Supporting Information - Royal Society of Chemistry · Supporting Information Peracetylation as...
Transcript of Supporting Information - Royal Society of Chemistry · Supporting Information Peracetylation as...
Supporting Information
Peracetylation as strategy to improve oleuropein stability and affinity to fatty foods.Sonia Bonacci,a [co] Rosina Paonessa,b [co] Paola Costanzo,a Raffaele Salerno,c Jessica Maiuolo,c Monica Nardi,d,e Antonio Procopio,a and Manuela Oliverioa*
a.Department of Health Sciences, University Magna Graecia of Catanzaro, Viale Europa, Loc. Germaneto, 88100 Catanzaro, Italy. E-mail: [email protected] of Experimental and Clinical Medicine, University Magna Graecia of Catanzaro, Viale Europa, Loc. Germaneto, 88100 Catanzaro, Italy.c. InterRegional Center for Food Safety and Health, University Magna Graecia of Catanzaro, Viale Europa, Loc. Germaneto, 88100 Catanzaro, Italy.d.Telematic University San Raffaele, Roma, Italy .e. Department of Chemistry, University of Calabria, Cubo 12C, 87036-Arcavacata di Rende (CS), Italy
Characterization of OleAc and Mix
LC-MS conditions 3
Figure S1: OleAc LC-MS spectra 4
Figure S2: Mix LC-MS Spectra 5
Evaluation of low oil quality oil parameters by FT-NIR
Table S1: Calibration and Cross Validation efficiency parameters 7
Table S2: Physico-chemical and organoleptic characteristics of olive oil 9
Figure S3: Acidity, K232 and K268 values of prepared oils 16
Evaluation of phenols composition in EVOO extracts
Figure S4: LC-MS Calibration curves 17
Table S3: phenols quantification by LC-MS 18
Nano-LC HRMS direct infusion analysis of EVOOs
Electronic Supplementary Material (ESI) for Food & Function.This journal is © The Royal Society of Chemistry 2018
2
Nano- LC HRMS conditions 19
Figure S5: SIM HRMS Spectra 20
Figure S6: Full scan with labelling relative to selected mass 21
3
Characterization of OleAc and Mix
LC-MS Conditions
Chromatography was performed using a Thermo Scientific (Rodano, MI, Italy) Dionex Ultimate 3000 RS, injecting directly onto a
Thermo Scientific Hypersil Gold C18 column (50 x 2.1 mm, 1.9 µm particle size), equilibrated in 95% solvent A (0,1% aqueous solution
of formic acid), 5% solvent B (methanol). The column and autosampler temperatures were maintained at 24 °C and 20 °C
respectively. The elution flow rate was 600 µl/min by linearly increasing solvent B concentration from 5 to 55% in 4 min, from 55% to
95% in 2 min and remain for other 2 minutes in isocratic, then return at 5% in other 1 minute, end re-equilibrated in 3 minutes. The
total run time, including column wash and equilibration was 15 min.
A Thermo Scientific Q-ExactiveTM (Rodano, MI, Italy) mass spectrometer was operated using electrospray with both negative and
positive polarities, at 35,000 resolving power (defined as FWHM at m/z 200), IT 100 ms, and ACG target= 500,000, by full scan
analysis (mass range 140-900 amu for 2 samples and 200-1500 amu for other 2 samples). Source conditions were: spray voltage
2.9KV, sheath gas: 30, arbitrary units, Auxiliary gas: 10, probe heater temperature: 280°C; capillary temperature: 320°C; S-Lens RF
Level: 50. The instrument was calibrated by Thermo calibration solutions prior to the beginning the analysis.
