1  

Synthesis and cellular activity of stereochemically‐pure 2’‐O‐

(2‐methoxyethyl)‐phosphorothioate oligonucleotides Meiling Li, Helen L. Lightfoot, François Halloy, Anna L. Malinowska, Christian Berk, Alok Behera, 

Daniel Schümperli and Jonathan Hall  

 

Supplementary Information 

 

Contents Reagents and Instruments ........................................................................................................................... 3 

The synthesis of 5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S3) ................................................................. 3 

2’‐OMOE adenosine (S1) .......................................................................................................................... 3 

2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S2)4 ....................................................................................................... 4 

5’‐DMT‐2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S3)5 .......................................................................................... 5 

The synthesis of 5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐Guanosine (S9) ........................................................... 5 

2’‐OMOE‐2‐amino‐adenosine (S5) ........................................................................................................... 5 

2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐adenosine (S6) ................................................................................................... 6 

2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐guanosine (S8) ................................................................................................... 7 

5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐guanosine (S9)5 .................................................................................. 8 

The synthesis of chiral phosphoramidites (4a‐4h)2 ..................................................................................... 9 

Sp‐T OAP monomer (Sp‐4a) ...................................................................................................................... 9 

Sp‐GiBu OAP monomer (Sp‐4d) ................................................................................................................ 10 

Sp‐mCBz OAP monomer (Sp‐4b) ............................................................................................................... 11 

Sp‐ABz OAP monomer (Sp‐4c) ................................................................................................................. 12 

Rp‐ABz OAP monomer (Rp‐4g) ................................................................................................................ 13 

Rp‐T OAP monomer (Rp‐4e) ................................................................................................................... 14 

Rp‐mCBz OAP monomer (Rp‐4f) ............................................................................................................... 14 

Rp‐GiBu OAP monomer (Rp‐4h) ............................................................................................................... 15 

Materials and methods for properties ....................................................................................................... 16 

Oligoribonucleotide phosphorothioate synthesis ................................................................................. 16 

Thermal stability studies (Tm) ................................................................................................................. 17 

Cell culture and gapmers (Mp (16), Mp‐Rp (17) and Mp‐Sp (18)) transfection .................................... 17 

Electronic Supplementary Material (ESI) for ChemComm.This journal is © The Royal Society of Chemistry 2016

2  

RNA extraction and purification............................................................................................................. 17 

Quantitative reverse transcriptase‐polymerase chain reaction (qRT‐PCR) .......................................... 17 

Cell culture and SSO (FCH (20), FCH‐Rp (21), FCH‐Sp (22) and FCH‐PO (24)) minigene assay .............. 18 

RNA extraction and purification............................................................................................................. 18 

Reverse transcriptase‐polymerase chain reaction (RT‐PCR) ................................................................. 18 

Agarose gel electrophoresis ................................................................................................................... 19 

Data analysis ........................................................................................................................................... 19 

Plasmid for SSO minigene assay ............................................................................................................. 19 

HPLC‐MS profiles of purified FCH‐Sp (22), FCH‐Rp (21), Mp‐Sp (18) and Mp‐Rp (17) .............................. 21 

Melting temperature (Tm) curves of stereodefined PS‐oligonucleotides ................................................. 23 

Spectra of synthesized nucleosides and phosphoramidites ..................................................................... 24 

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE adenosine (S1) ............................................................................ 24 

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE‐2‐amino‐adenosine (S5) ............................................................. 25 

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S2) .......................................................... 26 

1H and 13C NMR spectra of 5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S3) .......................................... 27 

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐adenosine (S6) ..................................................... 28 

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐guanosine (S8) ..................................................... 29 

1H and 13C NMR spectra of 5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐guanosine (S9) ..................................... 30 

1H, 13C and 31P NMR spectra of Sp‐ABz (Sp‐4c) OAP monomer .............................................................. 31 

1H, 13C and 31P NMR spectra of Rp‐ABz (Rp‐4g) OAP monomer ............................................................. 32 

1H, 13C and 31P NMR spectra of Sp‐GiBu (Sp‐4d) OAP monomer ............................................................. 33 

1H, 13C and 31P NMR spectra of Rp‐GiBu (Rp‐4h) OAP monomer ............................................................ 34 

1H, 13C and 31P NMR spectra of Sp‐T (Sp‐4a) OAP monomer ................................................................. 35 

1H, 13C and 31P NMR spectra of Rp‐T (Rp‐4e) OAP monomer ................................................................ 36 

1H, 13C and 31P NMR spectra of Sp‐mCBz (Sp‐4b) OAP monomer ............................................................ 37 

1H, 13C and 31P NMR spectra of Rp‐mCBz (Rp‐4f) OAP monomer ............................................................ 38 

The crude HPLC‐MS profiles of stereodefined PS‐ORNs ........................................................................... 39 

Crude HPLC‐MS profiles of DMT‐TRpCGTACGT (5) and DMT‐TSpCGTACGT (11) ..................................... 39 

Crude HPLC‐MS profiles of DMT‐CRpCGTACGT (6) and DMT‐CSpCGTACGT (12) .................................... 40 

Crude HPLC‐MS of DMT‐ARpCGTACGT (7) and DMT‐ASpCGTACGT (13) ................................................. 41 

Crude HPLC‐MS of DMT‐mCRpCGTACGT (6) and DMT‐mCSpCGTACGT (12) .............................................. 42 

Crude HPLC‐MS of DMT‐GRpCGTACGT (8) and DMT‐GSpCGTACGT (14) ................................................. 43 

Crude HPLC‐MS of DMT‐TRpAGTACGT (10) ............................................................................................. 44 

Crude HPLC‐MS of DMT‐TRpTGTACGT (9) ............................................................................................... 44 

3  

Crude HPLC‐MS of DMT‐ASpGGTACGT (15) ............................................................................................ 45 

References .................................................................................................................................................. 45 

 

 

Reagents and Instruments 

All  NMR  spectra were  recorded  on  a  Bruker  AV400.  1H  NMR,  13C  NMR  and  31P  NMR were 

measured  in  deuterated  solvents.  ESI  Mass  spectra  were  recorded  on  a  Bruker’s  solariX 

(ESI/MALDI‐FTICR‐MS).  

All  glassware were dried  thoroughly prior  to use. Triethylamine was distilled  from CaH2,  and 

stored over KOH pellets under Argon. N‐methyl morpholine was distilled from BaO, and stored 

over KOH pellets under Argon. Phosphorus trichloride was purchased from Aldrich and used as 

received. Tetrahydrofuran and toluene were purchased from Aldrich and stored over molecular 

sieves. The other organic solvents were reagent grade and used as received. Silica gel column 

chromatography was carried out using Merck Silica gel 40‐60 µm (230 – 400 mesh). Analytical TLC 

was performed on Merck Kieselgel 60 F254 aluminium sheet. The activator N‐phenyl imidazolium 

triflate was prepared according to the literature1.  

Chiral auxiliaries D‐I and L‐I were synthesized as previously reported2. Compound 5’‐ODMT‐2’‐

OMOE‐thymidine  and  5’‐DMT‐2’‐OMOE‐5‐methyl‐cytidine were  synthesized  according  to  the 

literature3. 

The synthesis of 5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S3) 

2’‐OMOE adenosine (S1) 

 

Adenosine (5.34 g, 20 mmol) was dissolved in DMF (130 ml) at 100 °C. Then it was cooled down 

to 0 °C and NaH (60% in mineral oil, 1.28g, 32 mmol) was added portionwise. The resulting mixture 

4  

was stirred at room temperature for 1 h. Tosylated alcohol (5.0 g, 22 mmol) was added over 10 

mins. The reaction mixture was stirred for 16 h at 50 °C. DMF was evaporated to dryness under 

reduced pressure. The residue was dissolved in methanol (100 ml) followed by silica gel (20 g). 

