Taninos condensados y su efecto sobre los parásitos gastrointestinales de ovinosCiencia Unisalle Ciencia Unisalle
2009
Taninos condensados y su efecto sobre los parásitos Taninos condensados y su efecto sobre los parásitos
gastrointestinales de ovinos gastrointestinales de ovinos
Claudia Patricia Lascano Goenaga Universidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada Lascano Goenaga, C. P. (2009). Taninos condensados y su efecto sobre los parásitos gastrointestinales de ovinos. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/medicina_veterinaria/322
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El parasitismo gastrointestinal ha sido una de las mayores causas de baja productividad en los sistemas de ganadería ovina. Para contrarrestar éste problema, productores y técnicos han intentado controlar las infecciones con vermífugos químicos, usándolos continua e indiscriminadamente. Sin embargo, el control parasitario basado únicamente en el uso de químicos no es sostenible a largo plazo debido a problemas de desarrollo de resistencia a los antiparasitarios, además de generar altos costos y residuos en carne y leche. En los últimos 20 años se han generado esfuerzos en desarrollar estrategias de control complementarias/alternativas especialmente no químicas. La inclusión de leguminosas forrajeras con taninos condensados, en los sistemas de pastoreo, se considera una estrategia de control de parásitos gastrointestinales novedosa. Sin embargo, para que esta alternativa de control sea efectiva es necesario describir los diferentes tipos de taninos existentes, su concentración y estructura química que varía dependiendo de la especie de planta y de factores ambientales, ya que éstos podrían tener implicaciones en el control de parásitos internos en ovinos. Numerosas investigaciones se han realizado con resultados positivos en el control de parásitos con leguminosas con taninos condensados (TC). Se describen dos mecanismos mediante los cuales los TC controlan parásitos gastrointestinales, estos pueden ser directos (eclosión de huevos, sobrevivencia de larvas) o indirectos (mejoras en el sistema inmune) dado su efecto en la protección de proteínas de la planta en el rumen que resulta en mayor absorción de proteínas en el tracto posterior del rumiante. Para determinar si el efecto es directo diversos autores proponen diferentes metodologías para evaluar in vitro la efectividad de los TC en el control de parásitos gastrointestinales. Finalmente, se presentan una conclusiones haciendo énfasis en la investigación que se debe realizar para poder integrar en los sistemas de producción de ovinos el control de parásitos mediante el uso de leguminosas con taninos.
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1. INTRODUCCIÓN
La población de ovinos en Colombia está predominantemente en manos de pequeños productores, cumpliendo una importante función económica en las comunidades agrícolas y otras zonas de concentración de pobreza. A diferencia de otros sistemas de producción animal, como son el bovino, el porcino, y el avícola los sistemas de producción ovino no han logrado un adecuado desarrollo, en gran parte, debido a un inapropiado manejo de la sanidad y sistemas de producción. En la actualidad, esta situación está cambiando, dada la orientación de la producción ovina artesanal hacia una producción más comercial, cumpliendo con exigencias del mercado que resulte en mayores beneficios económicos para los productores. A esto puede contribuir, que la exportación de carne ovina ha venido creciendo en forma significativa. En el periodo comprendido entre 1991-2006 se produjo un en Colombia un total de 4.311 toneladas de carne caprina y ovina, con un total de participación de esta última del 98% (Martínez, 2006). Sin embargo, la productividad de los ovinos no ha llegado al óptimo rendimiento debido probablemente a las efectos dañinos que los parásitos gastrointestinales ocasionan en estos pequeños rumiantes, los cuales se reflejan en baja producción y pérdidas por (Otero et al., 2004). Estudios realizados por Poppi et al., (citados por Molan et al., 2000) indican que las infecciones por helmintos de manifestación sub-clínica pueden generar pérdidas del orden de 40% en ganancia de peso vivo, lo cual está asociado con una disminución de ingestión de alimento que va de 6% a 30% en corderos. La producción de leche se ha reportado que puede disminuir en un 40%, la lana hasta en 15% en animales parasitados (Poppi et al., citados por Molan et al., 2000) y la mortalidad llega hasta un 50% (Castells et al., 1991). De otra parte, para contrarrestar los problemas asociados con los parásitos gastrointestinales en ovinos, productores y técnicos controlan las infecciones con vermífugos químicos. Sin embargo, el uso indiscriminado y continuo de estos compuestos químicos ha conducido a la aparición de resistencia en estos parásitos a los principales principios activos empleados para el control, lo cual agrava la problemática de los parásitos en los sistemas de producción ovina, por el incremento de las pérdidas económicas que las resistencia genera (Márquez, 2007). Lo anterior impone la necesidad de cambiar los métodos actualmente empleados para el control de los parásitos en ovinos, so pena de que se agoten los antihelmínticos químicos en un futuro cercano (Cuellar, 2007). En consonancia con lo anterior, y debido a los problemas asociados con los altos costos de los medicamentos antihelmínticos, a la resistencia generada por los endoparásitos y al incremento de la demanda de carne libre de
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residuos químicos (Márquez, 2008, Waller y Thamsborg, 2004; citado por Heckendorn et al., 2007), existe notable interés en controlar las infecciones parasitarias por métodos que no dependan en su totalidad del uso de químicos para su tratamiento. Alternativas como el empleo de ovinos resistentes a los endoparásitos, manejo del pastoreo (rotación), manejo alterno bovino-ovinos, uso de taninos condensados y el control biológico, entre otros, con base en escarabajos estercoleros y hongos ( spp. y Duddingtonia flagrans), constituyen herramientas promisorias de control parasitario en los sistemas de producción ovino (Márquez, 2007). En particular, la inclusión de plantas con taninos condensados en los sistemas de pastoreo como Lotus uliginosus (Lotus Makú) y Lotus corniculatus, han demostrado las bondades de estos arbustos en reducir el número de parásitos gastrointestinales en los ovinos y mejorar la capacidad productiva de estos rumiantes, tal como han demostrado diferentes estudios (Kimambo et al., 2002, Min y Hart, 2003). De las plantas con taninos condensados, L. uliginosus es una alternativa forrajera que se encuentra en avanzado estado de evaluación (después de 10 años de introducida al país) en sistemas de producción de bovino, ovinos y caprinos en las ecorregiones de clima frío en Colombia (Cárdenas et al., 2007) Debido a que la concentración y la estructura química de los taninos en especies forrajeras de clima templado y tropical son muy variables, (Min y Hart, 2003), se hace necesario determinar el efecto directo de los taninos contra los parásitos gastrointestinales y definir las concentración con las cuales se logren mejores resultados en cuanto a la disminución de los mismos, particularmente en Colombia con el propósito de desarrollar sistemas de producción sustentables.
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2. OBJETIVOS
Esta Monografía tiene como objetivo describir el efecto de taninos condensados obtenidos de leguminosas forrajeras en huevos y larvas de nematodos gastrointestinales en ovinos como una opción complementaria para el Control Integrado de Parásitos (CIP) y evitar así la resistencia generada por los antihelmínticos químicos. Para alcanzar este objetivo general se ha realizado: a) Una revisión de la literatura sobre la importancia de la inclusión de un nuevo método en el control de los nematodos gastrointestinales en ovinos dada la creciente resistencia de los mismos a antihelmínticos comúnmente usados b) Una revisión de literatura sobre los taninos y sus efectos en el control de los parásitos gastrointestinales en ovinos. Adicionalmente, se describen algunas metodologías in vitro para evaluar el efecto directo de taninos condensados purificados sobre eclosión de los huevos de nematodos y sobre la viabilidad y motilidad de las larvas L2- L3. Finalmente, con base en la revisión realizada se resumen algunas recomendaciones sobre necesidades de investigación para lograr impulsar el uso de leguminosas con taninos en el control de parásitos gastrointestinales en ovinos.
