OSTRAVSKÁ UNIVERZITA V OSTRAVĚPŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Katedra fyziky

Vliv kontinuálního přisvětlování UV zářením na průběh

fotosyntetických reakcí ječmene jarního (Hordeum

vulgare L. cv. Bonus) a optimalizace použité gazometrické

metody měření

SRC 2008

Autor: Ladislav Šigut

Vedoucí práce: Doc. RNDr. Jiří Kalina, Ph.D.

Ostrava 2008

Poděkování

Autor by tímto chtěl poděkovat docentu Kalinovi za cenné rady a připomínky,

inspiraci a motivaci. Dále také paní laborantce Běle Piskořové za její vstřícnost a spolupráci a

Martině Volfové za pomoc při měření.

Prohlašuji, že předložená práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracoval

samostatně. Literaturu a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal, v práci řádně cituji

V Ostravě dne 7.5. 2008

_________________________

(podpis)

1

Vliv kontinuálního přisvětlování UV zářením na průběh fotosyntetických reakcí

ječmene jarního (Hordeum vulgare L. cv. Bonus) a optimalizace použité gazometrické

metody měření

OBSAH

1. Úvod.....................................................................................................................................31.1. Obsah a cíl práce.........................................................................................................31.2. Charakteristika ultrafialového záření..........................................................................31.3. Absorpce ultrafialového záření...................................................................................41.4. Ochranné mechanismy rostlin proti ultrafialovému záření a vliv jeho působení na rostliny4

2. Materiál a metody..............................................................................................................52.1. Růstové podmínky a odběr vzorku rostlinného materiálu..........................................52.2. Gazometrické měření systémem Ciras 2.....................................................................72.3. Statistické vyhodnocení dat........................................................................................9

3. Výsledky měření.................................................................................................................93.1. CO2 křivka...................................................................................................................93.2. Kvantitativní vyhodnocení fyziologických procesů spojených s fotosyntézou kontrolních a UV ošetřených vzorků ječmene jarního měřených pomocí přístroje Ciras 2..10

4. Diskuze výsledků..............................................................................................................115. Závěr..................................................................................................................................126. Použitá literatura a WWW odkazy................................................................................12

2

1. Úvod

1.1. Obsah a cíl práce

Důsledkem poškozování ozónové vrstvy atmosféry je nárůst intenzity ultrafialového

(UV) záření dopadajícího na povrch Země. Řada vědeckých prací se proto zabývá vlivem

tohoto záření na živé organismy. Významnost výzkumu zabývajícího se účinkem UV záření

na primární producenty spočívá v jejich navázání na potravinové řetězce. Účinkem UV-B

záření dochází především k inaktivaci fotosystému II (PS II), poškozování DNA a narušování

biomembrán. Tyto efekty jsou redukovány řadou reparačních mechanismů. Vzhledem k tomu,

že odpověď na UV záření je odlišná pro různé druhy rostlin, byl pro měření vybrán

hospodářsky významný ječmen jarní [2]. Cílem této práce bylo kvantitativní vyhodnocení

fyziologických procesů spojených s fotosyntézou kontrolních a UV ošetřených vzorků

ječmene jarního měřených pomocí přístroje Ciras 2. Dále byla optimalizována metoda měření

za účelem zpřesnění získaných dat s důrazem na zachování co nejkratší doby měření.

Úspěšnost optimalizace byla testována v průběhu měření.

1.2. Charakteristika ultrafialového záření

Spektrum slunečního záření je značně široké. Neabsorbované sluneční záření má

rozsah od gama záření po rádiové vlny. Největší množství energie vyzářené Sluncem pak

spadá do oblasti viditelného a infračerveného záření. Významnost tohoto faktu pro život

spočívá mimo jiné v tom, že oblast fotosynteticky aktivního záření (PAR) využívaná

rostlinami pro fotosyntézu je téměř totožná s oblastí viditelného záření, které navíc spolu

s infračerveným zářením Zemi předává vesmírným vakuem tepelnou energii Slunce. Z těchto

i mnohých dalších důvodů byl vliv těchto složek slunečního záření na organismy zkoumán po

dlouhou řadu let. Stejná pozornost však nebyla věnována třetí nejvýznamnější složce

slunečního záření, a to UV záření. K prohloubení výzkumu v tomto směru došlo teprve po

narušení ozonové vrstvy, převážně zodpovědné za absorpci tohoto typu záření [3].