Methanol  was  removed  until  very  thin  power  was  formed.  The  mixture  was  subjected  to 

purification by chromatography (silica gel, CH2Cl2:MeOH, 10:1) to give the mixture of 2’‐ and 3’‐ 

isomers. The mixture was precipitated from CH2Cl2 to give pure 2’‐ isomer S1 (2.6 g, 40%). 1H NMR 

(400 MHz, DMSO‐d6) 8.38 (s, 1 H), 8.14 (s, 1 H), 7.35 (s, 2 H), 5.99 (d, J = 6.08 Hz, 1 H), 5.42 (dd, 

J = 6.97, 4.69 Hz, 1 H), 5.13 (d, J = 4.82 Hz, 1 H), 4.55 (dd, J = 6.21, 4.94 Hz, 1 H), 4.35 ‐ 4.28 (m, 1 

H), 3.98 (q, J = 3.30 Hz, 1 H), 3.72 ‐ 3.63 (m, 2 H), 3.60 ‐ 3.48 (m, 2 H), 3.37 (t, J = 4.69 Hz, 2 H), 3.12 

(s, 3 H). 13C NMR (100 MHz, DMSO‐d6)  156.4, 153.0, 149.4, 140.6, 119.6, 119.5, 86.7, 86.5, 81.6, 

71.5, 69.4, 61.8, 58.4. 

2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S2)4

 

Compound S1  (4.87 g, 15 mmol) was  coevaporated with anhydrous pyridine  (2  x 15 ml) and 

dissolved in anhydrous pyridine (70 ml) followed by the addition of chlorotrimethylsilane (61.7 

mmol, 7.8 ml). After 30 mins, benzoyl chloride (2.3 ml, 19.6 mmol) was added and stirring was 

continued for 3 h. The reaction mixture was then cooled down to 0 °C and quenched with water 

(30  ml).  Subsequently  the  reaction  mixture  was  treated  with  an  aqueous  concentrated 

ammonium hydroxide solution (50 ml) and stirred for 30 min at room temperature. The mixture 

was extracted with CH2Cl2 (3 x 100 ml). The organic layer was dried over Na2SO4 and concentrated 

under reduced pressure. Flash chromatography (CH2Cl2:MeOH, 95:5) give the desired compound 

S2 (4.76, 74%) as a colorless foam. 1H NMR (400 MHz, DMSO‐d6) 11.21 (s, 1 H), 8.75 (d, J = 10.65 

Hz, 2 H), 8.04 (d, J = 7.10 Hz, 2 H), 7.68 ‐ 7.61 (m, 1 H), 7.59 ‐ 7.52 (m, 2 H), 6.15 (d, J = 5.83 Hz, 1 

H), 5.20 (d, J = 5.32 Hz, 1 H), 5.15 (t, J = 5.58 Hz, 1 H), 4.61 (t, J = 5.32 Hz, 1 H), 4.39 ‐ 4.32 (m, 1 H), 

4.00 (q, J = 3.80 Hz, 1 H), 3.77 ‐ 3.65 (m, 2 H), 3.64 ‐ 3.54 (m, 2 H), 3.42 ‐ 3.39 (m, 2 H), 3.14 (s, 3 

5  

H). 13C NMR (100 MHz, DMSO‐d6) 166.1, 152.6, 152.2, 151.0, 143.5, 133.8, 133.0, 128.9 (4C), 

126.3, 86.6, 86.3, 81.7, 71.6, 69.5, 69.3, 61.6, 58.5. 

5’‐DMT‐2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S3)5

Compound S2 (3.7 g, 8.6 mmol) was coevaporated with anhydrous pyridine (2 x 15 mL) and then 

dissolved in anhydrous pyridine (40 mL). DMTrCl (3.79 g, 9.50 mmol) was added portionwise at 0 

°C. The reaction was stirred for 3 h at 0 °C. Once completed, the reaction mixture was stirred for 

30min  after  the  addition  of  methanol  (5  mL).  The  solvent  was  evaporated  under  reduced 

pressure. The residue was portioned between ethyl acetate (40 mL) and sat. aq. NaHCO3 (70 mL). 

The organic phase was separated. The aqueous layer was extracted with ethyl acetate (2 x 40 mL). 

The combined organic extracts were dried over Na2SO4, filtered and concentrated. Purification on 

chromatography (silica gel, DCM:MeOH, 97:3) afford compound S3 as a white foam (5.1 g, 81%). 

1H NMR (400 MHz, CD3CN) 9.54 (br s, 1 H), 8.58 (s, 1 H), 8.27 (s, 1 H), 7.98 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 

7.61 ‐ 7.58 (m, 1 H), 7.51 ‐ 7.49 (m, 2 H), 7.42 ‐ 7.39 (m, 2 H),  7.29 ‐ 7.18 (m, 7 H), 6.82 ‐ 6.79 (m, 

4 H), 6.12 (d, J = 4.6 Hz, 1 H), 4.71 (t, J = 4.7 Hz, 1 H), 4.53 (br s 1 H), 4.16 ‐ 4.13 (m, 1H),  3.82 ‐ 

3.74 (m, 3 H), 3.72 (s, 6 H), 3.48 ‐ 3.45 (m, 2 H), 3.34 (d, J = 4.1 Hz, 2 H), 3.23 (s, 3H). 13C NMR (100 

MHz, CD3CN) 159.7, 153.0, 146.0, 143.5, 136.9, 136.8, 133.6, 131.1, 129.7, 129.4, 129.2, 129.1, 

128.9, 128.4, 127.9, 114.1, 88.1, 87.2, 85.1, 82.7, 72.5, 71.1, 70.8, 64.4, 59.1, 55.9. 

The synthesis of 5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐Guanosine (S9) 

2’‐OMOE‐2‐amino‐adenosine (S5) 

 

6  

2‐Amino adenosine S4 (22.6 g, 80 mmol) was dissolved in DMF (350 ml) at 100 °C. Then it was 

cooled down to 0 °C and NaH (60% in mineral oil, 5.12 g, 128 mmol) was added portionwise. The 

resulting mixture was stirred at room temperature for 1 h. Tosylated alcohol (20.2 g, 88 mmol) 

was added over 20 min. The reaction mixture was stirred for 16 h at 50 °C. DMF was evaporated 

to dryness under reduced pressure. The residue was dissolved in MeOH (100 ml) followed by silica 

gel (60 g). Methanol was removed until very thin power was formed. The mixture was subjected 

to purification by chromatography (silica gel, CH2Cl2:MeOH, 10:1) to give the mixture of 2’‐ and 

3’‐ isomers. The mixture was precipitated from CH2Cl2 to give pure 2’‐ isomer S5 (9.0 g, 33%). 1H 

NMR (400 MHz, DMSO‐d6)  7.97 (br s, 1 H), 6.79 (br s, 2 H), 5.83 (d, J = 6.84 Hz, 1 H), 5.78 ‐ 5.72 

(m, 2 H), 5.44 (dd, J = 6.59, 4.82 Hz, 1 H), 5.05 (d, J = 4.82 Hz, 1 H), 4.45 (dd, J = 6.59, 5.07 Hz, 1 H), 

4.27 (td, J = 4.69, 2.79 Hz, 1 H), 3.93 (q, J = 3.46 Hz, 1 H), 3.72 ‐ 3.60 (m, 2 H), 3.58 ‐ 3.48 (m, 2 H), 

3.44  ‐ 3.36  (m, 2 H), 3.16  (s, 3 H). 13C NMR  (100 MHz, DMSO‐d6) 160.5, 156.7, 151.9, 136.6, 

113.9, 86.5, 85.5, 81.4, 71.5, 69.6, 69.3, 62.1, 58.5. 

2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐adenosine (S6)

 

Compound S6 was prepared using a protocol  from ref6. S5  (10.48 g, 30.8 mmol) was dried by 

repeated  co‐evaporation  with  anhydrous  pyridine  (3  X  100 ml)  and  dissolved  in  anhydrous 

pyridine (350 ml). Trimethylsilyl chloride  (19.5 ml, 154 mmol) was added and the mixture was 

stirred at room temperature for 30 min. The solution was cooled to ‐ 20 °C and isobutyryl chloride 

(3.55 ml, 34.0 mmol) was added dropwise over 30 min. The reaction mixture was stirred at ‐ 20 

°C for 2.5 h followed by 1 hour at room temperature. After completion of the reaction (by TLC), 

the reaction mixture was cooled (ice‐bath), ethanol (100 ml) was added, and after 20 min, 28% 

aqueous ammonia (200 ml) was added. Stirring was continued for 30 min at room temperature. 