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3. RESISTENCIA DE PARÁSITOS GASTROINTESTINALES A ANTIHELMÍNTICOS
La elevada prolificidad, adaptabilidad y resistencia a diversas condiciones climáticas hacen que los nematodos gastrointestinales (NGI) tengan una amplia distribución geográfica y una alta prevalencia, tanto en regiones con clima templado como tropical (Quiroz, 2003, citado por Cuellar, 2007). Por lo anterior, y con la finalidad de contrarrestar los efectos negativos de los NGI, se han utilizado antihelmínticos, como las avermectinas, benzimidazoles e imidazoles para lograr un buen estado de salud de los animales. Infortunadamente, el uso excesivo de compuestos químicos, las rotaciones inadecuadas de los mismos, la aplicación de dosis menores a las terapéuticamente recomendadas (Cuellar, 2007) y el desconocimiento de los factores intrínsecos de los parásitos han facilitado el surgimiento de la resistencia de los NGI a productos químicos (Márquez, 2007). En las primeras décadas del siglo veinte, ya los expertos en el manejo y control de parásitos del ganado advertían sobre el riesgo de depender exclusivamente del uso de fármacos antiparasitarios en el control del gusano gástrico, (Haemonchus contortus) de los pequeños rumiantes (Swales, 1937), En 1998, una encuesta realizada en 77 países miembros de la Organización Internacional de Epizootias (OIE) reporto que en 55% de los países encuestados se había diagnosticado resistencia por lo menos a un agente antiparasitario y, de éstos, 86% informó tener diagnostico de resistencia a antihelmínticos especialmente en ovinos (Márquez, 2003). Tras la evaluación de 60 predios en África se encontró que el 90% de los mismos presentó cepas resistentes a por lo menos un principio activo y que el 40% fue resistente a más de tres grupos antihelmínticos de los que fueron probados (benzimidazol, levamisol, salicilanilida, ivermectina) (Márquez, 2007). En Argentina, Brasil, Paraguay y Uruguay se reportó altos y extensos niveles de resistencia a los antihelmínticos, creyéndose, que los grupos más utilizados, benzimidazoles y levamisol/morantel, habían llegado al fin de su efectividad terapéutica (Márquez, 2007). Entre los ganaderos, la selección de los principios activos usados para el control de los parásitos internos se basa en la disponibilidad, precio y en los resultados que ellos perciben de sus propios esfuerzos. Márquez (2007) y Benavides (2007) coinciden en señalar algunos factores de importancia asociados con la resistencia de NGI a productos químicos, sobresaliendo entre ellos:
Tamaño de la población en refugio (hábitat y localización de los parásitos que se pretende remover)
Inmunidad del hospedero (fisiología del huésped)
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Antihelmínticos adecuados (uso del mismo principio activo y de larga acción)
Tratamientos estratégicos (técnicas de administración de diversos antihelmínticos e intervalos, intensidad y dosis de los tratamientos)
Conocimiento de las contraindicaciones
El concepto de parásitos en refugio juega un papel más importante en la resistencia antihelmíntica actualmente que otros factores comúnmente mencionados como son la frecuencia de tratamientos y las sub- dosificaciones (Márquez, 2007). Refugio se refiere a la proporción de la población parasitaria que no está expuesta a una medida de control en particular, escapando así a la selección para resistencia (Van Wyk, 2001). En el caso de los NGI, esto incluye generalmente la proporción de la población de nematodos que vive fuera del huésped, en la pradera. Cuando este número en refugio es alto, las larvas que son ingeridas por los huéspedes son pocas en relación a las que permanecen en las praderas tras el pastoreo. Estas mantienen su característica de susceptibilidad y su capacidad de aportar estos genes en los cruces con las poblaciones de nematodos expuestas a antihelmínticos que fueron seleccionados por resistencia, dando como resultado híbridos con características de susceptibilidad que permiten retrasar la aparición de poblaciones de parásitos resistentes (Márquez, 2007).
Muchos individuos del refugio suelen perderse como consecuencia de condiciones ambientales (rayos solares, desecación), depredadores o simplemente porque no coincidieron con el huésped apropiado y llegaron al límite de sus reservas (Papadopoulos et al., 2001). Esta condición junto con una inadecuada rotación de potreros y un inadecuado suministro de antihelmínticos en épocas de sequía causa una desaparición casi en su totalidad de la población en refugio. En esta situación se incrementa la presión de selección porque los parásitos resistentes que han sobrevivido tienen la oportunidad de repoblarse en las praderas que están poco pobladas. La relevancia epidemiológica de este proceso, está basada en el enorme potencial biótico de los parásitos, que les permite cambiar sucesivamente la composición genética del refugio (Johnsonn, 2003).
De acuerdo con la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO, 2003), el concepto MIP (Manejo Integrado de Plagas) aplicado a la ganadería implica el uso conjunto de diversas herramientas y estrategias químicas y no químicas de control, para lograr la mayor eficiencia en su combinación, manteniendo los plagas a niveles inferiores a su umbral de daño, minimizando el uso de químicos. En términos de resistencia parasitaria se creó el concepto del control Integrado de Parásitos (CIP) que se describe a continuación.
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3.1 MÉTODOS INTEGRADOS DE CONTROL DE PARÁSITOS GASTROINTESTINALES Debido a que la dependencia de los antiparasitarios químicos para el control de los parásitos ha resulta insostenible ambiental, económica y socialmente por el incremento de los costos, la aparición de la resistencia parasitaria y la presencia de residuos químicos de los antiparasitarios en carne y leche, se hace necesario el cambio de estos enfoques de control, siendo el enfoque del Control Integrado de Parásitos el esquema propuesto en la actualidad para un adecuado control de parásitos (Márquez, 2007), en tanto la combinación de distintas herramientas ha demostrado mayor eficiencia. El Control Integrado de Parásitos (CIP) combina varias herramientas de control, a efectos de desestabilizar la formación de aquellas poblaciones parasitarias con mayor proporción de individuos genéticamente resistentes, manteniendo un nivel adecuado de productividad en los sistemas de producción ganadera (Benavides, 2007). El principio de estos métodos es que la eliminación de la máxima cantidad de parásitos internos de los rumiantes no es necesaria, y que de hecho, la sobrevivencia de algunos de estos puede ser beneficiosa (Van Wyk, 2001; Vercruysse y Dorny, 1999; Waller, 1999, citado por Ketzis et al., 2006). Algunos investigadores han indicado que la máxima la eficacia de los nuevos métodos de control de parásitos gastrointestinales depende del conocimiento epidemiológico, de la especie del huésped (vaca, oveja o cabra), el estado fisiológico de los animales (estado inmune, exposición previa, nivel nutricional y estado de producción), el nivel de infección, el estrés ambiental (condiciones climáticas), la especie parasitaria y el sistema de manejo de los animales dentro de la explotación (Corwin, 1997; Stromberg, 1997; Stromberg y Averbeck, 1999; Vercruysse y Claerebout, 2001; Citado por: Ketzis et al., 2006) Todos estos factores determinan un umbral económico, entendido como el máximo número de parásitos adultos y/o larvas que un heospedador puede tener sin experimentar una disminución en los parámetros de producción (Jonsson, 2005). El CIP, que busca la sostenibilidad del sistema de producción combinando diferentes alternativas (químicas y no químicas) de control, ha demostrado ser más eficaz que la dependencia en un sólo método de control y además considera la creciente demanda por productos provenientes de sistemas de producción orgánica o limpia (Chafton, 2006). De acuerdo con Niezen et al. (1995) se ha utilizado forrajes ricos en taninos como medida alternativa de control de helmintos en ovejas, reduciendo el uso de químicos, el costo en el tratamiento y mejorando el manejo del rebaño, (Cenci et al., 2007) al mismo tiempo que se asegura una adecuada nutrición.
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4. LOS TANINOS EN LEGUMINOSAS
Los taninos se encuentran ampliamente distribuidos en tallos, hojas e inflorescencias de diversas especies forrajeras y plantas dicotiledóneas. Junto con la lignina hacen parte del grupo de polifenoles, que son componentes secundarios, que las plantas tienen para defenderse contra el ataque de microorganismos (hongos patógenos, virus y bacterias) y la destrucción por herbívoros (insectos y vertebrados) (Pabón y Ossa, 2005). Los taninos se clasifican en base a su estructura molecular en taninos condensados (TC) o taninos hidrolizables (TH), siendo los primeros los más abundantes en la naturaleza. Los TH tienen un carbohidrato en posición central (Figura 1), generalmente d-Glucosa y presentan bajo peso molecular (500-3,000 dalton) haciéndolos más solubles en agua y de fácil absorción en el intestino delgado por lo que son potencialmente tóxicos para los rumiantes cuando se suministran en grandes cantidades sin el suficiente tiempo de adaptación de la flora microbial (Min et al., 2003, citado por Márquez y Suárez, 2008). Los TC no tienen carbohidratos y son polímeros compuestos de flavan 3-ol (catequinas), flavan–3-4-diol (leucoantocianidina) y sus derivados. Tienen un peso molecular entre 1900-28,000 y no son fáciles de hidrolizar. Estos tienden a polimerizarse en productos insolubles y estables en presencia de ácidos (Fahey y Jung, 1989) unidos mediante enlaces carbono-carbono y no son susceptibles de degradación enzimática anaerobia. Por lo general los TC se encuentran en las vacuolas y pueden presentarse en forma libre (soluble o extractable) o ligados (insoluble) a proteínas o a los carbohidratos de la pared celular; .Solamente los TC solubles son responsables de la depresión en la digestibilidad de la proteína y de la fibra (Barahona y Lascano, 1996; citado por Pabón y Ossa, 2005) en rumiantes. ..