Za ultrafialové považujeme elektromagnetické záření s vlnovou délkou kratší než má

viditelné světlo, ale delší než má měkké rentgenové záření.

3

Z hlediska působení na živé organismy je lze dále dělit na:

1. dlouhovlnné UV-A záření: o vlnové délce 400 – 315 nm

2. středně vlnné UV-B záření: o vlnové délce 315 – 280 nm.

3. krátkovlnné UV-C záření: o vlnové délce 280 – 100 nm [5].

1.3. Absorpce ultrafialového záření

Zabránění průniku podstatné části ultrafialového záření k povrchu Země je zajištěno

ozónovou vrstvou ve stratosféře, která absorbuje tvrdší ultrafialové záření. K průniku záření

s nižší vlnovou délkou než asi 100 nm prakticky nedochází, protože je pohlcováno v podstatě

všemi hlavními složkami atmosféry. Molekulárním kyslíkem je absorbováno sluneční záření

v oblasti 100 – 200 nm, méně pak v oblasti 200 – 242 nm. Zde již převládá absorpce ozónem

v oblasti 200 – 315 (320) nm, kde je dominantním a v části spektra i jediným absorbérem.

V závislosti na výšce Slunce nad obzorem sluneční záření od 310 – 320 nm výše proniká

s dostatečnou intenzitou až k povrchu Země. Úbytek ozónu se projeví právě růstem průniku

záření o vlnových délkách 280 – 320 nm odpovídající UV-B radiaci. Záření na kratších

vlnových délkách pod 280 nm je i při značném poklesu koncentrace ozónu dostatečně

absorbováno a k zemskému povrchu nepronikne. Intenzita UV-B záření je dále ovlivňována

oblačností, aerosoly v atmosféře a dalšími faktory [2].

1.4. Ochranné mechanismy rostlin proti ultrafialovému záření a vliv jeho

působení na rostliny

Stejně jako se zvyšuje množství energie přenášené fotonem se se snižující se velikostí

vlnové délky ultrafialového záření zvyšuje poškození způsobované rostlinám. Pro buňku je

tedy nejdestruktivnější UV-C záření, které způsobuje četné mutace, narušuje buněčné

struktury, membrány atd. To často vede k fyziologickým změnám neslučitelným se životem

[3]. UV-C záření na povrch Země nedopadá, ale jeho mutagenní vlastnosti se používají při

laboratorních výzkumech.

4

UV-B záření způsobuje rostlinám také řadu typů poškození. Mezi nejpodstatnější

řadíme: poškozování DNA, inaktivaci PS II a degradaci v něm obsaženého D1 a D2 proteinu,

snižování integrity thylakoidních membrán a narušování membrán vlivem peroxidace v nich

integrovaných lipidů. Poškození rostliny může být zamezeno protekcí proti UV záření pomocí

aktivace genů a enzymů zodpovídajících za produkci vosků nebo poškození opravit pomocí

několika reparačních mechanismů: aktivací enzymů a látek s anitoxidačními vlastnostmi,

enzymů schopných reparace poškozené DNA (např. fotolyasa), genů a enzymů zodpovědných

za produkci sekundárních metabolitů (flavonoidů a jiných polyfenolických látek, alkaloidů).

Pokud ochranné mechanismy rostliny selžou, ovlivněné buňky zahynou. V případě poškození

DNA mohou buňky přežít se změněnou genetickou informací. Pokud jsou takovéto buňky

schopné rozmnožování, může se to později projevit vznikem nádorového bujení. Vlivem

UV-B záření je také možno pozorovat fyziologické a morfologické změny ve velikosti rostlin

(ty jsou zpravidla menšího vzrůstu), zmenšení listové plochy, stáčení listů a podobně [2], [3].