The  solvents were evaporated. The  resulting oily  residue was coevaporated with  toluene and 

7  

subjected  to  flash  chromatography  (silica gel, CH2Cl2:MeOH, 95:5)  to give mono‐protected S6 

(6.82 g) and double‐protected S7 (3.70 g). The isolated product S7 was dissolved in methanol (25 

ml)  followed by  the addition of  trimethylamine  (1.15 ml, 8.25 mmol)7. The  resulting  reaction 

mixture was stirred for 24 h at room temperature. The reaction was condensed and the residue 

was purified on flash chromatography (silica gel, CH2Cl2:MeOH, 94:6) to give the product S6 (3.16 

g) with an overall yield of 79% over two steps. 1H NMR (400 MHz, DMSO‐d6) 9.82 (s, 1 H), 8.27 

(s, 1 H), 7.22 (br s, 2 H), 5.93 (d, J = 6.34 Hz, 1 H), 5.09 (d, J = 5.07 Hz, 1 H), 5.04 (t, J = 5.70 Hz, 1 

H), 4.53 (dd, J = 6.21, 4.94 Hz, 1 H), 4.30 (td, J = 4.75, 3.17 Hz, 1 H), 3.93 (d, J = 3.29 Hz, 1 H), 3.73 

‐ 3.49 (m, 4 H), 3.43 ‐ 3.37 (m, 2 H), 3.15 (s, 3 H), 2.84 (br s, 1 H), 1.06 (d, J = 6.59 Hz, 6 H). 13C NMR 

(100 MHz, DMSO‐d6) 175.5, 156.6, 153.3, 150.8, 139.2, 116.7, 86.4, 85.4, 81.5, 71.5, 69.4, 61.9, 

58.4, 55.4, 34.6, 19.8 (2C). 

2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐guanosine (S8)

 

Compound S8 can be prepared via enzymatic transformation 7. However, we synthesized it in a 

protocol similar to that  in ref 8. To a stirred solution of compound S6 (7.48 g, 18.2 mmol)  in a 

mixture of acetic acid (7.3 ml) and water (15 ml) was added NaNO2 (15.1 g, 218.4 mmol). The 

reaction mixture was stirred for 20 h at room temperature. Once it was completed, the solvents 

were evaporated under reduced pressure. Then acetone  (30 ml) was added. The precipitation 

was filtered off. The filtrate was concentrated and the residue was subjected to chromatography 

(silica gel, CH2Cl2:MeOH, 12:1) to give an off white powder S8 (7.0 g, 94%). 1H NMR (400 MHz, 

DMSO‐d6) 12.08 (br s, 1 H), 11.67 (br s, 1 H), 8.28 (s, 1 H), 5.90 (d, J = 6.59 Hz, 1 H), 5.14 ‐ 5.04 

(m, 2 H), 4.41 (dd, J = 6.59, 4.82 Hz, 1 H), 4.29 (d, J = 3.04 Hz, 1 H), 3.93 (d, J = 3.04 Hz, 1 H), 3.73 

‐ 3.65 (m, 1 H), 3.64 ‐ 3.50 (m, 3 H), 3.42 ‐ 3.37 (m, 2 H), 3.16 (s, 3 H), 2.82 ‐ 2.69 (m, 1 H), 1.12 (d, 

J = 6.59 Hz, 6 H). 13C NMR (100 MHz, DMSO‐d6) 180.34, 155.02, 149.11, 148.48, 137.72, 120.25, 

86.26, 84.68, 81.74, 71.31, 69.12 (2C), 61.43, 58.20, 34.97, 19.06 (2C).   

8  

5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐guanosine (S9)5

 

Compound S8 (2.05 g, 5.0 mmol) was coevaporated with anhydrous pyridine (2 x 10 mL) and then 

was dissolved in anhydrous pyridine (30 mL). DMTrCl (2.20 g, 5.5 mmol) was added portionwise 

at 0 °C. The reaction was stirred for 3 h at 0 °C and 30 mins at room temperature. Once completed, 

the reaction mixture was stirred for 30mins after the addition of methanol (3 mL). The solvent 

was evaporated under reduced pressure. The residue was portioned between ethyl acetate (30 

mL)  and  sat.  aq. NaHCO3  (60 mL).  The organic phase was  separated.  The  aqueous  layer was 

extracted with ethyl acetate (2 x 30 mL). The combined organic extracts were dried over Na2SO4, 

filtered and concentrated. Purification on chromatography (silica gel, DCM:MeOH, 96:4) afford 

the white foam S9 (2.3 g, 65%). 1H NMR (400 MHz, CD3CN) 11.96 (s, 1 H), 9.23 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 

H), 7.43 ‐ 7.38 (m, 2 H), 7.31 ‐ 7.17 (m, 7 H),  6.83 ‐ 6.77 (m, 4H),  5.90 (d, J = 4.56 Hz, 1 H),  4.59 ‐ 

4.54 (m, 1 H), 4.53 ‐ 4.46 (m, 1 H), 4.10 ‐ 4.06 (m, 1 H), 3.84 ‐ 3.77 (m, 1 H), 3.76 ‐ 3.68 (m, 7 H), 

3.54 ‐ 3.47 (m, 3 H), 3.38 (dd, J = 10.52, 5.70 Hz, 1 H),  3.29 ‐ 3.22 (m, 4 H), 2.64 ‐ 2.52 (m, 1 H),  

1.15 (dd, J = 8.74 Hz, 3 H),  1.13 (dd, J = 8.74 Hz, 3 H). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) 180.4, 159.3, 

155.8, 149.1, 148.5, 145.6, 138.5, 136.4, 136.3, 130.6, 130.5, 128.6 (2C), 128.3 (2C), 127.4 (2C), 

122.0 (2C), 117.9, 113.5 (4C), 87.4, 86.7, 84.7, 82.4, 72.1, 70.7, 70.5, 64.5, 58.7, 55.5 (2C), 36.2, 

18.8, 18.7. 

9  

The synthesis of chiral phosphoramidites (4a‐4h)2 

 

Sp‐T OAP monomer (Sp‐4a) 

 

A typical procedure for the synthesis of phosphoramidites 4a‐4h2. 

(S)‐phenyl((R)‐pyrrolidin‐2‐yl)methanol  (533 mg,  3 mmol) was  co‐evaporated with  anhydrous 

toluene three times and was dissolved in anhydrous toluene (3 mL) in a 25 ml round bottom flask 

with stirring under Argon. To this solution was added N‐methyl morpholine (0.66 ml, 6 mmol). A 

second  round  bottom  flask  was  charged  with  anhydrous  toluene  (5  ml)  and  phosphorus 

trichloride (0.25 ml, 2.85 mmol) at – 70 ˚C with stirring under Argon. The amino alcohol solution 

was transferred to the solution of PCl3 over a period of 5 mins at – 70 ˚C. The reaction mixture 

was allowed to warm to room temperature and was stirred for 1 hour.  

10  

In a third round bottom flask (50 ml), 5’‐ODMTr‐2’‐OMOE‐thymidine (930 mg, 1.5 mmol) was co‐

evaporated three times with anhydrous toluene and was dissolved in THF (7.5 ml). Et3N (2.1 ml, 

15 mmol) was  then added. The solution of 2‐chloro‐oxazaphospholidine  intermediate D‐I was 

added via syringe over a period of 20 mins at – 70 ˚C. The reaction was allowed to warm up to 

room temperature and was stirred for 3 h. The reaction mixture was cooled to – 20 ˚C and was 

quenched with saturated aqueous sodium bicarbonate solution (30 ml). The mixture was dilute 

with ethyl acetate (30 ml). The organic layer was separated and the aqueous layer was extracted 

twice with ethyl acetate (2 X 30 ml). The combined organic phases were washed with brine, dried 

over Na2SO4, filtered and concentrated. The crude material was passed through a very short of 

silica gel, which was flushed with elute (EA:hexane:Et3N, 80:20:2). The fractions containing the 

product were collected and concentrated to give the amidite (Sp)‐4a as a white powder (1.10 g, 

89%). 1H NMR (400 MHz, CD3CN)  9.06 (br s, 1 H), 7.54 (s, 1 H), 7.48 ‐ 7.44 (m, 2 H), 7.36 ‐ 7.21 

(m, 12 H),  6.86 (dd, J = 8.74, 0.89 Hz, 4 H),  5.86 (d, J = 4.31 Hz, 1 H),  5.66 (d, J = 6.59 Hz, 1 H), 

4.80 (d, J = 9.38 Hz, 1 H), 4.22 ‐ 4.17 (m, 1 H), 4.15 ‐ 4.09 (m, 1 H), 3.90 ‐ 3.82 (m, 1 H), 3.80 ‐ 3.75 

(m, 8 H), 3.69 ‐ 3.65 (m, 1 H),  3.58 ‐ 3.49 (m, 1 H), 3.47 ‐ 3.43 (m, 2 H), 3.42 (d, J = 2.28 Hz, 1 H), 