Figura 1. Estructura química de los taninos hidrolizables (A) y condensados (B)
A B
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Fuente: Hess, H.; Noto, F. y Tiemmann, T. Efecto del sitio de producción en la composición química y las
características de fermentación ruminal de Caliandra calothyrsus var. Patulul. Segundo Taller Tninos en la nutrición
de rumiantes en Colombia. Memorias. Editores: Hans Dieter Hess, Julia Gómez y Carlos Lascano. Publicación
CIAT, n 352, ISBN 958-694-087-X. Cali, Colombia, 2006. Citado por Márquez, D. y Suárez, A. 2008.
4.1 TANINOS CONDENSADOS Y SU CONCENTRACIÓN Como resultado de numerosos estudios se ha concluido que hay varios factores que determinan la concentración de TC en leguminosas forrajeras. Entre estos factores están la especie de la planta (factores genéticos), la madurez de la planta, la temperatura ambiental, la humedad del suelo y la fertilidad del suelo (Lascano et al., 2000; Acuña et al., 2003). En la Tabla 1 y Tabla 2 se resumen los contenidos de taninos y sus pesos moleculares en especies forrajeras de trópico alto.
Tabla 1. Concentración de taninos totales en plantas de clima templado.
Fuente: Terril et al. (1992); Barry y McNann (1999). Tomado de Otero e Hidalgo (2004)
Tabla 1. Fenoles totales y cantidad de taninos en forrajes leguminosos
tropicales (g/kgMS)
Fuente: Norton, B.(1999). Tomado de Márquez y Suárez (2008)
En la revisión realizada por Lascano et al. (2000) se resumen estudios realizados bajo condiciones controladas en cámaras de crecimiento e invernaderos. Los resultados en general muestran que la concentración de TC en el follaje incrementa en especies como Lotus pedunculatus y L. cuneata cuando la temperatura ambiental aumenta. Por otra parte, la falta de humedad (sequia) en el suelo es un factor de estrés que causa disminución en el rendimiento de biomasa y aumento en la concentración de TC en la planta.. Tanto en leguminosas de clima templado y tropical la concentración de TC aumenta cuando los nutrientes del suelo son deficientes y afectan el crecimiento de la planta. Adicionalmente, la fertilización con P y S han mostrado reducir la concentración TC de algunas de las leguminosas de clima templado (Lotus sp.) y tropical (Desmodium) (Lascano et al. 2000). Shultze-Kraft y Benavides (1998, citado por Schmidt, et al., 1997, citado por Pabón y Ossa, 2005) señalaron que el contenido de taninos de una misma especie de planta puede variar bajo idénticas condiciones ambientales y puede variar también entre accesiones, como fue reportado en Desmodium ovalofolium por Lascano y Barahona (1997). En general, la concentración incrementa con la madurez y va directamente asociada al incremento de lignina que esta inversamente relacionada a la digestibilidad. Es decir, a grandes cantidades de lignina, se espera encontrar grandes cantidades de taninos y una disminución considerable en la digestibilidad y palatabilidad del forraje.
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Estudios realizados por Cano et al. (1994; citado por Pabón y Ossa, 2005) describen que en plantas de trópico alto (ej. Flemingia macrophylla) el 79% de los taninos fueron extractables (solubles) y sólo el 14% estuvieron ligados a proteínas. Este mismo grupo de trabajo describió, al igual, algunas variedades de leguminosas de trópico alto (clima templado) y encontraron que la fracción de taninos extractables fue del 55% y que los taninos ligados a proteínas llegaron al 32%. Recordando que los problemas de digestibilidad se asocian a las fracciones extractables es importante determinar dietas particulares e identificar los efectos nutricionales de los taninos en los animales, cuantificar estos factores y conocer la estructura química y la fisiología del animal objeto de estudio (Sturm et al., 2007).
4.2 EFECTOS NUTRICIONALES Y ANTIPARASITARIOS DE LOS TANINOS CONDENSADOS 4.2.1 Efectos Nutricionales: Existe un creciente interés en integrar leguminosas con TC en las dietas de los rumiantes debido a que pueden resultar en proteína de paso, que es proteína que escapa la degradación en el rumen y llega al intestino delgado, lo cual repercute en forma positiva en producción de leche y carme. En los estudios con TC se han encontrado cuatro tipo de enlaces que son dependientes del pH y reversibles: covalentes, iónicos, puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas, siendo los dos últimos los más frecuentes (Min et al., 2003, citado por Márquez y Suárez, 2008). Cada proteína tiene su pH distintivo y óptimo para unirse a los TC. Un ejemplo de esto es la albúmina del suero bovino que puede unirse a los TC en un pH de 4.1 a 6.1 y disociarse cuando el pH es menor a 3.5 (Jones y Mangan, 1997, citados por Min et al., 2003, citados por Márquez y Suárez, 2008). En general, en un rango de pH de entre 5 y 7,5 en el rumen e intestino delgado, la proteína permanece unida a los taninos, pero a pH bajos (pH < 3,5) (Hagerman et al., 1992) o >8 (Andrabi et al., 2005, citado por Márquez y Suárez, 2008) la proteína es ligada por TC es liberada. Otros factores que influyen en el grado de enlaces de TC-proteína son su peso molecular, y su estructura química. En la leguminosa Lotus corniculatus los TC están compuestos principalmente por unidades de Cyanidina mientras que en Lotus pedunculatus los TC están compuestos por unidades de delphinidina que los hace ser mas reactivos con proteínas en comparación con los TC de L. corniculatus (McNabb et al, 1997). Estas diferencias en la estructura química de los TC en leguminosas pueden tener implicaciones no solo en la protección de proteína dietética sino también en su capacidad de controlar parásitos gastrointestinales. Se sugiere, por lo tanto, que para
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poder entender el efecto de TC presentes en leguminosas forrajeras en el control de parásitos gastrointestinales es necesario no solo estudiar los efectos de concentración, sino también el efecto de su estructura química definida esta en términos de composición monomérica. La concentración de TC también afecta el efecto de estos en la nutrición de rumiantes (Otero et al. 2004). Por ejemplo, se ha encontrado que a altas concentraciones de TC (5-10 % de la materia seca), se deprime el consumo y la digestibilidad del forraje mientras que a menor concentración (2-4 % de la materia seca), se reducen las pérdidas de amonio en el rumen producida por la proteólisis por los microorganismos y se incrementa la cantidad de proteína que llega y es absorbida en el duodeno (proteína de paso o sobrepasante) (Waghorn et al., 1997; citado por: Otero et al., 2004). Ésto en virtud a la capacidad que tienen los TC para unirse a las enzimas y formar complejos polifenoles con un efecto inhibidor sobre celulasa, ureasa celulasa, ureasa, alda-amilasa, proteasas, beta-glucosidasa y lipasa . Al inhibir las enzimas proteolíticas se reduce, consecuentemente, la degradación de la proteína de la dieta (McSweeny et al., 2001, Min et al., 2005, citado por Márques y Suárez, 2008) aumentando su absorción en intestino delgado. 4.2.2 Control de parásitos: Existen reportes en lo9s cuales se señala que los TC presentes el leguminosas actúan sobre los parásitos. Así, por ejemplo, Niezen et al. (1995) indica que se han utilizado forrajes ricos en TC como medida alternativa de control de helmintos en ovejas, reduciendo el uso de químicos, el costo en el tratamiento y mejorando el manejo del rebaño (Cenci et al. 2007), al mismo tiempo que se asegura una adecuada
nutrición. El efecto de las plantas ricas en taninos más comúnmente
reportado es una notable disminución del conteo de huevos en materia fecal. En algunos estudios. se ha encontrado una disminución de la carga parasitaria cercana al 50% cuando se usan especies de leguminosa del
género Lotus con respecto a alfalfa y raigrás (Niezen et al 1995). Hekerdon
et al. 2007 reporta que el L corniculatus redujo la cantidad del parásito en abomaso (H. contortus) y disminuyó el conteo de huevos en materia fecal en un 60 % con respecto control. Dado que la proteína ligada a los TC no es degradada en el rumen, está disponible para la digestión en el abomaso e intestino delgado. La disociación de los complejos taninos- proteína en el tracto digestivo posterior debido a cambio de pH resulta en proteína sobre-pasante que podría resultar en un efecto indirecto en control de parásitos ya que una mayor absorción de proteína mejora el estado inmunológico del animal e incrementa la respuesta inmune a los PGI (Min et al., 2000, citado por Min et al., 2003 y
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MacRae, 1993; Barry y McNabb, 1999, citado por Min et al., 2003) desarrollando resistencia (Van Houter y Sykes, 1996; Donaldson et al., 1997; citados por: Iqbal et al., 2007; Mangan, 1988; citado por: Mateos-Sanza et al., 2005). Asimismo, este mecanismo de protección puede causar un efecto directo en el parásito al producir una reducción en la disponibilidad de proteína para los mismos y por ende un estado de inanición de la larva y su consiguiente muerte (Iqbal et al., 2007). En otros estudios se ha comparado el efecto de leguminosas con y sin TC. Por ejemplo, Niezen et al (1995) evaluaron el efecto de Sulla (con TC) y alfalfa con ovinos en pastoreo a los cuales dosificaron con 20.000 Trichostrongylus colubriformis, y un grupo fue tratado farmacológicamente. Los resultados indicaron que no hubo diferencias significativas en ganancia de peso y producción de lana dentro de los animales tratados que pastoreaban las dos leguminosas. Sin embargo, en el grupo de los animales no tratados con antihelmínticos, se observó una ganancia de peso significativa los que pastoreaban Sulla con TC (129g/día vs. -39g/día). Cuando se sacrificaron los animales, en los no tratados y que pastorearon Sulla, el conteo de huevos y el número de T. colubriformis fue menor que en los animales que pastorearon alfalfa (Figura 2).
