Fachbereich Biolo gie, Techni sche Hochschule, Darmstadt

Tagesgang der Amylasenaktivitat im Blatt von Kalanchoedaigrernontiana

Diurnal Fluctuation of Amylase Activity in Kalan choe daigremontiana Leaves

G. H . VIEWEG and MARIA A. R. DE FEKETE

Mit 3 Abbildungen

Eingegangen am 5. Juli 1976 . Angenommen am 23. Juli 1976

Summary

The ac tivities of amylases in Kalancboe daigremontiana leaves fluc tuate during a day.With the light there is a twofold increase in the act ivit y which stays stable unt il itdar kens. Th e sta rch conte nt rises slowly with illumination time and reache s the maximumva lue towards the end of the light per iod. In the first hours of the night a furt her twofoldincrease of the amylases activity ta kes pla ce (108 pmoles reducing sugars' h- 1

• mg" chloro­phyll). Thi s activity is maintain ed until star ch cont ent is high. Th en a parallel decrease instarch content and amylase act ivity can be observed. Th e act ivity of amylases is inhib itedby maltose. We suggest that the increase of amy lases activity in the morning is corre la tedwith the product ion of primer for starch synt hesis.

Key wo rds: starch content, amylases, maltose inhi bition, diurnal fluctuation, Kalanchoedaigremonti ana leav es.

Einleitung

D ie Starke in griinen Blattern wird durch Phosphorolyse oder Hydrolyse abge­baut. Beide Stoffwechselwe ge konnen gleichzeitig aktiv sein (FEKETE und VIEWEG,1974). Die Phosphorolyse, katalysiert durch das Enzym Starkephosphorylase (EC2.4.1.1), ist die energetisch giinstigere Reaktion. Sie bild et Glucose-I-phosphar, dasohne weitere Phosphorylierun g direkt in den Zuckerstoffwechsel eingeschleust wird.Dagegen hydrolysiert Ii-A mylase (EC 3.2.1.2) Sta rke zu Maltose. Die Aktivitat dera-Amylase (EC 3.2.1.1) fiihrt zu Oligosacchariden und zu Maltose (THOMA et al .,1971). Erst weitere Spaltung durch eine Maltase ode r Glucosidase zu Glucose undeine anschliefende Phosphorylierung ermoglichen die Bereitstellung eines ener gierei­chen Zuckers.

Kalancbo e daigrem ont iana gehort zu den CAM-Pflanzen (Crassulacean AcidMetabolism). Sie konnen die im Licht gespeicherte Starke in der anschlieBendenDunkelphase hauptsachl ich in Malar umwandeln (KLUGE, 1969). Dabei wird Phos -

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phoenolpyruvat als Zwischenprodukt gebildet. SUTTON (1975 a) berichtet, daB er bei

Vertretern dieser Gruppe zwar Phophorylase, aber keine a-Amylase aus Blattern

isolieren konnte. Dieser Hinweis veranlaiite uns, in unsere Untersuchungen der

Steuerung des Starkestoffwechsels auch eine CAM-Pflanze einzubeziehen. 1m Fol­genden berichten wir iiber die Aktivitaten der Amylasen im Blatt von Kalanchoedaigremontiana innerhalb eines Tages.

Material und Methoden

Die Blatter stammten von 3 Monate alten Pflanzen (Kalanchoe daigremontiana HAMETet PERRIER), die aus Brutpflanzen vegetativ vermehrr worden waren. Die Anzucht erfolgteim Gewachshaus ohne Zusarzbeleuchtung. Es wurden die jiingsten ausgewachsenen Blatterdes 2. oder 3. Wirtels, von oben gezahlt, verwendet. Ihr Frischgewicht betrug zwischen5 und 7 g. Fiir jede Aufarbeitung wurde ein Blatt ohne Mittelrippe eingesetzt. Die Probenwurden stiindlich genommen. Beginn am 13. April 1976 urn 04.30 Uhr bis 14.30 Uhr (Pro­bennummer 11). Die Serie wurde fortgesetzt am 14. April urn 15.30 Uhr und mit der Pro­be 24 am nachsten Tag urn 03.30 Uhr beendet. In den Darstellungen ist die Unterbre­chung iibergangen, da kein Hinweis auf eine Inhomogenitat zwischen den beiden Teilenbcsteht. Wahrend der Nachte lag die Temperatur im Gewachshaus bei 18 DC, tagsiiberschwankte sie zwischen 24 und 29 ClC. Dunkelheit wahrte von 20.00 bis 05.00 Uhr. Dieschwankende Helligkeit am Tage wurde durch Wolken und die kiinstliche Schattierungdes Gewachshauscs verursacht. Gleichzeitig mit jeder Probenahme wurde die an der Ver­suchspflanze herrschende Bclcuchtungsstarke mit einem Beleuchtungsmesser UM der Fa.AEG bestimmr.