3.28 (dd, J = 11.15, 3.04 Hz, 2 H), 3.24 (s, 3 H), 3.11 ‐ 3.01 (m, 2 H), 1.67 ‐ 1.49 (m, 2 H), 1.21 ‐ 1.13 

(m, 1H), 0.90 ‐ 0.85 (m, 1 H). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) 164.7, 159.9, 151.6, 145.8, 139.8 (d, 3Jpc = 4.02 Hz), 136.6, 136.5, 131.2, 129.2, 129.1, 129.0, 128.5, 128.1, 126.6, 114.2, 111.4, 88.5, 

87.7, 84.1 (d, 2Jpc = 9.1 Hz), 83.8 (d, 3Jpc = 3.02 Hz), 82.2 (d, 3Jpc = 2.01 Hz), 72.8, 70.9 (d, 2Jpc = 5.03 

Hz), 70.8, 68.1 (d, 2Jpc = 3.02 Hz), 63.3, 59.2, 56.0, 47.7 (d, 2Jpc = 34.2 Hz), 28.8, 26.7 (d, 3Jpc = 3.02 

Hz), 12.4. 31P NMR (161 MHz, CD3CN) 151.63. ESI‐HRMS: m/z calcd for C45H50N3O10P+ [(M + H)+] 

823.3234, found 823.3235. 

Sp‐GiBu OAP monomer (Sp‐4d) 

 

11  

Crude (Sp)‐4d was synthesized from 5’‐ODMTr‐2’‐OMOE‐guanosine S9 (715 mg, 1 mmol) and (S)‐

phenyl((R)‐pyrrolidin‐2‐yl)methanol  (355 mg, 2 mmol) following the procedure described above 

and purified by silica gel column chromatography (EA:Acetone:Et3N, 80:20:2) to give (Sp)‐4d as a 

white powder (500 mg, 49%). 1H NMR (400 MHz, CD3CN)  7.90 (s, 1 H), 7.49 ‐ 7.42 (m, 2 H), 7.36 

‐ 7.19 (m, 12 H), 6.83 (d, J = 8.87 Hz, 4 H), 5.90 (d, J = 5.58 Hz, 1 H), 5.62 (d, J = 6.59 Hz, 1 H),  4.87 

(dt, J = 9.70, 4.66 Hz, 1 H), 4.68 ‐ 4.61 (m, 1 H), 4.26 ‐ 4.18 (m, 1 H), 3.85 (dt, J = 13.31, 6.53 Hz, 1 

H), 3.75 (s, 6 H), 3.73 ‐ 3.69 (m, 2 H), 3.60 ‐ 3.47 (m, 1 H), 3.45 ‐ 3.39 (m, 3 H), 3.31 (dd, J = 10.90, 

4.31 Hz, 1 H), 3.19 (s, 3 H), 3.09 ‐ 3.01(m, 1 H), 2.53 ‐ 2.44 (m, 1 H), 1.65 ‐ 1.49 (m, 2 H), 1.19 ‐ 1.13 

(m, 1 H), 1.13 (d, J = 6.84 Hz, 3 H), 1.09 (d, J = 6.84 Hz, 3 H), 0.93 ‐ 0.83 (m, 1 H). 13C NMR (100 

MHz, CD3CN) 180.4, 159.3, 156.0, 149.3, 148.7, 145.5, 139.2 (d, 3Jpc = 4.02 Hz), 137.8, 136.3, 

136.1, 130.7, 130.6, 128.7, 128.6, 128.5, 128.0, 127.5, 126.1, 113.7, 86.9, 86.6, 84.2 (d, 3Jpc = 3.01 

Hz), 83.7 (d, 2Jpc = 11.1 Hz), 81.3 (d, 3Jpc = 2.01 Hz), 72.1, 70.7 (d, 2Jpc = 4.02 Hz), 70.3, 67.6 (d, 2Jpc 

= 3.01 Hz), 63.6, 58.6, 55.5, 47.2 (d, 2Jpc = 35.2 Hz), 36.2, 28.3, 26.2 (d, 3Jpc = 3.01 Hz), 18.8, 18.7. 

31P NMR (161 MHz, CD3CN) 151.26. ESI‐HRMS: m/z calcd for C49H55N6O10P+ [(M + H)+] 918.3717, 

found 918.3715.

Sp‐mCBz OAP monomer (Sp‐4b) 

 

Crude (Sp)‐4b was synthesized from 5’‐ODMTr‐2’‐OMOE‐5‐methyl‐cytidine (1.44 g, 2 mmol) and 

(S)‐phenyl((R)‐pyrrolidin‐2‐yl)methanol  (709 mg,  4 mmol)  following  the  procedure  described 

above and purified by silica gel column chromatography (EA:hexane:Et3N, 60:40:2) to give (Sp)‐

4b as a white powder (1.70 g, 91%). 1H NMR (400 MHz, CD3CN)  13.25 (br s, 1 H), 8.23 ‐ 8.33 (m, 

2 H), 7.87 (d, J = 1.01 Hz, 1 H), 7.62 ‐ 7.53 (m, 1 H), 7.52 ‐ 7.44 (m, 4 H), 7.38 ‐ 7.25 (m, 12 H), 6.91 

‐ 6.85 (m, 4 H), 5.89 (d, J = 3.30 Hz, 1 H), 5.73 (d, J = 6.59 Hz, 1 H), 4.93 ‐ 4.81 (m, 1 H), 4.24 (dd, J 

12  

= 5.07, 3.55 Hz, 1 H), 4.22 ‐ 4.16 (m, 1 H), 3.93 ‐ 3.83 (m, 2 H), 3.77 (s, 6 H),  3.74 ‐ 3.67 (m, 1 H), 

3.61 ‐ 3.44 (m, 4 H), 3.36 (dd, J = 11.15, 3.04 Hz, 1 H), 3.26 (s, 3 H), 3.15 ‐ 3.03 (m, 1 H), 1.51 ‐ 1.70 

(m, 5 H), 1.22 ‐ 1.12 (m, 1 H), 0.94 ‐ 0.84 (m, 1 H). 13C NMR (100 MHz, CD3CN)  161.5, 159.9, 

149.0, 145.7, 139.7 (d, 3Jpc = 4.0 Hz), 138.9, 138.2, 136.6, 136.5, 133.5, 131.2, 130.6, 129.0, 129.1, 

129.2, 129.3, 128.5, 128.2, 126.6, 114.3, 112.2, 89.5, 87.7, 84.0 (d, 2Jpc = 9.1 Hz), 83.7 (d, 3Jpc = 

4.02 Hz), 82.6, 72.7, 70.9, 70.5 (d, 2Jpc = 5.03 Hz), 68.1 (d, 2Jpc = 4.02 Hz), 62.7, 59.2, 56.0, 47.7 (d, 

2Jpc = 35.2 Hz), 28.8, 26.7 (d, 3Jpc = 3.02 Hz), 13.4. 31P NMR (161 MHz, CD3CN) 152.46. ESI‐HRMS: 

m/z calcd for C52H55N4O10P+ [(M + H)+] 926.3656, found 926.3655.

Sp‐ABz OAP monomer (Sp‐4c) 

 

Crude  (Sp)‐4c was  synthesized  from  5’‐ODMTr‐2’‐OMOE‐N‐benzoyl‐adenosine  S3  (732 mg,  1 

mmol) and  (S)‐phenyl((R)‐pyrrolidin‐2‐yl)methanol  (355 mg, 2 mmol)  following  the procedure 

described above and purified by silica gel column chromatography (EA:Et3N, 100:2) to give (Sp)‐

4c as a white powder (700 mg, 78%). 1H NMR (400 MHz, CD3CN)  9.32 (br s, 1 H), 8.68 (s, 1 H), 

8.35 (s, 1 H), 8.03 (d, J = 7.60 Hz, 2 H), 7.66 (d, J = 7.60 Hz, 1 H),  7.62 ‐ 7.53 (m, 2 H), 7.44 ‐ 7.18 

(m, 14 H), 6.86 ‐ 6.73 (m, 4 H), 6.14 (d, J = 4.31 Hz, 1 H), 5.82 (d, J = 6.59 Hz, 1 H), 5.25 ‐ 5.14 (m, 

1 H),  4.94 (t, J = 4.56 Hz, 1 H), 4.26 (d, J = 5.32 Hz, 1 H), 4.04 ‐ 3.94 (m, 1 H),  3.83 ‐ 3.69 (m, 7 H), 

3.65 ‐ 3.44 (m, 4 H), 3.30 (dd, J = 10.90, 4.06 Hz, 1 H),  3.21 (s, 3 H), 3.12 (dd, J = 8.11, 5.58 Hz, 1 