Figura 2 . Conteo de hpg en corderos parasitados no tratados
farmacológicamente pastoreando alfalfa o sulla. (Niezen et al., 1995).
Forrajes como la Sericea lespedeza (SL) y la Sulla demostraron una reducción significativamente alta en el conteo de huevos en la material fecal (1320 and 2220 huevos/g, respectivamente) en comparación a la leguminosa Medicago sativa (sin TC) (Niezen et al., 1995). En estudios recientes, Min et al. (2004) encontró que el pastoreo de SL inhibe el desarrollo de larvas y Butter et al. (2000, citado por Min et al., 2004) sugiriere que los TC extraídos de hojas de Quebracho (Schinopsis spp.) tienen una acción antihelmíntica directa en Trichostrongylus colubriformis (intestino delgado).
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A través de estudios realizados in vitro, Molan et al. (2000, citado por Cenci et al., 2007) demostró que extractos de taninos de sulla y Lotus spp. inhibieron el desarrollo de huevos de T. colubriformis a L1 y de L1 a L3. La motilidad de la larva también se redujo y se encontró una mortalidad del 20%. Estos autores sugieren que los forrajes que contienen TC pueden alterar el ciclo de los nematodos y reducir la contaminación en las pasturas con L3. Estudios han demostrado que la ingesta de leguminosas con TC incrementa la disponibilidad de aminoácidos esenciales, lo que conlleva a un aumento del crecimiento corporal (Aerts et al., 1999; citado por: Iqbal et al., 2007) y a su vez en un efecto indirecto en el desarrollo de resistencia parasitaria por mejor nutrición del los animales. En otros estudios se ha reportado que los TC causan un aumento de la hormona de crecimiento. En ovejas alimentadas con forrajes con TC provenientes de L. pedunculatus se encontró una correlación positiva entre su concentración en la dieta y los niveles plasmáticos de la hormona de crecimiento (Barry et al., 1986; citados por: Iqbal et al., 2007) estimulando por esta vía la retención de nitrógeno en el animal (Muir et al., 1983. citados por: Iqbal et al., 2007). Un mecanismo de acción directa de los TC sobre el control de nematodos propuesto por Iqbal et al. (2007) es el de la unión de estos a la cutícula de la larva, la cual está compuesta por una alta cantidad de glicoproteínas (Thompson y Geary, 1995.), que al ser destruidas y disminuidas producen la muerte del parásito. Asimismo se ha reportado que cuando hay una alta carga parasitaria, los TC minimizan algunos efectos adversos como son episodios de diarrea (Nietzen et al., 1995; Robertson et al., 1995; citados por: Iqbal et al., 2007). Por otro lado, dado que los TC no son totalmente absorbidos en el tracto digestivo (Terrill et al., 1994; citados por: Iqbal et al., 2007), puede haber una alta concentración de estos en la heces, lo cual de suceder podría afectar la eclosión de los huevos de los nematodos, causando una disminución en la contaminación de los pastos (Iqbal et al., 2007). En varios estudios se encontró que cuando se descontinuaba la administración de TC, aumentaba la excreción de huevos de T. colubroformis y Haemonchus contortus (Athanasiadou et al., 2000; Min et al., 2005; Lange et al., 2006; citado por: Heckendorn et al., 2007), lo cual sugiere que los TC
reducen temporalmente la fecundidad de la hembra y directamente a los
parásitos adultos. El efecto directo de los TC sobre parásitos gastrointestinales se ha comprobado en ensayos in vitro, en los cuales se ha demostrado que al incubar larvas parasitarias en extractos crudos de TC se reduce su
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desarrollo, viabilidad, motilidad y habilidad migratoria (Athanasiadou et al., 2007; Butter et al., 2001 Molan et al., 2002; citado por Ketzis et al., 2006). En estudios realizados por Ketzis et al., (2006) se determino que la acción directa de los TC en la mayoría de los casos resulta en un control aproximado al 100%. Finalmente, Heckendorn et al. (2007) indican que el control efectivo de parásitos con TC en experimentos in vivo e in vitro realizados en periodos cortos de tiempo con cabras y ovejas soporta la hipótesis de un efecto directo de los TC sobre parásitos gastrointestinales, ya que en estudios de corto plazo el tiempo para permitir el desarrollo y expresión de una respuesta inmune del hospedador es poco (Molan et al., 2000b, 2003; Paolini et al., 2003a, 2004; Heckendorn et al., 2006). Además, estudios realizados por Min et al.,(2005) con animales menores de 6 meses, incapaces de responder inmunitariamente a una infección de nematodos, muestran una efectividad considerable sugiriendo un efecto directo de los TC contra los PGI. En resumen, los resultados en la literatura muestran el gran potencial que tiene el uso de compuestos orgánicos naturales como son los TC para reducir el impacto de las infecciones parasitarias, disminuyendo así el problema de las resistencias a vermífugos comerciales, pérdidas económicas por infecciones y contribuyendo al desarrollo de una agricultura orgánica que actualmente presenta una gran demanda por muchos consumidores. 5. METODOLOGÍA PARA EVALUAR LA EFECTIVIDAD DE LOS TANINOS EN EL CONTROL DE PARÁSITOS GASTROINTESTINALES
Se sabe que a través de estudios in vitro se puede evaluar el potencial de los TC presentes en leguminosas de climas templados (ej. Sabana de Bogotá) y cálidas en el control directo de parásitos internos en ovinos. La prueba más usada mundialmente para probar la eficacia de antihelmínticos es la de reducción en el conteo de huevos (FECR, por sus siglas en inglés) (Coles et al., 1992, citado por Várady et al., 2005). Aunque esta técnica estandarizada es muy buena, resultan más económicas y prácticas de realizar pruebas in vitro en un principio. La prueba de eclosión de huevos (egg hatch test –EHT) y la de desarrollo larvario (larval development test – LDT) son las más usadas in vitro (Mitchel et al., 1991; Hong et al., 1992; Bartley et al., 2003, citado por Várady et al., 2005). A continuación se describen los métodos in vitro empleados para evaluar la efectividad de TC purificados de leguminosas contra larvas y huevos de nematodos recolectados en heces de ovejas infestadas. Se describe además, la metodología para la obtención de los TC purificados, la
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recolección de la materia fecal, los coprocultivos, la obtención de larvas y su identificación por género y hasta especie, la separación de los huevos y la evaluación del efecto ejercido en huevos y larvas de nematodos gastrointestinales en función de los TC. 5.1 PURIFICACIÓN DE TANINOS CONDENSADOS Una vez se haya seleccionado la leguminosa con la que se quiere trabajar para la evaluación de la actividad antiparasitaria de sus TC se debe cortar la parte foliar de la misma y emplear métodos para la conservación de la muestra que alteren lo menos posible el nivel y la actividad biológica de éstos (Pabón y Ossa, 2005). Cano et al. (1994, citado por Pabón y Ossa, 2005) indican que la liofilización es el mejor método de conservación de las muestras para el análisis de taninos, conclusión a la que llegaron después de comparar con el secado al horno (60 C) y la conservación de hojas frescas y congeladas. Estos autores encontraron que en varias leguminosas secadas al horno se reducían los TC extractables y se generaba un aumento de los TC no extractables en comparación con las muestras liofilizadas. Los extractos de taninos de leguminosas pueden obtenerse por los métodos que a continuación se describen, cuyos resúmenes aparecen en el artículo Métodos de Extracción y Caracterización de Taninos Condensados, Utilizados en CIAT, Ventajas Y Desventajas (Vargas P, A. 2006). 5.1.1 Protocolo A de purificación de taninos condensados: El protocolo está basado en el descrito por Jones et al., (1976); Foo y Porter, (1981) y Horigome et al., (1988) en el cual la se usa como solución extractora (taninos solubles): acetona 70% más acido ascórbico 0.1%, eter dietílico, etil acetato, metanol (50%), acetona (70%), Sephdex LH-20. Para la extracción y cuantificación de taninos libres o extractables se pesan 15-20g de forraje en erlenmeyers de 250 ml y se adicionan 45 ml de la solución extractora (acetona más ácido ascórbico) hasta que quede totalmente mojado el forraje. Luego los frascos se agitan por aproximadamente 75 minutos y se pasa la muestra de los erlenmeyers a tubos falcon de 50 ml usando embudos con doble gasa. A los tubos se les adiciona igual cantidad de eter dietílico, y se agita y succiona el eter por vacío, realizando este lavado por tres veces con similar volumen (10 ml/muestra). El paso anterior se repite tres veces, pero adicionando etil acetato, agitando y succionando por vacío. Luego se evapora la acetona, eter y etil acetato preferiblemente en un concentrador de muestras (con agujas). Las muestras