4
Figure S1: OleAc LC-MS spectra
OLEAACETILATANEW_22_11_2013_10ppm 11/22/13 17:01:10
RT: 0.00 - 30.02 SM: 7B
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time (min)
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
0
20
40
60
80
100R
elat
ive
Abu
ndan
ce
16.50
16.28 17.56 19.25 24.0620.18 24.7623.2221.58 25.9715.3410.62 11.929.647.4415.42
15.88
16.24
12.56
12.91
13.3410.6410.07 15.118.01 12.267.45 24.436.345.61 17.4816.291.25 27.1418.21 26.564.65 28.0121.063.38 29.7120.071.89
NL: 5.73E8m/z= 815.23445-815.23935 F: FTMS + p ESI Full ms [200.00-1300.00] MS OLEAACETILATANEW_22_11_2013_10ppm
NL: 2.56E7m/z= 773.22398-773.22862 F: FTMS + p ESI Full ms [200.00-1300.00] MS OLEAACETILATANEW_22_11_2013_10ppm
NL: 1.19E7m/z= 303.08299-303.08481 F: FTMS + p ESI Full ms [200.00-1300.00] MS OLEAACETILATANEW_22_11_2013_10ppm
OLEAACETILATANEW_22_11_2013_10ppm 11/22/13 17:01:10
RT: 0.00 - 30.02 SM: 7B
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time (min)
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
0
20
40
60
80
100R
elat
ive
Abu
ndan
ce16.50
16.28 17.56 19.25 24.0620.18 24.7623.2221.58 25.9715.3410.62 11.929.647.4415.42
15.88
16.24
12.56
12.91
13.3410.6410.07 15.118.01 12.267.45 24.436.345.61 17.4816.291.25 27.1418.21 26.564.65 28.0121.063.38 29.7120.071.89
NL: 5.73E8m/z= 815.23445-815.23935 F: FTMS + p ESI Full ms [200.00-1300.00] MS OLEAACETILATANEW_22_11_2013_10ppm
NL: 2.56E7m/z= 773.22398-773.22862 F: FTMS + p ESI Full ms [200.00-1300.00] MS OLEAACETILATANEW_22_11_2013_10ppm
NL: 1.19E7m/z= 303.08299-303.08481 F: FTMS + p ESI Full ms [200.00-1300.00] MS OLEAACETILATANEW_22_11_2013_10ppm
m/z 777[M-Ac+ Na]+
OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2 #6777 RT: 16,88 AV: 1 NL: 1,89E6F: FTMS + p ESI d Full ms2 815,23@hcd30,00 [56,67-850,00]
420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relativ
e Abun
dance
485,1404R=12802
453,1141R=13302
467,1300R=13002
815,2346R=9702
755,2119R=9402443,1280
R=11500
425,1200R=12000
653,1884R=7600
773,8846R=6700
Peracetilated Oleuropein (89%)
5
Figure S2a: Mix LC-MS spectra
RT: 0,20 - 17,35 SM: 11B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Time (min)
0
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
10016,55
13,25
14,56
11,85 14,36 16,3015,485,77 11,299,15 11,949,78 10,578,267,716,705,374,784,331,64 3,452,510,8316,55
16,3215,95
15,49
16,3115,2811,285,69
16,55
16,3315,979,8315,9515,48
16,3115,3114,61
NL: 4,22E9Base Peak F: FTMS + p ESI Full ms [200,00-1300,00] MS OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2
NL: 4,21E8m/z= 815,22875-815,24505 F: FTMS + p ESI Full ms [200,00-1300,00] MS OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2
NL: 3,27E7m/z= 773,21857-773,23403 F: FTMS + p ESI Full ms [200,00-1300,00] MS OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2