Vzhledem k tomu, že negativní účinek UV-B záření silně závisí na přítomnosti

denního světla, je pro design experimentu důležité měření v „polních podmínkách“

s dosvěcováním UV-B zářením z umělého zdroje. Takovýchto experimentů bylo zatím

provedeno velmi málo, protože se dříve používalo ne zcela vyhovujícího umělého osvětlení

rostlin pěstovaných ve sklenících. Citlivost rostlin vůči UV-B záření se různí pro jednotlivé

druhy.

Asi 99 % UV záření, které není absorbováno atmosférou a dopadne na zemský povrch,

je ze spektrální oblasti UVA. UV-A záření téměř není absorbováno ozónovou vrstvou. Jeho

negativní účinek je mnohem menší ve srovnání s předcházejícími dvěma formami UV záření

[3], [5].

2. Materiál a metody

2.1. Růstové podmínky a odběr vzorku rostlinného materiálu

Použité rostliny ječmene jarního Hordeum vulgare L. (cv. Bonus 2003) byly

pěstovány v půdním substrátu a pravidelně zalévány destilovanou vodou. Misky byly

umístěny na improvizovaných podstavcích ve výšce 28 cm od parapetu (viz Obr. 1) (v případě

5

Obr. 1: Fotografická dokumentace umístění misek na improvizovaných podstavcích ve výšce 28 cm od

parapetu.

přisvětlovaných rostlin byla svrchní část substrátu vzdálena přibližně 10 cm od středu trubice

zářivky). Tyto podstavce byly umístěny v prostoru mezi oknem a plastovou roletou. Okna

byla orientována jihozápadním směrem. Roleta zamezovala průniku UV záření z lampy do

prostoru laboratoře a naopak průniku záření svítidel (a jiných případných rušivých vlivů)

z laboratoře do pěstícího prostoru. Umožňovala utvoření pěstícího mikroklimatu. Roleta byla

vždy pootevřená (cca 1 cm), aby byla umožněna alespoň částečná cirkulace vzduchu. Obilky

ječmene byly zasazeny 25.3. 2008. Misky byly 31.3. rozděleny do dvou skupin. Skupina

označovaná UV byla přisvětlována lampou Repti Light (Narva, Německo) (více viz Obr. 2),

rostliny kontroly (K) nebyly přisvětlovány. Rostliny K vyrůstaly za shodných světelných

podmínek jako rostliny ve venkovním prostředí s tím rozdílem, že skleněné tabule

propouštěly jen malou část UV-A a UV-B záření [3]. Osvětlování skupiny UV bylo

kontinuální. Po 11 dnech od vysazení obilek (4.4.) byly odebírány vzorky s největším

vzrůstem (1 vzorek = 2 rostliny) po třech z obou skupin v časovém rozmezí 9.00 až 15.00

hod. letního času přibližně každou hodinu. Byly odebírány střídavě z K a UV rostlin a to s co

nejméně porušeným kořenovým systémem následně obaleným v navlhčené buničité vatě a

přeneseny do tlustostěnné zkumavky.

6

Obr. 2: Spektrální hustoty ozářenosti [μmol m-2 s-1 nm-1], podávající detailnější informaci o světelných

podmínkách při pěstování rostlin K a UV. Hodnoty jsou naměřeny za jasného odpoledne ve vzdálenosti přibližně

10 cm od rostlin (i trubice lampy). Obr.: A zobrazuje spektrální hustotu ozářenosti se zapnutou (UV on),

vypnutou (UV off) lampou Repti Light za oknem kde byly pěstovány vzorky UV, třetí křivka (Bez UV)

zobrazuje hodnoty spektrální hustoty ozářenosti za oknem, kde byly pěstovány vzorky K. Obr.: B Spektrální

charakteristika lampy Repti Light (získaná odečtením spekter UV on a UV off) (převzato z Nezval 2007).