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se almacenan en la nevera hasta el día siguiente. Al otro día, se agrega metanol 50% (50 ml), se agita con el vortex y se centrifuga por 15 minutos a 3500 rpm. Se transvasa el sobrenadante a las botellas con sephadex con cuidado quedando en el fondo el pellet que se descarta. A las botellas de sephadex más extractos de taninos se les adiciona metanol 50% (130 ml) a cada botella y se agita muy bien antes de centrifugar por 5 minutos a 3500 rpm (botar el sobrenadante). Se repite el proceso de centrifugación de Sepadex más metanol hasta que el líquido quede transparente. El número de centrifugaciones depende de la muestra. Cuando el líquido este transparente se cambia el metanol 50% por acetona al 70% y se repiten las centrifugaciones por 5 minutos cada vez recuperando el sobrenadante en tubos nuevos con papel filtro. El sobrenadante recuperado en beakers llevar al concentrador de muestras para evaporar la acetona. Paso posterior congelar y llevar al liofilizador (2-3 días). El rendimiento de taninos purificados, varía según la especie de leguminosa. Preparación del Sephadex: Compuesto que ayuda a extraer los taninos, se pesan 10 g de Sephadex LH-20 se adiciona metanol 50% (130 ml), centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. (repetir este paso por 3 veces). Almacenar en nevera, proteger de la luz. 5.1.2 Protocolo B de purificación de taninos condensados: En este procedimiento desarrollado por Carulla (Comunicación Personal) se utiliza como solución extractora alcohol al 96% (70%), agua destilada ( 30%), acido fórmico (0.5%),y acido ascórbico (0.05%). Esta solución extractora se complementa con una solución de acetona al 50%. Se debe además preparar una columna de Sephadex LH-20, pesando 15 g de Sephadex LH- 20 y adicionando alcohol al 96%, a cual se debe refrigerar un día antes. El material de leguminosa a la cual se le va a extraer los TC se pesa en el erlenmeyers 40 g de leguminosa y se adiciona la solución extractora (400 ml) y se agita en el shaker (60 minutos). Posteriormente la mezcla es filtrada a un beaker utilizando un embudo con filtro (whatmanfibra de vidrio cat1820 de 150 mm de diámetro) y gasa doble. El filtrado se pone en el concentrador por espacio de 30 minutos para nivelar los volúmenes, se pasa por la columna y se centrifuga con alcohol al 96% hasta que este completamente transparente. Cuando está listo, se cambia el proceso con acetona al 50% y se alistan beakers pirex con filtros de 150 mm para recoger el sobrenadante que contiene los taninos. Una vez se ha evaporada la acetona se coloca gasa a los beaker y se llevan al congelador para posterior liofilización. 5.2 RECOLECCIÓN DE HECES FECALES
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En esta sección se resume la metodología de recolección y procesamiento que se encuentra en la guía RVC/FAO para el diagnóstico parasitológico veterinario y en el capítulo de diagnóstico parasitológico del libro Parasitología para Veterinarios de Bowman y colaboradores (2004). Para la recolección de la materia fecal se necesita el siguiente equipo:
Botella de tapa-rosca con boca ancha.
Recipientes de plástico con tapas.
Guantes desechables para toma de muestras
Bolsas de plástico
Marcador para etiquetado
Contenedor térmico para transporte de muestras (recipiente de icopor, aserrín y hielo)
Refrigerador en laboratorio apropiado para almacenamiento de muestras fecales (4 °C)
Las muestras para examen parasitológico son, preferiblemente, tomadas directamente del recto o mientras el animal defeca sin dejar tocar el piso para evitar la contaminación por nematodos de vida libre o parásitos de vegetales (Vázquez y Herrera, 2005). Se deben usar guantes desechables apropiados. El recipiente de las heces se debe llenar a toda su capacidad antes de cerrar con la tapa o atar el guante desechable tan cerca de las heces como sea posible. Es importante excluir el aire del recipiente dado que esto retardará el desarrollo de los huevos. Cada muestra debe ser cuidadosamente etiquetada con la identificación del animal del que se toman las heces, la fecha y el lugar de colecta. Si se hace un banco de heces, las bolsas se rotulan según el grupo de animales (ej. Edad de los animales). Tan pronto como las muestras lleguen al laboratorio se almacenan en un refrigerador a una temperatura de 4°C hasta que estas sean procesadas a fin de que las estructuras parasitarias presentes en las heces no continúen su desarrollo embrionario. Las muestras se pueden mantener en refrigeración hasta por tres semanas sin presentar cambios significativos en el conteo de huevos y en su morfología. Si no es posible almacenar las muestras en un refrigerador por algún tiempo después de su colección, se les puede añadir solución salina fisiológica formolada (SSFF al 5% en proporción de una parte de heces por tres de solución. Sin embargo, estas heces no servirán para coprcultivo sólo para coproscópico. Para la preparación se requiere de formol comercial (50 ml), cloruro de sodio (8g) y agua destilada (1,000ml) (Vázquez y Herrera, 2005):
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5.3 DILUCIONES DE TANINOS CONDENSADOS En los estudios in vitro las larvas y huevos obtenidas se exponen a los extractos de taninos en diferentes diluciones (i.e, 100μg/ml, 200μg/ml y 300μg/ml). En cada prueba es necesario tener un control positivo (benzimidazol o albendazol) , si se trabaja con huevos, (0.55 mg/ml) y un control negativo usando una solución de PBS Tampón Fosfato salino) recomendado por Várady et al. (2006) o acuoso o metanólico como describe Paramita et al. (2006). Es recomendable la adición de amphotericin B a una concentración de 5μg/ml a la suspensión de huevos para inhibir el crecimiento de hongos (Várady et al., 2006). Los platos/recipientes se incuban por 7 días 27C y la incubación se da por terminada con la adición de 10μl de Lugol (solución), si no se va a evaluar motilidad de las larvas. Se han utilizado cantidades variables de huevos y larvas para la evaluación del efecto de diferentes concentraciones de TC in vitro. Várady et al. (2006) dice que en cada pozo debe haber como mínimo 300 huevos. En el caso de las larvas según comunicación personal con Márques (2009) debe haber como mínimo 1,500 mientras que Paramita et al. (2006) indica que con 50 larvas es suficiente. 5.4 COPROCULTIVO PARA LA RECUPERACIÓN DE LARVAS Y HUEVOS Es importante tener en cuenta que las distintas especies de nematodos tienen condiciones óptimas distintas para la eclosión, desarrollo y supervivencia. En consecuencia, la abundancia relativa de especies de larvas de fase 3 obtenidas de los cultivos no es una función directa de la abundancia relativa de especies de huevos de estrongiloides que había en un principio. Le Jambre et al., (2007) constataron que aunque se encuentre una proporción alta de larvas de H. contortus en cultivo, el Trichostrongylus spp. puede ser la causa principal de parasitosis in vivo dado que la capacidad de ovoposición de H. contortus es mucho mayor. Siempre que hay huevos de Haemonchus contortus o Strongyloides en las heces, las larvas de estas especies acostumbran a predominar en el cultivo. Soulsby, 1994 (citado por Vázquez, 2004) anota que por su característica reproductiva Haemonchus spp. es considerado uno de los nematodos de mayor diseminación en los potreros ya que una hembra adulta y madura sexualmente llega a ovopositar de 5,000 a 10,000 huevos por día. Teniendo en cuenta lo anterior, Heckerdon et al. (2007) describieron un método de cultivo de materia fecal y separación de larvas. Cada muestra de 2g de materia fecal debe ser homogenizada para asegurar la distribución uniforme de los huevos. Estos se cuentan (FEC: Fecal egg count) para determinar el número de los mismos pre-cultivo. Para cada cultivo, se
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colocan 12g de la materia fecal en envases de poliestireno y se incuban por 10 días a 20C, bajo condiciones de máxima humedad. Posteriormente, las larvas se extraen por 24h usando un aparato de Baermann y se transfieren a tubos Falcon. Una vez identificadas las larvas se cuentan en 10 alícuotas de 50μg (500μg) y el valor se extrapola al volumen total del cultivo. Bowman et al. (2004) propusieron un método de cultivo de heces y obtención de larvas. Con este método se parte del hecho de que las heces bien formadas de ovejas contienen una cantidad adecuada de agua, por lo que habitualmente se pueden cultivar simplemente colocando algunas bolas en un frasco tapado lavado con una solución de carbonato sódico al 0.1% para inhibir el crecimiento de los hongos y dejando el frasco en una mesa o estante oscuro a temperatura ambiente durante 7 a 10 días. Para esto, las paredes del frasco siempre tienen que estar cubiertas con gotas de humedad condensada, de lo contrario se deben añadir algunas gotas de agua o solución de carbonato sódico. Cuando se vuelve a sacar el frasco a la luz tras la incubación enseguida se observan las larvas agitándose en las gotas de condensación de las paredes del frasco. Cuando las larvas se encuentran nadando en las gotas de humedad condensada en las paredes del frasco de cultivo se procede a hacer lo siguiente:
Lavar el frasco con una pequeña cantidad de agua y recoger la solución de lavado
Someter la solución de lavado a centrifugación.