NL: 4,22E9m/z= 810,27340-810,28960 F: FTMS + p ESI Full ms [200,00-1300,00] MS OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2
NL: 1,34E8m/z= 768,26322-768,27858 F: FTMS + p ESI Full ms [200,00-1300,00] MS OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2
50 100 150 200 250 300 350 400 450m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
153,0543R=23102
397,1094R=14302
337,0885R=15402
111,0442R=27002
273,0962R=17202
213,0752R=19502 231,0858
R=18602171,0648R=21602
457,1297R=13002
93,0338R=29202
375,1268R=14202
295,0780R=16102
315,1064R=15102
69,0341R=31702
355,0989R=13402
125,0596R=22100
419,3144R=9400
375,1275R=14602
452,1748R=13002
153,0545R=22202
443,7631R=11902
273,0970R=15602 333,1174
R=10300111,0442R=19800
238,9041R=11600
89,0598R=21100
213,0754R=12200
418,0999R=9400
NL: 2,52E6OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2#5444 RT: 13,17 AV: 1 F: FTMS + p ESI d Full ms2 457,12@hcd30,00 [50,00-485,00]
NL: 4,87E5OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2#5383 RT: 13,02 AV: 1 F: FTMS + p ESI d Full ms2 452,17@hcd10,00 [50,00-480,00]
Peracetylated Oleuropein (65%)
Monoacetylated elenolic acid glicoside (minor)
OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2 #5943 RT: 14,51 AV: 1 NL: 1,23E8F: FTMS + p ESI d Full ms2 696,23@hcd10,00 [50,00-730,00]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relativ
e Abun
dance
331,1015R=15702
696,2327R=10802
211,0596R=19602
169,0490R=21902
271,0804R=17302109,0285
R=27402127,0387R=24602
559,1608R=10600
97,0290R=27000
229,0700R=12100
192,8246R=15000
595,6639R=7800
147,9892R=14500
Peracetylated Diglicoside
Peracetyated Leaves Extract(Naturex)
OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2 #6777 RT: 16,88 AV: 1 NL: 1,89E6F: FTMS + p ESI d Full ms2 815,23@hcd30,00 [56,67-850,00]
420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relati
ve Ab
unda
nce
485,1404R=12802
453,1141R=13302
467,1300R=13002
815,2346R=9702
755,2119R=9402443,1280
R=11500
425,1200R=12000
653,1884R=7600
773,8846R=6700
6
Figure S2b: Mix LC-MS spectra
OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2 #6777 RT: 16,88 AV: 1 NL: 1,89E6F: FTMS + p ESI d Full ms2 815,23@hcd30,00 [56,67-850,00]
420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relat
ive Ab
unda
nce
485,1404R=12802
453,1141R=13302
467,1300R=13002
815,2346R=9702
755,2119R=9402443,1280
R=11500
425,1200R=12000
653,1884R=7600
773,8846R=6700
Peracetylated Oleuropein
OLEAESTRATTOACETILATO_23_1_2014_260PPMconammonio_ddMS2 #5943 RT: 14,51 AV: 1 NL: 1,23E8F: FTMS + p ESI d Full ms2 696,23@hcd10,00 [50,00-730,00]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100Rel
ative A
bundan
ce331,1015R=15702
696,2327R=10802
211,0596R=19602
169,0490R=21902
271,0804R=17302109,0285
R=27402127,0387R=24602
559,1608R=10600
97,0290R=27000
229,0700R=12100
192,8246R=15000
595,6639R=7800
147,9892R=14500
Peracetylated Diglicoside (minor)