Jeweils 4-5 g frisches Blatt wurde mit der Rasierklinge kleingeschnitten und in der3fachen Menge von 0,1 M Glycylglycinpuffer pH 8,6, der auch 0,02 M EDTA enthielt, beioDC gepottert. Der Extrakt wurde durch Perlongaze gedriickt. Dann wurde sein pH-Wertgemessen und wenn notwendig mit 1 M NaOH auf pH 7,6 eingestellt. Aus dem Extraktwurden die Enzyme mit festem Ammoniumsulfat bis 80 % Sattigung gefallr (fiir je 10 mlExtrakr wurden 5,61 g Ammoniumsulfat zugegeben), eine halbe Stunde im Kalten stehen­gelassen und dann 20 min bei 35 000 X g abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 0,05 MGlycylglycinpuffer pH 7,6, der auch 0,002 M EDTA enthielt, aufgenommen und in kleine­ren Portioncn eingefroren. Vor der Enzymherstellung wurde eine Portion von 400-700 mgdes kleingeschnittenen Materials gewogen und in Aceton gepottert. Nach Auffiillen auf5 ml mit Aceton wurde dieser Extrakt zentrifugiert. Im Uberstand wurde nach ARNON(1949) das Chlorophyll bestimmt. Die Starke wurde im Niederschlag nach Aufschluf mitCa Clj-Losung, wie bei SHANNON (1968) beschrieben, nach der J2-Methode von KR!SMAN(1962) gemessen. Aus den freigesetzren reduzierenden Zuckern wurde die Aktivitat derAmylase berechnet. Hierfiir wurden die frisch aufgetauten Enzymproben mit 0,05 MGlycylglycinpuffer pH 7,6, der auch 0,002 M EDTA enthielt, verdiinnt (1 : 5). Es wurdenjeweils 10, 20 und 40,ul dieser Verdiinnung eingesetzt und mit 12,umol Citratpuffer pH6,1, 3,umol NaF und 0,4 mg Amylopektin in einem Endvolumen von 0,2 ml bei 30 DCwahrend 30 min inkubiert. Danach wurden die Proben mit Kupferreagenz von Somogygekocht und nach Nelson die Farbe, wie bei NAJDAR (1955) beschrieben, besrimmt, DieHemmung der Arnylaseaktivitat durch Maltose wurde an einem Enzyrnpraparat, das zwi­schen 0-33 % Sattigung mit Ammoniumsulfat gefallt wurde, untersucht. Es wurden 20,ulEnzym mit 12,amol Citratpuffer pH 6,1, 3/imol NaF, 0,4 mg Amylopektin und Maltose,wie angegeben, in einem Endvolumen von 0,2 ml angesetzt. Die nach 30 min Inkubationbei 30 DC noch vorhandene Reststarke wurde, wie oben beschrieben, gemessen. Gleichzei­tig wurde auch der Chlorophyllgehalt der Enzympraparate analysiert,

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Bei der Gelelektrophorese wurden die Enzympraparate in 7,5 % Polyacrylamidgel, das0,4 mg losliche Starke bzw. ~-Grenzdextrin aus Amylopektin im ml enthielt, in Tris-Glycin­Puffer pH 8,3 bei 6 rnA pro Rohrchen getrennt. Die Gele wurden 4 Stunden in 0,1 MCitr atp uffer pH 6,1 bei 37 "C inkubiert, anschl ieBend in essigsaurem Arhanol, das J2-KJenthielr, entwickelt.

Ergebnisse und Diskussion

In der Abb . 1 ist der Tagesgang der Starkegehalte und der Amylasenaktivitatenin den Blattern von Kalancboe daigremont iana dargestellt . Die Punkte sind diegleitenden Mittel aus zwei MeBwerten. Die bei der Probenahme herrschende Be­leuchtung ist ebenfalls eingezeichnet. Die Dunkelheit endet gegen 5 Uhr. Die Pflan­zen befanden sich im Dbergang vom Kurztag in den Langtag. Es war 14 Stundenlang hell. Die schwankende Be1euchtung wahrend des Tages ist durch Wolken unddie zeitweise notwendige Schattierung des Cewachshauses verursacht .