Poner a decantar el tubo antes de retirar el sobrenadante para evitar pérdida de larvas
Así se puede recoger el sedimento que contiene las larvas en un pequeño volumen de agua retenido por cohesión y transferir con una pipeta a un portaobjetos para mirar bajo el microscopio. En la literatura existe una técnica de cultivo de materia fecal y separación de huevos en la que la materia fecal es licuificada y separada en grupos que van entre 100 y 200g (Várady et al. (2006). Los huevos de nematodos son colectados al pasar la materia fecal procesada por varios tamices (poros de 250, después de100 y finalmente de 20μm) El material retenido en el último tamiz se lava con agua y sedimentados. Los huevos son posteriormente recuperados por flotación con una solución salina saturada. Por otra parte, Hubert et al. (1982) describe dos métodos de cultivo larvario bajo la premisa de que para el desarrollo de larvas de vida libre se requiere un ambiente adecuado (temperatura, humedad, oxigenación y nutrición). Uno
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de los métodos intenta controlar estas variables y se basa en la separación de los huevos de la materia fecal. Estos huevos se lavan y se incuban en agar-agar neutro al que se le adiciona un medio nutritivo (Solución salina de Earl’s fortificada con extracto de levadura), a una temperatura de 22-23C con una humedad relativa de 85-90%. Trece días después se recolectan las larvas lavando suavemente el fondo del medio de cultivo y pasando por una malla los volúmenes recolectados. El otro método descrito por Hubert et al.,(1982) empieza con una muestra de materia fecal fresca de 1250g que se homogeniza para posteriormente estimar la cantidad de huevos por gramo en 10 alícuotas de 1ml cada una. Después del conteo de huevos los 1200 gramos restantes se distribuyen en 25 vasos de vidrio (14 x 9.5 x 4 cm) tapados, en los que se han introducido 40g de materia fecal previamente homogenizada. Tras el conteo de huevos se estima que cada vaso contiene 22,000 huevos de Strongylídos. Las condiciones del cultivo incluyen una incubadora humidificada que mantenga una temperatura de 22-23C y una humedad relativa de 85-90%. La oxigenación se mantiene tras mezclar diariamente con una espátula los cultivos. La extracción de larvas se realiza trece días después. La Guía RVC/FAO para el Diagnóstico Parasitológico Veterinario propone un cultivo larvario en el que no es necesario una incubadora humidificada. Tras romper las heces en un recipiente con una espátula u otro implemento de agitación se debe asegurar que las heces estén húmedas y desmenuzables. Si las heces están muy secas se debe añadir agua hasta obtener la consistencia correcta. Y si por lo contrario, están muy húmedas se debe añadir carbón o heces estériles de ovino hasta obtener la consistencia correcta. Cuando ésta se logre se transfiere la mezcla a vasos o recipientes plásticos o de icopor y se deja el cultivo a temperatura ambiente por 14-21 días, tiempo en el cual las larvas deberán haber alcanzado la fase infectiva (L3). Se añade agua a los cultivos regularmente si la mezcla se está secando demasiado, aproximadamente cada 1-2 días. Si se tiene disponible una incubadora, el cultivo puede ser colocado a 27C y dejado por 7-10 días. Transcurrido este tiempo el recipiente se llena de agua y se pone boca a bajo contra un recipiente Petri manteniendo una leve inclinación para que las larvas sean transportadas hacia el borde del recipiente de Petri.
Otra opción es la Técnica de Corticelli Lai descrita por Vázquez (2004) en la que se pesan 20 g de heces y se homogenizan en agua destilada. Éste homogenizado de heces se coloca en una caja de Petri de 10 cm de diámetro extendiéndolo perfectamente. La caja de Petri más pequeña junto con el contenido se colocan en la caja de Petri de 15 cm de diámetro, a la cual se le agregan de 20 a 25 ml de agua destilada y se tapa. Se incuba a 27 C se humedece con agua, destapando una hora diariamente por 8 días. Transcurrido el tiempo se coloca el líquido en un vaso de precipitado y se
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inicia el conteo de larvas. Con esta técnica se obtienen larvas totalmente limpias, no requiriendo emplear el aparato de Bearmann. Es una técnica práctica en la que se puede encontrar presencia de larvas al día siguiente. 5.4.1 Separación de larvas con la Técnica de Baermann: La técnica de Baermann es usada para separar las larvas del material fecal. Con esta técnica se toma un embudo y se ajusta un pedazo corto de tubo en el cuello. Se cierra el tubo con el clip. Se sujeta el embudo a una base sencilla. (Figura 3). Si se requiere procesar más de una muestra al mismo tiempo se usa un tablón con agujeros para colocar varios embudos. Luego se coloca una doble capa de papel filtro (Figura 4) o toallas dentales sobre una toalla de papel desechable o equivalente sobre la mesa de trabajo. Se usa una cuchara o espátula para pesar o medir aproximadamente 5-10 gramos de material fecal y se coloca la materia fecal en el centro de la estopilla. Se forma una bolsa conteniendo la materia fecal juntando las cuatro esquinas de la estopilla y moldeándola alrededor de la misma. Esta bolsa que contiene la materia fecal se coloca en el embudo y corta el exceso de estopilla. Se llena el embudo con agua tibia, asegurándose que la materia fecal quede sumergida. Esta materia fecal se deja reposar en el aparato por 24 horas y se drenan unos cuantos mililitros de fluido por el cuello del embudo hacia un tubo de ensayo. Después se deja sedimentar por lo menos durante 30 minutos o si se dispone de una centrífuga, el fluido puede ser drenado en un tubo de centrífuga y centrifugarse a 1000 rpm por 2 minutos. Posteriormente, se examina una muestra de sedimento en una lámina porta objetos para lo cual se añade una gota de yodo para fijar la larva y colocar cuidadosamente un cubreobjetos sobre la gota. Cualquier nematodo de vida libre se coloreará de café oscuro muy rápidamente mientras que las larvas de especies parásitas se colorearán muy lentamente debido a que la vaina larvaria protege el cuerpo. Las larvas se examinan en un microscopio compuesto con un aumento de 10 x 10.
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Figura 3: Embudo de Bearmann Figura : Embudo de Bearmann con papel filtro.