Peracetylated Oleuropein (major)
7
Evaluation of low oil quality oil parameters by FT-NIR
Table S1: Calibration and Cross Validation efficiency parameters
Parameters R2 Q2 RMSEC RMSECV
Acidity 0,99087 0,95060 0,0327 0,0759
Peroxides index 0,94835 0,79903 1,222 2,39
K232 0,88116 0,79095 0,108 0,140
K268 0,86431 0,78349 0,0129 0,0159
K264 0,89160 0,76505 0,0108 0,0154
K272 0,92351 0,83409 0,00968 0,0139
Wax Esters (C42+C44+C46) 0,99467 0,67010 5,07 27,72
Fatty Acid Ethyl Esters (FAEE) 0,96978 0,65767 2,81 8,70
Myristic acid 0,80058 0,48347 0,00178 0,00268
Eicosenoic acid 0,85411 0,7485 0,03939 0,0439
Arachic acid 0,81046 0,67714 0,0280 0,0354
Linolenic acid 0,96144 0,39775 0,0120 0,0457
8
Behenic acid 0,98754 0,25334 0,00182 0,0129
Lignoceric acid 0,79409 0,53101 0,00552 0,00797
Translinoleic 0,89714 0,03149 0,00238 0,125
Erythrodiol + Uvaol 0,37805 0,154 0,639 0,698
Total Sterols 0,91989 0,81773 0,110e3 0,161e3
Total Betasitosterol 0,70041 0,03897 0,219 0,343
Total Polyphenols 0,76571 0,12418 39,7 71,4
9
Table S2: Physico-chemical and organoleptic characteristics of olive oil
Parameters Time
EVO Oil Untreated
Blk_EtOH Oil_OleAc Oil_Mix Blk US
Horn Oil_OleAc Oil_Mix Blk UsBath Oil_OleAc
T0 0,46±0,02 0,53±0,01 0,53±0,01 0,52±0,03 0,44±0,02 0,44±0,02 0,44±0,02 0,44±0,02 0,44±0,02
T1 0,45±0,01 0,46±0,02 0,48±0,01 0,52±0,03 0,45±0,01 0,44±0,01 0,45±0,02 0,48±0,01 0,47±0,02
T2 0,47±0,02 0,44±0,01 0,47±0,01 0,54±0,03 0,43±0,03 0,43±0,03 0,41±0,02 0,47±0,02 0,47±0,01
T3 0,44±0,03 0,41±0,03 0,44±0,01 0,48±0,01 0,37±0,00 0,37±0,02 0,36±0,02 0,49±0,02 0,46±0,02
Acidity
(%)
T4 0,50±0,02 0,44±0,01 0,41±0,03 0,44±0,02 0,46±0,02 0,47±0,03 0,47±0,02 0,48±0,01 0,47±0,04
T014,33±0,5
814,00±0,0
014,00±0,0
015,00±0,0
014,33±0,5
814,00±0,0
014,33±0,5
814,33±0,5
814,00±0,0
0
T115,33±0,5
815,00±0,0
015,67±0,5
816,00±0,0
014,33±0,5
815,00±0,0
014,33±0,4
814,00±0,0
014,00±0,0
0
T219,00±0,0
017,00±0,0
019,00±0,0
021,00±0,0
017,00±0,0
017,00±0,0
020,00±0,0
017,00±0,0
017,00±0,0
0
T324,33±0,5
820,67±0,5
824,00±0,0
029,00±0,0
020,33±0,5
819,33±0,5
821,33±0,0
320,22±0,0
322,00±0,0
0
Peroxides
(ppm)
T432,00±0,5
825,00±0,5
838,67±0,5
836,00±0,0
032,33±0,5
827,00±0,5
828,00±0,0
025,67±0,0
532,67±0,0
0
T0 1,93±0,02 1,90±0,08 1,88±0,02 1,88±0,02 1,94±0,03 2,04±0,05 1,95±0,01 1,97±0,03 1,95±0,02K232
T1 2,02±0,09 2,14±0,03 1,92±0,06 1,92±0,06 2,09±0,13 2,13±0,01 2,16±0,02 2,12±0,06 2,15±0,07
10
T2 2,25±0,01 2,25±0,02 2,20±0,01 2,20±0,01 2,19±0,06 2,23±0,03 2,40±0,07 2,22±0,02 2,30±0,02
T3 2,63±0,09 2,40±0,07 2,57±0,04 2,57±0,04 2,43±0,07 2,43±0,06 2,53±0,05 2,43±0,07 2,66±0,03
T4 2,50±0,05 3,03±0,11 3,75±0,02 3,75±0,02 3,44±0,08 2,99±0,03 3,06±0,01 2,88±0,04 3,58±0,03
T0 0,06±0,01 0,05±0,01 0,06±0,00 0,07±0,00 0,05±0,00 0,06±0,01 0,05±0,00 0,06±0,00 0,06±0,00
T1 0,04±0,00 0,06±0,00 0,06±0,00 0,07±0,01 0,04±0,01 0,05±0,01 0,04±0,01 0,06±0,01 0,06±0,00