3D

150

90

120

60

4

urnoljJmol ·h"l

180

22320

13. 1--14. April 1976 ---.j 15.

I

11I

8

16

24

12

20

IKlx)28

I

14 17Time (hou rs)

Fig. 1; Diurnal fluctua tion of sta rch content and amylases acnvit y in K. daigremontianaleaves. +--+ starch content (umol glucose unit s' mg" chlorophyll) , .A.-.A. amylasesactivity (,umol redu cing sugar' h- 1 • mg" chlorophyll), •....• illumination (Ix).

Die Starkeanhaufung beginnt nicht gleichzeitig mit der Belichtung, sondern erstnach 3stlindiger Lagphase. Eine Verzogerung der Starkeakkumulation ist auch fiirdie CAM-Pflanze Tillandsia usneoides beobachtet worden (KLUGE et aI., 1973). DieUmwandlung von Malar in Starke setzt erst nach einer Belichtung der pflanzenvon 2 bis 4 Stunden ein. Da unser Versuch an zwei verschiedenen Ta gen durchge­[iihrt worden ist, erklaren wir den Abfall der Starkegehalte zwischen 13 und 18Uhr durch die unterschiedlichen Lichtverhaltnisse an den Versuchstagen. Die erste

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Serie endet urn 14.30 Uhr, die zweite beginnt am darauffolgenden Tag urn 15.30Uhr.

Die Arnylaseaktivitaten zeigen aber keine grogeren Unterschiede zwischen denBestimmungen vor und nach der Unterbrechung. Irn Gegensatz zum Starkegehaltandert sich die Arnylasenaktivitat gleich nach dem Einsetzen der Belichtung. Siesteigt auf das Doppelte und bleibt auf dieser Hohe bis zum Abend. Dann nimmt sienoch einmal urn das 2fache zu. Diese erhohte Amylasenaktivitat wird nur so langegefunden, wie Starke noch in grogeren Mengen vorhanden ist (bis 23 Uhr). Dieserverzogerte Riickgang des Starkegehaltes im Dunkeln ist bemerkenswert, besondersweil die Arnylasenaktivitaten zu dieser Zeit (18 bis 22 Uhr) die Maximalwerte er­reichen. Wir haben die Amylasen durch Gelelektrophorese getrennt und 6 Bandengefunden. Davon sind 4 a-Amylasen, wie durch den Grenzdextrintest bestatigtwird, und 2 Banden zeigen iJ-Amylaseneigenschaften (Abb. 2). Maltose beeinflufstdie Amylaseaktivitat, Die Abb. 3 zeigt ihre Hemmung durch steigende Konzentra­tionen von Maltose. Wir haben schon fur das Maisblatt die Hemmung der Amyla­sen durch Maltose beschrieben (FEKETE und VIEWEG, 1973). Diese Befunde sprechendafiir, daf eine Kontrolle der Amylaseaktivitat durch die Maltose allgemein ist und

Fig. 2: Ionophoretic separation of the a- and B-amylases from K. daigremontiana leaves.:::::::::::: a-amylase. _ B-amylase; the B-amylases were confirmed by the failure of reactingwith B-limit dextrines.

100

80

~ 60

co

.D:c 40c l•

~.•

Fig. 3: Effect of various concentrationsof maltose on the inhibition of amylasesactivity in an enzyme preparation fromK. daigremontiana leaves. 40 60 80

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nicht nur eine Spezialitat der Biindelscheidenzellen des Maisblattes. Steigt die Kon­zentration der Maltose innerhalb der Plastiden, so ist die Amylase gehemmt. Da­durch ist der Abbau der Starke wahrend der Lichtphase auf die Bereitstellung derMaltooligosaccharide , die als Primer fur weitere Synthese dienen sollen , begrenzt.Ober die Bildung der Maltose in Plastiden haben LINDEN und Mirarbeiter (1975 )berichtet. Diese wird durch Abschalten des Lichtes nicht beeinflutlt.