2.2. Gazometrické měření systémem Ciras 2

Do asimilační komůrky přístroje CIRAS 2 (viz Obr. 3) byly uzavírány dva primární a

dva sekundární listy ječmene. Po provedení gazometrických měření byla stanovena plocha

listů dle [1]. Pro měření fotosyntetických charakteristik byl používán otevřený gazometrický

7

Obr. 3: Celkový pohled na otevřený gazometrický systém CIRAS-2 (zleva: rostliny ječmene jarního, listová

kyveta, zdroj FAR, infračervený analyzátor plynů s trubicemi pro regulaci množství CO2 a H2O v systému a

dávkovacím zařízením oxidu uhličitého, PC s obslužným software pro řízení měření a záznam měřených hodnot

(převzato z Kalina 2005).

systém CIRAS 2 (PP–Systéme, Ltd., UK). Pomocí gazometrického systému CIRAS 2 byly

změřeny závislosti rychlosti fotosyntézy (Aact) na ozářenosti (světelné křivky, LRC) při

PAR - 50, 100, 150, 300, 500, 700, 1000, 1500 μmol.m-2.s-1; koncentraci CO2 ([CO2]) - 380

μmol(CO2).mol-1; t = 20 °C. Ze světelných křivek byly pomocí programu Photosyn assistant

určeny následující parametry: maximální rychlost asimilace CO2 při saturační intenzitě

ozářenosti (Amax), rychlost temnostní respirace (Rday), fotochemická efektivnost

představující limitaci asimilace rychlostí regenerace primárního akceptoru, tedy ribulosa-

(1,5)-bisfosfátu (QE), světelný kompenzační bod (LCP), odhad saturační ozářenosti a

konvexita světelné křivky (Convex). Dále byla měřena závislost rychlosti fotosyntézy (Aact)

na intercelulární koncentraci CO2 (CO2 křivky, CRC) při PAR - 1000 μmol.m-2.s-1.

Koncentrace [CO2] v asimilační komůrce byla nastavena na – 400, 210, 105, 0, 725, 1000

μmol(CO2).mol-1; t = 20 °C [4]. Měření CO2 křivky bylo optimalizováno přidáním měřícího

bodu při [CO2] 400 μmol(CO2).mol-1 mezi koncentracemi 0 a 750 μmol(CO2).mol-1. Z CO2

křivek byly pomocí programu Photosyn assistant určeny následující parametry: rychlost

výronu CO2 do atmosféry bez CO2, vyjadřuje rychlost reasimilace uvnitř asimilačního aparátu

(Resp), účinnost karbonylace představující limitaci asimilace aktivitou enzymu ribulosa-

(1,5)-bisfosfátu (CE), maximální rychlost karboxylace enzymu ribulosa-(1,5)-bisfosfátu

(Vcmax), max. rychlost elektronového transportu (Jmax), rychlost asimilace CO2 při saturační

8

intenzitě CO2 (Asat), CO2 kompenzační bod (CO2Comp.Est.) a limitaci trióza fosfátu (TPU).

Gazometrické parametry byly přepočteny na plochu listu.

2.3. Statistické vyhodnocení dat

K vyhodnocení statistické průkaznosti výsledků měření byl použit grafický výstup

programu Microsoft Office Excel 2003 a program R v.2.6.2 [6]. Pro vytvoření grafů bylo

potřeba vypočítat průměry hodnot a směrodatné odchylky (MS Office 2003). Pomocí

programu R byla otestována normalita dat (Shapirův-Wilkův test). Pro data z normálního

rozdělení byl použit F-test a dvouvýběrový t-test. Pro data nepatřící do normálního rozdělení

byly použity neparametrické testy Flignerův-Killeenův test homogenity rozptylů a Kruskalův-

Wallisův test. Hladiny významnosti byly zvoleny P = 0,05 *, P = 0,01 **, P = 0,001 ***.