T2 0,06±0,00 0,06±0,00 0,07±0,00 0,09±0,00 0,06±0,00 0,06±0,00 0,07±0,00 0,07±0,00 0,07±0,00
T3 0,09±0,01 0,08±0,00 0,10±0,01 0,12±0,01 0,06±0,00 0,06±0,00 0,07±0,00 0,07±0,00 0,07±0,00
K268
T4 0,12±0,01 0,08±0,00 0,12±0,00 0,12±0,00 0,12±0,00 0,11±0,00 0,11±0,01 0,11±0,00 0,13±0,00
T0 0,07±0,00 0,07±0,00 0,08±0,00 0,09±0,00 0,06±0,00 0,07±0,01 0,06±0,01 0,07±0,00 0,06±0,00
T1 0,06±0,00 0,07±0,00 0,09±0,00 0,10±0,01 0,06±0,01 0,06±0,01 0,06±0,00 0,07±0,00 0,07±0,00
T2 0,08±0,00 0,07±0,00 0,10±0,00 0,12±0,00 0,07±0,00 0,06±0,01 0,07±0,00 0,07±0,00 0,07±0,00
T3 0,10±0,01 0,07±0,00 0,10±0,00 0,11±0,00 0,07±0,00 0,08±0,00 0,08±0,00 0,09±0,00 0,09±0,00
K264
T4 0,12±0,00 0,10±0,01 0,14±0,00 0,15±0,00 0,11±0,00 0,10±0,00 0,10±0,00 0,09±0,01 0,09±0,00
T0 0,03±0,00 0,03±0,00 0,05±0,00 0,05±0,01 0,03±0,01 0,03±0,01 0,02±0,01 0,03±0,00 0,02±0,00
T1 0,02±0,01 0,03±0,00 0,06±0,00 0,07±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,03±0,01 0,03±0,00
T2 0,04±0,00 0,03±0,01 0,06±0,00 0,10±0,00 0,03±0,00 0,02±0,01 0,02±0,00 0,03±0,00 0,03±0,00K272
T3 0,06±0,01 0,04±0,01 0,06±0,00 0,08±0,00 0,03±0,00 0,04±0,01 0,04±0,01 0,05±0,00 0,06±0,00
11
T4 0,10±0,00 0,07±0,01 0,11±0,00 0,12±0,00 0,09±0,00 0,07±0,00 0,07±0,00 0,06±0,01 0,06±0,00
T0 0,01±0,00 0,01±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 0,01±0,01 0,01±0,01 0,01±0,01 0,01±0,00 0,02±0,00
T1 0,00±0,00 0,00±0,00 -0,01±0,00 -0,02±0,00 0,00±0,00 0,01±0,00 0,00±0,00 0,01±0,00 0,01±0,00
T2 0,00±0,00 0,01±0,01 -0,01±0,00 -0,02±0,01 0,01±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00
T3 0,01±0,00 0,03±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,01±0,00 0,00±0,01 0,00±0,00 0,00±0,01 0,00±0,01
Delta K
T4 0,01±0,00 0,00±0,00 -0,01±0,00 -0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,03±0,00 0,03±0,00 0,05±0,00
T098,83±4,1
9104,90±1,
32102,93±1,
58112,27±1,
93100,97±3,
2597,50±6,9
597,57±2,9
896,30±1,5
691,77±2,4
6
T1117,57±3,
46106,30±2,
23111,87±3,
02116,93±2,
63121,43±1,
59120,17±3,
25119,67±3,
31107,23±5,
90109,33±4,
17
T2116,83±2,
73109,43±2,
14105,30±3,
12117,73±4,
47103,50±1,
97105,40±1,
20107,70±1,
6597,40±2,9
8100,07±2,
22
T3122,50±3,
60104,43±2,
14104,90±5,
81115,60±0,
57127,20±2,
36129,27±3,
40132,20±2,
72121,80±4,
10124,63±1,
63
Wax Esters
(C42+C44+C46)
(mg/Kg)
T4112,90±1,
32142,83±1,
33164,57±0,
65166,73±2,
63116,20±3,
22105,87±1,
91108,67±2,
41102,50±1,
39112,97±1,
65
T031,78±3,0
435,06±3,0
128,43±2,2
333,03±0,4
531,02±4,5
033,39±3,8
727,58±3,6
130,12±3,2
031,62±0,6
6Fatty Acid
Ethyl Esters (FAEE)
(mg/Kg) T138,74±3,8
328,38±1,0
137,44±4,1
239,44±2,8
630,74±3,5
834,76±2,4
733,72±1,0
829,27±2,0
928,58±2,7
5
12
T239,29±0,8
130,94±3,0
033,67±2,5
236,55±1,4
030,36±0,4
830,74±1,5
030,00±0,4
427,69±0,4
726,36±3,7
5
T333,40±4,2
526,88±2,7
931,06±4,1
734,41±0,1
931,54±2,5
933,92±4,5
630,29±1,1
230,84±2,0
631,80±1,9
2
T430,97±1,3