H),  1.72 ‐ 1.51 (m, 2 H), 1.26 ‐ 1.16 (m, 2 H), 0.91 (dd, J = 12.42, 8.36 Hz, 1 H). 13C NMR (100 MHz, 

CD3CN)  159.7, 152.9, 151.1, 146.0, 144.0, 139.8 (d, 3Jpc = 4.02 Hz), 136.9, 136.8, 133.6, 131.1, 

131.0, 129.7, 129.2, 129.0, 128.8, 128.4, 127.9, 126.6, 126.0, 114.1, 88.8, 87.3, 84.4 (d, 2Jpc = 10.1 

Hz), 84.0 (d, 3Jpc = 4.02 Hz), 81.5 (d, 3Jpc = 2.01 Hz), 72.6, 71.3 (d, 2Jpc = 2.01 Hz), 71.1, 68.1 (d, 2Jpc 

13  

= 3.02 Hz), 63.4, 59.0, 55.9, 47.7 (d, 2Jpc = 34.2 Hz), 28.9, 26.7 (d, 3Jpc = 3.02 Hz). 31P NMR (161 

MHz,  CD3CN)   150.21.  ESI‐HRMS:  m/z  calcd  for  C52H53N6O9P+  [(M  +  H)+]  936.3612,  found 

936.3615.

Rp‐ABz OAP monomer (Rp‐4g) 

 

Crude  (Rp)‐4g was  synthesized  from 5’‐ODMTr‐2’‐OMOE‐ N‐benzoyl‐adenosine S3  (732 mg, 1 

mmol) and  (R)‐phenyl((S)‐pyrrolidin‐2‐yl)methanol  (355 mg, 2 mmol)  following  the procedure 

described above and purified by silica gel column chromatography (EA:Et3N, 100:2) to give (Rp)‐

4g  as a white powder (500 mg, 52%). 1H NMR (400 MHz, CD3CN)  9.26 (br s, 1 H), 8.63 (s, 1 H), 

8.29 (s, 1 H), 8.00 (d, J = 7.35 Hz, 2 H), 7.64 (d, J = 7.35 Hz, 1 H), 7.60 ‐ 7.52 (m, 2 H), 7.44 ‐ 7.34 

(m, 4 H), 7.33 ‐ 7.17 (m, 10 H), 6.78 (dd, J = 8.87, 2.28 Hz, 4 H), 6.09 (d, J = 4.56 Hz, 1 H),  5.88 (d, 

J = 6.34 Hz, 1 H), 5.14 ‐ 5.08 (m, 1 H), 4.88 (t, J = 4.82 Hz, 1 H), 4.25 (d, J = 4.31 Hz, 1 H), 4.00 ‐ 3.90 

(m, 1 H), 3.85 ‐ 3.77 (m, 1 H), 3.76 ‐ 3.64 (m, 7 H), 3.58 ‐ 3.48 (m, 1 H), 3.46 ‐ 3.44 (m, 2 H), 3.41 

(d, J = 3.80 Hz, 1 H), 3.31 (dd, J = 10.65, 4.82 Hz, 1 H), 3.19 (s, 3 H), 3.02 ‐ 2.92 (m, 1 H), 1.68 ‐ 1.49 

(m, 2 H), 1.22 ‐ 1.12 (m, 1 H), 0.94 ‐ 0.85 (m, 1 H). 13C NMR (100 MHz, CD3CN)  159.7, 152.9, 

152.7, 151.1, 146.1, 144.0, 139.8 (d, 3Jpc = 4.02 Hz), 136.9, 136.8, 135.0, 133.6, 131.1, 131.0, 129.7, 

129.2, 129.1, 129.0, 128.8, 128.5, 127.8, 126.7, 114.0, 88.6, 87.2, 84.5 (d, 3Jpc = 2.01 Hz), 84.2 (d, 

2Jpc = 11.1 Hz), 81.5 (d, 3Jpc = 2.01 Hz), 72.7, 71.6 (d, 2Jpc = 5.03 Hz), 71.1, 68.1 (d, 2Jpc = 4.02 Hz), 

63.8, 59.0, 55.9, 47.5 (d, 2Jpc = 35.2 Hz), 28.9, 26.7 (d, 3Jpc = 3.01 Hz). 31P NMR (161 MHz, CD3CN) 

 151.88. ESI‐HRMS: m/z calcd for C52H53N6O9P+ [(M + H)+] 936.3612, found 936.3614.

14  

Rp‐T OAP monomer (Rp‐4e) 

N

O

O

DMTrO

O

PO N

Ph

O

NH

O

O

(Rp)-4e

8

 

Crude (Rp)‐4e was synthesized from 5’‐ODMTr‐2’‐OMOE‐thymidine (930 mg, 1.5 mmol) and (R)‐

phenyl((S)‐pyrrolidin‐2‐yl)methanol (535 mg, 3 mmol) following the procedure described above 

and purified by silica gel column chromatography (EA:hexane:Et3N, 80:20:2) to give (Rp)‐4e as a 

white powder (810 mg, 68%). 1H NMR (400 MHz, CD3CN)  8.99 (br s, 1 H), 7.52 ‐ 7.41 (m, 2 H), 

7.40 ‐ 7.20 (m, 13 H), 6.85 (dd, J = 8.87, 1.77 Hz, 4 H), 5.89 (d, J = 3.60 Hz, 1 H), 5.77 (d, J = 6.70 

Hz, 1 H), 4.71 ‐ 4.76 (m, 1 H), 4.24 ‐ 4.21 (m, 1 H),  4.14 ‐ 4.12 (m, 1 H), 3.83 ‐ 3.74 (m, 9 H), 3.56 ‐ 

3.45 (m, 3 H), 3.41 ‐ 3.35 (m, 1 H), 3.31 ‐ 3.27 (m, 4 H),  3.04 ‐ 2.96 (m, 1 H), 1.61 ‐ 1.50 (m, 2 H), 

1.42 (d, J = 1.01 Hz, 3 H), 1.18 ‐ 1.09 (m, 1 H), 0.91 ‐ 0.83 (m, 1 H). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) 

164.2, 159.4, 159.3, 151.2, 145.3, 139.3 (d, 3Jpc = 4.02 Hz), 136.0, 136.1, 130.7, 130.6, 128.7, 128.6, 

128.5, 128.0, 127.6, 126.2, 113.7, 111.1, 87.5, 87.2, 83.8 (d, 3Jpc = 3.01 Hz), 83.7 (d, 2Jpc = 10.1 Hz), 

81.4 (d, 3Jpc = 3.01 Hz), 72.4, 71.0 (d, 2Jpc = 7.04 Hz), 70.4, 67.5 (d, 2Jpc = 3.01 Hz), 63.1, 58.7, 55.5, 

47.0 (d, 2Jpc = 35.2 Hz), 28.4, 26.2 (d, 3Jpc = 3.01 Hz), 11.8. 31P NMR (161 MHz, CD3CN)  152.95. 

ESI‐HRMS: m/z calcd for C45H50N3O10P+ [(M + H)+] 823.3234, found 8223.3235.