3. Výsledky měření

3.1. CO2 křivka

Hodnoty naměřené gazometrickým systémem Ciras 2 byly pro jednotlivé body

zprůměrňovány za účelem dosažení nejjednodušší interpretace dat [4]. Pomocí programu

Photosyn assistant byly metodou nejmenších čtverců vyneseny křivky závislosti rychlosti

fotosyntézy (Aact) na intercelulární koncentraci CO2.. Software současně provedl výpočet

parametrů fotosyntézy spojených se světelnou křivkou. Křivky získané optimalizovanou

metodou měření mají hladký průběh (viz Obr. 4). Přidaný měřící bod vykazoval větší

intercelulární koncentraci CO2 než u počátečního bodu se zadanou stejnou hodnotou [CO2],

ale nižší hodnoty rychlosti fotosyntézy (Aact). U předešlé metodiky byly hodnoty v místech

křivky odpovídajících počátku měření, tedy [CO2] 400 μmol(CO2).mol-1 ve směru měření od

[CO2] 0 do 750 μmol(CO2).mol-1 silně podhodnocené.

9

02468101214

kontrola UV

Am

ax [

μm

ol.m

-2.s

-1]

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

kontrola UV

Rd

ay [

μm

ol.m

-2.s

-1]

Obr. 4: Příklad výsledné CO2 křivky získané měřením pomocí gazometrického systému Ciras 2 (vlevo) UV

vystavených listů ječmene jarního (Hordeum vulgare L. cv. Bonus) a (vpravo) kontrolních listů rostlin ječmene

jarního, které nebyly ošetřeny UV zářením.

3.2. Kvantitativní vyhodnocení fyziologických procesů spojených s fotosyntézou kontrolních a UV ošetřených vzorků ječmene jarního měřených pomocí přístroje Ciras 2

Po stanovení gazometrických parametrů (viz kapitolu 2.2.) pro jednotlivé vzorky (3

vzorky UV a 3 vzorky K) za pomoci programu Photosyn assistant byly tyto zprůměrovány

do dvou skupin: UV a Kontrola a vypočteny směrodatné odchylky. Z množství získaných

grafů byla vybrána ta porovnání obou skupin, u kterých byly zjištěny změny UV skupiny vůči

skupině kontrolní a která byla užitečná pro podpoření výsledků měření mých kolegů (viz

Obr. 5). Všechny použité statistické testy vyšly nesignifikantní, data fotochemické účinnosti

bylo nutné testovat neparametrickými testy, protože nebyla z normálního rozdělení.

10

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

kontrola UV

QE

[r.

j.]

00,51

1,52

2,53

3,54

kontrola UV

CE

[r.

j.]

05101520253035

kontrola UV

Asa

t [μ

mol

.m-2

.s-1

]

0102030405060708090100

kontrola UV

Vcm

ax [

μm

ol.m

-2.s

-1]

Obr. 5: Porovnání gazometrických parametrů získaných měřením UV vystavených listů ječmene jarního

(Hordeum vulgare L. cv. Bonus) a kontrolních listů rostlin ječmene jarního, které nebyly ošetřeny UV zářením,

pomocí gazometrického systému Ciras 2 (zleva: maximální rychlost asimilace CO2 při saturační intenzitě

ozářenosti (Amax), rychlost temnostní respirace (Rday), fotochemická efektivnost představující limitaci

asimilace rychlostí regenerace primárního akceptoru, tedy ribulosa-(1,5)-bisfosfátu (QE), účinnost karbonylace

představující limitaci asimilace aktivitou enzymu ribulosa-(1,5)-bisfosfátu (CE), rychlost asimilace CO2 při

saturační intenzitě CO2 (Asat), maximální rychlost karboxylace enzymu ribulosa-(1,5)-bisfosfátu (Vcmax).