735,82±1,4
844,47±2,4
944,72±0,9
124,85±3,6
929,75±4,3
726,78±2,2
131,99±4,4
125,77±2,6
7
T0 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00
T1 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00
T2 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00
T3 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00
Myristic acid
(%)
T4 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00
T0 0,24±0,02 0,20±0,01 0,20±0,01 0,16±0,01 0,24±0,01 0,25±0,01 0,23±0,01 0,24±0,00 0,24±0,01
T1 0,23±0,01 0,22±0,01 0,21±0,01 0,15±0,01 0,22±0,01 0,23±0,01 0,24±0,01 0,23±0,01 0,22±0,01
T2 0,25±0,01 0,24±0,01 0,21±0,00 0,16±0,01 0,25±0,01 0,25±0,01 0,25±0,01 0,25±0,01 0,25±0,01
T3 0,20±0,01 0,24±0,01 0,23±0,01 0,19±0,01 0,21±0,01 0,21±0,01 0,20±0,02 0,22±0,01 0,21±0,00
Eicosenoic acid
(%)
T4 0,26±0,01 0,22±0,01 0,21±0,01 0,17±0,01 0,27±0,01 0,28±0,01 0,27±0,01 0,27±0,01 0,28±0,01
T0 0,47±0,01 0,45±0,01 0,47±0,01 0,47±0,01 0,46±0,01 0,47±0,02 0,47±0,01 0,47±0,01 0,48±0,02Arachic acid
(%) T1 0,45±0,01 0,46±0,00 0,46±0,02 0,47±0,01 0,44±0,01 0,44±0,02 0,45±0,01 0,46±0,01 0,47±0,01
13
T2 0,48±0,01 0,48±0,02 0,50±0,01 0,49±0,01 0,47±0,01 0,49±0,01 0,47±0,02 0,49±0,01 0,49±0,01
T3 0,44±0,01 0,47±0,01 0,48±0,01 0,48±0,01 0,43±0,01 0,42±0,01 0,42±0,01 0,45±0,00 0,47±0,01
T4 0,51±0,01 0,46±0,01 0,45±0,01 0,45±0,00 0,50±0,01 0,51±0,02 0,51±0,01 0,51±0,01 0,49±0,02
T0 0,52±0,01 0,52±0,01 0,53±0,01 0,55±0,01 0,52±0,02 0,52±0,01 0,53±0,01 0,52±0,01 0,52±0,00
T1 0,53±0,01 0,52±0,00 0,53±0,00 0,54±0,01 0,52±0,01 0,53±0,01 0,53±0,00 0,52±0,01 0,51±0,01
T2 0,52±0,01 0,49±0,01 0,51±0,00 0,53±0,00 0,51±0,01 0,51±0,01 0,51±0,00 0,50±0,00 0,50±0,01
T3 0,55±0,01 0,51±0,00 0,54±0,01 0,54±0,00 0,52±0,00 0,52±0,01 0,52±0,00 0,51±0,01 0,50±0,01
Linolenic acid
(%)
T4 0,49±0,00 0,52±0,01 0,54±0,01 0,54±0,01 0,48±0,00 0,48±0,01 0,48±0,01 0,49±0,01 0,49±0,01
T0 0,11±0,01 0,10±0,01 0,11±0,00 0,11±0,01 0,11±0,01 0,12±0,01 0,11±0,01 0,11±0,01 0,12±0,00
T1 0,11±0,01 0,11±0,01 0,12±0,00 0,11±0,01 0,10±0,01 0,11±0,01 0,10±0,01 0,12±0,00 0,11±0,01
T2 0,12±0,01 0,12±0,01 0,12±0,00 0,12±0,00 0,11±0,00 0,11±0,01 0,11±0,00 0,12±0,01 0,11±0,01
T3 0,11±0,00 0,11±0,01 0,11±0,01 0,12±0,01 0,11±0,00 0,12±0,00 0,11±0,01 0,12±0,01 0,12±0,01
Behenic acid
(%)
T4 0,10±0,01 0,13±0,01 0,13±0,01 0,13±0,00 0,11±0,01 0,11±0,01 0,11±0,01 0,12±0,01 0,11±0,01
T0 0,16±0,01 0,17±0,00 0,17±0,01 0,16±0,00 0,17±0,01 0,16±0,01 0,16±0,01 0,16±0,01 0,16±0,01
T1 0,17±0,00 0,16±0,00 0,16±0,00 0,16±0,00 0,17±0,00 0,17±0,00 0,17±0,01 0,17±0,00 0,17±0,00
T2 0,17±0,01 0,17±0,00 0,17±0,01 0,16±0,00 0,16±0,00 0,17±0,00 0,17±0,00 0,16±0,01 0,16±0,01
Lignoceric acid
(%)
T3 0,16±0,01 0,16±0,00 0,16±0,01 0,16±0,00 0,17±0,00 0,17±0,01 0,17±0,00 0,17±0,00 0,17±0,00
14
T4 0,16±0,00 0,17±0,01 0,16±0,00 0,16±0,01 0,16±0,00 0,16±0,00 0,16±0,00 0,16±0,01 0,16±0,00