Auch VICKERY (1954) hat fur Bryophyllum calyc inum im Dunkeln zuerst fastkeine Abnahme des Starkegehaltes gefunden, und BRUNNHOFER und Mirarbeiter(1968) haben fur Bryophyllum daigremontianum (= K alanchoe d .) sogar eine Stei ­geru ng der Srarkekonzentration nach Ausschalten des Lichtes beobachtet, Ein ahnli­ches Bild bieten die Werte von SUTTON (1975 b), wenn die MeBpunkte miteinanderverbunden werden und keine ausgleichende stetig fallende Kurve gezeichnet wird.Auch er findet vorerst nach dem Verdunkeln der intakten Pflanzen (B. tubiflorum)im Blatt einen Anstieg sowohl der Starke als auch der Glucane. Erst zwischen dervierten und siebten Stunde nach dem Einsetzen der Dunkelheit nehmen die Starke­gehalte abo Un sere Starkebestimrnungen ahneln denjenigen von BRUNNHOFER, dennwir haben die Proben in Aceton gepottert, dann den gesarnten Niederschlag mitCaCl2-Lasung aufgeschlossen und mit Jod angefarbt. Sornit sind die Glucanketten,die mehr als 12-14 Glukoseinheiten enthalten, in unserer Starkebcstimmung er­faBt. Dagegen harte SUTTON nur die durch Jod ausfallbare Fraktion als Starke de­Finiert. Die kiirzeren in Losun g gebliebenen Ketten bezeichnete er als Glucane. Die­se machten das 1,5- bis 2fache der Starkekonzcntration aus. Solche Glucane kon­nen der Aktivitat der a-Amylasen zugeschrieben werden. Das Angleichen der Amy­laseaktivitat an die Starkekonzcntration kann dazu beitragen, daf das Verhaltnisvon Glucanen zu Starke wahrend der Dundelperiode konstant bleibt,

D ie kleinste Am ylaseaktivit ar , die wir wahrend der beiden Versuchstage fan den,setzte 0.37,L1mol reduzierende Zucker' min -I . mg" Chlorophyll frei . Die hochsteAktivitat fanden wir zwischen 18 und 22 Uhr. Sie erreichte 1,8 ,LImol · min-I. mg".D iese Menge reicht gut aus, urn die vorhandene Starke abzubauen. Die Abnahmeerfol gre in der Dunkelheit zwischen 23 und 1 Uhr. Die Angabe von SUTTON(1975 a), keine Amylase - oder hochsten 0,05/tmol . min-I . rng'" - im Blatt von K.dai gremontiana gefunden zu haben, steht im Gegensatz zu unseren Ergebnissen. Eskonnte an einem Inhibitor liegen, der im Test die Amylaseaktivitat von Langtag­pflanzen hemmt, wie BRULFERT und Mitarbeiter (1973) fur K alanchoe blo ssieldianabeschrieben haben.

D ie von SUTTON ermittelten Aktivitaten der Phosphorylasen entsprechen unserenWerten, die wir urn 23 und 24 Uhr bestimmt haben. Da der hohe Starkegehalt in­nerhalb zweier Stunden auf den niedrigen absinkt, reicht die Phosphorylaseaktivitatnur aus, d ie 2fache Menge der jenigen abzubauen, die wirklich verschw indet, undniche das 6,86fache, wie von SUTTON angegeben.

Ob es die Phosphorylase oder die Amylase ist, die den Abbau der Starke kataly­siert, bleibt nach diesen Versu chen offen. Wir vermuten, daB beide Enzyme Hand

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in Hand an diesem Prozef beteiligt sind. Bemerkenswert ist jedoch der Anstieg derAmylasenaktivitar mit zunehmender Intensitat des Lichtes. Wir deuten dies als eineAnpassung der Pflanze an einen erhohten Bedarf an Primer fur die Starkesynthese,der durch die Aktivitat der a-Amylasen gedeckt wird.

Die Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft unterstiitzt. Wir dankenFrau C. JUNG und Fraulein G. SEIFER fur ihre zuverlassige technische Assistenz.

Literatur

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VICKERY, H. B.: Plant. Physiol. 29, 520 (1954).

Dr. G. H. VIEWEG, Prof. Dr. M. DE FEKETE, Fachbereich 10 Biologie, Technische HochschuleDarmstadt, Schnittspahnstr. 3-5, D-6100 Darmstadt, BRD.

Z. Pflanzenphysiol. Bd. 81. S. 74-79. 1977.