4. Diskuze výsledků

Z měření vyplynulo, že optimalizace metody měření CO2 křivky byla úspěšná. Zpětně

se tedy dá usuzovat, že razantní změna [CO2] z 0 na 750 μmol(CO2).mol-1 za krátký časový

interval způsobila, že se stomata nestačila otevřít do odpovídající míry. Stomatální vodivost

tedy byla faktorem značně limitujícím zkracování času potřebného k měření CO2 křivky. Za

účelem odstranění vlivu stomatální vodivosti na získaná data byl přidán další měřící bod při

[CO2] 400 μmol(CO2).mol-1 i za cenu prodloužení měření o přibližně 5 minut. Tato úprava

metodiky zároveň umožnila kontrolu míry otevřenosti průduchů vůči počátku měření, která

byla vždy nepatrně vyšší než na začátku měření.

11

Hodnoty gazometrických parametrů UV skupiny vůči K skupině ukazují:

• na 35 % pokles temnostní respirace (Rday)

• zcela nezměněnou maximální rychlost fotosyntézy (Amax)

• mírný nárůst (21 %) karboxylační účinnosti (CE) srovnatelný s nárůstem (22 %)

maximální karboxylační rychlosti Rubisca (Vcmax)

• mírný nárůst (10 %) byl také zaznamenán u hodnoty saturační rychlosti fotosyntézy

(Asat)

• naproti tomu byla fotochemická účinnost (QE) mírně potlačena (13 % pokles)

Vzhledem k tomu, že bylo u UV ošetřených rostlin naměřeno vyšší množství chlorofylů a i b

(Teslová 2008), lze vysvětlit nezměněnou maximální rychlost fotosyntézy (Amax) za snížené

fotochemické účinnosti fotosystému PS II (QE) tak, že ječmen nabuduje větší množství

chlorofylů, aby ztráty kompenzoval. Tvorba většího množství chlorofylů i karotenů spolu se

zapojením protekčních a reparačních mechanismů rostliny (převážně syntetizování

polyfenolických látek) by také mohla vysvětlovat pokles temnostní respirace (Rday)

spočívající v přeměně značného množství produktů fotosyntézy na látky potřebné k reparaci.

5. Závěr

Prakticky byly potvrzeny teoretické závěry ohledně limitace zkracování doby měření

CO2 křivek vlivem stomatální vodivosti. Nově upravená metodika měření CO2 křivek

umožnila získání přesnějších gazometrických parametrů, zejména mechanistické analýzy CO2

křivek. Ačkoliv bylo u rostlin vystavených subletálním dávkám UV radiace předpokládáno

snížení vitality, tato práce ukázala, že došlo pouze k mírnému potlačení fotochemické

účinnosti fotosystému PS II, naproti tomu však k mírnému nárůstu saturační rychlosti

fotosyntézy, karboxylační účinnosti a maximální karboxylační rychlosti Rubisca.

6. Použitá literatura a WWW odkazy

12

[1] KALINA, J., SLOVÁK, V., The inexpensive tool for the determination of projected leaf

area, 2004, Ekológia (Bratislava): 23(2), 163-167

[2] MECHLOVÁ, E., ZELENÁ, S. [online] poslední kontrola 25. dubna 2008

<http://artemis.osu.cz/Student/OVSE_tex.pdf>

[3] NEZVAL, J. Modifikace metod analýzy fotosyntetických pigmentů a dalších vybraných

látek z extraktů asimilačního aparátu (2007)

[4] ČERVEŇ, J. Optimalizace metodiky měření LRC a RCR pomocí gazometrického systému

Ciras 2 pro rostliny aklimatizované na různou úroveň ozářenosti (2006)

[5] WIKIPEDIE [online] poslední kontrola 6. května 2008

<http://cs.wikipedia.org/wiki/Ultrafialov%C3%A9_z%C3%A1%C5%99en%C3%AD>

[6] R Development Core Team (2008). R: A language and environment for statistical

computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0,

URL http://www.R-project.org

[7] KALINA, J. Studium vlivu zvýšené koncentrace CO2: metodické příspěvky ke studiu

fotosyntézy (2005)

[8] Teslová, P. Vytvoření metodiky stanovení obsahu sacharidů z rostlinných pletiv vyšších

rostlin (2008)

13