T0 0,01±0,01 0,01±0,00 0,01±0,00 0,00±0,00 0,02±0,01 0,01±0,01 0,01±0,01 0,02±0,01 0,01±0,00
T1 0,01±0,01 0,02±0,00 0,01±0,00 0,00±0,00 0,01±0,00 0,01±0,00 0,01±0,00 0,02±0,01 0,02±0,01
T2 0,01±0,00 0,02±0,01 0,02±0,00 0,01±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00 0,03±0,01 0,03±0,01
T3 0,01±0,00 0,03±0,01 0,01±0,01 0,01±0,00 0,01±0,00 0,01±0,00 0,01±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00
Translinoleic
(%)
T4 0,04±0,00 0,01±0,00 0,01±0,00 0,00±0,00 0,04±0,00 0,04±0,00 0,04±0,00 0,03±0,01 0,04±0,01
T0 3,03±0,06 3,16±0,12 2,98±0,21 3,10±0,04 2,91±0,01 3,03±0,06 3,10±0,13 3,06±0,08 3,08±0,08
T1 3,16±0,27 3,24±0,23 3,16±0,08 3,03±0,10 3,09±0,08 3,03±0,22 3,10±0,05 3,09±0,09 3,23±0,11
T2 3,21±0,21 3,17±0,02 3,04±0,09 3,12±0,13 2,80±0,20 3,07±0,06 2,96±0,11 3,00±0,14 2,97±0,26
T3 3,07±0,12 3,00±0,14 3,00±0,11 3,08±0,06 3,17±0,21 3,16±0,09 3,26±0,10 3,11±0,02 3,15±0,07
Erythrodiol
+ Uvaol
T4 2,90±0,06 3,19±0,08 3,30±0,04 3,35±0,21 2,99±0,12 2,93±0,08 2,97±0,10 3,09±0,04 2,93±0,24
T01523,57±3,
41543,99±30
,81528,42±13
,91575,26±21
,61541,26±0,
221523,93±13
,41523,34±16
,01517,77±9,
81506,45±18
,9
T11550,48±20
,41518,93±11
,91561,63±12
,41573,03±2,
41570,43±32
,71545,18±28
,71520,87±6,
31527,55±22
,21521,21±23
,1
T21516,36±16
,91518,84±28
,81557,49±18
,91580,48±9,
51514,68±8,
91504,27±9,
91515,83±20
,81472,09±11
,91477,99±7,
90
Total Sterols
(%)
T31564,83±20
,91512,68±15
,01549,54±27
,41582,24±10
,61574,15±14
,81578,50±26
,81604,64±24
,11549,99±19
,81551,78±6,
20
15
T41522,98±11
,31561,52±12
,81596,59±7,
871611,39±23
,01522,95±10
,71495,32±14
,21499,56±18
,01490,84±20
,51476,80±11
,1
T094,51±0,0
794,47±0,0
194,49±0,0
294,61±0,0
194,49±0,1
094,56±0,1
294,53±0,1
194,46±0,0
394,45±0,0
1
T194,66±0,0
894,57±0,0
194,64±0,0
894,61±0,0
294,70±0,0
294,70±0,0
294,72±0,0
194,46±0,0
194,47±0,0
1
T294,70±0,0
394,56±0,0
194,59±0,0
294,63±0,0
894,54±0,0
194,53±0,0
194,55±0,0
294,44±0,0
194,45±0,0
1
T394,47±0,0
194,44±0,0
194,54±0,0
694,51±0,0
094,58±0,0
194,55±0,0
294,56±0,0
294,52±0,0
494,54±0,0
2
Total Betasitosterol
(%)
T494,63±0,0
194,72±0,0
194,87±0,0
394,83±0,0
294,59±0,0
294,55±0,0
194,58±0,0
294,42±0,0
194,45±0,0
1
T0452,56±2,69
451,13±4,72
455,07±2,47
435,21±4,51
446,90±4,37
452,19±5,49
451,52±2,00
453,63±4,81
458,58±0,37
T1450,86±3,16
454,49±3,97
451,24±5,58
429,56±1,45
472,95±1,72
464,04±5,18
461,18±9,18
474,57±5,27
470,52±4,01
T2447,12±2,72
467,45±3,23
456,45±2,06
442,26±4,00
449,23±6,73
466,02±4,85
463,81±0,42
467,11±1,18
466,91±7,29
T3445,80±3,75
449,78±4,74
439,96±7,68
426,23±5,23
469,60±6,73
469,60±10,0
469,06±2,57
469,16±4,90
477,00±4,28
Total Polyphenols
(ppm)
T4460,25±5,15
473,78±7,80
457,25±4,76
453,04±5,25
476,55±1,77
473,15±8,24
479,36±3,82
469,48±6,89
471,92±9,29
16
Figure S3: Acidity, K232 and K268 values of prepared oils
17
Evaluation of phenols composition in EVOO extracts
Figure S4: LC-MS calibration curves.