5.4.2 Recolección de huevos: En la literatura se describe un método de separación de huevos presentes en la materia fecal de animales infestados que consiste en lavados con solución salina y posterior sedimentación por centrifugación suave (Soulsby, 1982; citado por Iqbal et al., 2006). Los huevos son lavados en agua destilada varías veces y ajustados a una densidad conocida en agua usando la técnica de McMaster (Whitlock, 1960; citado por: Iqbal et al., 2006), que será descrita posteriormente. Otra alternativa de recolección de huevos y larvas consiste en la colección de parásitos adultos del abomaso (Haemonchus) de ovejas adultas en el matadero en la que los parásitos son escogidos manualmente y posteriormente coleccionados en una botella con PBS (solución buferada – pH 7.2) (Iqbal et al., 2006). Después estos parásitos son transferidos a solución salina al 0.9% e incubados a 37C por 24 horas. La técnica de separación de los huevos depositados por los adultos es la misma descrita anteriormente. Éste método se puede usar siempre y cuando se decida que las muestras se van a tomar de animales (adultos en su mayoría) en el matadero. 5.5 CONTEO DE HUEVOS CON LA TÉCNICA DE MC MASTER Esta técnica es usada para contabilizar huevos de helmintos en muestras fecales utilizando cámaras de conteo que permiten el examen microscópico de un volumen conocido de suspensión fecal (2 x 0.15 ml). Por lo tanto, si se usa un peso de heces y un volumen de líquido de flotación conocidos para preparar la suspensión, entonces el número de huevos por gramo de heces (h.p.g.) puede ser calculado. Las cantidades son elegidas de tal manera que el conteo de huevos fecales puede ser fácilmente derivado al multiplicar el
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número de huevos dentro de las áreas marcadas por un simple factor de conversión. Es indispensable para comparar la cantidad de huevos que quedaron después de exponer los huevos a los diferentes tratamientos (diluciones) y poder determinar el efecto de los TC en los huevos de parásitos gastrointestinales. Para implementar la técnica se pueden utilizar tres tipos de fluido de flotación. Éstos son:
a. Solución salina saturada Gravedad específica: 1.18 - 1.20 Solución de propósito general. Cloruro de sodio: 400 gramos Agua: 1000 ml Revolver cuidadosamente antes de usar. Puede deformar los huevos.
b. Solución Sal/azúcar Gravedad específica: 1.28 Solución de propósito general. Cloruro de sodio: 400 gramos Agua: 1000 ml Azúcar: 500 gramos Disolver la sal en agua para hacer una solución saturada. Agregar el azúcar a la solución salina saturada. Revolver hasta que el azúcar se disuelva.
c. Nitrato de sodio Gravedad específica: 1.18 Esta solución algunas veces es usada para huevos de strongílidos.. Nitrato de sodio: 400 gramos Agua: 1000 ml Agregar nitrato de sodio al agua mientras se revuelve. Puede formar cristales y deformar los huevos si se deja por más de 20
minutos La cámara de McMaster tiene dos componentes, cada uno marcado con una rejilla sobre la superficie superior. Cuando la cámara es llenada con una suspensión de heces en fluido de flotación, muchos de los detritos se van al fondo mientras los huevos flotan hacia la superficie, en donde pueden ser fácilmente vistos y los que están dentro del la rejilla pueden ser contados. Para determinar cantidad de huevos por gramo de heces (h.p.g.) se siguen los siguientes pasos:
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Se pesan 4 gramos de heces frescas y se colocan dentro de un recipiente.
Se añaden 56 ml del fluido de flotación seleccionado.
Se revuelve cuidadosamente el contenido
Se filtra la suspensión fecal a un segundo recipiente y se revuelve
Se utiliza una pipeta Pasteur para retirar una sub-muestra con el que se llena el primer compartimiento de la cámara de conteo
Se procede a llenar el segundo compartimiento con otra sub-muestra
Se deja reposar la cámara de conteo por 5 minutos. Esto es importante ya que permite que los huevos floten hacia la superficie y que los detritos se vayan al fondo de la cámara.
Se examina la sub-muestra del filtrado bajo un microscopio compuesto con aumento de 10 x 10 y se identifica y cuenta todos los huevos dentro del área gravada de ambas cámaras.
El número de huevos por gramo (h.p.g.) se calcula contando el número de huevos dentro de la rejilla de cada cámara, ignorando aquellos fuera de los cuadros y multiplicando el total por 50
5.6 IDENTIFICACIÓN DE LARVAS Es importante la identificación de las larvas obtenidas por cualquiera de los métodos descritos anteriormente ya que va a permitir diferenciar el efecto que los TC ejerce sobre diferentes especies o géneros de parásitos gastrointestinales. Por lo general se requiere el sacrificio de las mismas (de una fracción) y su preparación en extensión. La mejor forma de conseguirlo es calentando cuidadosamente la gota de agua antes de poner el cubre objetos y mirarlos en el microscopio. “Relajación” es el eufemismo que acostumbra a aplicarse a la muerte técnica de los nematodos. A veces los Strongyloides se reavivan, por lo que es posible que se deba hacer un calentamiento nuevo. Se debe tener cuidado de no calentar excesivamente las larvas porque esto las distorsiona. Una posible alternativa al calor es una gota de de solución Lugol añadida al borde del cubre objetos (RVC/FAO, 2004). Esto relaja las larvas a la vez que la tiñe. Posteriormente, la identificación de las larvas se puede hacer por micrometría o por morfología. 5.6.1 Micrometría: Con el objetivo de identificar y clasificar por especie las larvas de nematodos es necesario observar su morfología y su micrometría. Mediciones de la cutícula de la larva, de la larva y de la relación entre estas dos resultan importantes en la caracterización de las mismas. Con este fin se procede a calibrar un microscopio, con el que se realizarán todas las mediciones correspondientes.
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Los pasos en la técnica de micrometría incluyen:
Colocar el micrómetro ocular en la parte interior del ocular 6X y en la platina del microscopio el micrómetro objetivo, manteniendo el revolver en 10x.
Sobreponer el punto 0 de la escala del micrómetro objetivo con el 0 de la escala del micrómetro ocular.
Verificar a la izquierda la superposición de las líneas que demarcan las divisiones de la escala, escogiendo las superpuestas, que están más próximas al cero de dichas escalas, ya que así, se reducirá el margen de error.
Para determinar el valor real de las divisiones del micrómetro ocular se cuentan las divisiones que hay entre el 0 de las dos escalas superpuestas, hasta las líneas superpuestas que están más próximas al 0 de dichas escalas. Es necesario contar las divisiones de las escalas del micrómetro ocular y del objetivo, con ocular 6x y objetivo 10x y 40x. Conociendo las divisiones de las dos escalas, se puede calcular cuantas divisiones de la escala del micrómetro objetivo están contenidas en un número determinado de intervalos del micrómetro ocular y definir cuantas divisiones del micrómetro objetivo comprenden un especio determinado en el micrómetro ocular. Por ejemplo, si se cuentan 70 divisiones en la escala del micrómetro ocular y 68 divisiones en el micrómetro objetivo 10x, se considera que cada división del micrómetro objetivo equivale a 10 μm, por lo que se multiplica 68 x 10 para convertir en μm y se realiza el siguiente cálculo: 68*10 / 70 = 9.71. Para el objetivo de 40x se realizó el mismo cálculo: 5*10 / 20 = 2.5.
Esto significa que una división del micrómetro ocular, con el objetivo de 10x equivale a 7.71μm, puesto que se divide el total de las divisiones del micrómetro objetivo, multiplicadas por 10, entre las divisiones del micrómetro ocular. En caso de usar el objetivo 40x, cada división del micrómetro ocular equivale a 2.5μm. Una vez realizados los cálculos, se retira el micrómetro objetivo de la platina y se coloca la lámina que contiene el espécimen a ser medido. Posteriormente, se enfoca el ocular y poniendo el extremo del espécimen en el 0 de la escala del micrómetro ocular, se cuentas las divisiones que abarca el ejemplar, de un extremo a otro. El número de divisiones obtenidas se multiplica por el valor que la calibración arrojó dependiendo del objetivo que se haya usado. Si se desea utilizar otro objetivo, éste se debe calibrar.