Rp‐mCBz OAP monomer (Rp‐4f) 

 

15  

Crude (Rp)‐4f was synthesized from 5’‐ODMTr‐2’‐OMOE‐5‐methyl‐cytidine (1.44 g, 2 mmol) and 

(R)‐phenyl((S)‐pyrrolidin‐2‐yl)methanol  (709 mg,  4 mmol)  following  the  procedure  described 

above and purified by silica gel column chromatography (EA:hexane:Et3N, 60:40:2) to give (Rp)‐

4f as a white powder (1.30 g, 70%). 1H NMR (400 MHz, CD3CN) 13.09 (br s, 1 H), 8.28 ‐ 8.26 (m, 

2 H), 7.79 (d, J = 1.01 Hz, 1 H), 7.59 ‐ 7.55 (m, 1 H), 7.50 ‐ 7.45 (m, 4 H), 7.41 ‐ 7.23 (m, 12 H), 6.89 

‐ 6.84 (m, 4 H), 5.93 (d, J = 4.31 Hz, 1 H), 5.78 (d, J = 6.34 Hz, 1 H), 4.81 ‐ 4.76 (m, 1 H), 4.27 (t, J = 

4.82 Hz, 1 H), 4.20 ‐ 4.18 (m, 1 H), 3.88 ‐ 3.81 (m, 3 H), 3.77 ‐ 3.74 (m, 7 H), 3.57 ‐ 3.47 (m, 2 H), 

3.45 ‐ 3.42 (m, 1 H), 3.37 ‐ 3.34 (m, 1 H), 3.28 (s, 3 H), 3.06 ‐ 2.96 (m, 1 H), 1.62 (d, J = 1.01 Hz, 3 

H), 1.60  ‐ 1.48 (m, 2 H), 1.20  ‐ 1.12 (m, 1 H), 0.93  ‐ 0.84 (m, 1 H). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) 

161.2, 159.7, 148.8, 145.6, 139.6, 138.6, 138.0, 136.3, 133.3, 131.1, 130.0, 130.0, 129.1, 128.9, 

128.8, 128.3, 127.9, 126.5, 114.0, 112.2, 88.9, 87.5, 84.0, 83.9, 82.2, 72.7, 70.9 (d,  2Jpc = 7.04 Hz), 

70.8, 67.8, 62.9, 59.0, 55.8, 47.4 (d, 2Jpc = 35.2 Hz), 28.7, 26.5, 13.0. 31P NMR (161 MHz, CD3CN)  

153.03. ESI‐HRMS: m/z calcd for C52H55N4O10P+ [(M + H)+] 926.3656, found 926.3655. 

Rp‐GiBu OAP monomer (Rp‐4h) 

 

Crude (Rp)‐4h was synthesized from 5’‐ODMTr‐2’‐OMOE‐guanosine S9 (715 mg, 1 mmol) and (R)‐

phenyl((S)‐pyrrolidin‐2‐yl)methanol (355 mg, 2 mmol) following the procedure described above 

after 16 h  stirring at  room  temperature and purified by  silica gel column chromatography  (3‐

Aminopropyl  functionalized  silical  gel,  EA:Acetone:Et3N,  80:20:2)  to  give  (Rp)‐4h  as  a  white 

powder (600 mg, 40%). 1H NMR (400 MHz, CD3CN)  7.86 (s, 1 H), 7.45 ‐ 7.15 (m, 14 H), 6.81 (dd, 

J = 9.00, 2.41 Hz, 4 H), 5.89 (d, J = 6.08 Hz, 1 H), 5.76 (d, J = 6.34 Hz, 1 H), 4.78 (dd, J = 9.76, 3.93 

Hz, 1 H), 4.71 ‐ 4.68 (m, 1 H), 4.22 (d, J = 3.80 Hz, 1 H), 3.80 ‐ 3.65 (m, 10 H), 3.49‐3.44 (m, 3H), 

3.35 ‐ 3.33 (m, 1 H), 3.26 ‐ 3.23 (m, 1 H), 3.21 (s, 3 H), 3.15 ‐ 3.08 (m, 1 H), 2.55 ‐ 2.49 (m, 1 H), 

16  

1.60 ‐ 1.50 (m, 2 H), 1.18 ‐ 1.05 (m, 7 H), 0.90 ‐ 0.84 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) 180.9, 

159.8, 156.4, 149.9, 149.3, 146.0, 142.1, 139.7 (d, 3Jpc = 3.02 Hz), 138.4, 136.8, 136.7, 131.2, 

131.1, 129.2, 129.1, 128.9, 128.5, 128.0, 127.4, 127.1, 126.7, 122.3, 114.1, 87.4, 86.9, 85.2, 84.1, 

81.7, 72.7, 68.0, 64.2, 59.1, 56.0, 53.7, 51.5, 47.5 (d, 2Jpc = 35.2 Hz), 36.7, 28.8, 27.3, 21.4, 19.2. 

31P NMR (161 MHz, CD3CN)  153.47. ESI‐HRMS: m/z calcd for C49H55N6O10P+ [(M + H)+] 918.3717, 

found 918.3718.

Materials and methods for properties 

Oligoribonucleotide phosphorothioate synthesis 

Oligoribonucleotides were prepared on MerMade 192 DNA/RNA  synthesizer using CPG 500 Å 

unylinker support (44.9 µmol/g). Fully protected stereopure nucleoside phosphoramidites were 

incorporated  using  standard  solid‐phase  oligonucleotide  synthesis  conditions:  i.e.  3% 

dichloroacetic acid in dichloromethane (DCM) for deblocking, 1.4 M N‐phenyl imidazolium triflate 

in anhydrous acetonitrile as activator, capping reagent A (THF/lutidine/acetic anhydride, 8:1:1) 

and  capping  reagent  B  (16%  N‐imidazole/THF)  for  capping,  a  0.05  M  solution  of  3‐((N,N‐

dimethylaminomethylidene)amino)‐3H‐1,2,4‐dithia‐zole‐5‐thione  (DDTT;  Sulfurizing Reagent  II; 

Glen Research, Virginia) in dry pyridine/ACN (60:40) for sulfurization, a 0.5 M solution of (1S)‐(+)‐

(10‐camphorsulfonyl)oxaziridine  in  anhydrous  acetonitrile  (0.5 M  CSO)  was  evaluated  as  an 

oxidizing solution. OAP amidites were prepared at 0.11 M  in anhydrous acetonitrile and were 

coupled utilizing three application of OAP amidites, with a 4 min contact time for each pass. After 

the completion of the synthesis, the solid support was suspended in aqueous ammonia (25%, 300 

µl) and heated at 55 ˚C for 24 hours. The reaction was cooled down to room temperature, and 

the solid support was filtered and washed with 400 µl of EtOH and H2O 1:1 (v/v). The filtrate was 

concentrated to dryness and the residue was dissolved in 200 µl water for the analysis on LCMS 

and the purification on RP‐HPLC. The oligonucleotides were purified on an Agilent 1200 series 

preparative HPLC fitted with a WatersXBridge OST C‐18 column, 10 x 50 mm, 2.5 µm, at 65°C). 

Running buffer: buffer A (0.1 M triethylammonium acetate), buffer B (methanol); gradient for the 

DMT‐on purification: 5–80% buffer B over 6 min; gradient for the DMT‐off purification: 5 –35% 

buffer B over 5 min. Fractions containing the product were collected and dried in a miVac duo 

SpeedVac  from  Genevac.  The  oligonucleotides  were  analysed  by  LC‐MS  (Agilent  1200/6130 

17  

system) on a Waters Acquity OST C‐18 column, 2.1 x 50 mm, 1.7µm, 65°C. Buffer A: 0.4 M HFIP, 

15 mM triethylamine; buffer B: MeOH. Gradient: 10 ‐ 50% B in 20 min; flow rate: 0.3 ml min‐1. 

Thermal stability studies (Tm) 

Melting temperatures of 2’‐OMOE RNA (PS) duplexes were measured on a CARY 300  (Agilent) 

equipped with a thermocontroller. 2’‐OMOE RNA (PS) and the counter strands (RNA, PO) were 

combined  to  yield  an  equimolar  concentration of  2 µM  in  phosphate‐buffered  saline  (5 mM 

Na2HPO4, 5 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA). Absorptions at 260 nm were measured 

in 80 µl quartz cuvettes. The temperature gradient was set to 0.5 K/min‐1 for the range of 20 ˚C – 

95 ̊ C. Absorbance readings were taken every 30 sec. Each series was performed three times. Hold 

time was set to 5 min at 95 ˚C and 20 ˚C, respectively, to ensure thermal equilibrium. The melting 

profiles were fitted to a sigmoidal and TM was determined by the derivative thereof.   

Cell culture and gapmers (Mp (16), Mp‐Rp (17) and Mp‐Sp (18)) transfection 

Huh7  cells  (ATCC)  were  cultured  as  monolayers  in  DMEM  GlutaMAXTM‐I  (31966‐021, 

ThermoFisher  Scientific)  supplemented  with  10%  of  FBS  (fetal  bovine  serum,  10270106, 

ThermoFisher  Scientific).  For  gapmer  transfections,  huh7  cells were  seeded  in  24‐well  plates 

(30,000 cells/well). Gapmers (Mp (16), Mp‐Rp (17), Mp‐Sp (18) and Neg Con (19)) as well as mock 

transfections were performed with lipofectamine 2000 (11668019, ThermoFisher Scientific), 24 

hours post‐seeding  (0.75 uL Lipofectamine/100ng gapmer). After 24 hours, supernatants were 

removed and RNA was isolated from the cells.  