18
Table S3: phenols quantification by LC-MS
Oleacin concentration (μg ml-1)
Time EVOO_Untreated EtOH_Blk EtOH_OleAc EtOH_Mix UsHorn_Blk UsHorn_OleAc UsHorn_Mix UsBath_Blk UsBath_OleAc UsBath_Mix
T0 1,57 1,78 2,73 1,30 1,62 3,39 2,41 2,42 1,86 1,73
T1 2,73 1,57 1,46 1,43 2,59 3,03 2,98 2,78 4,19 3,96
T2 1,47 2,34 2,31 2,66 2,05 1,77 2,02 1,43 1,96 1,70
T3 2,12 1,61 0,91 0,92 1,90 2,22 1,93 3,31 0,66 0,57
T4 0,80 1,22 1,13 1,16 1,30 1,63 1,83 2,38 0,09 0,09
Oleuropein aglycon concentration (μg ml-1)
Time EVOO_Untreated EtOH_Blk EtOH_OleAc EtOH_Mix UsHorn_Blk UsHorn_OleAc UsHorn_Mix UsBath_Blk UsBath_OleAc UsBath_Mix
T0 4,69 7,75 8,19 5,86 4,89 8,58 7,17 7,28 4,64 4,00
T1 5,87 4,40 3,63 4,59 7,80 8,65 9,09 9,13 10,24 9,87
T2 7,60 6,60 6,30 9,86 5,63 4,57 6,69 4,10 7,70 6,75
T3 7,60 7,40 3,24 3,25 5,27 5,68 6,05 6,18 5,50 5,89
T4 2,60 7,66 3,41 4,20 3,91 3,84 5,24 6,07 2,60 3,00
19
Nano-LC HRMS direct infusion analysis of EVOOs
Nano- LC HRMS conditions
Determination of peracetilated oleuropein in enriched oil was performed using a Thermo Scientific Q-ExactiveTM (Rodano, MI, Italy)
mass spectrometer. Analysis was operated using nano-electrospray with positive polaritiy, at 140,000 resolving power, IT 500 ms,
and ACG target, maximum injection time 200 ms by full scan analysis (mass range 700-1100 amu). Source conditions were: spray
voltage 1.0 KV, capillary temperature: 250 °C; S-Lens RF Level: 50. The instrument was calibrated by Thermo calibration solutions
prior to the beginning the analysis.
Enriched and blank EVOO samples were diluted before analysis. Previously, oil samples were diluted from 100 to 1000 μl, using
chloroform, then 5 μl of this solution were diluted with ethanol up to a final volume of 1000 μl.
20
SIM HRMS Spectra
Olio-Oleac-EVO-horn-bianco2 #10-225 RT: 0.10-2.00 AV: 54 NL: 3.00E7T: FTMS + p NSI SIM ms [800.00-830.00]
794 796 798 800 802 804 806 808 810 812 814 816 818 820 822 824 826 828 830 832 834 836 838m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relati
ve Ab
undanc
e
800.61262
827.71198801.61504 829.72952805.47391 817.65535811.60864 819.59816813.57063 825.69574809.62957
a
Olio-Oleac-EVO-horn-oleac #81-187 RT: 0.74-1.63 AV: 26 NL: 3.00E7T: FTMS + p NSI SIM ms [800.00-830.00]
794 796 798 800 802 804 806 808 810 812 814 816 818 820 822 824 826 828 830 832 834 836 838m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relativ
e Abun
dance
815.23853
816.24189
810.28365
817.24418811.28687
829.72878800.61108 813.66190 827.71189818.24626801.61376 805.72978 822.75543 825.69524807.67234
b
21
Figure S5 HRMS-SIM spectra of 815,23 m/z in blank (c) and enriched oil (d) samples.
Full scan with labelling relative to selected mass
Olio-Oleac-EVO-horn-oleac #141 RT: 1.25 AV: 1 NL: 5.00E8T: FTMS + p NSI Full ms [120.00-1500.00]
540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840m/z
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Rel
ativ
e A
bund
ance
-131.6935
-103.6623
-211.7023
-167.7782-237.7180
-263.7336 -75.6310
0.0000-223.7413
18.5231-195.7097-151.7833
-171.7101-245.7230 -4.9556-43.6622
-207.6711
-125.6444-267.8402 33.5339-176.6649 -15.63102.0056
-97.6123-108.6176 -39.5924-65.6087-136.6488
-163.7556
-80.5870
Fig. S6 HRMS spectrum where peaks are labeled as relative to the selected mass of 815,2369 m/z