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Una vez calibrado el microscopio se utilizan las claves micrométricas (Niec, 2003) para la identificación por especie de las larvas L3 (Ver Anexo 1) apoyándose en las claves morfológicas descritas en el Anexo 2. 5.7 EVALUACIÓN DEL DESARROLLO LARVARIO Y VIABILIDAD DE HUEVOS IN VITRO EN FUNCIÓN DE LA ACCIÓN DE LOS TANINOS Los estudios in vitro realizados hasta el momento han investigado si realmente existe una acción directa de los taninos condensados sobre los nematodos gastrointestinales. La metodología sugerida en todos estos estudios es similar. Las principales especies de nematodos gastrointestinales (larvas u huevos) que parasitan a los pequeños rumiantes son expuestas a diferentes concentraciones de extracto de TC, obtenido de leguminosas tropicales de diferentes géneros (Lotus, Schinopsis y Plagiochila, entre otros). Paramita et al. (2006) propone evaluar los efectos inhibitorios de los TC por la mortalidad de las larvas. Los parásitos muertos se reconocen fácilmente por su apariencia rígida y por la ausencia de movimiento de la cabeza y la cola. Los estudios liderados por Mateos-Sanza et al. (2005) valoran la actividad antihelmíntica de los taninos determinando la capacidad migratoria de las larvas de tercer estadio (L3) de los nematodos. Esto se realiza a través de una malla de nailon de 20 mm de tamaño de poro. Para evaluar el desarrollo larvario se debe tener muy claro las características de las diferentes especies en sus fases evolutivas. Y se propone una calificación con puntajes de 1-10 en diferentes momentos de la incubación, horas 0,2, 4, 6 y 8 post exposición Iqbal et al. (2007). Una opción es presentar los resultados como LC50 y LC99, definidos como la concentración antihelmíntica requerida para inhibir el desarrollo hacia L3 en un 50 y 99%. Otra opción es en forma de MIC (Concentración Inhibitoria Mínima) que esta dada por la concentración mínima necesaria para inhibir completamente la el desarrollo hacia L3 en el tiempo de incubación estipulado.
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6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Con base a la literatura revisada se concluye que para poder llegar a la formulación de sistemas de pastoreo para ovinos con base a leguminosas con TC como una alternativa de control de parásitos gastrointestinales es necesario en forma sistemática realizar una seria de estudios como los que se resumen a continuación:
1. Dilucidar el efecto de la concentración y estructura química de taninos de leguminosas forrajeras en el control de huevos y larvas de nematodos en ovinos.
2. Definir como cambios en fertilidad de suelos, temperatura ambiental y
precipitación pluvial afectan la concentración y estructura química de leguminosas con potencial de ser incluidas en sistemas de pastoreo de ovinos y como a su vez estos cambios en los TC afectan su efectividad en el control de parásitos.
3. Evaluar en sistemas de producción de ovinos en pruebas un vivo la efectividad de TC de leguminosas incluidas en sistemas de pastoreo o utilizados como extractos aplicados vía oral.
4. Definir como si es favorable combinar el uso de antihelmínticos comerciales con leguminosas con TC como componentes en un sistema de control integrado de parásitos internos.
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CLAVES MICROMÉTRICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE NEMATODOS L3 POR ESPECIE Bunostomum trigonocephalum
La más pequeña de las larvas de nematodos gastrointestinales de bovinos y ovinos.
Cavidad bucal de paredes gruesas, en forma de embudo.
Esófago bastante largo con ensanchamiento bulboso.
Dieciséis células intestinales, pocas veces bien diferenciadas.
Terminación de la cola de la larva obtusa.
La cola de la vaina larval, fina y bastante larga en relación con el largo total de la larva.
En temperatura óptima de 22-24° C se forman larvas infectantes en 6- 7 días. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Largo cola vaina larval
Sin envoltura de la segunda muda (vaina).
Esófago muy largo, aproximadamente 1/3 del total de la larva y de color claro.
Intestino bastante corto formado por células no diferenciables, con oscuras granulaciones.
En larvas de cultivos viejos no se distingue bien el esófago del intestino.
La cola larval termina trifurcada; vista de costado aparece bifurcada.
Evolución de huevo a larva infectante a 10-15° C en 7-8 días; a 20-25° C en 30-70 horas.
ANEXO 1
30
Figura 1. Terminación de la cola larval MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Largo cola vaina larval
75-95 80-92
Oesophagostomum venulosum
Larvas de tamaño mediano, provistas de una vaina gruesa y floja, que forma bien visibles ondulaciones.
La cavidad bucal recta, de paredes engrosadas.
Treinta y dos (32) células intestinales, triangulares Cantidad de células intestinales características para cada especie.
Evolución de huevo a larva infectante es de 7-8 días a temperatura de 22-24° C.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Morfológicamente muy parecida a la de Oesophagostomum venulosum.
Células intestinales, 28-32, por lo general 32, de forma rectangular.
Las larvas infectantes se obtienen tras seis días a 22-24° C. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
131-220 ____ ____
En cultivos mixtos con 0. venulosum y Chabertia ovina, se considera (según varios autores) a las larvas menores de 700 micrones como de Chabertia ovina y a las mayores de 800 micrones como 0. venulosum. Las larvas con medida entre 700-800 micrones, no son diferenciables entre sí. Trichostrongylus axei (Cobbold, 1879; citado por: Niec, 2007)
Larva de tamaño mediano, sin cavidad bucal.
Dieciséis células intestinales.
Cola de la vaina larval; corta, cónica, aguda.
En temperaturas de 22-24° C se forman larvas infectantes en 6-8 días. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Larva relativarnente chica, sin cavidad bucal.
Dieciséis células intestinales.
La cola larval termina en una o dos protuberancias.
Cola de la vaina larval muy corta, cónica, recta.
En temperatura de 22-24°C se forman larvas infectantes en 7-8 días. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Dieciséis células intestinales.
La punta de la cola de la larva con una hendidura semejando una W.
Cola de la vaina larval corta, cónica.
En temperatura de 22-24°C se forman larvas infectantes en 7-8 días. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Dieciséis células intestinales.
Terminación de la cola de la larva, obtusa-redondeada.
Cola de la vaina larval corta, puntiaguda, a menudo con desviación a la altura de la punta de la cola larval.
En temperaturas de 22-24° C se forman larvas infectantes en 6-7 días. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Cavidad bucal en forma de pera.
En el sitio donde empieza el esófago existe una cinta fibrilosa la que a la observación microscópica se ve como dos puntos refringentes o una línea clara, detalle morfológico característico para el género Cooperia.
Dieciséis células intestinales.
Terminación de la cola larval obtusa y redondeada.
La cola de la vaina larval, por lo general ligeramente ondulada, se reduce gradualmente en una terminación obtusa.
En cultivo se forman larvas infectantes en siete días a 22-24° C. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Cooperia curticei
Larvas más chicas (más cortas y delgadas) que las de C. oncophora.
Se observan los característicos cuerpos refringentes pero más pequeños y más juntos entre sí que los de C. oncophora
Dieciséis células intestinales.
Terminación de la cola larval obtusa.
La cola de la vaina larval recta, reduciéndose en una terminación filamentosa.
Las larvas infectantes de estas especies cultivan en 7-8 días a 22-24° C.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Cavidad bucal ovalada.
En muchos casos a la altura de la cavidad bucal se observa una pequeña plaqueta quitinosa, oscura.
Dieciséis células intestinales.
Terminación de la cola larval cónica, en muchos casos arrugada.
La cola de la vaina larval, que adelgaza gradualmente, termina en una prolongación filamentosa.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
35
119-149 124-160 ____
Nematodirus spp. N. filicollis, N. spathiger; N. battus (Crofton y Thomas, 1951-1954); N. helvetianus (May, 1920)
Entre todas las larvas infectantes de nemátodos gastrointestinales, las de Nematodirus spp. son las de mayor tamaño.
La cavidad bucal en forma de tubo recto.
El intestino está compuesto de ocho grandes células.
La forma de la terminación de la cola larval es característica para cada especie (ver fig. 4 en Anexo 3).
La cola de la vaina larval es larga, en forma de látigo.
La larva infectante se desarrolla dentro del huevo del parásito en 15- 30 días, según especie, a 24-28° C.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
CLAVES MORFOLÓGICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE NEMÁTODOS L3
Estas claves del libro Manual of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques permiten identificar las larvas hasta género y son de gran utilidad si no se tiene la forma de calibrar el microscopio
1. Esófago rabditiforme De vida libre Esófago no rabditiforme 2 2. Sin vaina, esófago a la mitad del cuerpo Strongyloides
Con vaina, esófago menos de la mitad del cuerpo 3
3. Cola de la vaina corta o mediana 4 Cola de la vaina muy larga 7 4. Dos cuerpos ovales refractiles o una banda transversa brillante entre la cavidad bucal
y el esófago. Cooperia Sin banda y sin cuerpos ovales retractiles 5
5. Larva delgada, cola de la vaina mediana, terminación en punta, a veces con un leve
doblez Haemonchus Cola de la vaina muy corta y cónica 6
6. Larva mediana o grande con cola
redondeada Ostertagia Larva pequeña, cola con tuberosidades o
indistintamente redondeada Thrichostrongylus 7. Larva muy grande, 8 células intestinales, cola con muesca, bilobulada o trilobulada Nematodirus Larva mediana, 32 células intestinales pentagonales, luz del intestino ondulado. Oesophagostomum Larva mediana, 32 células intestinales
cuadradas, lumen del intestino derecho. Chabertia Larva muy pequeña con 16 células intestinales Bunostomum
ANEXO 2
38
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