệch độc lực khoảng 100 lần ở 2 dòng đột biến và hoang dã. Tuy nhiên, chủng A. hydrophila hoang dã phân lập ở trên có độc lực cao hơn (LD50<102 CFU/ml) chủng hoang dã trong thí nghiệm của Moral (LD50=106 CFU/ml), vì vậy, chủng nhược độc ở 106CFU/ml (tương ứng với 105 CFU/cá) đã gây chết 30% cá. Điều này đặt ra vấn đề là khi dùng làm vaccine, với nồng độ 105CFU/ml có đủ để kích thích đáp ứng miễn dịch trên cá hay không và có nên dùng chủng có độc lực cao để tạo vaccine nhược độc hay không. KẾT LUẬN

Chủng M25 A. hydrophila đột biến bất hoạt gen aroA có độc lực thấp hơn nhiều (>1.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu. Tuy nhiên, cần đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của dòng đột biến này kháng lại bệnh nhiễm trùng huyết trong hướng sử dụng làm vaccine.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Moral C. H., del Castillo E. F., Fierro P. L., Cortés A. V., Castillo J. A., Soriano A. C., Carrasco G. N., 1998. Molecular

characterization of the Aeromonas hydrophila aroA gene and potential use of an auxotrophic aroA mutant as a live attenuated vaccine. Infect. Immun., 66(5): 1813-1821.

2. Priebe G. P., Mary M. B., Hatano K., Grout M., Fadie T. C., Gerald B. P., Joanna B. G., 2001. Construction and characterization of a live, attenuated aroA deletion mutant of Pseudomonas aeruginosa as a candidate intranasal vaccine. Virginia. USA.

3. Thune R. L., Fernandez D. H., Battista J. R., 1999. An aroA mutant of Edwardsiella ictaluri is safe and efficacious as a live, attenuated vaccine. J. Aquat. Anim. Health, 11(4): 358-372.

4. Vaughan L. M., Smith P. R., Foster T. J., 1993. An aromatic dependent mutant of the fish pathogen Aeromonas salmonicida is attenuated in fish andis effective as a live vaccine against the salmonid disease furunculosis. Infect. Immun., 61: 2172-2181.

5. Vivas J., Carracedo B., Riaño J., Razquin B. E., López-Fierro P., Acosta F., Villena A. J., 2004. Behavior of an Aeromonas hydrophila aroA live vaccine in water microcosms. Appl. Environ. Microbiol., 70(5): 2702-2708.

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21

21

A STUDY ON CREATING AN ATTENUATED Aeromonas hydrophila

MUTANT STRAIN BY KNOCKING OUT aroA GENE

Truong Ngoc Thuy Lien, Vu Thi Thanh Huong, Tran Thanh Tieng, Nguyen Quoc Binh Biotechnology Center of Ho Chi Minh City

SUMMARY

In order to develop live attenuated vaccine against Aeromonas hydrophila infection in fish, Aeromonas hydrophila mutant strain was created by knocking out the aroA gene, encoding 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase. A 683 bp middle fragment of this gene was replaced by kanamycin resistance gene KmR to make the cassette aroA::KmR. The E. coli Sm10 λpir strain carrying suicide pGP704 plasmid with aroA::KmR was used as donor in conjugation with A. hydrophila wild type to create the mutant. The toxicity of the mutant strain was determined by intra-peritoneal injection into Tra catfish fingerlings. The results showed that the LD50 of the mutant strain was >107 CFU/ml, whereas that of the wild type strain was <103

CFU/ml. Keywords: Aeromonas hydrophila, attenuated, knockout gene, mutant, vaccine. Ngày nhận bài: 15-7-2013