RNA extraction and purification 

Total RNA was extracted and purified using TRIzol (15596018, ThermoFisher Scientific).  

Quantitative reverse transcriptase‐polymerase chain reaction (qRT‐PCR) 

10 ng of RNA and 500 ng random primer (C1181, Promega) were used for cDNA synthesis with 

the TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (4366596, ThermoFisher Scientific), according 

to the manufacturer's protocol. qPCR reactions were performed using KAPA SYBR® FAST qPCR 

Master Mix  (KK4618, Kapa Biosystems) on  a  LightCycler 480 Detection  System  (Roche).  Each 

reaction was carried out in three technical replicates. The mean measured levels of ApoB were 

18  

normalized  to  the  housekeeping  gene  β‐Actin.  Data  from  three  independent  replicates was 

obtained. Primer pairs utilized are as follows: apoB F: TGC TAA AGG CAC ATA TGG CCT, R: CTC 

AGG  TTG  GAC  TCT  CCA  TTG  AG;  β‐Actin  F:  CCAACCGCGAGAAGATGA,  R: 

CCAGAGGCGTACAGGGATAG.  2−ΔΔCt  method  was  used  to  calculate  the  relative  transcript 

abundance. 

Cell culture and SSO (FCH (20), FCH‐Rp (21), FCH‐Sp (22) and FCH‐PO (24)) minigene assay 

COS‐7  cells  (ATCC)  were  cultured  as  monolayers  in  DMEM  GlutaMAXTM‐I  (31966‐021, 

ThermoFisher  Scientific)  supplemented  with  10%  of  FBS  (fetal  bovine  serum,  10270106, 

ThermoFisher Scientific). For transfections, COS‐7 cells were seeded  in 24‐well plates (135,000 

cells/well). FECH‐C minigene construct was transfected 24 hours post‐seeding at 750 ng/well with 

XtremeGENE HP reagent  (06366236001, Roche Life Sciences, 2.25 µl/1 µg plasmid DNA).   SSO 

(FCH (20), FCH‐Rp (21), FCH‐Sp (22), FCH‐Con (23), FCH‐PO (24)) transfection was performed 3 

hours  later  with  Lipofectamine  2000  (11668019,  ThermoFisher  Scientific;  1.25  µL 

Lipofectamine/50 nM SSO). Depending on the time course desired, supernatants were removed 

after 24 hours or 48 hours and RNA was isolated from the cells. Emetine (as HCl salt, E2375, Sigma‐

Aldrich) was used at a final concentration of 3 µM in cell culture well and was added 24 hours 

prior to cell harvest, i.e. immediately after SSO transfection for 24 hr time points or 1 day after 

SSO transfection for 48 hr time points.  

RNA extraction and purification 

Total RNA was extracted and purified using RNeasy Mini Kit (74106, Qiagen). DNase I treatment 

was doubled to ensure complete plasmid DNA removal. 

Reverse transcriptase‐polymerase chain reaction (RT‐PCR) 

1 µg of RNA and 500 pg random primer (C1181, Promega) were used for cDNA synthesis with the 

TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (4366596, ThermoFisher Scientific), according to 

the manufacturer's protocol. For PCR reaction, cDNA solutions were diluted 1/3 prior to mixing: 

1 µl cDNA solution, 5 µl DreamTaq 10X Buffer, 1 µl dNTPs (18427, ThermoFischer Scientific), 1 µl 

of FW primer (7.5 µM, 5’‐GCTCTCTACCTGGTGTGTGG‐3’, Microsynth), 1 µl of RV primer primer 

(7.5 µM, 5’‐GACAATTCATCCAGCAGCTTC‐3’, Microsynth), 0.25 µl DreamTaq Polymerase and 40.75 

19  

µl RNase‐free water. PCR program was : 1 min, 95°C ; 30 cycles ( 30 s, 95 °C ; 30 s ; 60 °C ; 30 s, 68 

°C) ; 5 min, 68°C. 

Agarose gel electrophoresis 

PCR samples  loaded with 5X GelPilot Loading Dye (239901, Qiagen) were allowed to run for 1 

hours under 85 V  in a 2 % agarose gel  in TAE Buffer and 1/10,000 GelRed Nucleic Acid Stain 

(41003, Chemie Brunschwig).  

Data analysis 

Gels were revealed in a UV chamber (Universal Hood II, BioRad) and ratios of aberrantly spliced 

product  on  (normal  +  aberrant)  were  calculated  using  ImageJ  software  and  background 

subtraction. 

Plasmid for SSO minigene assay 

ggctgattaa cactcaggga agcaatgatt attattcatt tgtactataa atatggattg

ttgctgccct tcttttcctt tcatccttct ttcccttctt ccttctctcc tttttctttc

aaaatagatt tctattatga aaaattagta catgcatggg ataaaaacta caaatagtat

aaaagtaatt acagtaaaag gcaagtgtcc ctttcacctt gcactcccag ttatccacct

ggaggaaagc gctgttacat ccagaaatag tccgtgcata tccaagcata cacatacata

cacacacaca cgcgcacata catacataca cacatgcaca cccccccccc cccacttcgt

tacacaaatg tgaaggtact tatgtactat atttgaaact ttcctttttt tttttttttt

tttttttaca tacgtataca tgtgccatgt tggtgtgctg cacccattaa ctcgtcattt

acattaggta tatctcctaa tgctatccct cccctctccc cccactccac gataggccct

ggtgtgtgat gttccccttc ctgtgtccaa gtgttctcat tgttcaattc ccacctatga

gtgagaacat gcggtgtttg gttttttgtc cttgtgatag tttgctgaga atggtggttt

ccagcttcat ccatgtccct acaaaggaca tgaactcatc cctttttatg gctgcattag

tattccacat tttcttaatc cagtctatca ttgatggaca tttgggttgg ttccaagtct

ttgctgttgt gaatgtgtaa acttaacact gtatcttgtt tcataacgtt atatcgatat

ataggtctgg ctcatttttt gattactatt tagaactgca tcatatggct gtaacttaat

ttgtttaatc catgcttcat ggtggacaat tagtttgttt acagtgttgc agtgaacatt

cttgtgcata catctttgct cctatatgca agtgtatcta taagattaat agactttatt

20  

ttttaaatta agagaaatgt ctacttcatt tgtcttatat cctagttctc gttaggtgtg

ggatcaaaat gtgttacgct agtagctagc gcacatccag gtttctctgc atgggtgttg

tgtgtcctga atcttcaggt gtgctgctgg aacagcttgt ggagcacagc tgggtattcc

tcagagaggg tatagcttta gctccttatt ctacaacaag agagctggct attgtcaatg

acctcaagct tctgttttaa aggcttaatc ttgttaggct ctctaaaatt ttgctttttt

tcttttttat tgagtagaaa acatttctca ggCtgctaag ctggaataaa atccacttac

ctgtatgtta aatgatttag taagctggca ccattcatcg ccaaacgccg aacccccaag

attcaagagc agtaccgcag gattggaggc ggatccccca tcaagatatg gacttccaag

cagggagagg gcatggtgaa gctgctggat gaattgtccc ccaacacagg tatggtgttt

cttcattaac atgtaactag attagttctt tcgaagtagt tatgaaattc aaaagagtag

tagatgctaa atgcttcata tgtactggca actcaatttg tggtgtttct acataataca

tggtcactta atttaggtct ccaggcgtta tcccttgacc tttagccttt gctatgactt

cttacattac aagtaaaaaa aagctaagga tttgggacat g

 

21  

Legend: (A) Sequence of FECH insert containing intron 3, exon 4 and intron 4 sequences that was 

cloned by gateway technology into pSlpiceExpress (Kishore et al., 2008) as shown in B. Exon 4 is 

highlighted in yellow. The extra 63 nucleotides present in aberrant transcripts are highlighted in 

green. The IVS3‐48C polymorphism that stimulates the use of the aberrant splice acceptor site is 

indicated by a larger, red and bold uppercase letter. Splice acceptor and donor sites (AG and GT 

dinucleotides) are underlined.  

Kishore, S., Khanna, A. and Stamm, S. Gene 2008, 427, 104. 

 

HPLC‐MS profiles of purified FCH‐Sp (22), FCH‐Rp (21), Mp‐Sp (18) and 

Mp‐Rp (17) 

Stereodefined PS ORNs FCH‐Sp (22), FCH‐Rp (21), Mp‐Sp (18) and Mp‐Rp (17) were synthesized 

according  to  the  general  procedure  for  the  oligoribonucleotide  phosphorothioate  synthesis 

described above.  

These stereodefined PS ORNs were obtained with extremely high stereoselectivities albeit in low 

yields, partly due to the unstability of OAP monomers in anhydrous acetonitrile. After a few hours 

on the automatic synthesizer, precipitation occurs in the solution of OAP monomers in anhydrous 

acetonitrile. We assume  the precipitation  is  likely H‐phosphonate, which does not dissolve  in 

acetonitrile  and  does  not  react  with  5’‐OH  nucleosides  under  our  reaction  conditions.  The 

precipitation can dissolve  in dichloromethane, however the precipitation still occurs even with 

10% anhydrous dichloromethane in anhydrous acetonitrile. 

 

22  

 

Figure S1 HPLC‐MS profiles of purified FCH‐Sp (22), FCH‐Rp (21), Mp‐Sp (18) and Mp‐Rp (17). 

HPLC‐MS was performed with a linear gradient of 10‐50% MeOH in 0.4 M HFIP buffer at 65 ˚C 

for 20 min at a rate of 0.3 ml min‐1. 

 

 

 

 

 

 

 

23  

Melting temperature (Tm) curves of stereodefined PS‐oligonucleotides 

 

 

Figure S2 Melting temperature (Tm) curves of 12 mers FCH (20), FCH‐Rp (21),FCH‐Sp (22) and FCH‐

PO 24(top), gapmers Mp (16), Mp‐Rp (17) and Mp‐Sp (18) (bottom). 

‐5

0

5

10

15

20

30 40 50 60 70 80 90

Hyp

erchromicity [%

]

Temperature [°C]

FCH‐Rp 21 FCH 20 FCH‐Sp 22 FCH‐PO 24

‐5

0

5

10

15

20

40 50 60 70 80 90

Hyperchromicity [%

]

Temperature [˚C] 

Mp Mp‐Rp Mp‐Sp

24  

 

Spectra of synthesized nucleosides and phosphoramidites 

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE adenosine (S1) 

 

 

 

 

 

 

25  

 

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE‐2‐amino‐adenosine (S5) 

 

 

 

26  

 

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S2)

 

27  

1H and 13C NMR spectra of 5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N‐benzoyl adenosine (S3)

 

 

 

 

28  

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐adenosine (S6) 

 

 

 

 

 

 

29  

1H and 13C NMR spectra of 2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐guanosine (S8)

 

 

 

 

30  

1H and 13C NMR spectra of 5’‐ODMT‐2’‐OMOE‐N2‐isobutyryl‐guanosine (S9)

 

 

 

 

 

 

 

31  

1H, 13C and 31P NMR spectra of Sp‐ABz (Sp‐4c) OAP monomer  

 

 

32  

1H, 13C and 31P NMR spectra of Rp‐ABz (Rp‐4g) OAP monomer  

 

33  

1H, 13C and 31P NMR spectra of Sp‐GiBu (Sp‐4d) OAP monomer  

 

34  

1H, 13C and 31P NMR spectra of Rp‐GiBu (Rp‐4h) OAP monomer  

 

35  

1H, 13C and 31P NMR spectra of Sp‐T (Sp‐4a) OAP monomer  

 

36  

1H, 13C and 31P NMR spectra of Rp‐T (Rp‐4e) OAP monomer  

 

37  

1H, 13C and 31P NMR spectra of Sp‐mCBz (Sp‐4b) OAP monomer  

 

38  

1H, 13C and 31P NMR spectra of Rp‐mCBz (Rp‐4f) OAP monomer  

 

39  

 

The crude HPLC‐MS profiles of stereodefined PS‐ORNs 

Crude HPLC‐MS profiles of DMT‐TRpCGTACGT (5) and DMT‐TSpCGTACGT (11) 

 

Crude HPLC‐MS of DMT‐TRpCGTACGT (5) and DMT‐TSpCGTACGT (11) were performed with a 

linear gradient of 10‐50% MeOH in 0.4 M HFIP buffer at 65 ˚C for 32 min at a rate of 0.3 ml min‐

1. The peaks at ~ 9.2 min are unreacted 7 mers with PO linkage. 

 

40  

Crude HPLC‐MS profiles of DMT‐CRpCGTACGT (6) and DMT‐CSpCGTACGT (12) 

 

Crude HPLC‐MS of DMT‐CRpCGTACGT (6) and DMT‐CSpCGTACGT (12) were performed with a 

linear gradient of 10‐50% MeOH in 0.4 M HFIP buffer at 65 ˚C for 20 min at a rate of 0.3 ml min‐

1. The peaks at ~ 7.4 min are unreacted 7 mers with PO linkage. 

 

 

41  

Crude HPLC‐MS of DMT‐ARpCGTACGT (7) and DMT‐ASpCGTACGT (13) 

 

Crude HPLC‐MS of DMT‐ARpCGTACGT (7) and DMT‐ASpCGTACGT (13) were performed with a 

linear gradient of 10‐50% MeOH in 0.4 M HFIP buffer at 65 ˚C for 20 min at a rate of 0.3 ml min‐

1. The peaks at ~ 7.5 min are unreacted 7 mers with PO linkage. 

 

 

 

 

 

 

 

42  

Crude HPLC‐MS of DMT‐mCRpCGTACGT (6) and DMT‐mCSpCGTACGT (12) 

 

Crude HPLC‐MS of DMT‐mCRpCGTACGT (6) and DMT‐mCSpCGTACGT (12) were performed with a 

linear gradient of 10‐50% MeOH in 0.4 M HFIP buffer at 65 ˚C for 20 min at a rate of 0.3 ml min‐

1. The peaks at ~ 7.5 min are unreacted 7 mers with PO linkage. 

 

 

 

 

 

43  

Crude HPLC‐MS of DMT‐GRpCGTACGT (8) and DMT‐GSpCGTACGT (14) 

 

 

Crude HPLC‐MS of DMT‐GRpCGTACGT (8) and DMT‐GSpCGTACGT (14) were performed with a 

linear gradient of 10‐50% MeOH in 0.4 M HFIP buffer at 65 ˚C for 20 min at a rate of 0.3 ml min‐

1. The peaks at ~ 7.5 min are unreacted 7 mers with PO linkage. 

44  

Crude HPLC‐MS of DMT‐TRpAGTACGT (10) 

 

 

Crude HPLC‐MS of DMT‐TRpAGTACGT (10) was performed with a linear gradient of 10‐50% 

MeOH in 0.4 M HFIP buffer at 65 ˚C for 32 min at a rate of 0.3 ml min‐1. The peak at ~ 9.0 min is 

unreacted 7 mers with PO linkage. 

 

Crude HPLC‐MS of DMT‐TRpTGTACGT (9)  

 

 

45  

Crude HPLC‐MS of DMT‐TRpTGTACGT (9) was performed with a linear gradient of 10‐50% MeOH 

in 0.4 M HFIP buffer at 65 ˚C for 32 min at a rate of 0.3 ml min‐1. The peak at ~ 8.8 min is 

unreacted 7 mers with PO linkage. 

 

Crude HPLC‐MS of DMT‐ASpGGTACGT (15)  

 

Crude HPLC‐MS of DMT‐ASpGGTACGT (15) was performed with a linear gradient of 10‐50% 

MeOH in 0.4 M HFIP buffer at 65 ˚C for 20 min at a rate of 0.3 ml min‐1. The peak at ~ 7.1 min is 

unreacted 7 mers with PO linkage. 

References 

1. Oka, N.; Wada,  T.; Saigo, K., J Am Chem Soc, 2003, 125, 8307. 2. Wan, W. B.; Migawa, M. T.; Vasquez, G., et al., Nucleic Acids Res, 2014, 42, 13456. 3. Ross, B. S.; Song, Q.; Han, M., Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2005, 24, 815. 4. Jawalekar, A. M.; Beeck, M.; van Delft, F. L., et al., Chem. Commun., 2011, 47, 2796. 5. Pradere, U.; Brunschweiger, A.; Gebert, L. F., et al., Angewandte Chemie, 2013, 52, 12028. 6. Pujari, S. S.; Leonard, P.; Seela, F., J Org Chem, 2014, 79, 4423. 7. Taj, S. A. S., Narayanan, S.; Meenakshi S. S., et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic acids,      2008, 27, 1024. 8.  L.  Beigelman,  A.  Karpeisky,  V.  Serebryany,  P.  Haeberli,  D.  Sweedler,  U.S.  Pat.Appl.publ.,     

20020150936.